<Desc/Clms Page number 1>
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Messanordnung sowie ein Verfahren unter Verwendung einer Messanordnung zur Detektion einer DNA-Sequenz mittels Impedanzspektroskopie, welche Messanordnung eine Goldelektrode, deren Oberfläche von einem Self Assembled Monolayer (SAM) aus identen Molekülen bedeckt ist, die an der von der Elektrode abgewandten Seite mit Oligonukleotiden, welche zu der zu detektierenden DNA-Sequenz komplementär sind und mit dieser hybridisieren, kovalent gekoppelt sind, ein den Elektrolyten bildender Hybridisierungspuffer, eine Referenzelektrode, gegebenenfalls eine Gegenelektrode und Mittel zum Anlegen einer Gleich- und Wechselspannungskomponente, zum Einstellen einer Messfrequenz und zur Impedanzmessung des Systems Arbeitselektrode/Elektrolyt umfasst.
Die spezifische, rasche und möglichst kostengünstige Detektion bestimmter DNA-Sequenzen in biologischen Proben ist ein wichtiges Anliegen in vielen Bereichen der modernen Diagnostik und Analytik.
Ein Standardverfahren ist die selektive Amplifizierung eines für z. B. einen Mikroorganismus spezifischen Teilstücks der genomischen DNA mittels PCR-Reaktion, anschliessender Gelelektrophorese und optischer Detektion der aufgetrennten Fragmente nach dem Färben mit Ethidiumbromid. Die Detektion erfolgt hierbei über die bekannte Fragmentgrösse.
Eine genauere, ebenfalls übliche Vorgangsweise ist das sogenannte Southern Blotting Verfahren, bei dem nach der PCR die im Gel aufgetrennte DNA auf eine spezielle Membran transferiert wird. Die Detektion erfolgt durch Hybridisierung mit einer Sonde, die z. B. mit einem Fluorophor oder einem Enzym markiert ist, so dass eine optische Auswertung vorgenommen werden kann.
Ein apparativ aufwendigeres Verfahren ist die sogenannte Realtime-PCR , bei der mittels Fluoreszenz die Amplifizierung des spezifisch vermehrten DNA-Fragments online verfolgt werden kann.
Mit Ausnahme der Gelelektrophorese ist den genannten Nachweisverfahren gemeinsam, dass die einwandfreie Identifizierung durch Detektion über ein markiertes Oligonukleotid, also indirekt, erfolgt. Eine direkte Detektion hätte jedoch Vorteile im Hinblick auf Einfachheit, Materialverbrauch und damit Kosten, da die markierten Sonden zumeist den teuersten Bestandteil darstellen. Die Gelelektrophorese verlangt hingegen das Arbeiten mit krebserregendem Ethidiumbromid. Zudem sind mit Ausnahme der Realtime-PCR alle genannten Verfahren äusserst zeitraubend.
Sensoren sind eine Gruppe von Vorrichtungen, die einen einfachen Umgang mit komplexen Proben ermöglichen sollen. Sie bestehen aus einem Transducer, auf dem oder allgemein in dessen unmittelbarer Nähe sich eine sensitive Schicht befindet. Bindet oder tritt der zu detektierende Stoff in unmittelbare Wechselwirkung mit dieser sensitiven Schicht, kommt es zu einer Änderung, die über den Transducer in ein leicht messbares, z. B. optisches oder elektrisches Signal umgewandelt wird. Die Gruppe der Biosensoren bedient sich bei der Detektion der Interaktion von Biomolekülen.
Im Bereich der Biosensoren werden jene mit optischer Detektion am häufigsten eingesetzt. Ein bekanntes Beispiel hierfür sind die auf Fluoreszenz basierenden Microarrays. Die Detektion der Fluoreszenz benötigt jedoch ein aufwendiges und daher teures Mess- und Auswertesystem.
Elektrochemische Nachweissysteme werden generell sowohl als sensitiver als auch kostengünstiger eingeschätzt. Bekannte Ansätze, um möglichst spezifisch und sensitiv DNA mit Hilfe eines elektrochemischen Sensors zu detektieren, beruhen auf der Verwendung von Elektroden, die auf Quecksilber aufbauen. Nachteilig hierbei sind jedoch die Toxizität des verwendeten Metalls und das daraus folgende Entsorgungsproblem. Ein weiterer, oft benützter Ansatz verwendet elektrochemisch messbare Interkalatoren, welche eine Spezifität entweder für den
<Desc/Clms Page number 2>
hybridisierten Doppelstrang oder den nicht hybridisierten Einzelstrang der zu detektierenden DNA aufweisen müssen. Diese Substanzen sind jedoch ebenfalls oftmals toxisch und weisen meist mangelnde Selektivität und Reproduzierbarkeit auf.
Andere Beispiele inkludieren DNA-Sonden, die mit verschiedenen Ferrocenen oder allgemeiner electron transfer moieties markiert sind (z. B. WO 01/06016 A). Bei diesen Sonden besteht jedoch die Notwendigkeit, modifizierte DNA-Stränge herzustellen.
Unter jenen elektrochemischen Techniken, die zumindest potentiell einen spezifischen DNAHybridisierungsnachweis ohne zusätzlich zugesetzte Reagenzien und ohne markierte Sonden, d. h. einen direkten Nachweis ermöglichen, befindet sich auch die Gruppe der kapazitiven Sensoren. Solche bestehen primär aus einer Elektrodenoberfläche, die mit einer dünnen, isolierenden Schicht möglichst lückenfrei besetzt ist. Auf dieser sind jene Elemente immobilisiert, die das nachzuweisende Biomolekül bzw. die DNA-Sequenz binden sollen.
Zwei verschiedene Elektrodentypen werden im Bereich der kapazitiven Biosensoren üblicherweise verwendet (Berggren et al., Electroanalysis 13/3 (2002), S. 173-180): Interdigitated Elektroden messen eine Kapazitätsveränderung zwischen zwei, z. B. metallischen, Leitern, die extrem nahe nebeneinander, aber zuverlässig isoliert voneinander und mit Bindungsstellen für den Analyten zwischen den Leiterbahnen angeordnet sind. Es gilt das bekannte Modell des Plattenkondensators. Die Schwierigkeiten liegen bei diesem Typ in der Erzeugung einer kurzen und reproduzierbaren Distanz zwischen den beiden Leitern.
