JP5205922B2 - 生体物質検出用チップおよび生体物質検出用チップの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、特定のＤＮＡやタンパク質などの生体物質を検出するための、生体物質検出用チップおよび生体物質検出用チップの製造方法に関するものである。

ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。

マイクロ流体チップは、ＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ（合成オリゴＤＮＡやｃＤＮＡなど）と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。例えば、特許文献１には、マイクロチャネル中にプローブのスポットを形成し、反応液を流路内で往復させることにより、ハイブリダイゼーション反応を促進する方法が開示されている。また、特許文献２には、反応液を流路内で循環させる方法が開示されている。

米国特許出願公開第２００７／００８７３５３号明細書 米国特許第６８７５６１９号明細書

しかし、特許文献１や２に記載された従来の方法では、マイクロチャネル中にプローブをスポット状に配置しているため、マイクロチャネル中でプローブとターゲット遺伝子が接触する機会が限られ、ハイブリダイゼーション反応の効率が十分とはいえなかった。

そこで、本発明の目的は、少ない反応液で効率良く生体物質を検出することが可能な生体物質検出用チップを得ることである。

本発明に係る生体物質検出用チップは、流路内に検体を流して反応を行う生体物質検出用チップであって、溝が形成された第１の基板と、溝が形成された第２の基板と、前記第１の基板と前記第２の基板とを貼り合わせ、前記第１の基板上の溝と前記第２の基板上の溝とで形成される流路と、前記第１の基板上の溝および前記第２の基板上の溝に形成され、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブが固定された領域である反応領域と、を含み、前記反応領域は、前記第１の基板上の溝および前記第２の基板上の溝に、前記流路の検体が流れる方向に間隔をおいて一列に形成されており、かつ、前記第１の基板上の溝に形成された前記反応領域と前記第２の基板上の溝に形成された前記反応領域とが交互に配置されているものである。

本発明によれば、２枚の基板を貼り合わせて形成される流路内に、検体の流れる方向に間隔をおいて一列に形成された複数の反応領域を形成するようにしたので、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。

また、前記第１の基板上の溝に形成された前記反応領域と前記第２の基板上の溝に形成された前記反応領域とが交互に配置されているので、反応領域間の距離を十分に確保しつつ、流路内により多くの反応領域を形成することができ、各々の反応領域に異なるプローブを塗布しても、反応領域間のプローブのコンタミネーションを防止しつつ、反応効率の向上も図ることができる。

例えば、流路の検体の流れる方向に垂直な断面の形状が矩形の場合には、流路の内壁の向かい合う２面に反応領域が交互に配置されることが望ましい。

前記流路の前記検体の流れる方向に垂直な断面の形状は、円形または楕円形とすることができる。断面を円形または楕円形とすると、各々の基板に形成する溝の断面は半円型または半楕円形となる。溝にプローブの液体を塗布すると、表面張力により溝の長さ方向及び幅方向に液体が濡れ広がるが、断面が半円形（または半楕円型）の場合、断面が四角形の場合に比べて、塗布したプローブの形状や厚みを均一にすることができ、反応領域全体のプローブの密度を均一にできるという効果がある。

また、前記流路は、透明基板で形成されていることが望ましい。これにより、基板の外側から流路内の観測を行うことができるので、反応処理と検出処理を同一の装置で行うことができ、装置の小型化および処理の効率化を図ることができる。

本発明に係る生体物質検出用チップの製造方法は、流路に検体を流して、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブが固定された前記流路内の領域である反応領域において反応を行う生体物質検出用チップの製造方法であって、第１の基板および第２の基板に、前記流路の一部となる溝を形成する工程と、前記第１の基板上の溝および前記第２の基板上の溝に、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを塗布する工程と、前記第１の基板と前記第２の基板とを貼り合わせて、前記第１の基板上の溝と前記第２の基板上の溝とで前記流路を形成する工程と、を含み、前記プローブを塗布する工程は、前記流路を形成した場合に、前記第１の基板上の溝に形成された前記反応領域と前記第２の基板上の溝に形成された前記反応領域とが交互に配置されるように、前記検体の流れる方向に間隔をおいて一列に前記プローブを塗布するものである。

