CN105764914A

CN105764914A - 新型吸附性组合物及其用途

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Publication number: CN105764914A
Application number: CN201480058100.8A
Authority: CN
Inventors: R·哈恩; A·章格鲍尔; A·特列菲洛夫; M·艾曼德埃菲尔
Original assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Grandis Biotech GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim RCV GmbH and Co KG; Grandis Biotech GmbH
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2014-08-25
Publication date: 2016-07-13
Anticipated expiration: 2034-08-25
Also published as: SG11201600275PA; US10537887B2; JP2020019799A; US20160193598A1; AU2014310479A1; AU2014310480B2; SG10201801371PA; CA2921883A1; US10661264B2; EP3036250A1; KR20160065092A; SG11201600574XA; EP3036249B1; CA2919288A1; EP3036249A1; JP2016530271A; CN105683210A; AU2014310479B2; US20190046969A1; AU2014310480A1

Abstract

本发明提供了一种新型的用于从流体中回收生物分子的吸附性组合物。该组合物包含以磨碎颗粒的形式的带正电的和带负电的微粒。该吸附剂尤其用于从细胞培养中纯化生物分子。

Description

新型吸附性组合物及其用途

发明技术领域

本发明一般涉及从流体特别是从生物流体中分离生物分子的领域。本发明涉及应用于从生物流体中回收生物分子的组合物、用途和方法。此外，在另外一个方面，本发明涉及细胞培养和从细胞培养中纯化生物分子的领域。

发明背景

从混合物中分离生物分子传统上已经通过利用色谱技术、过滤或沉淀来实现。生物技术产品和工艺发展的持续激增已经随之带来了对有效且有成本效益的分离和纯化工艺以及装置的需求。通过发酵工艺来制备生物分子能够被分成两个通用类，其通常被称为“上游”工艺和“下游”工艺。该上游工艺解决系统生化设计，以生产所需的生物制药产品，该下游工艺聚焦于收获和纯化最终产品。

下游工艺典型地包括：(1)如必要，例如通过细胞破碎来释放发酵细胞的内容物，这是因为，由于所述宿主细胞的分泌，发酵产品例如蛋白质或多核苷酸诸如质粒可能已经存在于所述培养上清液中；(2)典型地通过从包含所需产品和其它生物实体的母液中分离细胞碎片来离心以净化内容物，；(3)随后的步骤中超滤以浓缩母液；以及(4)典型地通过液体色谱技术使用多方法分离方法例如离子交换、疏水相互作用、反相来纯化最终产品。

用于蛋白质吸附的色谱树脂通常包括大孔亲水材料。在传统的色谱技术中，使用了具有限定粒径和孔径的常规颗粒色谱材料。多孔性对提供用于高容量的足够的表面积是必要的，而亲水性表面则使其能够可逆吸附。用于色谱树脂的基础材料通常是交联天然聚合物，如纤维素、右旋糖苷或琼脂糖，以及由聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯二乙烯苯衍生物制成的合成聚合物。后者通常包覆有亲水性聚合物。离子交换树脂、疏水性相互作用树脂或亲和树脂通过化学衍生法或通过表面接枝技术以功能性配体耦合。

在工业上，上游制造能力已经显著增强，众多制造商选择同时操作多个10000L生物反应器。然而，标准的色谱分析方法不允许快速规模化。

在色谱纯化步骤(也称为捕获步骤)的第一阶段，由于必须处理大样本体积，因此通常使用大柱床体积。然而，大型柱会遭受与规模相关的填充问题，例如滞后现象、边缘效应和树脂压缩，这会导致不可预料的流体分布和压力降。

填充色谱柱的性能在工业和制备应用中受最大可允许的压力降的限制。由于压力降的限制，使用大直径诸如使用大于40μm的树脂珠。

捕获生物分子取决于孔隙扩散，但是大生物分子不容易扩散进孔隙中，扩散路径随着较大的树脂颗粒的使用而增加。这会引起传质阻力和降低柱效率，这是因为大分子只能结合至所述树脂珠的外部表面。因此，需要较长停留时间以在树脂颗粒内部寻找结合配体，这反过来会导致缓慢的吸附过程。由于高流通量对处理大样本体积来说很重要，因而，使用大颗粒，特别是对吸附大蛋白质而言，对整体的生产力都具有影响。

总而言之，当前的色谱技术不能容易地被放大来满足工业需求。该方法具有在工业规模中耗时和实施昂贵的缺陷。

因此，需要提供柱色谱法的替代方法。已经提议的色谱法的替代方法包括膜滤法、双水相萃取法、沉淀法、结晶法、整体柱法和膜色谱法(Przybycien等人“Alternativebioseparationoperations:lifebeyondpacked-bedchromatography”CurrOpinBiotechnol.2004；15(5):469-78)。

Paril等人J.Biotechnol.2009；141:47-57提供了一种用于在微粒带电表面上吸附pDNA的手段和方法。具体而言，Paril等人使用由Rohm和Haas提供的聚苯乙烯基微粒吸附pDNA。然而，Paril等人没有教导如何制备这些微粒使得它们能够吸附pDNA。通常，微粒是指具有微米尺寸的颗粒。

仍然有需要提供用于从流体获得生物分子的替代的，优选经改进的方法，以替代标准色谱技术。本发明的技术问题就是为了符合上述提及的需求中的一个或多个。

必须指出的是，除非上下文有其它明确指示，本文所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”包括复数描述。因此，例如，提及的“试剂”包括一种或多种这种不同的试剂，提及的“所述方法”包括本领域普通技术人员已知的等效的步骤和方法，其可以被修改或替代本文所述的方法。

除非另有说明，一系列元素之前的术语“至少”将被理解为是指该系列中的每一个元素。本领域技术人员将承认或仅使用常规实验能够确定本文所述的具体实施方案的许多等价方案。这种等价方案意图被本发明所包含。

术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”和“所述术语所连接的元素的全部或任何其它组合”。

本文使用的术语“约”或“近似”意为在给出的值或范围的20％内，优选为10％内，更优选为5％内。然而，它还包括具体数目例如约20包括20。

术语“小于”或“大于”包括具体数目。例如，小于20意为小于或等于20。同样地，多于或大于分别意为多于或等于、或大于或等于。

本发明全文及其所附的权利要求中，除非上下文有其它要求，词语“包括(comprise)”以及变形词语诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”将被理解为意指包括陈述的整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。当本文使用术语“包括(comprising)”时能够以术语“含有(containing)”或“包含(including)”替代，或有时本文使用时会以术语“具有”替代。

当本文使用“由…组成”意为排除了权利要求要素中未规定的任何元素、步骤或成分。当本文使用“本质上由…组成”并不排除实质上不影响权利要求的基本特征的和新颖性特征的材料或步骤。

本文的每一个实例中，术语“包括”、“本质上由…组成”和“由…组成”中任意一个可被其它两个术语中的任意一个替代。

应该理解的是，本发明并不限于本文所述的具体的方法学、方案、材料、试剂和物质等，因为这些能够改变。本文所使用的专有名词只用于描述特定实施方案的目的，其并不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求限定。