Die zweite Elektrodentyp beruht auf Verwendung nur einer einzelnen Arbeitselektrode und Evaluierung der Kapazität an der Elektroden/Lösung-Zwischenschicht. Das dazugehörige Messprinzip basiert auf der Theorie der elektrolytischen Doppelschicht, welche in Prinzip als aus zwei leitfähigen Medien bestehend angesehen werden kann, von denen eines von der Elektrode und das zweite vom Elektrolyten gebildet wird. Diese beiden Phasen sind durch die oben erwähnte isolierende Schicht voneinander getrennt. Veränderungen in dieser Schicht (z.B. durch die Bindung des Analyten bedingt) bewirken eine Veränderung im kapazitiven Messsignal. Die Grösse und damit die Messbarkeit des Signals hängt ebenso von der Art des Analyten wie von der Belegung mit diesem ab.
Wenn beispielsweise ein Fängermolekül an die isolierende Schicht gebunden wird und damit Wassermoleküle aus der Zwischenschicht (Phasengrenze isolierende Schicht /Elektrolyt) verdrängt werden, wird eine weitere Schicht gebildet. Diese entspricht einer weiteren Kapazität in Serie mit der ersten und führt somit zu einer Herabsetzung der Gesamtkapazität. Zum selben Effekt kommt es, wenn das Fängermolekül eine Affinität für ein Protein oder eine komplementäre DNA-Sequenz in der Lösung besitzt und dadurch eine Bindung desselben bzw. derselben erfolgt. In all diesen Fällen kommt es somit entsprechend der Theorie zu einer Verringerung der Gesamtkapazität. Ein einfaches System eines solchen Sensors ist beispielsweise in der DE 39 23 420 A beschrieben.
Bekannt ist ein auf einer Halbleiterelektrode basierender Sensor, wobei die Elektrode mit einer polymeren, relativ ungeordneten Schicht bedeckt ist, an die ein Antigen als Fängermolekül gekoppelt wurde (Sibai, A. et al., Sens. Act. B31 (1996), S. 125-130). Bei diesem Sensor wird als Reaktion auf die Zugabe von zu detektierendem Antigen eine Kapazitätserhöhung gemessen, welche auf der Möglichkeit des Einsickerns in die Polymerschicht und dort erfolgendem Ladungsaustausch und Ladungsdeponierung beruht.
Vagin et al. (Bioelectrochemistry 56 (2002), S. 91-93) beschreiben einen Sensor für den impedanzspektroskopischen Nachweis einer bestimmten DNA-Sequenz oder von Meerrettichperoxidase, bestehend aus einer Goldelektrode mit einem seit assembled Bilayer aus einem oberflächenaktiven Stoff, an den ein zur nachzuweisenden DNA-Sequenz komplementäres Oligonukleotid bzw. ein Meerrettichperoxidase-Antikörper gekoppelt wurde. Die Impedanzmessung
<Desc/Clms Page number 3>
erfolgte in einem Frequenzbereich von 1-10 kHz, wobei für beide Analyten unterschiedliche Messeffekte erzielt wurden.
Von Berggren et al. (Electroanalysis 11/3 (1999), S. 156-160) wird ein kapazitiver Sensor beschrieben, der aus einer Goldelektrode mit einer isolierenden Schicht aus Thiolen und darauf immobilisierter DNA aufgebaut ist. Die Messung erfolgt in einem Durchflusssystem, in welches das nachzuweisende, denaturierte DNA-Fragment zur Hybridisierung injiziert wird. Die Kapazität wird mittels einer plötzlichen Potentialänderung evaluiert, wobei das System aus dem Gleichgewichtszustand gebracht und der Abfall des Stroms im Zuge der Wiedereinstellung des Gleichgewichts gemessen wird. Neben den aus der Messung in einem Durchflusssystem resultierenden Nachteilen ist auch die Reproduzierbarkeit dieses Systems relativ gering.
In der DE 198 07 338 A und der WO 99/42827 A ist ein kapazitiver Sensor sowie eine Messanordnung für die Detektion der Hybridisierung von Nucleotidsequenzen beschrieben. Als Substrat für den Sensor dienen beispielsweise Goldelektroden, die mit einem dichten Self Assembled Monolayer (SAM) beschichtet werden, auf welchem danach Oligonukleotide immobilisiert werden. Der Nachweis der Hybridisierung mit einem komplementären Oligonukleotid erfolgt über eine Impedanzmessung, die bei einer Frequenz von 20 Hz durchgeführt wird. Bei erfolgreicher Hybridisierung kommt es hierbei als Signaländerung zu einer Kapazitätserniedrigung.
Alle oben genannten bekannten Vorrichtungen wurden bislang nicht zum Nachweis von Oligonukleotiden aus realen Proben eingesetzt. Keinem dieser Sensoren gelang es, spezifisch Produkte einer PCR ( polymerase chain reaction ) über eine Hybridisierung zu detektieren.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, eine Messanordnung und ein Verfahren bereitzustellen, die eine rasche, spezifische und kostengünstige Detektion von DNA-Sequenzen, insbesondere solcher biologischer Proben, ermöglichen. Der Nachweis der DNA-Sequenzen soll nur einen geringen Arbeitsaufwand erfordern und die Verwendung gefährlicher oder gesundheitsschädlicher Stoffe vermeiden. Insbesondere soll zur Verringerung des Arbeitsaufwands ein Weglassen des Denaturierungsschritts ermöglicht werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss durch eine Messanordnung der eingangs genannten Art gelöst, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass die lonenstärke des Elektrolyten in einem Bereich von 0,005 bis 0,15 mol/I ist und das Mittel zum Einstellen der Messfrequenz derart gestaltet ist, dass eine Messfrequenz zwischen 17 kHz und 24 kHz einstellbar ist.
Vorteilhafte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Messanordnung sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 9 angegeben.
Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass das Verhalten eines Sensors, dessen prinzipieller Aufbau dem eines kapazitiven Sensors auf Basis einer Goldelektrode mit einem SAM entspricht, mit der Eigenschaft, dass der Sensor bei 20 Hz einen Phasenwinkel zwischen -86,5 und -90 aufweist, nicht mehr zur Gänze dem eines kapazitiven Sensors entspricht, sondern diesem nur mehr als verwandt zuzuordnen ist, wenn Komponenten der Messanordnung gegen- über herkömmlichen Systemen verändert eingesetzt werden.
So stellte sich heraus, dass eine erfolgreiche Detektion bei einer lonenstärke des Elektrolyten im Bereich von 0,005 bis 0,15 mol/I (eigentlich Waschbedingungen), vorzugsweise 0,01 bis 0,1 mol/I, insbesondere 0,024 mol/I, und einer Messfrequenz zwischen 17 und 24 kHz, vorzugsweise 18. 828 Hz, nicht in einer Erniedrigung der Kapazität (eigentlich Pseudokapazität ) sondern in einer Erhöhung dieser Messgrösse resultierte.
Das Modell der unabhängigen Layer, wie es allgemein der Funktionsweise eines kapazitiven Sensors entspricht, ist auf die Erfindung nicht anzuwenden. Dies zeigt sich sofort im Ansteigen
<Desc/Clms Page number 4>
der Kapazität als Resultat auf eine nachweisbare, spezifische Hybridisierung. Bei einem rein kapazitiv arbeitenden Sensor hätte das Messsignal zwingend in einer Kapazitätserniedrigung bestehen müssen (wenn auch möglicherweise sehr klein und dadurch eventuell nicht messbar).
Auch weicht der Äquivalentschaltkreis signifikant von dem eines rein kapazitiven Sensors ab: während rein kapazitive Sensoren durch einen Äquivalentschaltkreis aus einem Widerstand und einer Kapazität ausreichend charakterisiert sind, zeigt es sich bei der Erfindung als notwendig, die Kapazität durch ein Konstantes-Phasen-Element (CPE) zu ersetzen. Diese eigentlich rein rechnerische Grösse (Symbol Q) ist an sich nicht intuitiv, d. h. muss keinen real erklärbaren Hintergrund besitzen. Als prinzipielle Erklärung für die Existenz eines CPE werden allgemein Inhomogenitäten im System oder eine Dispersion eines Werts einer physikalischen Grösse angenommen.
Das erfindungsgemässe System ist ausreichend durch einen R-Q-Schaltkreis charakterisiert : RE/CE-Rsol-Q-WE RE : Referenzelektrode, z. B. Kalomel, Ag/AgCI CE : Gegenelektrode WE : Arbeitselektrode Rsol: ohmscher Widerstand des Elektrolyten Der Aufbau der in der erfindungsgemässen Messanordnung verwendeten Arbeitselektrode entspricht dem bekannter kapazitiver Sensoren. So wird eine Goldelektrode durch SelfAssembly mit einer Schicht aus isolierenden, also nicht leitenden Molekülen besetzt, die einen dichten Monolayer bilden (SAM).
Die in der Erfindung eingesetzten Goldelektroden sind dadurch charakterisiert, dass im Rohzustand zumindest diejenige Metallfläche, welche mit dem Elektrolyten in direkten Kontakt kommen kann, aus hochreinem Gold (über 99% Reinheit) besteht. Diese Fläche kann aus massivem Gold bestehen, das Gold kann aber ebenso in einer relativ dünnen Schicht auf isolierendem Material, wie z.B. Glas, Kunststoff oder Silikon, aufgebracht sein, auch mit einer oder mehreren Zwischenschichten, die nur als Haftvermittler zwischen dem isolierenden Material und dem Gold dienen, aber auch die Eigenschaften der Elektrode beeinflussen können. Analog wäre es denkbar, statt Gold andere Edelmetalle zu verwenden, z.B. Platin. Kompliziertere Ausführungen bezüglich Schichtaufbau und Geometrie der Elektrode sind ebenfalls möglich.
Auch besteht die Möglichkeit, mehrere Elektroden auf einem Chip zu vereinigen und so einen Elektrodenarray aufzubauen. Die Herstellungsverfahren sind z. B. aus der Elektronikindustrie, insbesondere der Dünnschichttechnik unter Verwendung von Evaporatoren und SputteringMaschinen, und aus der Photolithographie bekannt und Stand der Technik.
Als Self Assembled Monolayer (SAM) wird eine Schicht aus organischen oder anorganischen Molekülen bezeichnet, die nur ein Molekül Dicke aufweist ( Monolayer ) und aus gleichen oder wenigen Sorten ( self assembled mixed monolayer ), üblicherweise jedoch nicht mehr als zwei verschiedenen Molekülsorten, von ähnlichen Molekülen besteht, die sich durch laterale Wechselwirkungen zu einer relativ dichten Schicht anordnen. Solche Schichten lassen sich auf Goldoberflächen beispielsweise mit Hilfe von Molekülen herstellen, deren End- und/oder Kopfgruppen Schwefelatome besitzen (z. B. in Form von Thiolen, Sulfiden, Disulfiden und ähnlichem), die eine hohe Affinität für Gold aufweisen. Für die notwendigen lateralen Wechselwirkungen sorgen z. B. Kohlenwasserstoffketten unterschiedlicher Länge ((-CH2)n mit n=2 bis ca. 24).
Vorzugsweise ist der SAM aus Verbindungen der allgemeinen Formel HS-(CH2)n-X aufgebaut, wobei n = 8-24 und X eine funktionelle Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy-, Amino-, Hydroxy-, Aldehyd-, Keto- und Azo-Gruppe, ist. Es können auch andere funktionelle Gruppen in den verwendeten Molekülen vorkommen, die für den prinzipiellen Vorgang des Self Assembly nicht notwendig sind, sofern sie diesen nicht oder nur in geringem Masse ungünstig
<Desc/Clms Page number 5>
beeinflussen.