上記構成により、２枚の基板を貼り合わせることにより形成される流路内に、検体の流れる方向に間隔をおいて複数個所にプローブを塗布するようにしたので、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる生体物質検出用チップを簡易な方法で製造できる。

また、前記第１の基板上の溝に形成された前記反応領域と前記第２の基板上の溝に形成された前記反応領域とが交互に配置されているので、反応領域間の距離を十分に確保しつつ、流路内により多くの反応領域を形成することができ、各々の反応領域に異なるプローブを塗布しても、反応領域間のプローブのコンタミネーションを防止しつつ、反応効率の向上も図ることができる。

また、前前記プローブを塗布する工程では、非接触で液滴を吐出する手段を用いて前記プローブを含む溶液を塗布することが望ましい。
非接触で液滴を吐出する手段を用いてプローブの塗布を行うと、ピンスポッターを使う場合に比べ、溝の幅が狭い場合や、溝の底が平坦でない場合でも正確に塗布することができる。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出用チップ（生体物質検出用チップ）１０の概略構成を示す斜視図、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図に示すように、核酸検出用チップ１０は、透明基板１０１，１０２、流路１０３、リザーバ１０４，１０５を備えている。また、流路１０３の内壁には、複数の反応領域１０６が形成されている。

図１に示すように、核酸検出用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼りあせて構成されている。透明基板１０１，１０２それぞれに、流路１０３の一部となる溝が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって、立体的な流路１０３が形成される。なお、透明基板１０１，１０２は例えばガラスにより形成することができる。

流路１０３は、検体の流れる方向（図中矢印Ｆの方向）に垂直な断面の形状が円形に形成されており、ここでは、直径が１００μｍである。なお、断面の形状は、楕円形など円形以外の形状であってもよい。

反応領域１０６には、プローブが塗布されている。反応領域１０６は、流路１０３の内壁面の全周に亘って形成されており、このためプローブとターゲットが広い面積で接することが可能となり、反応効率の向上が図れる。反応領域１０６は、例えば検体の流れる方向の幅を２００μｍ、隣り合う反応領域１０６と反応領域１０６の間隔を２００μｍとすることができる。

プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。

なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。

本実施形態では、各々の反応領域１０６には、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。

次に、本実施形態による核酸検出用チップ１０の製造方法について説明する。
上述したように、核酸検出用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼りあせて構成されている。図２は、透明基板１０１の構成を示す斜視図である。図に示すように、透明基板１０１には、流路１０３の一部となる溝１０７が形成されている。溝１０７の検体の流れる方向に垂直な断面の形状は半円形である。透明基板１０２にも透明基板１０１と同様に、流路１０３の一部となる溝１０７が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって円形の流路１０３が形成される。なお、図２では、リザーバ１０４，１０５を形成する部分（流路１０３の端部）については図示を省略している。透明基板１０１，１０２がガラス基板の場合には、溝１０７は例えばエッチングまたはサンドブラスト法によって形成することができる。

次に、溝１０７にプローブを塗布し、反応領域１０６を形成する。溝１０７へプローブを塗布する方法には、ピンスポッターを使う方法や非接触で液滴を吐出する手段を使う方法などがある。しかし、本実施形態のように、溝１０７の幅が狭く、また溝１０７の底が平坦でない場合には、ピンスポッターよりも非接触で液滴を吐出する手段を用いて行う方がよい。図３（Ａ），（Ｂ）は、溝１０７へのプローブの塗布を説明する図である。図３（Ａ）に示すように、液滴吐出ヘッド（図示せず）を用いて、溝１０７上の反応領域１０６を形成する領域に、プローブを含む液滴Ｐを吐出する。

図３（Ｂ）は、プローブを含む液滴Ｐが吐出された溝１０７の表面を示す図である。溝１０７にプローブを含む液体を塗布すると、表面張力により溝１０７の長さ方向及び幅方向に液体が濡れ広がるが、本実施形態のように溝１０７の断面が半円形の場合、塗布したプローブの形状や厚みを均一にすることができ、反応領域１０６全体のプローブの密度を均一にできる。

透明基板１０１及び１０２に形成された溝１０７には、両基板を貼り合わせた際に対向する領域に同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。

