JP5088494B2

JP5088494B2 - 生体物質検出方法

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Publication number: JP5088494B2
Application number: JP2008121426A
Authority: JP
Inventors: 富美男 ▲高▼城
Original assignee: Seiko Epson Corp
Current assignee: Seiko Epson Corp
Priority date: 2008-05-07
Filing date: 2008-05-07
Publication date: 2012-12-05
Anticipated expiration: 2028-05-07
Also published as: JP2009270923A

Description

本発明は、特定のＤＮＡやタンパク質などの生体物質を検出するための、生体物質検出方法に関するものである。

ガラス基板等に微細流路が設けられたマイクロ流体チップを使用して、化学分析や化学合成、あるいはバイオ関連の分析などを行う方法が注目されている。マイクロ流体チップは、マイクロTotal Analytical System (マイクロＴＡＳ)や、Lab-on-a-chip等とも呼ばれ、従来の装置に比較して試料や試薬の必要量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ないなどのメリットがあり、医療診断、環境や食品のオンサイト分析、医薬品や化学品などの生産等、広い分野での利用が期待されている。試薬の量が少なくてよいことから、検査のコストを下げることが可能となり、また、試料および試薬の量が少ないことにより、反応時間も大幅に短縮されて検査の効率化が図れる。特に、医療診断に使用する場合には、試料となる血液など検体を少なくすることができるため、患者の負担を軽減できるというメリットもある。

マイクロ流体チップは、ＤＮＡマイクロアレイとして使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイは、基板上に固定化されたプローブ（合成オリゴＤＮＡやｃＤＮＡなど）と検体中の遺伝子とを反応（ハイブリダイゼーション）させることにより、目標の遺伝子の有無を検出する。例えば、特許文献１には、多孔板の孔の中に多孔性の吸着性領域を設けてそこにプローブを固定し、ターゲットを含む溶液がプローブと接触しながら循環するための流路を備えた生化学解析用ユニット構造体が提案されている。また、特許文献２には、生体物質がゲル中の気孔に捕集されてカプセル化されたスポットがチップ基板上に固定されたバイオチップが開示されている。
特開２００４−３６１３１６号公報特表２００５−５３９２１５号公報

しかし、特許文献１や２に記載された従来の方法では、流路中でプローブとターゲット遺伝子が接触する機会が限られ、ハイブリダイゼーション反応の効率が十分とはいえなかった。また、反応処理後の検出工程において、検出感度の高い化学発光物質を用いた方法を用いて検出を行おうとすると、吸着性領域やスポットに化学発光基質を接触させる際に発光物質が拡散してしまい、取得した画像データの解析精度が低くなるという問題があった。

そこで、本発明の目的は、少ない反応液で効率良く生体物質を検出すると共に、生体物質の検出精度を高めることが可能な生体物質検出方法を得ることである。

本発明に係る生体物質検出方法は、検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブが固定された複数の反応領域を有する反応チャンバーを用いて行う生体物質検出方法であって、前記検体に含まれる特定の生体物質と、前記プローブとを結合させる工程と、前記プローブに結合した前記生体物質に酵素を結合させる工程と、前記反応チャンバー内に親水性の高分子と、前記プローブと結合した前記生体物質を酵素反応を用いて検出するための基質を含む反応液を充填する工程と、前記親水性の高分子をゲル化する工程と、前記酵素反応により、光学的に検出可能な物質を生成させる工程と、各反応領域に対応して生成された前記光学的に検出可能な物質による発光強度を測定する工程と、を備えたものである。

本発明によれば、プローブが固定された複数の反応領域を有するチャンバー内を用いて、生体物質検出反応を行うことにより、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。また、酵素反応に用いる基質を含む反応液をゲル化することにより、生成された光学的に検出可能な物質の拡散が抑制されて反応領域の近傍に集中するため、検出感度が高まるとともに、隣接する反応領域で生成された物質との混合が防げるため、検出精度を高めることができる。

前記親水性の高分子をゲル化する工程では、紫外線の照射により前記親水性の高分子をゲル化するようにしてもよい。
この場合、前記親水性の高分子は、例えばポリビニルアルコールを含むものとすることができる。