Das erfindungsgemässe Verfahren unter Verwendung einer Messanordnung der eingangs genannten Art ist dadurch gekennzeichnet, dass der Elektrolyt mit einer lonenstärke im Bereich von 0,005 bis 0,15 mol/I vorgelegt wird, die nachzuweisende DNA-Sequenz durch an sich bekannte Methoden aus einer Probe isoliert, amplifiziert und gegebenenfalls denaturiert wird, zum Elektrolyten zugegeben wird, und nach bei Raumtemperatur erfolgter Hybridisierung der Amplifikate mit den an der Arbeitselektrode immobilisierten Oligonukleotiden die Impedanzmessung bei einer Messfrequenz zwischen 17 kHz und 24 kHz durchgeführt wird. Eine statistisch eindeutige Erhöhung des Messsignals lässt hierbei auf ein Vorhandensein der nachzuweisenden DNA-Sequenz schliessen.
Der Grund für die Kapazitätserhöhung ist nicht völlig klar. Es wird jedoch vermutet, dass es durch die Hybridisierung zu einer Änderung des Platzbedarfs und damit zu einer Lageveränderung der nunmehrigen DNA-Doppelstränge kommt. Nachdem die immobilisierten Einzelstränge mit dem darunter liegenden SAM kovalent verknüpft sind, ist es nicht unlogisch, dass eine
Bewegung und Platzveränderung der DNA im Zuge der Hybridisierung auch zu einer Veränderung der Ordnung und der Konformation des SAM führt. Da das Modell der einzelnen unabhängigen Layer keine Gültigkeit besitzt, bezieht sich die Veränderung auf die Gesamtschicht.
Eine Konformationsänderung einiger/vieler Moleküle teilt sich dadurch auch den nicht unmittelbar von einem Ereignis betroffenen Molekülen mit und führt in der Gesamtheit zu einer Veränderung der Eigenschaften der gesamten Gruppe. Mögliche Beispiele einer Konformationsänderung könnten beispielsweise in einer Änderung der Dielektrizitätskonstante der betroffenen Schicht, in einer Änderung der Kristallstruktur des SAM oder der Gesamtschicht oder in einer Veränderung des Neigungswinkels der Thiole zu der Goldoberfläche und damit verbunden in einer Veränderung der Dicke des SAM bestehen.
Die Abhängigkeit der Struktur des SAM von Ereignissen auf molekularer Ebene ist gut dokumentiert. Diese Phänomene sind erwartungsgemäss von der lonenstärke abhängig. Aus der Praxis verschiedener elektrochemischer Messungen ist bekannt, dass auch praktisch defektfreie SAM durch verschiedene Puffer, verschiedene Pufferkonzentrationen oder allgemein verschiedene Anteile von sich in Lösung befindlichen Stoffen in ihren Eigenschaften, die z.B. durch Impedanzmessung zugänglich sind, verändert werden (Ekeroth et al., Anal. Chem. 73 (2001), S. 4463-4468). Dies ist auch in der Praxis ein Hindernis bei der Analyse von Proben mit schwankender Matrix, da der bzw. die gemessenen Parameter so gewählt werden muss bzw. müssen, dass diese durch die Schwankungen nicht gestört werden. Oftmals wird auch unspezifische Adsorption z.
B. von Proteinen für solche Effekte verantwortlich gemacht, was bei verschiedenen Puffern jedoch kaum der Fall sein kann. Im erfindungsgemässen Fall wird dieser sonst unerwünschte Effekt für die eigentliche Messung ausgenützt.
Prinzipiell könnte man auch die Möglichkeit einer Schädigung des Monolayers durch die Hybridisierung selbst in Betracht ziehen. Es wäre möglich, dass die Bindung zusätzlicher DNA die einzelnen Thiolmoleküle jeweils hydrophiler macht, die Permeation von Ionen durch den Layer dadurch vergleichsweise gefördert wird und so die Schicht weniger dicht wird. Als Folge verändert sich die Dielektrizitätskonstante des Gesamtlayers, ebenso lassen entstehende (Subnano-) Löcher die Kapazität ansteigen. Daten des Phasenwinkels bei niedrigen Frequenzen, welcher an sich sehr empfindlich auf eine Verletzung der Schicht reagiert, lassen hingegen auf keine Schädigung des Layers schliessen. Die Übergänge zum Effekt der Konformationsänderung bei gleichmässig verteilten Subnanolöchern sind jedoch fliessend.
Allgemein erfolgt der Nachweis der DNA-Sequenz erfindungsgemäss wie folgt: Goldelektroden werden durch Self-Assembly mit einer Schicht aus isolierenden, also nicht leitenden Molekülen, z. B. Thiolen, besetzt, welche einen dichten Monolayer (SAM) bilden. Diese Moleküle besitzen an ihrem, der Elektrodenoberfläche abgewandten Ende eine funktionelle Gruppe (z. B. eine
<Desc/Clms Page number 6>
Carboxygruppe), durch die nach erfolgter vollständiger Assemblierung die kovalente Kopplung einer zur nachzuweisenden DNA-Sequenz komplementären Fangsonde ( Capture Probe ) mittels Standardchemie ermöglicht wird.
Die zu detektierende DNA wird aus einer Probe, beispielsweise aus Mikroorganismen einer Lebensmittelprobe, isoliert, wenn nötig aufgereinigt, und mit spezifischen Primern im Zuge einer PCR (Polymerasekettenreaktion) amplifiziert. Ohne weitere Aufreinigung oder Zusätze werden die PCR-Produkte danach hitzedenaturiert und schockartig bei etwa -20 C auf Eis transferiert, um eine einzelsträngige DNA zu erhalten. Für einige Anwendungen des Nachweisverfahrens ist der Denaturierungsschritt jedoch nicht notwendig.
Die Messung erfolgt mit Hilfe der Technik der Impedanzspektroskopie in einem Elektrolyten, der sowohl eine spezifische Hybridisierung der Fangsonde mit dem PCR-Fragment bei Raumtemperatur als auch eine Detektion der Konformationsänderung der nichtleitenden Schicht durch die erfolgte Hybridisierung erlaubt. Das Signal besteht in einer Erhöhung der (Pseudo)Kapazität des Systems Arbeitselektrode/Elektrolyt als Folge einer Konformationsänderung der nichtleitenden Schicht.