本说明书全文所引用的所有的出版物和专利(包括所有的专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、指导书等)，无论在前还是在后，其以全文并入本文。由于在先发明，本文不能被解释为承认本发明不早于这样的公开物。在一定程度上，通过引入方式并入的材料或与本说明书矛盾或不一致，本说明书将取代任何这样的材料。

发明简述

本发明提供一种新型工艺和吸附材料，其允许直接捕获分子，优选来自例如液体、流体如培养基上清液的生物分子，以及来自细胞匀浆和/或其它生物流体的生物分子。相比于传统色谱技术，本发明简单、快速和廉价。如前所述，目前捕获生物分子或者是通过填充有多孔颗粒的固定床吸附或者是通过使用多孔颗粒进行间歇吸附来实现。然而这些处理过程均具有非期望的缺点，这是由于要求大床体积的柱，这样反过来导致了吸附缓慢，原因在于通常具有大直径的颗粒孔隙中的扩散路径长。此外，这些处理过程受限于传质。

根据本发明，提供了一种用于捕获生物分子的新型吸附材料。所述吸附材料包括固体并带电荷的微粒。所述微粒为磨碎的形式，其能够通过研磨阴离子交换树脂和阳离子交换树脂来制备。

本发明还提供了一种用于捕获生物分子微粒的新型吸附材料，该材料为固体并为疏水性的。所述微粒是磨碎的形式，其能够通过研磨疏水性吸附材料例如AmberliteXAD4、AmberliteXAD7HP、AmberliteXAD761来制备。

本发明所提供的具有粗糙表面的细小颗粒不作为填充床中的色谱介质使用，这是由于这些细小颗粒会堵塞熔块(frits)和过滤器从而导致处理困难。此外，这些细小颗粒在间歇处理应用中会延长沉淀时间和促使树脂磨损。但是，尽管这些基于公知常识的假设令人沮丧，本发明人已经惊奇地发现，本发明的颗粒能够迅速而高效地吸附分子，优选生物分子，特别是多肽，这使得这些颗粒适合于间歇吸附。此外，已经发现本发明体现了快速的吸附性。尤其是，本发明人发现本发明的颗粒，既有带电颗粒又有疏水颗粒一旦结合至分子，优选生物分子就会絮凝。絮凝物的形成使得生物分子易于从包含多余细胞碎片的生物流体中分离出来。因此，本发明所述吸附剂能够被用来以可规模化的方式吸附分子，优选生物分子。此外，已经惊讶地发现，在回收过程中使用带电颗粒会有高的吸附能力。此外，其还允许便利地处理由此形成的絮凝物，以及方便从流体分离形成的絮凝物。

此外，本发明人已经发现所述微粒还能够起到破坏细胞结构的作用。因此，本发明一方面提供了一种简化的用途和方法，其中，合并了下游工艺中的细胞破碎和生物分子回收的步骤。

术语“细胞破碎”或“破碎细胞”交替使用，其一般是指用于阻断细胞完整性的方法或工艺。本文所使用的细胞破碎包含但不限于用于使细胞可渗透到使得生物分子会从细胞中释放的程度的方法或工艺。细胞破碎可以或不可以参与细胞死亡。优选地，细胞破碎不参与细胞结构的完全分裂。在不希望被特定理论的约束下，可以假定的是，细胞片段的减少降低了(可能)受到污染的细胞碎片的水平。在本发明的一些实施方案中，通过本文所述方法使细胞破碎并释放了生物分子，但是这些分子仍保持了活性。所述被释放的生物分子可以或不可以吸附至用于破坏细胞的微粒。随后，使用本文所述方法或其它已知技术，能够从生物流体中回收该释放的生物分子。如此，本发明提供了一种新的用于采用简化的两步工艺破碎细胞、释放生物分子以及随后回收生物分子的方法。本发明的微粒可以用于打开细胞以释放生物分子以便它们可以在细胞悬浮液中被回收，而不论该生物分子的酸度(也就是说该生物分子可以是酸性、碱性或中性)。

根据本发明的第一个方面，所述组合物包括带正电的微粒和带负电的微粒，其中所述带正电的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂。所述组合物是指互相混合或不混合的带正电的微粒和带负电的微粒。正如本说明书将呈现的，该吸附材料能够通过向生物流体中分别加入带正电的微粒和带负电的微粒来使用。或者，它们能够被预混合再加入至生物流体中。

根据本发明第二个方面，所述组合物包括疏水微粒。这些疏水微粒能够吸附尤其是肽和多肽。吸附机制被认为主要基于吸附配体的疏水部分(诸如肽或多肽)和微粒的聚合表面之间有疏水(范德华，伦敦型)引力。

如本文所述，所述微粒通过研磨树脂获得(能够获得)，例如，通过研磨离子交换树脂并任选调节该树脂。本发明中的此种颗粒在本文优选被称为“微粒”、“吸附颗粒”、“吸附剂”、“颗粒”、“磨碎的颗粒”或“磨碎的树脂”。这些术语交替使用。优选地，所述微粒通过研磨常规的大直径小孔径颗粒来获得，该颗粒通常意图用于例如水的去离子化和废水处理。

所述带正电的微粒优选包括磨碎的聚合阴离子交换树脂，所述带负电的微粒优选包括磨碎的聚合阳离子交换树脂。在一个优选的实施方案中，所述微粒以粉末的形式存在，或者存在于液体介质中形成颗粒悬浮液。优选地，所述微粒不是含水凝胶的形式。通过将带正电的微粒和带负电的微粒混合能够制备包括带正电的微粒和带负电的微粒的组合物。通过分别提供带正电的微粒和带负电的微粒从而将它们分别加入生物流体中来制备该组合物。

所述阳离子交换树脂能够被用来制备带负电的微粒。该阳离子交换树脂可以是弱酸性或强酸性。类似地，阴离子交换树脂能够被用来制备带正电的微粒。该阴离子交换树脂可以是弱碱性或强碱性。

根据本发明，所述离子交换树脂可以基于任何适合的材料。优选地，所述树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的或甲基丙烯酸(MAA)基的。更优选地，所述树脂为以基于二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。

在一个优选的实施方案中，所述微粒为磨碎颗粒的形式，该颗粒的平均粒径小于约10μm，例如小于约5μm。基于计算的表面积、测量的蛋白质容量以及理论计算，假设球状蛋白质为六角形足迹，本发明～1μm直径(d₅₀)的微粒具有与～100nm直径(d₅₀)的球形纳米颗粒相类似的蛋白质容量。更优选地，本发明所述颗粒具有与具有高结合力大孔介质，诸如由Bio-RadLaboratories(USA)开发的Nuvia介质颗粒(NuviaSMedia–onlineCatalog2013，No.156-0311，NuviaQMedia–onlineCalalog2013，No.156-0411，orNuviacPrimemedia–onlineCatalog2013No.156-3401)可比较的，即与其相当的比表面积。“比表面积”意指每毫升(ml)浆料的表面积或者每克(g)树脂的表面积。