また、前記親水性の高分子をゲル化する工程では、加温により前記親水性の高分子をゲル化するようにしてもよい。
この場合、前記親水性の高分子は、例えばポリイソプロピルアクリルアミドを含むものとすることができる。

前記反応チャンバーは、前記検体の流れる方向に間隔をおいて一列に形成された複数の前記反応領域を備えた流路を有することが望ましい。
これにより、少ない反応液で短時間での効率良い検出を行うことができる。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出用チップ（反応チャンバー）１０の概略構成を示す斜視図、図１（Ｂ）は、図１（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。図に示すように、核酸検出用チップ１０は、透明基板１０１，１０２、流路１０３、リザーバ１０４，１０５を備えている。また、流路１０３の内壁には、複数の反応領域１０６が形成されている。

図１に示すように、核酸検出用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。透明基板１０１，１０２それぞれに、流路１０３の一部となる溝が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって、立体的な流路１０３が形成される。なお、透明基板１０１，１０２は例えばガラスにより形成することができる。

流路１０３は、検体の流れる方向（図中矢印Ｆの方向）に垂直な断面の形状が円形に形成されており、ここでは、直径が１００μｍである。なお、断面の形状は、楕円形など円形以外の形状であってもよい。

反応領域１０６には、プローブが塗布されている。反応領域１０６は、流路１０３の内壁面の全周に亘って形成されており、このためプローブとターゲットが広い面積で接することが可能となり、反応効率の向上が図れる。反応領域１０６は、例えば検体の流れる方向の幅を２００μｍ、隣り合う反応領域１０６と反応領域１０６の間隔を２００μｍとすることができる。

プローブには、例えば血液、尿、唾液、髄液のような検体試料に含まれる標的物質（ターゲット）を捕捉し得る物質を用いることができる。例えば、ターゲットがＤＮＡやＲＮＡのような核酸である場合には、プローブとしては、これらの核酸とハイブリダイゼーション（相補的に結合）する核酸やヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）等を用いることができる。このような核酸としては、例えばｃＤＮＡやＰＣＲ産物等が用いられる。

なお、ターゲットは核酸に限られず、例えば特定のタンパク質であってもよい。この場合には、プローブとしては、このタンパク質を特異的に捕捉（例えば、吸着、結合等）するもの等が用いられる。具体的には、抗原、抗体、レセプター、酵素等のタンパク質、ペプチド（オリゴペプチド）等である。

本実施形態では、各々の反応領域１０６には、それぞれ異なる１種類のプローブが固定されている。これにより、１度に複数種類のターゲットの検出が可能である。

次に、本実施形態による核酸検出用チップ１０の製造方法について説明する。
上述したように、核酸検出用チップ１０は、２枚の透明基板１０１，１０２を貼り合わせて構成されている。図２は、透明基板１０１の構成を示す斜視図である。図に示すように、透明基板１０１には、流路１０３の一部となる溝１０７が形成されている。溝１０７の検体の流れる方向に垂直な断面の形状は半円形である。透明基板１０２にも透明基板１０１と同様に、流路１０３の一部となる溝１０７が形成されており、透明基板１０１，１０２を貼り合わせることによって円形の流路１０３が形成される。なお、図２では、リザーバ１０４，１０５を形成する部分（流路１０３の端部）については図示を省略している。透明基板１０１，１０２がガラス基板の場合には、溝１０７は例えばエッチングまたはサンドブラスト法によって形成することができる。

次に、溝１０７にプローブを塗布し、反応領域１０６を形成する。溝１０７へプローブを塗布する方法には、ピンスポッターを使う方法や非接触で液滴を吐出する手段を使う方法などがある。しかし、本実施形態のように、溝１０７の幅が狭く、また溝１０７の底が平坦でない場合には、ピンスポッターよりも非接触で液滴を吐出する手段を用いて行う方がよい。図３（Ａ），（Ｂ）は、溝１０７へのプローブの塗布を説明する図である。図３（Ａ）に示すように、液滴吐出ヘッド（図示せず）を用いて、溝１０７上の反応領域１０６を形成する領域に、プローブを含む液滴Ｐを吐出する。