透明基板１０１，１０２の溝１０７にプローブを塗布し、反応領域１０６を形成したら、透明基板１０１，１０２を接着等のプローブを分解させない方法を用いて貼り合わせることによって、核酸検出用チップ１０が形成される。透明基板１０１及び１０２の溝１０７には、対向する位置に同じ種類のプローブが塗布されているので、反応領域１０６は流路１０３の内壁面の全周に亘って形成される。

本実施形態による核酸検出用チップ１０を用いて、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理を行う際には、図４に示すように、リザーバ１０４をシリコンゴム製のチューブ１０８を介してシリンジポンプ１０９に接続し、リザーバ１０５へ検体液を供給する。

検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡやＲＮＡを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法やＩＶＴ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。

検体液をリザーバ１０５に供給したら、シリンジポンプ１０９を駆動して検体液を流路１０３に導入する。この時の流速は１μｌ／ｍｉｎ程度が適切である。さらに、シリンジポンプ１０９を駆動して所定の周期で検体液を流路１０３内で往復させる。

例えば、流路１０３の内径を１００μｍ、全体の長さを２００ｍｍとした場合、流路１０３全体を充填するために必要な検体液の量は約１．６μＬである。本実施形態のようにシリンジポンプ１０９を駆動して検体液を流路１０３内で往復させることにより、流路１０３内の全ての反応領域１０６と検体液が均等に接触し、均一なハイブリダイゼーション反応が可能となる。また、流路１０３内で常に検体液を往復させることにより、プローブにより多くのターゲットが接するようになり、反応効率が向上する。

なお、流路１０３に検体液を供給する前に、必要に応じて流路１０３内にブロッキング液を充填し、プローブが固定化されていない領域をブロッキングしておいてもよい。

所定時間のハイブリダイゼーション反応を行ったら、シリンジポンプ１０９を用いて流路１０３内より検体液を排出する。必要に応じて流路１０３内の洗浄を行った後、ハイブリダイゼーション反応の検出処理を行う。

本実施形態では、化学発光物質を用いた検出を行う。一般にＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応の測定には蛍光標識剤を用いた検出方法を用いることも多いが、蛍光強度がターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するのに対し、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合した酵素が触媒となって生成される発光物質の量によって発光強度が調整できるので、化学発光物質を用いた方法のほうが検出感度が高い。

具体的には、流路１０３内に化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）とストレプトアビジンの複合体液を充填し、予めビオチンを標識したターゲット核酸と化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）を結合させる。そこへ化学発光基質液（ルミノール、過酸化水素）を加えることにより、ＨＲＰがルミノールと過酸化水素と反応して発光物質を産出することにより発光する。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。本実施例においては、プローブが内壁の全周に固定されているため、発光物質が反応領域内に高濃度に産出され、高感度の測定が期待できる。また、拡散の方向が流路の長さ方向に限られるため、従来のように２次元的に反応領域を配置した場合に比べて発光物質の拡散が抑制され、測定精度が高いという特徴がある。

流路１０３内に化学発光基質液を充填したら化学発光物質の産出を待つ。この時、流路１０３内での往復送液操作は行わない。これは、産出された発光物質が流路１０３内を移動してしまい、測定精度が低下することを防止するためである。化学発光物質が産出されたら、ＣＣＤカメラ等を用いて発光強度を測定する。なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。

以上のように、実施の形態１によれば、各々に溝１０７が形成された透明基板１０１，１０２を貼り合わせて形成される流路１０３と、流路１０３内に、検体の流れる方向に間隔をおいて形成され、検体中のターゲットを検出するプローブを固定するための複数の反応領域１０６とを備えるようにしたので、少ない検体液で短時間での効率良い検出を行うことができる。

なお、流路１０３を形成する基板の枚数は本実施形態のように２枚に限られず、各々が流路の一部となる溝１０７を有する３枚以上の基板によって形成するようにしてもよい。

また、反応領域１０６は、流路１０３の内壁面の全周に亘って形成するようにしたので、流路１０３の一面のみに反応領域１０６が設けられている場合よりも、ターゲットとプローブとの反応機会が多くなり、さらなる反応効率の向上を図ることができる。

また、流路１０３の、検体の流れる方向に垂直な断面の形状を円形とし、透明基板１０１，１０２に形成する溝１０７の断面形状を半円型としたことにより、溝１０７にプローブを塗布する際、表面張力による液体の濡れ広がりが、幅方向で規制されるため、塗布したプローブの形状や厚みを均一にすることができ、反応領域１０６全体のプローブの密度を均一にできる。