根据本发明的微粒能够通过研磨阴离子交换树脂和阳离子交换树脂而获得。阴离子交换树脂可以是，例如AmberliteIRA-485、AmberliteIRA-400、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、DIAIONSA20A、MarathonA2或其它本领域熟知的阳离子交换树脂；以及，阳离子交换树脂可以是，例如AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、DIAIONSK110、MarathonMSC或其它本领域熟知的阴离子交换树脂。

带正电的微粒和带负电的微粒的之比为约0.1：99.9(w/w)至99.9：0.1(w/w)。

在另一方面，本发明提供本文所公开的带正电的微粒和带负电的微粒用来从流体中吸附生物分子，优选蛋白质或多聚核苷酸，诸如DNA，例如质粒DNA的用途。可选择的，疏水颗粒被用于相同的用途。以下将进一步描述能够被本发明所述微粒吸附的生物分子。所述流体为生物流体，诸如细胞匀浆、发酵上清液、细胞悬浮液、发酵液等。本文以下提供了“生物流体”更详细和优选的描述以及生物流体的优选实例。

本发明的再另一方面是所述微粒的用途，尤其是带电微粒用于破坏细胞和吸附从细胞释放的生物分子的用途。此种细胞优选被包含于本文所述的细胞悬浮液、发酵液或培养液。

本发明还涉及一种从生物流体获得诸如细胞匀浆或发酵上清液的生物分子的方法，该方法包括加入本文所述的吸附剂；允许所述微粒形成絮凝物；从生物流体中除去絮凝物；以及通过从絮凝物中解吸生物分子或通过从生物流体中纯化生物分子来回收所述生物分子。

优选地，所述方法用于从发酵液、发酵上清液、细胞匀浆或细胞悬浮液中获得生物分子。在一个优选的实施方案中，添加所述微粒后，搅拌生物流体。

生物流体的实例包括诸如来自大肠杆菌、毕赤酵母和CHO细胞培养的细胞培养物、细胞匀浆、细胞裂解液、细胞悬浮液、发酵液、培养液、发酵上清液、培养上清液和细胞上清液。所述细胞培养物和细胞匀浆、细胞裂解液、细胞悬浮液、发酵液、培养液、发酵上清液、培养上清液和细胞上清液还能够经过滤、浓缩、透析、调节或以其它任何方式处理。本文所描述的细胞培养物、细胞匀浆、细胞裂解液、细胞悬浮液、发酵液、培养液、发酵上清液、培养上清液和细胞上清液等诸如此类能够通过下述方式调节：例如稀释、pH调节、盐度调节等或以其它任何方式处理。

在另一方面，本发明提供了包括带正电的微粒和带负电的微粒或疏水微粒的试剂盒。该试剂盒可以进一步包含用于使所述微粒悬浮的装置(means)，例如水。

此外，本发明还提供了包含本发明所述的生物分子、带正电的微粒和带负电的微粒或疏水微粒的生物流体。

以下将通过描述和实施例来使本领域技术人员了解本发明的确切性质及其优点。因此本发明并不限于所公开的实施方案或实施例。本领域技术人员能够容易地根据本发明所教导的内容从而获得其它的实施方案和应用。

附图简要说明

图1：由Dowex1X8-100离子交换树脂制备的微粒的光学显微镜图(1000倍放大率)(图1a)以及粒径分布(图1b)。

图2：各种微粒的粒径分布。

图3a-b：MARATHONA2(图3a为研磨前，图3b为研磨后)表面的原子力显微镜图像；细节区分度从左到右递增。

图3c-d：MARATHONMSC(图3c为研磨前，图3d为研磨后)表面的原子力显微镜图像；细节区分度从左到右递增。

图4：浓度为0.1mg/ml的胰蛋白酶抑制剂(TI)和IgG(左面板)以及浓度为0.5mg/ml(右面板)的TI在微粒上的吸附动力学分析。

图5：在以LabstarLS1研磨机研磨MARATHONMSC过程中微粒的粒径分布(图5a)和平均直径(图5b)。百分比以(v/v)给出。

图6：胰蛋白酶抑制剂(图6a)和牛血清白蛋白BSA(图6b)在各种阴离子交换微粒上的平衡容量；缓冲液条件为20mMTris，pH8.0；培养时间为1/2小时。

图7：溶菌酶(图7a)和多克隆IgG(图7b)在各种阳离子交换微粒和聚合物微粒NuviaS上的平衡容量；缓冲液条件为50mM乙酸钠；pH6.0；微颗粒的培养时间为1/2小时，以及NuviaS的培养时间为12小时；

图8：来自大肠杆菌滤液中的GFP在阴离子交换微粒上的平衡容量；缓冲液条件为20mMTris，pH8.0；培养时间为1/2小时。

图9：多克隆IgG的平衡容量与NuviaS树脂(图9a)和MARATHONMSC微粒(图9b)的吸附缓冲液的传导性之间的关系曲线。

图10：多克隆IgG在pH6.0、不同粒径的MARATHONMSC上的平衡容量；吸附条件为：1mg/mL多克隆IgG、20mMMES、pH6.0；在微量滴定板中280nm处测量IgG浓度。

图11：磨碎的DOWEXMATATHONA2(MA2)在吸附、洗脱和再生步骤经过01、02和03次(pass01,02and03)后的GFP、HCP和dsDNA的回收率(％)；经过01、02和03次(pass01,02and03)用作随后处理相同样品的同义词。图11a-c分别表示GFP、HCP和dsDNA的回收率结果。

图12：吸附/洗脱实验期间上清液的内毒素浓度。

图13.1：经约30秒沉淀时间后，絮凝的含10％MARATHONA2微粒的MARATHONMSC。

图13.2：使用磨碎的MarathonA2捕获磨碎的MarathonMSC上的pIgG随后絮凝期间形成的絮凝物经计算的铃动力直径的箱线图；该铃动力直径d₁₀以10％的百分位数(percentile)给出(絮凝物的90％大于给定的直径)；根据MarathonA2(AIEX)相对于MarathonMSC(CIEX)的体积百分比将数据分组；在1.5倍四分位距处绘制须线(Whiskers)；红色线表示分布中值；蓝色加号为须线所描述的范围外的数据点。

图14.1：絮凝的MARATHONMSC微粒的流速分布图。

图14.2：描述从CHO细胞上清液中捕获和洗脱lgG的流程图。

图14.3：使用AIEX微粒捕获细胞，随后捕获IgG；超过99％的DNA和60％的宿主细胞蛋白与所述细胞一起被捕获。

图14.4：在不同的盐和缓冲条件下，从MarathonMSC中回收IgG；使用磨碎的MarathonMSC捕获浓度为1mg/mL的多克隆IgG。吸附条件为：50mMMES，pH6.0；在15mL离心管中、在旋转振动筛上以20rpm的转速进行吸附15分钟；得到的MarathonMSC容量约为40mg/mL；微粒在16000rcf下通过离心10分钟被分离；测定体积为2mL；使用1mL相应的缓冲液进行洗脱。