図３（Ｂ）は、プローブを含む液滴Ｐが吐出された溝１０７の表面を示す図である。溝１０７にプローブを含む液体を塗布すると、表面張力により溝１０７の長さ方向及び幅方向に液体が濡れ広がるが、本実施形態のように溝１０７の断面が半円形の場合、塗布したプローブの形状や厚みを均一にすることができ、反応領域１０６全体のプローブの密度を均一にできる。

透明基板１０１及び１０２に形成された溝１０７には、両基板を貼り合わせた際に対向する領域に同じ種類のプローブが配置されるようにプローブを塗布する。

透明基板１０１，１０２の溝１０７にプローブを塗布し、反応領域１０６を形成したら、透明基板１０１，１０２を接着等のプローブを分解させない方法を用いて貼り合わせることによって、核酸検出用チップ１０が形成される。透明基板１０１及び１０２の溝１０７には、対向する位置に同じ種類のプローブが塗布されているので、反応領域１０６は流路１０３の内壁面の全周に亘って形成される。

本実施形態による核酸検出用チップ１０を用いて、ターゲット（核酸）とプローブとのハイブリダイゼーション処理を行う際には、図４に示すように、リザーバ１０４をシリコンゴム製のチューブ１０８を介してシリンジポンプ１０９に接続し、リザーバ１０５へ検体液を供給する。

検体液は、例えば血液、尿、唾液、髄液のような生体サンプルから抽出したＤＮＡやＲＮＡを含む。必要に応じて、ＰＣＲ法やＩＶＴ法を用いて、ターゲットとなる核酸の増幅処理を行っておく。

検体液をリザーバ１０５に供給したら、シリンジポンプ１０９を駆動して検体液を流路１０３に導入する。この時の流速は１μｌ／ｍｉｎ程度が適切である。さらに、シリンジポンプ１０９を駆動して所定の周期で検体液を流路１０３内で往復させる。

例えば、流路１０３の内径を１００μｍ、全体の長さを２００ｍｍとした場合、流路１０３全体を充填するために必要な検体液の量は約１．６μＬである。本実施形態のようにシリンジポンプ１０９を駆動して検体液を流路１０３内で往復させることにより、流路１０３内の全ての反応領域１０６と検体液が均等に接触し、均一なハイブリダイゼーション反応が可能となる。また、流路１０３内で常に検体液を往復させることにより、プローブにより多くのターゲットが接するようになり、反応効率が向上する。

なお、流路１０３に検体液を供給する前に、必要に応じて流路１０３内にブロッキング液を充填し、プローブが固定化されていない領域をブロッキングしておいてもよい。

所定時間のハイブリダイゼーション反応を行ったら、シリンジポンプ１０９を用いて流路１０３内より検体液を排出する。必要に応じて流路１０３内の洗浄を行った後、ハイブリダイゼーション反応の検出処理を行う。

本実施形態では、化学発光物質を用いた検出を行う。一般にＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応の測定には蛍光標識剤を用いた検出方法を用いることも多いが、蛍光強度がターゲット核酸に結合している蛍光標識剤の量に依存するのに対し、化学発光物質を用いた検出方法では、ターゲット核酸に結合した酵素が触媒となって生成される発光物質の量によって発光強度が調整できるので、化学発光物質を用いた方法のほうが検出感度が高い。

化学発光とは、化学反応により分子が励起されて励起状態になり、そこから基底状態に戻るときに放出される光である。代表的な発光系として、ルミノール系とジオキタセン系がある。ルミノール系では、ルミノールがペルオキシダーゼを触媒として過酸化水素と反応し、中間体を経て３−アミノフタレイトジアニオンが生成され、同時に化学発光がおきる。ジオキタセン系では、化学発光基質であるＡＭＰＰＤ（登録商標）がアルカリフォスファターゼと反応し、アダマンタノンと化学発光をおこす物質を生成する。それぞれ、キット化された試薬が数多く販売されている。

本実施形態では、流路１０３内に化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）とストレプトアビジンの複合体液（濃度１０μｇ／ｍｌ）を充填し、反応領域１０６に捕捉されている予めビオチン標識したターゲット核酸と化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）を結合させる。次に、流路１０３内に洗浄液を流して、特異的に結合していないＨＲＰを除去する。