また、流路１０３を透明基板１０１，１０２で形成したことにより、透明基板１０１，１０２の外側から流路１０３内の観測を行うことができるので、反応処理と検出処理を同一の装置で行うことができ、装置の小型化および処理の効率化を図ることができる。

また、溝１０７にプローブを塗布する工程では、液滴吐出ヘッドを用いてプローブを含む溶液を吐出することにより、塗布するようにしたので、ピンスポッターを使う場合に比べ、溝１０７の幅が狭い場合や、溝１０７の底が平坦でない場合でも正確に塗布することができる。

（変形例）
また、図５は、本発明の変形例による核酸検出用チップ１０の構成を示す上面図である。図に示すように１本の流路１０３を基板上で蛇行させることにより、反応領域１０６を二次元に配置でき、１つの装置でより多くのプローブとの反応を行うことができる。

実施の形態２．
本発明の実施の形態２による核酸検出用チップ１０は、実施の形態１と同様に、２枚の透明基板１０１，１０２を貼りあせて構成されている。図６は、実施の形態２による核酸検出用チップ１０を形成する透明基板１０１の構成を示す斜視図である。図に示すように、透明基板１０１には、流路１０３の一部となる溝１０７が形成されている。溝１０７の検体の流れる方向に垂直な断面の形状は矩形である。透明基板１０２にも透明基板１０１と同様に、流路１０３の一部となる溝１０７が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって四角形の流路１０３が形成される。なお、図６では、リザーバ１０４，１０５を形成する部分（流路１０３の端部）については図示を省略している。透明基板１０１，１０２がガラス基板の場合には、溝１０７は例えばエッチングまたはサンドブラスト法によって形成することができる。

また、図７は、実施の形態２による核酸検出用チップ１０の流路１０３の構成を説明する図である。図７（Ａ）は、図１（Ａ）に示すＡ方向から流路１０３見た図、図７（Ｂ）は、核酸検出用チップ１０の上面から流路１０３を見た図である。
図に示すように、実施の形態２では、反応領域１０６の形成位置が実施の形態１と異なっている。反応領域１０６は、流路１０３の内壁の互いに対向する第１の面（第１の部分）または第２の面（第２の部分）に形成されている。ここでは、第１の面が透明基板１０１の溝１０７の底面、第２の面が透明基板１０２の溝１０７の底面である。図７に示すように、第１の面に形成された反応領域１０６ｂと第２の面に形成された反応領域１０６ａは、流路１０３を上面から見たときに互いに重複しないように、かつ隣り合う反応領域１０６ａと１０６ｂは隙間なく配置されるように、交互に配置されている。反応領域１０６ａ，１０６ｂは、例えば検体の流れる方向の幅を２００μｍとすることができる。
溝１０７へプローブを塗布する方法には、実施の形態１と同様に、ピンスポッターを使う方法や液滴吐出ヘッドを使う方法などがある。

このように実施の形態２によれば、反応領域１０６ａ，１０６ｂ間の距離を十分に確保しつつ、流路１０３内により多くの反応領域１０６ａ，１０６ｂを形成することができるので、各々の反応領域１０６ａ，１０６ｂに異なるプローブを塗布しても、反応領域間のプローブのコンタミネーションを防止し、さらに反応効率の向上も図ることができる。

実施の形態２では、流路１０３の検体の流れる方向に垂直な断面の形状を矩形とし、流路１０３の内壁の向かい合った第１の面（第１の部分）と第２の面（第２の部分）に反応領域１０６を形成しているが、反応領域１０６間の距離を十分に確保できる形状であればこの形態に限られない。例えば、流路１０３の検体の流れる方向に垂直な断面の形状が六角形や八角形等の多角形であってもよく、例えば六角形の場合には内壁の隣り合う１面あるいは２面を第１の部分とし、それらの面と向かい合う面を第２の部分とすることができる。また、断面の形状が円の場合には１つの直径を挟む２つの部分を第１の部分と第２の部分とすることができる。