图15：磨碎的微粒MARATHONA2和MARATHONMSC以及市场可购买的微球AIEX和CIEX的粒径分布图。

图16：磨碎的微粒MARATHONA2和MARATHONMSC以及市场可购买的微球AIEX和CIEX的zeta电势图。

图17：磨碎的微粒MARATHONA2和MARATHONMSC以及市场可购买的微球AIEX和CIEX的蛋白结合容量。

图18：IgG在MarathonMSC(ORS)和预絮凝的MarathonMSC(TRS)上的蛋白质容量的比较。MarathonA2与MarathonMSC之比为0.4。执行吸附15分钟。

本发明的项目

还可以通过下述项目来描述本发明的特点：

1.一种包含带正电的微粒和带负电的微粒的组合物，其中所述带正电的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂。

2.一种包含疏水性微粒的组合物。

3.一种项目1所述的组合物，其中所述阳离子交换树脂为弱酸性或强酸性。

4.一种项目1所述的组合物，其中所述阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性。

5.前述任一项目所述的组合物，其中所述阴离子交换树脂和所述阳离子交换树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。

6.前述任一项目所述的组合物，其中所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂是以基于二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。

7.前述任一项目所述的组合物，其中所述微粒的平均粒径小于约5μm。

8.前述任一项目所述的组合物，其中所述带负电的微粒使用如实施例4所列出的条件能够吸附至少5mg的GFP。

9.前述任一项目所述的组合物，其中所述带正电的微粒使用如实施例4所列出的条件能够吸附至少5mg的IgG。

10.前述任一项目所述的组合物，其中所述微粒可通过以下方式获得：研磨阴离子交换树脂及阳离子交换树脂，以及将所述磨碎的阴离子交换树脂和所述磨碎的阳离子交换树脂混合。

11.前述任一项目所述的组合物，其中所述阴离子交换树脂为AmberliteIRA-485、AmberliteIRA-400、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、MarathonA2或DIAIONSA20A。

12.前述任一项目所述的组合物，其中所述阳离子交换树脂为AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonMSC或DIAIONSK110。

13.前述任一项目所述的组合物，其中所述树脂无孔。

14.前述任一项目所述的组合物，其中通过研磨和调节所述树脂可获得所述带正电的微粒和/或带负电的微粒或疏水性微粒。

15.前述任一项目所述的组合物，其中所述组合物为粉末形式。

16.前述任一项目所述的组合物，其中所述组合物存在于液体介质，诸如存在于浆体或悬浮液中。

17.前述任一项目所述的组合物，其中带正电的微粒和带负电的微粒的比为约0.1：99.9(w/w)至99.9：0.1(w/w)。

18.前述任一项目所述的带正电的微粒和带负电的微粒或疏水性微粒吸附生物分子，优选蛋白质或质粒的用途。

19.项目17所述的吸附生物分子的用途，优选蛋白质来自细胞匀浆或发酵上清液。

20.前述任一项目所述的带正电的微粒和带负电的微粒破坏细胞的用途。

21.项目1-16中所述的带正电的微粒和带负电的微粒破坏细胞和吸附分子的用途，其中所述分子优选生物分子，更优选为多肽和多聚核苷酸。

22.一种从包含所述生物分子的生物流体中获得生物分子的方法，该方法包括：

a)向所述生物流体中加入项目1-16中任一项所述的带正电的微粒和带负电的微粒；

b)允许所述微粒形成絮凝物；

c)从所述生物流体中去除所述絮凝物；

d)从所述絮凝物中解吸所述生物分子，或从步骤c)所述的生物流体中纯化所述生物分子。

23.根据项目21所述的方法，其中所述生物流体为细胞匀浆或发酵上清液。

24.根据项目21所述的方法，其中所述流体为细胞悬浮液，其中所述方法进一步包括在步骤a)和/或d)后，搅拌所述细胞悬浮液。

25.根据项目21、22或23所述的方法，其中步骤c)通过分离，诸如离心或过滤进行。

26.根据项目21至24中任一项所述的方法，其中在步骤a)中分别加入所述带正电的微粒和所述带负电的微粒。

27.根据项目21至24中任一项所述的方法，其中步骤a)包括将所述带负电的微粒加入所述生物流体中，然后将带正电的微粒加入所述生物流体中。

28.包含项目1-16中任一项所述的带正电的微粒和带负电的微粒以及任选用于悬浮液的装置的试剂盒。

29.包含项目1-16中任一项所定义的生物分子和带正电的微粒以及带负电的微粒或疏水性微粒的生物流体。

30.项目29所述的流体还包含絮凝物。

31.带正电的微粒和带负电的微粒用于回收生物分子的用途，其中所述带正电的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂，其中所述生物分子为酸性或碱性。

32.项目31所述的用于从细胞裂解液或细胞匀浆中回收生物分子的用途。

33.项目31所述的用于从细胞悬浮液中回收生物分子的用途。

34.带正电的微粒和带负电的微粒用于细胞破碎和从细胞中释放生物分子的用途，其中所述带正电的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂，其中所述生物分子为酸性或碱性。

35.一种从生物流体中获得生物分子的方法，包括a)将带正电的微粒和带负电的微粒加入生物流体中，以及从所述生物流体中回收生物分子，其中所述生物分子为酸性或碱性。

36.项目35所述的方法，其中所述生物流体为细胞悬浮液、细胞裂解液或细胞匀浆。

37.一种从细胞中获得生物分子的方法，包括a)加入带正电的微粒或带负电的微粒以破坏细胞；b)加入带相反电荷的微粒；以及b)回收所述生物分子。

38.项目37所述的方法，其中所述生物分子为酸性或碱性。

39.项目37所述的方法，其中首先加入带正电的微粒。

40.项目37所述的方法，其中首先加入带负电的微粒。

发明详述

本发明提供一种使用本文所述的吸附剂回收生物分子的简单而快捷的方法。本发明在一定程度上基于以下惊奇的发现：所述包含带电微粒的吸附剂会快速形成大直径(诸如至少为5μm)絮凝物，其使分子易于从所述生物流体中分离，所述分子优选生物分子。此外还发现，本发明的吸附剂的纯化效率高、杂质降低明显。本领域技术人员认可的是，本发明尤其适用于在大规模应用(诸如本文所述试点和工业规模)中从细胞匀浆和发酵上清液中分离蛋白质。所述吸附剂能够方便地应用在连续处理或间歇处理(称为间歇吸附)中。

术语“生物分子”意为一种通常在生物体中发现或由生物体合成的分子，其包括多肽或多核苷酸。该生物分子可以为酸性或碱性生物分子。生物分子的实例包括但不限于：寡糖、多聚糖、脂多糖、寡肽、蛋白质、核苷、类黄酮、寡糖苷酸类、DNA(双链或单链DNA)、质粒DNA、粘粒DNA、BACDNA、YACDNA、RNA(双链或单链RNA)、有机金属化合物、氨基酸、脂类、嘧啶、嘌呤、碳水化合物、肽类化合物、毒素、类固醇、酶。所述术语还包括以下所述的“产物”或“表达产物”。生物分子优选为带电的。