Der Aufbau der Arbeitselektrode sowie der Vorgang der Hybridisierung sind schematisch in Fig. 1 dargestellt.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele und der Fig. 2-8 näher erläutert, wobei Fig. 2 schematisch einen Teil einer Ausführungsform der erfindungsgemässen Messanordnung veranschaulicht, die Fig. 3-5 sowie 8 eine graphische Darstellung der Messergebnisse (Kapazität versus Zeit) der Beispiele 1,2, 3, 5 und 6 zeigen und Fig. 6 und 7 jeweils ein Blockdiagramm zeigen, in dem die prozentuelle Kapazitätszunahme für die Messungen des Beispiels 4 dargestellt ist.
Beispiele : Beispiel 1: Detektion von komplementären Oligonukleotiden Goldelektroden wurden von E&E-Electronik GmbH (Engerwitzdorf, AT) im Auftrag gefertigt.
Diese Elektroden in Dünnschichttechnik bestehen aus einem Glassubstrat, auf welchem mittels Ni/Cr-Haftvermittler eine Struktur, wie sie aus Fig. 2 ersichtlich ist, aufgebracht wurde. Die Reaktionszone hat einen Durchmesser von ca. 700 um; das Glassubstrat hat ein Format von ca. 3 x 10 mm. Die Länge der Zuleitung und die exakten Masse der Kontaktfläche sind für die Erfindung nicht relevant.
Die in den Beispielen verwendeten Oligonukleotide wurden von VBC-Genomics bezogen.
Modifizierung der Elektroden mit einer Thiolschicht (SAM) : Elektroden wurden in einem Glasgefäss einzeln in ca. 700 l Ethanol absolut p. A. (von Merck) 2 x 4 min im Ultraschallbad behandelt (Schwimmständer), wobei die Lösung dazwischen gewechselt wurde. Dann wurden die Elektroden im Stickstoffstrom getrocknet. Auf die Reaktionszone der Elektrode wurden zuerst 1 l Wasserstoffperoxid 30% (ppA, Fluka) und dann 3 l konzentrierte Schwefelsäure (ACS-Reagent, Sigma) pipettiert. Nach 1-2 Minuten Reaktionszeit wurde die Flüssigkeit entfernt und mit 2 x 700 l Wasser pro Elektrode gewaschen (Wasser für die Molekularbiologie von Sigma, filtriert über Vorspritzenfilter 0,2 um von Nalgene). Danach wurde zuerst im Stickstoffstrom und anschliessend im Vakuumexsiccator über Silicagel orange getrocknet (60 min).
Dann erfolgte die Inkubation in 700 l einer Lösung von 3,2 mg 11-Mercaptoundekansäure (Aldrich) in 100 ml Chloroform (Sigma, ACS-Reagent, Spectrophotometric Grade) in verschlossenen Glasgefässen für mindestens 14 Stunden. Multilayerschichten wurden durch zweimaliges Waschen mit Ethanol (jeweils ca. 700 l) entfernt und die Elektroden im Stickstoffstrom getrocknet.
<Desc/Clms Page number 7>
Oligonukleotid-Immobilisierung: Auf die Reaktionszone der Elektroden wurden in gesättigter Atmosphäre zuerst je 5 l frisch angesetzter EDC-Lösung (4,2 mg auf 300 l Puffer [0,5 mM Phosphat, 10 mM NaCI], pH=4,0) und danach sofort eine spezifizierte Menge aminomodifiziertes Oligonukleotid in 0,5 bis 1 l Volumen aufgebracht. Nach 40 Minuten wurde der Flüssigkeitsfilm entfernt. Die Elektroden wurden mit Wasser gespült und im Stickstoffstrom getrocknet. Die Lagerung der Elektroden bis zur Verwendung erfolgte trocken und staubgeschützt bei Raumtemperatur.
Messung : Die Zuleitung der Elektrode (1) wurde vorsichtig mit Isolierband (2) abisoliert, so dass nur mehr die Reaktionszone (3) mit dem Elektrolyten (4) in Kontakt treten kann. Der Kontaktbereich der Elektrode (1) wurde in eine kleine, in einem Teflonkopf befindliche Goldklammer gesteckt. Der Teflonkopf besitzt Aussparungen, durch welche ein als Gegenelektrode (5) benützter Platindraht sowie eine Salzbrücke (6), welche zur Referenzelektrode führt, in Kontakt mit dem Elektrolyten (4) treten können, sowie eine innen angeordnete, leitende Verbindung (7) der Goldklammer nach aussen (siehe Fig. 2). Die Salzbrücke (6) besteht aus einem gebogenen dünnen Glasröhrchen, welches z. B. aus einer Pasteurpipette hergestellt werden kann.
Dieses wurde mit einer heissen gesättigten KCI-Lösung (ca. 4 M) mit 0,5% Agarose luftblasenfrei gefüllt, nach erfolgter Abkühlung in gesättigter KCI-Lösung gelagert und bei Bedarf entnommen.
Der Teflonkopf wurde in ein 1,5 ml Eppendorfgefäss (8) eingesetzt, welches mit 200 l 0,1 x SSC (hergestellt aus einer Stocklösung mit 20 x SSC = 0,3 M Natriumcitrat + 3 M NaCI, pH = 7,0) partiell gefüllt wurde, wobei die Lösung eine lonenstärke von 0,024 mol/I aufwies.
Vorzugsweise ist die Konzentration bei Verwendung von SSC-Puffer in einem Bereich von 0,02 x SSC bis 1 x SSC, insbesondere von 0,05 x SSC bis 0,5 x SSC. Als Referenzelektrode dient eine über die oben beschriebene Salzbrücke angekoppelte gesättigte Kalomelelektrode (SCE).
Die Messung wurde mit einem Potentiostat/Galvanostat PGSTAT30 mit FRA2-Modul der Fa.