実施の形態２による核酸検出用チップ１０を用いてターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理を行う際には、基本的に実施の形態１による核酸検出用チップ１０を用いる場合と同様の手順で行うことができる。ただし、ハイブリダイゼーション反応の検出処理については、実施の形態１と異なり、蛍光標識剤を用いた検出方法を用いる方が望ましい。上述したように、蛍光標識剤を用いる方法では、蛍光標識剤がターゲットに結合しているが、化学発光物質を用いる方法は、ターゲットに結合している酵素が触媒となって、発光物質が生成される。このため、化学発光物質を用いた方法では、生成された発光物質が流路１０３内を移動しやすく、反応領域が近接している場合は、測定精度が低下する恐れがある。一方、蛍光標識剤を用いる方法では、発光物質が混ざってしまう問題がない。実施の形態１に比べると、実施の形態２による核酸検出用チップ１０では、反応領域１０６ａ，ｂ間の距離が小さいため、発光物質が移動する恐れの無い蛍光標識剤による方法を用いる方が望ましい。

なお、発光物質の測定はＣＣＤカメラ等を用いて行う。この際、第１の面に形成された反応領域１０６ｂにおける結果は透明基板１０１の外側から、第２の面に形成された反応領域１０６ａにおける結果は透明基板１０２の外側から測定してもよいが、流路１０３の深さ（第１の面と第２の面の距離）を小さくすることにより、フォーカスをずらすことなく両方の面を１回で測定することができる。

図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出用チップの概略構成を示す斜視図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。 本発明の実施の形態１による透明基板の構成を示す斜視図である。 図３（Ａ），（Ｂ）は、溝へのプローブの塗布を説明する図である。 本発明の実施の形態１による核酸検出用チップを用いた、ターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション処理を説明する図である。 本発明の変形例による核酸検出用チップの構成を示す上面図である。 本発明の実施の形態２による透明基板の構成を示す斜視図である。 本発明の実施の形態２による核酸検出用チップの流路の構成を説明する図である。

符号の説明

１０ 核酸検出用チップ、１０１，１０２ 透明基板、１０３ 流路、１０４，１０５ リザーバ、１０６，１０６ａ，１０６ｂ 反応領域、１０７ 溝、１０８ チューブ、１０９ シリンジポンプ

Claims (5)

1. 流路内に検体を流して反応を行う生体物質検出用チップであって、
   溝が形成された第１の基板と、
   溝が形成された第２の基板と、
   前記第１の基板と前記第２の基板とを貼り合わせ、前記第１の基板上の溝と前記第２の基板上の溝とで形成される直線状の流路と、
   前記第１の基板上の溝および前記第２の基板上の溝に形成され、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブが固定された領域である反応領域と、
   を含み、
   前記反応領域は、前記第１の基板上の溝および前記第２の基板上の溝に、前記流路の検体が流れる方向に間隔をおいて一列に形成されており、かつ、前記第１の基板上の溝に形成された前記反応領域と前記第２の基板上の溝に形成された前記反応領域とが交互に配置されている、
   生体物質検出用チップ。
2. 前記流路の前記検体の流れる方向に垂直な断面の形状は、円形または楕円形である、
   請求項１に記載の生体物質検出用チップ。
3. 前記流路は透明基板で形成されている、
   請求項１または請求項２に記載の生体物質検出用チップ。
4. 流路に検体を流して、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブが固定された前記流路内の領域である反応領域において反応を行う生体物質検出用チップの製造方法であって、
   第１の基板および第２の基板に、前記流路の一部となる溝を形成する工程と、
   前記第１の基板上の溝および前記第２の基板上の溝に、前記検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブを塗布する工程と、
   前記第１の基板と前記第２の基板とを貼り合わせて、前記第１の基板上の溝と前記第２の基板上の溝とで直線状の前記流路を形成する工程と、
   を含み、
   前記プローブを塗布する工程は、前記流路を形成した場合に、前記第１の基板上の溝に形成された前記反応領域と前記第２の基板上の溝に形成された前記反応領域とが交互に配置されるように、前記検体の流れる方向に間隔をおいて一列に前記プローブを塗布する、
   生体物質検出用チップの製造方法。
5. 前記プローブを塗布する工程は、非接触で液滴を吐出する手段を用いて前記プローブを含む溶液を塗布する、
   請求項４に記載の生体物質検出用チップの製造方法。

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