次に、流路１０３内に、化学発光基質液とポリビニルアルコール−スチルピリジウム（ＰＶＡ−ＳｂＱ）の４％水溶液を１：１で混合したものを充填する。化学発光基質液はプローブと反応した前記生体物質を検出するための反応液であり、ルミノールと過酸化水素が含まれる。なお、ルミノール、過酸化水素水と共にエンハンサーを含む化学発光基質液（ピアスケミカル社、Supersignal Chemiluminescent Substrate等）を用いてもよい。ＰＶＡ−ＳｂＱは、親水性の高分子であり、一定条件で紫外線を照射することによりゲル化する性質を有する。

シリンジポンプ１０９を駆動して化学発光基質液とＰＶＡ−ＳｂＱの混合液を流路１０３内に充填したら、シリンジポンプ１０９を停止し、ＵＶランプを用いて、流路１０３に１００ｍＪ〜２００ｍＪで１秒間紫外線を照射する。紫外線を照射することにより、流路１０３内のＰＶＡ−ＳｂＱがゲル化する。

さらに、ＰＶＡ−ＳｂＱがゲル化した状態で、４０℃で２０分間、ＨＲＰをルミノール及び過酸化水素と反応させ、発光物質を産出させる。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。また、本実施例においては、プローブが内壁の全周に固定されているため、発光物質が反応領域内に高濃度に産出され、高感度の測定が期待できる。化学発光物質が産出されたら、ＣＣＤカメラ等を用いて、各反応領域１０６に対応する発光強度を測定する。

ここで、図５（Ａ）に示すように、産出された化学発光物質は流路１０３内の溶液が液状であれば流路１０３内を拡散してしまう。しかし本実施形態では、図５（Ｂ）に示すように流路１０３内の溶液がゲル化しているため、生成された化学発光物質の拡散が抑制されて反応領域１０６の近傍に集中する。このため検出感度が高くなる。また、隣接する反応領域１０６で生成された物質との混合が防げるため、検出精度を高めることができる。

なお、化学発光物質を用いた検出に用いる酵素や基質等は、上記に示すものに限られない。ここでは、酵素としてＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）を用いているが、他にアルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼなどを用いることができる。これらの酵素に、化学発光基質、色素基質、あるいは蛍光基質を接触させると、それぞれ、化学発光、発色、蛍光が検出される。化学発光基質としては、酵素がアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼである場合には、それぞれジオキセタン、ルミノール、ルシフェリンを用いることができる。

また、化学発光基質液と混合する高分子はＰＶＡ−ＳｂＱに限られず、紫外線照射によりゲル化する親水性の分子であれば代用することができる。

以上のように、実施の形態１によれば、複数の反応領域１０６を備えた流路内１０３でターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、検出には化学発光物質を用いるようにしたので、少ない検体液で効率よく反応を行い、検出感度も高めることができる。さらに、検出工程では、流路１０３内の溶液をゲル化して化学発光物質を生成するようにしたため、生成された化学発光物質の拡散が抑制されて検出感度がさらに高くなる。また、隣接する反応領域１０６で生成された物質との混合が防げるため、検出精度を高めることができる。

なお、反応チャンバーの形態は、図１に示すものに限られない。例えば、図６に示すように１本の流路１０３を基板上で蛇行させることにより、反応領域１０６を二次元に配置したものでもよい。また、従来の一般的なＤＮＡマイクロアレイのように、反応領域が２次元に配置された反応チャンバーであってもよい。

実施の形態２．
実施の形態２でも実施の形態１と同様に、ハイブリダイゼーション反応の後、化学発光物質を用いた検出を行う。

まず実施の形態１と同様に、流路１０３内に化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）とストレプトアビジンの複合体液（濃度１０μｇ／ｍｌ）を充填し、反応領域１０６に捕捉されている予めビオチン標識したターゲット核酸と化学発光標識用酵素（ＨＲＰ）を結合させる。次に、流路１０３内に洗浄液を流して、特異的に結合していないＨＲＰを除去する。

次に、流路１０３内に、化学発光基質液とポリイソプロピルアクリルアミド（ＰＮＩＰＡＭ）の５％水溶液を１：１で混合したものを充填する。化学発光基質液はプローブと反応した前記生体物質を検出するための反応液であり、ルミノールと過酸化水素が含まれる。なお、ルミノール、過酸化水素水と共にエンハンサーを含む化学発光基質液（ピアスケミカル社、Supersignal Chemiluminescent Substrate等）を用いてもよい。ＰＮＩＰＡＭは、親水性の感熱高分子であり、相転移温度で急激に体積収縮が起こりゲル化する性質を有する。なお、ＰＮＩＰＡＭの相転移温度は３７℃であり、酵素が活性化する温度領域に一致するため都合がよい。