Ecochemie (NL) in der Dreielektrodenkonfiguration durchgeführt. Es wurde ein Potential von 250 mV vs. SCE angelegt. Bevorzugt entspricht der Potentialbereich 200 bis 300 mV. Die Amplitude betrug 10 mV, als Detektionsfrequenz wurden 18. 828 Hz eingestellt.
Die graphische Präsentation der gemessenen Impedanzdaten in Form der substituierten seriellen Kapazität (eigentlich eine Pseudokapazität, da es sich um keinen R-C- sondern um einen R-Q-Schaltkreis handelt) versus Zeit erfolgte durch die Frequence Response Analysis (FRA) Software für Windows, Version 4. 8, der Fa. Ecochemie (NL).
Oligonukleotid-Sequenzen: (1) Immobilisiertes Amino-Oligonukleotid SLT1-CPL3' Amino : 5'-TCG CCA TTC GTT GAC TAC TTC TTA T-3' mit Aminolink (Cs-Spacer) am 3'-Ende, gelöst in Wasser für die Molekularbiologie; Konzentration 0,5 g/$ l; immobilisiert : 1 l; dieses Oligonukleotid diente auch als Negativkontrolle (2) Positivkontrolle SLT1 ohneAP : 5'-ATA AGA AGT AGT CAA CGA ATG GCG A-3 , gelöst in Wasser für die Molekularbiologie, Konzentration 1 g/ l (3) Negativkontrolle: SLT1-CPL3' Amino (siehe (1)) Wie in Fig. 3 (a, b) ersichtlich, ist eine einwandfreie Unterscheidung von komplementären und nicht komplementären Oligonukleotiden möglich.
Beim komplementären Oligonukleotid (entspricht der nachzuweisende DNA-Sequenz) wird eine Zunahme von 8% in der (Pseudo) Kapazität gemessen, beim nicht-komplementären Oligonukleotid (= Negativkontrolle) eine Zunahme von lediglich 2,5%. Dies entspricht einem Signal-zu-Noise-Verhältnis von 320%.
Das Mitführen der Negativkontrolle dient der Illustration der Spezifität. Eine Messung bzw. ein
<Desc/Clms Page number 8>
Mitführen dieser Negativkontrolle ist für die spezifische Detektion nicht notwendig, da weitere Experimente zeigten, dass reproduzierbar eine Signalerhöhung um mindestens 3,3% im Fall von in Wasser gelösten Oligonukleotiden unter den beschriebenen Umständen signifikant für spezifische Hybridisierung ist.
Beispiel 2: Detektion von komplementären PCR-Fragmenten vs. Negativkontrolle der PCR PCR-Reaktion - Ansatz insgesamt 25 l; 1 x Amplifizierungspuffer (Quiagen) 2,5 mM MgCI2 (Quiagen) Nukleotidmix: je 200 uM dATP, dGTP, dCTP; 600 uM dUTP (Genexpress, Genecraft) 1 uM Primer "SLT1-f1 ": 5'-GCT ATA CCA CGT TAC AGC GTG TTG C-3' 1 uM Primer "SLT1-r1": 5'-GCT CTT GCC ACA GAC TGC GTC A-3' 1 Unit HotStar Taq Polymerase (Quiagen) 106 Genomkopien von enterohämorrhagischen Escherichia coli (EHEC) ATCC 43895, die mit dem High Pure PCR Template Preparation Kit von Roche isoliert wurden (entfällt bei der Negativkontrolle) Amplifizierungsbedingungen: 15 Minuten 95 C 35 Zyklen:
30 Sekunden 95 C (Denaturierung)
30 Sekunden 64 C (Annealing)
30 Sekunden 72 C (Extention) 10 Minuten 72 C Die amplifizierten Sequenzen sind spezifisch für das SLT1-Gen (SLT = shiga like toxin), welches wichtig bei der Detektion von EHEC-Stämmen ist. Weitere zur Identifikation wichtige EHEC-Gene sind das SLT2-, eaeA- und rfbE-Gen, weshalb vorzugsweise Sequenzen, die Teil dieser Gene sind, für den Nachweis unter Verwendung der Erfindung eingesetzt werden.
Vor der Messung wurde ein entsprechendes Aliquot der PCR-Reaktion mindestens 5 Minuten bei mindestens 90 C denaturiert, rasch auf mindestens -20 C abgekühlt und anschliessend bei -20 C gehalten.
Die Qualität der Positiv- und Negativkontrollen wurde vor der elektrochemischen Messung mittels Dot-Plot Hybridisierung überprüft.
Elektroden wurden analog zu Beispiel 1 vorbereitet. Immobilisiert wurden 0,5 l SLT1CPPCR -Oligonukleotid: 5'-ATC TGC ATC CCC GTA CGA CTG A-3' mit 5'-Aminolink, gelöst in Wasser für die Molekularbiologie mit einer Konzentration von 0,5 g/ l Die Kapazitätserhöhung für das komplementäre PCR-Fragment und die Negativkontrolle der PCR betrugen 6,5% bzw. 2,3%. In Fig. 4 (a, b) und aus einem Vergleich mit Fig. 3 (a, b) ist ersichtlich, dass der Unterschied zwischen positiv und negativ verlaufender Reaktion bei PCRProdukten, d. h. Hybridisierung bzw. keine Hybridisierung, ein niedrigeres Verhältnis aufweist als für reine Oligonukleotide. Das Signal-zu-Noise-Verhältnis beträgt aber ausreichende 280%.
Eine eindeutige Zuordnung der Signale ist somit gewährleistet. Auch in diesem Beispiel ist eine Signalerhöhung von mindestens 3,3% Hinweis auf eine eindeutige Detektion der spezifischen Hybridisierung mit einem PCR-Fragment.
Beispiel 3: Detektion von komplementären PCR-Fragmenten vs. Negativkontrolle der PCR mit Vorbehandlung durch UNG (Uracil-N-Glykosilase) In Labors, in denen oft mit bestimmten PCR-Fragmenten hantiert wird, können Kontaminationen mit diesen PCR-Fragmenten zu einem Problem werden. Eine einfache Möglichkeit, solche
<Desc/Clms Page number 9>
Kontaminationen auszuschliessen, besteht in der Verwendung des Enzyms Uracil-N-Glykosilase und der durchgehenden Verwendung von dUTP anstelle von dTTP in der PCR.