根据本发明的吸附剂包括磨碎颗粒状的离子交换树脂。

可选择地，根据本发明的吸附剂包括磨碎颗粒形式的疏水性树脂。此种疏水性微粒的杰出的蛋白质吸附能力特别有利于例如多聚核苷酸或亲水性蛋白的负净化，其在低盐浓度下优于常规色谱介质。因此，本发明提供了通过应用所述疏水性微粒来负净化多聚核苷酸或亲水性蛋白的用途和方法。为该目的，向匀浆或标准蛋白质溶液中，将50％(v/v)的疏水性颗粒悬浮液加入匀浆或蛋白溶液中。培养微粒悬浮液例如30分钟。之后微粒经离心，并通过加入洗脱缓冲液、混合、培养例如30分钟来洗脱结合蛋白。任选地，可以包括使用洗脱缓冲液进行第二次清洗的步骤。微粒经洗脱后，再次经前述的离心处理。通过例如光度分析来量化上清液中的蛋白质浓度，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来检测靶蛋白纯度。

第一方面，本发明提供一种包括带正电的微粒和带负电的微粒的组合物，其中所述带正电的微粒包括磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电的微粒包括磨碎的聚合的阳离子交换树脂。

本发明所用的树脂是一种固体的、非可溶性的聚合物材料，该聚合物材料能够与各种元素相互作用并粘附至各种元素，并且允许从混合物中捕获这些元素。树脂通常由包括但不限于以下的惰性化合物组成：葡聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯或中性多糖。它们还可包括交联天然聚合物，如纤维素、葡聚糖或琼脂糖。这种树脂将与本发明教导的关于磨碎的颗粒(也就是指微粒)相一致。

如本文所定义的，“带正电的”微粒具有至少一个基本电荷的质子，更典型地，在中性pH时具有多于一个基本电荷的质子。“带负电的”微粒具有至少一个基本电荷的电子，更典型地，在中性pH时具有多于一个基本电荷的电子。

根据优选的实施方案，微粒由离子交换树脂，更优选由聚合的阴离子交换树脂和阳离子交换树脂来制备。离子交换树脂是指包含不溶性电荷聚合物的载体的固体载体，其中该电荷聚合物携带含有交换性离子的固定官能团和位点。适当的离子交换树脂的说明性实例包括阴离子交换树脂、阳离子交换树脂和混合型色谱树脂，本文有时也称之为混合型离子交换树脂。可交换的离子形式通常为Na⁺、H⁺、OH^-或Cl^-离子中一个或多个，这取决于离子交换树脂的种类。离子交换树脂包括弱和强阳离子交换树脂以及弱碱性和强碱性阴离子交换树脂。离子交换树脂广泛应用于各种工业领域中。离子交换树脂通常用于例如水处理领域，诸如锅炉水去矿化或发电厂凝结水处理；用于食品领域，例如用于糖溶液的纯化；或用于半导体制备中的超纯水领域。

本发明的吸附性颗粒优选由多孔球形离子交换树脂来制备。球形离子交换树脂通过悬浮聚合法来制备，该方法中，将包括了单官能基加成聚合单体和自由基聚合引发剂的单体混合物加入液体介质中，随后搅拌，制备单体混合物的悬浮液。然后，将该悬浮液在聚合反应温度下保持一段时间以获得球形交联共聚物。用于水处理的离子交换树脂的直径典型地为300-600μm。

离子交换树脂的聚合物基体可包括聚苯乙烯、聚苯乙烯和苯乙烯共聚物、聚丙烯酸酯、芳基取代乙烯基共聚物、聚甲基丙烯酸酯、苯酚-甲醛、聚烷基胺以及上述的组合，诸如此类。在一个优选的实施方案中，所述聚合物基体为聚苯乙烯和苯乙烯共聚物、聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯，而在另一个实施方案中，所述聚合物基体为苯乙烯二乙烯基苯共聚物。优选地，所述用于制备吸附性颗粒的离子交换树脂所使用的树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)、甲基丙烯酸(MAA)基的。最优选地，所述树脂由以二乙烯基苯交联聚苯乙烯来制备的。

本文使用的阳离子交换树脂可以是弱酸性或强酸性。本文使用的术语“弱酸性阳离子交换树脂”是指这样一种树脂，其经常规方法(例如Fishery等人，J.Phys.Chem.，60，1030(1956))测量的表观解离常数或电离常数(pKa)高于约4.5。其可具有作为交换基团的羧酸基团、酚型羟基团、膦酸基团和胂羧基团。典型地，此种树脂是属于聚丙烯酸类型或聚甲基丙烯酸类型的树脂。优选地，该树脂具有甲基丙烯酸的类型。

各种离子在弱酸性阳离子交换树脂上的吸附强度通常类同于这些离子在强酸性树脂上的吸附强度。对较高价离子的选择性较高。

另一方面，术语“强酸性阳离子交换树脂”是指具有pKa小于约1.5的树脂。强酸性阳离子交换树脂可具有磺酸基团诸如聚苯乙烯磺酸钠或聚2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(polyAMPS)。所述磺酸基团(-HSO₃)是交换基团，其表现的像强酸，甚至在酸性溶液中会离解为(-SO₃)-和H⁺，而在碱性溶液中更是如此。

本文使用的阴离子交换树脂可以是弱碱性或强碱性。本文使用的术语“弱碱性阳离子交换树脂”是指这样一种树脂，其经常规方法(例如Fishery等人，J.Phys.Chem.，60，1030(1956))测量的表观解离常数或电离常数(pKa)高于约8.5。其可具有作为交换基团的伯氨基、仲氨基和/或叔氨基基团例如聚乙烯胺。在另一方面，术语“强碱性阴离子交换树脂”是指具有pKa小于约12的树脂。强碱性阴离子交换树脂可具有作为交换基团的季氨基基团，例如，三甲基胺基团，如聚胺丙基三甲基氯化铵(polyAPTAC)。

技术人员能够选择用于吸附生物分子的阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。有一些能确定生物分子和离子交换剂的吸附能力的参数。具有常规知识的技术人员可以确定何种类型的离子交换剂在何种条件下能够吸附何种生物分子。对吸附剂的选择尤其取决于感兴趣的生物分子的等电点(IEP)和/或其整体亲水性。生物分子溶液pH值和生物分子如蛋白质的等电点(IEP)在很大程度上决定了该生物分子是否能够结合至阳离子或阴离子交换剂。已知的是，蛋白质在其pH值低于生物分子等电点时可结合至阳离子交换剂，而在其pH值高于生物分子等电点时可结合至阴离子交换剂。