シリンジポンプ１０９を駆動して化学発光基質液との混合液を流路１０３内に充填したら、シリンジポンプ１０９を停止し、温度制御用ヒータを用いて、流路１０３を４０℃に加熱する。４０℃に加熱することにより、流路１０３内のＰＮＩＰＡＭがゲル化する。

さらに、ＰＮＩＰＡＭがゲル化した状態で、４０℃で２０分間、ＨＲＰをルミノール及び過酸化水素と反応させ、発光物質を産出させる。発光物質の産出量はルミノールと過酸化水素を増やすことにより増加させることができるので、検出感度を高めることが容易である。また、本実施例においては、プローブが内壁の全周に固定されているため、発光物質が反応領域内に高濃度に産出され、高感度の測定が期待できる。化学発光物質が産出されたら、ＣＣＤカメラ等を用いて、各反応領域１０６に対応する発光強度を測定する。

また、化学発光基質液と混合する高分子はＰＮＩＰＡＭに限られず、所定温度でゲル化する親水性の分子であれば代用することができる。

以上のように、実施の形態２によれば、複数の反応領域１０６を備えた流路内１０３でターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、検出には化学発光物質を用いるようにしたので、少ない検体液で効率よく反応を行い、検出感度も高めることができる。さらに、検出工程では、流路１０３内の溶液をゲル化して化学発光物質を生成するようにしたため、生成された化学発光物質の拡散が抑制されて検出感度がさらに高くなる。また、隣接する反応領域１０６で生成された物質との混合が防げるため、検出精度を高めることができる。

図１（Ａ）は、本発明の実施の形態１による核酸検出用チップの概略構成を示す斜視図、図１（Ｂ）は図１（Ａ）のＢ−Ｂ断面図である。本発明の実施の形態１による透明基板の構成を示す斜視図である。図３（Ａ），（Ｂ）は、溝へのプローブの塗布を説明する図である。本発明の実施の形態１による核酸検出用チップを用いた、ターゲットとプローブとのハイブリダイゼーション処理を説明する図である。本発明による生成された化学発光物質の拡散の様子を説明する図である。本発明による核酸検出用チップの他の構成例を示す上面図である。

符号の説明

１０核酸検出用チップ、１０１，１０２透明基板、１０３流路、１０４，１０５リザーバ、１０６，１０６ａ，１０６ｂ反応領域、１０７溝、１０８チューブ、１０９シリンジポンプ

Claims

検体中の特定の生体物質を検出するためのプローブが固定された複数の反応領域を有する反応チャンバーを用いて行う生体物質検出方法であって、
前記検体に含まれる特定の生体物質と、前記プローブとを結合させる工程と、
前記プローブに結合した前記生体物質に酵素を結合させる工程と、
前記反応チャンバー内に親水性の高分子と、前記プローブと結合した前記生体物質を酵素反応を用いて検出するための基質を含む反応液を充填する工程と、
前記親水性の高分子をゲル化する工程と、
前記酵素反応により、光学的に検出可能な物質を生成させる工程と、
各反応領域に対応して生成された前記光学的に検出可能な物質による発光強度を測定する工程と、を備えた生体物質検出方法。
前記親水性の高分子をゲル化する工程では、
紫外線の照射により前記親水性の高分子をゲル化することを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出方法。
前記親水性の高分子をゲル化する工程では、
加温により前記親水性の高分子をゲル化することを特徴とする請求項１に記載の生体物質検出方法。
前記親水性の高分子は、ポリビニルアルコールを含むことを特徴とする請求項２に記載の生体物質検出方法。
前記親水性の高分子は、ポリイソプロピルアクリルアミドを含むことを特徴とする請求項３に記載の生体物質検出方法。
前記反応チャンバーは、
前記検体の流れる方向に間隔をおいて一列に形成された複数の前記反応領域を備えた流路を有することを特徴とする請求項１から請求項５のいずれかに記載の生体物質検出方法。