Vor der PCR wird der Ansatz 10 Minuten mit 1 U N-Uracil-N-Glykosilase (Roche) inkubiert.
Dieses Enzym baut eventuell vorhandene Kontaminationen in der Form von PCR-Produkten ab.
Die verwendete N-Uracil-N-Glykosilase ist hitzelabil und wird folglich im Zuge der PCR-Reaktion inaktiviert, verbleibt aber in der Lösung.
Die PCR-Reaktion und die Messung wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Die Messergebnisse sind in Fig. 5 (a, b) veranschaulicht. Eine eindeutige Unterscheidung zwischen der Negativ- und der Positivkontrolle ist auch bei Vorbehandlung mit UNG möglich. Die Kapazitätserhöhung beträgt 6,7% für die Positivreaktion und 4,1 für die Negativreaktion. Dies entspricht einem Signal-zu-Noise-Verhältnis von 163%. Die Kennzahlen sind damit nicht so gut wie in den Beispielen 1 und 2. Weitere Experimente haben jedoch gezeigt, dass eine Kapazitätserhöhung von mindestens 5,4% einen eindeutigen Hinweis für eine spezifische Hybridisierung darstellt. Ein Mitführen der Negativkontrolle ist für die einwandfreie Detektion ebenso wie im vorhergehenden Beispiel nicht erforderlich.
Beispiel 4: Detektion von komplementären PCR-Fragmenten vs. Negativkontrolle der PCR mit Vorbehandlung durch UNG ohne Denaturierung Die Vorgangsweise entspricht derjenigen von Beispiel 3 mit Ausnahme der Hitzedenaturierung, welche im vorliegenden Beispiel weggelassen wurde. Die Messergebnisse zeigen keinen wesentlichen Unterschied zu Beispiel 3. Daraus folgt, dass die Denaturierung der PCR-Fragmente bei gegebener Menge an PCR-Fragment und der erreichten Sensitivität nicht notwendig ist, da jener kleine Prozentteil der PCR-Fragmente, der als Einzelstrang vorliegt, für die Detektion ausreichend ist.
Beispiel 5: Spezifische Detektion von Keimen in verschiedenen beimpften Fleischproben Fleischproben: Faschiertes gemischtes Schweine- und Rindfleisch wurde bei einem Fleischhauer gekauft und bis zur Verwendung gekühlt aufbewahrt. Analoges gilt für die Zwiebelmettwurst.
Anzucht und Voranreicherung: Je 25 g Faschiertes wurden im Stomacherbeutel mit Filtereinsatz (Bagfilter von Intersciencem, St. Nom, FR) eingewogen, mit 225 ml Anreicherungsmedium (gepuffertes Peptonwasser von Oxoid (CM 509) + 5 g/l Lactose) versetzt, im Stomacher eine Minute lang homogenisiert, mit Verdünnungen von EHEC-Übernachtkulturen mit bekannter Keimzahl künstlich kontaminiert und bei 37 C für 18 Stunden inkubiert. Analoges gilt für Zwiebelmettwurst mit Brilliantgrünmedium (hergestellt gemäss DIN 10137 :2002).
Keimzahlbestimmung: Die Keimzahl der zur künstlichen Kontamination verwendeten Übernachtkulturen, die Gesamtkeimzahl sowie die Keimzahl der Coliformen im unbeimpften Faschierten wurden mittels BacTrac 4300 Analysensystem nach Vorgabe des Herstellers (SY-LAB Geräte GmbH, Neupurkersdorf, AT) impedometrisch bestimmt. Die Messmethode wurde für die verwendeten Stämme mit der Plate-Count-Methode (Kolonienanzahl auf Platten) kalibriert. Coliforme wurden mit ca.
2,8 x 102 Keime/ml bestimmt, die Gesamtkeimzahl betrug ca. 1,6 x 104 Keime/ml. Bei 1-10 inokulierten Keimen ergibt sich so ein ca. 1000 bis 10.000-facher Überschuss der Hintergrundflora, bei 10-100 ein ca. 100 bis 1000-facher Überschuss an anderen Keimen.
Isolierung der DNA aus Fleischproben: 1 ml Kulturüberstand der Fleischprobe wurde in 1,5 ml-Röhrchen in einer Eppendorfzentrifuge (5 Minuten, 16. 000 g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgehoben und verworfen, die sedi-
<Desc/Clms Page number 10>
mentierten Bakterien in 1 ml sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und gründlich resuspendiert. Dies wurde ein Mal wiederholt. 100 l wurden abgenommen und abzentrifugiert. Das Bakterien-Pellet wurde in 100 l sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und die Bakteriensuspension erhitzt (100 C für 20 Minuten am Heizblock). Nach Abzentrifugieren der Zellreste wie oben wurde der resultierende Überstand in frische Röhrchen überführt. Die Aufbewahrung der Proben bis zur Amplifizierung erfolgte bei -20 C.
PCR : Pro 25 l PCR-Ansatz wurden 5 l der oben erhaltenen Lösung eingesetzt. Sämtliche andere Angaben entsprechen Beispiel 2.
Elektrodenpräparation: Die Elektrodenpräparation entspricht weitgehend Beispiel 1, jedoch wurden die Elektroden statt einer Stunde zwei Stunden im Vakuumexsiccator über Silicagel orange getrocknet. Die Aktivierung der endständigen Carboxygruppe erfolgte durch 3 l statt 5 l EDC-Lösung gleicher Konzentration und immobilisiert wurde 1 l statt 0,5 l SLT1-CPPCR -Oligonukleotid mit 5'-Aminolink, gelöst in Wasser für die Molekularbiologie mit einer Konzentration von 0,5 g/ l.
Detektion : Analog zu Beispiel 2. Es wurden jeweils 5 l der PCR-Reaktion zur Messung eingesetzt. Wie in Beispiel 4 erfolgte keine Denaturierung der Fragmente.
Ergebnisse : Sowohl in gemischtem Faschierten als auch in Zwiebelmettwurst war die zuverlässige (pseudo) kapazitive Detektion einer mikrobiologischen Kontamination möglich.