可商购的离子交换树脂为：例如Amberlite、Amberjet、Duolite和Imac树脂，由美国宾夕法尼亚州费城的罗门哈斯公司(Rohm&HaasofPhiladelphia,PennsylvaniaUSA)提供；Lewatit树脂，来自德国勒沃库森的拜耳公司(BayerofLeverkusen,Germany)；Dow树脂，来自美国密歇根州米德兰的陶氏化学公司(DowChemicalofMidland,MichiganUSA)；Diaion和Relite树脂，来自日本东京的三菱化学公司(MitsubishiChemicalofTokyo,Japan)；Purolite树脂，来自美国宾夕法尼亚州巴拉辛魏德镇的漂莱特公司(PuroliteofBalaCynwyd,PennsylvaniaUSA)；Ionac树脂，来自美国新泽西州伯明翰盛邦公司(SybronofBirmingham,N.J.USA)；以及来自美国新泽西州西柏林的Resintech公司(ResintechofWestBerlin,N.J.USA)的树脂。

带正电的微粒能够由聚合的阴离子交换树脂来制备。商购的阴离子交换树脂典型地为OH^-或Cl^-的形式。在一个实施方案中，所述阴离子交换树脂是OH^-的形式。该树脂可以为例如“Diaion”阴离子交换树脂，诸如DiaionSA树脂(包括DIAIONSA20A)和DiaionSK树脂(包括DIAIONSK110)(来自三菱化学公司(MitsubishiChemical))、“Amberlite”树脂诸如AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-734和AmberliteIRA-900(来自罗门哈斯公司公司(Rohm&Haas))或“Dowex”树脂诸如Dowex1、Dowex2、Dowex11、Dowex21K、Dowex1x2、Dowex1x4、Dowex1x8和DowexMarathon树脂(来自陶氏化学公司(DowChemicalCo))。优选使用细孔球形离子交换树脂Dowex1x2，Dowex1x4、1x8。阴离子交换树脂中的官能团可包括季胺基团例如苄基三甲铵基团(1型树脂)、苄基二甲基乙醇铵基团(2型树脂)、三烷基苄基铵基团(1型树脂)、二甲基乙醇胺基团(2型树脂)或叔胺官能团。

带负电的微粒可由聚合的阳离子交换树脂制备。可商购的阳离子交换树脂典型地或者是H⁺的形式或者是Na⁺的形式。在一个实施方案中，阳离子交换树脂是H⁺的形式。该树脂可以例如是“Diaion”阳离子交换树脂诸如DiaionPK树脂、DiaionSK树脂(来自三菱化学公司(MitsubishiChemical))或“Dowex”树脂诸如Dowex50WX2、Dowex50WX8和DowexMarathon树脂诸如MarathonC、MarathonMSC(来自陶氏化学公司(DowChemicalCo))。阳离子交换树脂的官能团可包括磺酸基团(-SO₃H)、膦酸基团(-PO₃H)、次膦酸基团(-PO₂H)、羧酸基团(-COOH或-C(CH₃)-COOH)以及上述的组合。在一个实施方案中，阳离子交换树脂中的官能团将会是-SO₃H、-PO₃H或-COOH，而在一个最优选的实施方案中，阳离子交换树脂中的官能团为-SO₃H。

本文使用的聚合物材料可以指聚合物、聚合物的混合物、交联聚合物以及上述的混合物，或者是指聚合物网络。通常，聚合物材料仅被简单的称为聚合物。

本文使用的聚合的阳离子交换树脂是指具有一个或多个基本电荷的质子的聚合物材料，或者是指该大分子本身。聚合的阴离子交换树脂具有一个或多个基本电荷的电子。

本发明所述带正电的微粒是具有至少一个基本电荷的质子的颗粒，更加典型地是，该微粒在相对中性pH下的具有多于一个基本电荷的质子，而在这样的条件下带负电的微粒具有至少一个基本电荷的电子。

当微粒成分中至少有一小部分是离子电荷时，获得带正电或带负电的微粒。

带正电的微粒和带负电的微粒之比可为约0.1：99.9(w/w)至约99.9：0.1(w/w)。例如，该比可为约50：50，但是其也可以是不同的，诸如90：10、80：20、75：25、60：40、40：60、20：80、25：75、10：90等。优选的比为约90：10。

本发明的疏水性微粒优选被研磨过夜，磨碎的树脂在水中悬浮。离心上清液。树脂重新悬浮于盐溶液诸如2M的氯化钠中，离心并丢弃颗粒物(pellet)。转移上清液并再次离心，丢弃上清液。磨碎的树脂于水中重新悬浮，将其转移至试管中。离心树脂，丢弃上清液，树脂于水性清洗液中重新悬浮。清洗顺序为：

-1x50％EtOH(稀释有机残留物)

-3x去离子水(稀释EtOH)

在一个优选的实施方案中，所述微粒以磨碎颗粒的形式存在，这些颗粒的平均粒径小于约10μm，如小于约9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm和1μm。优选地，这些磨碎的颗粒的平均粒径小于约5μm，更优选地，小于2.5μm。优选地，这些磨碎的颗粒的平均粒径大于0.5μm。因此，这些磨碎的颗粒的平均粒径可优选的范围为约10μm至0.5μm、约9μm至约0.5μm、约8μm至约0.5μm、约7μm至约0.5μm、约6μm至约0.5μm、约5μm至约0.5μm、约4μm至约0.5μm、约3μm至约0.5或约2.5μm至约0.5μm。然而，这些磨碎的颗粒的粒径可大于10μm以及小于0.5μm。

吸附性颗粒的制备

通过研磨阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂可获得微粒。优选地，通过研磨所述树脂和调节所述树脂可获得(或获得)本发明所述微粒。

优选调节所述磨碎的颗粒来去除在制备所述树脂过程中所剩余的副产品。典型的用于离子交换树脂的调节方法是本领域已知的且也被供给方进行了描述。

如必要，可进行“调节”来将所述树脂中的H⁺或OH^-转化为Na⁺或Cl^-。在一个实施方案中，通过使用NaCl和水的重复清洗步骤进行调节。在此过程中，可在水中磨碎所述树脂并经离心产生沉淀，这方法有助于去除非常细小的微粒。非常细小的颗粒是通常不沉淀而是漂浮在表面的微粒。正因如此，它们可被倒出或经机械法去除。可选择的，已经以Na⁺或Cl^-形式存在的树脂还可经商业途径获得，以及从供应方获取。

在一个优选的实施方案中，所述微粒通过以下步骤来制备：(a)研磨所述离子交换树脂；(b)将所述磨碎的树脂在水中重新悬浮；(c)允许所述磨碎的树脂产生沉淀；(d)从沉淀的悬浮液的上清液中收集磨碎的树脂；(e)将所收集的磨碎的树脂在约2M的氯化钠中重新悬浮；(f)允许所述磨碎的树脂产生沉淀；(g)从(f)步骤产生的沉淀的悬浮液的上清液中收集磨碎的树脂；(h)允许所述磨碎的树脂产生沉淀；(i)收集(h)步骤产生的磨碎的树脂沉淀物，以及(j)清洗所收集的磨碎的树脂。

研磨

可通过本领域已知的任何方式进行研磨，其包括但不限于，通过诸如研磨机(包括喷射式粉碎机、球磨机、锤式粉碎机等此类)的研磨设备进行研磨，或通过例如研钵及研杵来手动研磨。本文使用的“研磨”是指减少粒径大小的一种操作。技术人员能够很容易地选择研磨方法来制备所述树脂。在一个实施方案中，以自动化方式通过在研钵中移动一个或多个研杵来湿磨该树脂。该研磨过程一直持续到所得到的大部分颗粒的粒径小于约10μm，比如所得到的颗粒粒径小于9、8、7、6、5、4、3、2、1μm。优选地，研磨树脂使得大部分颗粒具有下述的平均粒径。大部分的意思是超过50％，诸如超过60％、70％、80％、90％或95％。在其它的实施方案中，大部分的颗粒具有的平均粒径至少为0.1μm，诸如0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、3μm、4μm和5μm。

技术人员运用本领域的已知方法能够容易地确定所磨碎颗粒的尺寸。随后通过本领域已知的手段和方法能够确定平均粒径。例如，在使用诸如实施例所述的基于软件的尺寸确定法通过光学显微镜能够确定尺寸。所磨碎的树脂的粒径可在放大1000倍下通过估算等效圆直径来确定。分布优选通过比较1％v/v下约100-500个颗粒的直径尺寸来计算。研磨破坏了窄孔并具有增大表面积的效果，这能显著增大生物分子尤其是蛋白质或多肽的结合能力，以及非常快速的结合动力。优选在技术手段，诸如能识别颗粒和测量直径的软件的帮助下确定直径。

当本文使用“重新悬浮”或“悬浮”或其的任何语法形式时，其意为将微粒引入悬浮液中。

当本文使用“允许沉淀”时，其意为允许微粒从流体中沉淀，其中这些微粒被夹带并依靠障碍物停止移动。所述沉淀是由于粒子移动穿过流体时为响应作用于它们上的外力而产生的。该外力可以是重力或通过例如离心机所产生离心加速度，优选后者。

“收集”意为从悬浮液中收获所述微粒。

本文使用的“洗涤”意为减少那些能破坏或干扰所述微粒性能的残留流体。优选地，所述洗涤步骤具有如下顺序：1x50％乙醇；3x水，优选去离子水；1x0.5MNaOH；4x水，优选去离子水；在水中，优选去离子水中重新悬浮。上述每一种流体的体积均超出微粒的体积，优选超出10倍或20倍。

经研磨处理后，可任选例如通过离心、沉淀、过滤或其它本领域技术人员所熟知的任何方法来移除上述优选范围外的颗粒。

采用如实施例4所列出的条件，所述带负电的微粒能够吸附至少5mg，诸如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg的GFP。采用如实施例4所列出的条件，所述带正电的微粒能够吸附至少5mg，诸如至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg的IgG。

令人惊奇的是，已经发现所述磨碎的颗粒的粗糙表面提供的用于吸附的比表面积可相当于具有高结合容量的大型多孔介质如由Bio-RadLaboratories(USA)所开发的Nuvia介质。Nuvia介质包括由Bio-RadLaboratories(USA)所开发的NuviaS介质-在线目录2013，No.156-0311；NuviaQ介质-在线目录2013，No.156-0411或NuviacPrime介质-在线目录2013No.156-3401。

组合物

可通过将带正电的微粒和带负电的微粒以粉末的形式混合、或在悬浮液中混合来制备本申请要求保护的组合物。还可能在分别的悬浮液中制备带正电的微粒和带负电的微粒，然后将所述悬浮液混合。

吸附生物分子的方法

另一方面，本发明涉及使用带正电的微粒和带负电的微粒从流体中获得生物分子。本文所使用的术语“流体”是指趋向于流动的无定型物质。

根据本发明的一个方面，提供了一种从生物流体中获得分子的方法，所述分子优选生物分子，更优选多肽。该方法包括：

a)向所述生物流体中加入带正电的微粒和带负电的微粒；

b)允许所述颗粒形成絮凝物；

c)将所述絮凝物从所述生物流体中移除；

d)从所述絮凝物中解吸所述生物分子，或将步骤c)得到的所述生物流体中的生物分子进行纯化。

在另外一个实施方案中，使用所述带正电的微粒和带负电的微粒使得它们被分别加入所述生物流体中。从而本发明包含如下方法：

a)将带正电的微粒或将带负电的微粒加入至所述生物流体中；

b)将带有相反电荷的微粒加入至所述生物流体中；

c)允许所述颗粒形成絮凝物；

d)将所述絮凝物从所述生物流体中移除；

e)从所述絮凝物中解吸所述生物分子，或将步骤c)得到的所述生物流体中的生物分子进行纯化。

添加微粒

第一步，将所述微粒加入至所述流体中。本发明所公开的吸附剂可用于实验室规模、中试规模或工业规模。本文所使用的“实验室规模”包括从约1或10ml流体至约1000ml的流体(1升大肠杆菌(E.coli)细胞匀浆或发酵上清液，通常对应于约450-550g大肠杆菌的细胞湿重)中间歇吸附生物分子。本文所使用的“中试规模”包括从约1升流体至约10升流体(10升大肠杆菌细胞匀浆或发酵上清液，通常对应于约4.5-5.5kg大肠杆菌的细胞湿重)中间歇吸附生物分子。本文所使用的“工业规模”或大规模包括从约10升流体至约1000升或甚至10000升流体(1000升大肠杆菌细胞匀浆或发酵上清液，通常对应于约4.5-5.5吨大肠杆菌的细胞湿重)中间歇吸附生物分子。

可将所述微粒加入至将从中分离生物分子的生物流体中。应在广义上理解术语“生物流体”。它们是指任何与生物体有关联的流体，诸如从任何生物体中获得或由任何生物体所产生。生物流体的实例包括细胞培养基、发酵上清液、发酵液、细胞悬浮液、细胞裂解液。本文所述生物流体的进一步的实例如上所述。在其它的实施方案中，生物流体还可以是唾液、尿液、淋巴液、前列腺液、精液、血液、血浆、血清、汗液、分泌的粘液、牛奶、牛奶乳清、腹水、器官提取物、植物提取物、动物提取物。在一个优选的实施方案中，所述生物流体是本文所述的任何生物流体，诸如多肽或多核苷酸如质粒DNA、粘粒DNA、BACDNA、微环DNA等，包括来源于各种体内或体外过程的流体，尤其是发酵液、培养液、发酵上清液、培养上清液、细胞匀浆、细胞裂解液或细胞悬浮液。“细胞匀浆”通常被理解为破碎细胞的混合物。可通过机械或化学方法来获得细胞匀浆。例如，可通过常规方法如通过高压匀质化或通过裂解液中的简单涡流来使细胞均匀化从而得到发酵匀浆，所述裂解液包括碱裂解。

因此，本发明还包括包含生物分子、带正电和带负电的微粒或疏水性微粒的流体。在一个优选的实施方案中，在本发明的方法的任一步骤期间和/或之后搅拌所述生物流体，但是当允许颗粒形成絮凝物时和/或当将絮凝物从所述生物流体中移除时优选不在该步骤期间进行搅拌。