Die mittlere prozentuelle Kapazitätszunahme für Keime im Faschierten betrug 7,55% (#n-1 = 0,27 bei n=3) gegenüber dem durchschnittlichen Wert der beiden Negativkontrollen von 3,40%.
Unter Berücksichtigung der absoluten Streuung ergibt sich somit ein sicheres Resultat für den Nachweis einer derartigen Kontamination in einer faschierten Probe. Die Resultate sind in Fig. 6 in Form eines Blockdiagramms dargestellt.
Die prozentuelle Kapazitätszunahme bei der Zwiebelmettwurst betrug 6,88% bzw. 6,72%, jene der Negativkontrolle lediglich 4,8%. Der Unterschied zwischen spezifischer und unspezifischer Reaktion ist zwar geringer als im Fall des Faschierten, die geringe Variation der Messresultate zeigt jedoch, dass auch hier von einer absolut zuverlässigen Unterscheidung der positiven und negativen Proben gesprochen werden kann. Die Ergebnisse der Messungen sind in Fig. 7 in Form eines Blockdiagramms dargestellt.
Beispiel 6: Detektion von nicht-denaturierten, komplementären PCR-Produkten vs. nichtkomplementären, nicht-denaturierten PCR-Produkten Die Elektroden wurden wie in Beispiel 5 vorbereitet.
Die PCR-Angaben entsprechen für das komplementäre SLT1-Fragment dem Beispiel 2. Das nicht-komplementäre PCR-Fragment SLT2 wurde analog dazu mit folgenden Primern erzeugt: SLT2-f1 : 5'-TTT CCA TGA CAA CGG ACA GC-3'
SLT2-r2 : 5'-CCA CTG AAC TCC ATT AAC GCC-3' Zur Detektion wurden jeweils 5 l des rohen PCR-Produkts eingesetzt.
Die prozentuelle Kapazitätszunahme betrug 7,64% für das komplementäre SLT1-Fragment bzw. 4,66% für das nicht-komplementäre SLT2-Fragment. Das entspricht einem Signal-zuNoise-Verhältnis von 164%. Die Messkurven sind in Fig. 8 (a, b) dargestellt. Es ist ersichtlich, dass ein komplementäres und ein nicht-komplementäres PCR-Fragment eindeutig unterschieden werden können. Die Kapazitätserhöhungen des komplementären PCR-Fragments liegen
<Desc/Clms Page number 11>
im gleichen Bereich wie die der komplementären PCR-Produkte des Fleischversuchs (Beispiel 5). Die Reaktion auf das nicht-komplementäre SLT2-Fragment entspricht der Reaktion der Wasserkontrolle im Fleischversuch.
Somit kann davon ausgegangen werden, dass auch im Fall einer nicht selektiven PCR keinesfalls Probleme auftreten werden, da auf nicht-komplementäre PCR-Produkte im Wesentlichen keine höhere Reaktion erfolgt als auf die Wasserkontrolle.
Die erfindungsgemässe Messanordnung und das erfindungsgemässe Verfahren weisen gegen- über dem Stand der Technik erhebliche Vorteile auf. Sowohl die Hybridisierung als auch die Detektion der Hybridisierung verlaufen extrem rasch. Das Feststellen des Vorhandenseins von zu den immobilisierten Oligonukleotiden ( Capture Probe ) komplementären Sequenzen ist in spätestens 5 Minuten abgeschlossen. Mit einer Denaturierung, die wie gezeigt wurde, nicht unbedingt notwendig ist, ergibt sich eine Zeitspanne von nur etwas über 10 Minuten nach Fertigstellung der PCR. Dies minimiert signifikant den zeitbedingten Vorteil beispielsweise einer RT-PCR durch online-Detektion. Im Vergleich dazu ist das erfindungsgemässe Verfahren sowohl bezüglich Materialverbrauch als auch apparativ weit weniger aufwendig und damit kostengünstiger.
Ein bereits sehr rasches, auf einer Dot-Plot-Hybridisierung mit enzymmarkierten Sonden basierendes Konzept benötigt zwischen dem Ende der PCR und der Detektion der Hybridisierung mindestens 150 Minuten.
Zusätzlich ist die Spezifität des erfindungsgemässen Verfahrens so hoch, dass keinerlei Waschvorgänge nötig sind, d. h. der Arbeitsaufwand ist auf ein minimales Mass reduziert. Die Hybridisierung erfolgt zudem bei Raumtemperatur (für spezifische Hybridisierungen sind meistens erhöhte Temperaturen notwendig).
Weiters erfordert ein Nachweis unter Verwendung des erfindungsgemässen Verfahrens bzw. der Messanordnung auch keinen Umgang mit toxischen Chemikalien, wie z.B. Interkalatoren, was in einem Zeitalter der erhöhten Sensibilität gegenüber dem Thema Arbeitsschutz immer mehr an Bedeutung gewinnt.
Für die Detektion von Mikroorganismen in z.B. Lebensmitteln ist bedeutsam, dass nach einer Anreicherung über Nacht durch ein einfaches und kurzes Protokoll die DNA rasch und ohne Kostenaufwand isoliert werden kann. Nach erfolgter Amplifizierung durch die PCR kann das nachzuweisende DNA-Fragment ohne weitere Aufreinigung oder auch nur Denaturierung sofort einer Messung mit der erfindungsgemässen Messanordnung oder gemäss dem Verfahren der Erfindung unterzogen werden. Die Nachweisgrenze am Beispiel eines EHEC-Nachweises liegt um oder unter 10 Keimen pro 25 g Fleisch. Diese Ergebnisse beziehen sich auf realistische Proben mit einer (wie in der Realität immer vorhandenen) Untergrundflora.
Die erfindungsgemässe Messanordnung und die Messung selbst sind apparativ relativ einfach und damit für einen spezifischen Nachweis ausgesprochen kostengünstig. Auffällig wird dieser Punkt vor allem im Vergleich zum apparativen und damit finanziellen Aufwand im Bereich der Microarrays oder Realtime-PCR.
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.