在将所述微粒加入至所述生物流体期间和/或之后，能够对它们进行搅拌或振动来获得均匀混合物。在没有理论约束下，假设所述颗粒与所述生物流体混合的同时吸附自然发生了。

在一个优选的实施方案中，先向所述生物流体中加入所述微粒来破坏细胞。实际上，已经令人惊讶地发现，本发明的微粒能够用于破坏细胞和吸附细胞内生物分子，这使得不必要使用例如高压匀质化。带正电的微粒和带负电的微粒的另一种用途是破坏细胞，以及(联合)用于破坏细胞和吸附分子，优选生物分子，优选本文所述的蛋白质或多核苷酸。

絮凝

下一步骤是允许形成絮凝物。已经令人惊讶地发现，所述吸附性颗粒将吸附生物分子并快速与该生物分子形成大直径的絮凝物。一旦吸附生物分子(当先将带正电和带负电的微粒混合，然后再加至所述生物流体)，以及一旦添加带相反电荷的微粒，如果微粒被分别添加，那么在添加后，就会形成絮凝物。

在一个实施方案中，所述带相反电荷的微粒在不同时期被加入。当所述生物分子为酸性时，用于吸附的带正电的微粒可被加入至生物流体中，如细胞裂解液或细胞匀浆。带正电的微粒还可被加入至细胞悬浮液中，其或者以仅能破坏细胞和释放生物分子的量，或者以能够破坏细胞以及吸附所述生物分子的更高的量。技术人员能够确定部分地或完全地破坏细胞所必需的量。带负电的微粒可随后被加入，其作为交联剂以增大絮凝物的粒径和稳定性。可选择地，例如由螯合型阳离子交换树脂所制备的带负电的微粒还可以足以破坏细胞和释放所述生物分子的量先被加入至所述细胞悬浮液中。然后，再加入带正电的微粒来增加絮凝。

在某些情况下，待回收的生物分子可为碱性。此种情况下，带正电的微粒可首先被加入至生物流体例如细胞裂解液或细胞匀浆，以与细胞碎片或其它杂质如DNA、宿主细胞蛋白质和细胞片段一起形成絮凝物。然后，带负电的微粒可被加入以增加絮凝，从而该絮凝物能够容易地被分离和丢弃。然后，该碱性生物分子可从上清液中被去除。可选择地，或者带正电的微粒或者带负电的微粒可被加入至细胞悬浮液中用于细胞破碎，这将导致在上清液中释放生物分子。该上清液可进一步经纯化处理。

所述絮凝物典型地具有100μm或更大的尺寸，这使其可见。这种构造有利于通过重力或过滤来分离包括吸附在其上的生物分子的絮凝物。这意味着其它多余的材料诸如细胞碎片能够容易地经过滤被去除，而不需要通过离心分离。因此，本发明比现有技术的方法更快且更简单。所述微粒是较便宜的材料，使用后可将其丢弃。

此外，所述生物分子通过解吸缓冲液被解吸后，由于所形成的絮凝物的尺寸，其很容易从吸附缓冲液中被分离。

在一个优选的实施方案中，形成絮凝物的平均粒径至少为5μm，诸如至少为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μm或更大。

发明人已经观察到，只有带正电或带负电的微粒的絮凝在生物分子解吸后产生问题。解吸后，所述微粒将形成均匀悬浮液，其中的生物分子不能容易地从被分离出。因此，需要离心机或微孔过滤器来将该生物分子从该颗粒中分离出去。然而，已经惊奇地发现，当另外使用带相反电荷的微粒时，所述微粒即使在解吸后仍然保持絮凝物，因而，即使在更小尺寸时也能容易地通过简单沉淀而从所述生物分子中分离。因此，发明人已经发现，带正电的微粒和带负电的微粒的组合具有意想不到的优势，其允许使用较小直径的微粒。有利地是，使用较小直径(如小于1μm)的微粒允许每体积更多量的生物分子得到处理。此外，本发明允许使用简单的混合澄清槽设备，这提供了简单的操作程序。

去除絮凝物

通常，能够通过过滤、离心、沉淀或其它任何适当的方法将所述絮凝物从液体(如生物流体或缓冲液)中去除。技术人员能够容易地确定使用何种方法能从该流体中分离或解吸该絮凝物。对于中试和工业规模的操作，所述絮凝物的悬浮液能够例如在斗式离心机(实验室规模)、管式离心机、倾析式离心机或者在碟片式离心机(diskstackcentrifuge)中被处理。同样地，可能通过过滤或者通过沉淀或萃取来去除絮凝物残留处的絮凝物。能够通过萃取倾析机、混合沉降器或柱式萃取器来完成解吸。其它对去除有用的方法可以是正切流动过滤、深层过滤、死端过滤或涉及使用压滤机、滤过器的方法。

生物分子的解吸

能够利用本领域已知的任何方法进行解吸。例如，能够通过将絮凝物在缓冲液中重新悬浮来进行解吸，这允许解吸生物分子如蛋白质(解吸缓冲液)。这能够通过使用本领域已知的任何方法来实现，这些方法包括管式(静态)混合器或其它混合设备例如搅拌槽。还能够通过萃取倾析机、混合沉降器或柱式萃取器来进行解吸。

然后，使所述悬浮液经历适合解吸的条件。技术人员能够容易地确定该类用于解吸吸附在所述絮凝物上的生物分子的条件。通常，能够采纳用在常规离子交换色谱法中的解吸方法。例如，能够通过在低于或高于等电点的pH下洗脱或者通过增加盐浓度来完成解吸。

所述生物分子能够通过本领域已知的方法来进一步纯化或富集。这些方法包括，例如，沉淀法、结晶法和/或选自下列的色谱法：疏水作用色谱法、亲和色谱法、假亲和色谱法、阴离子或阳离子交换色谱法和/或尺寸排阻色谱法。因此，在一个优选的实施方案中，本文所述的方法包括通过使用上述沉淀法和/或色谱法来纯化和/或富集该(期望的)生物分子的进一步的步骤，所述生物分子尤其为蛋白质。

最后，回收经本发明的吸附剂所吸附的生物分子。以所有语法形式存在的“回收生物分子”包括获得(obtained)的生物分子、收获(harvested)的生物分子、取得(achieved)的生物分子、收到(received)或得到(gained)的生物分子，其可以是质粒、多聚核苷酸或表达产物诸如肽、蛋白质，包括糖基化蛋白质或翻译后修饰的蛋白质。可分离和/或进一步处理所述生物分子，例如其可通过例如本领域已知的和/或本文其它处所述的手段和方法来纯化。此外，术语回收生物分子还包括破坏宿主细胞以释放产物，优选达到以下程度：可能通过本发明的吸附剂进行吸附，并且使该产物的进一步纯化和/或富集成为可行。

本发明的方法还可包括从所述解吸缓冲液中回收所述絮凝物的步骤。

在一个实施方案中，该方法能够通过下述步骤进行：

-通过例如调节浓度或pH、盐度或稀释生物液体来获得和可选择地制备所述生物液体；

-向所述生物流体中同时或分别加入带正电的微粒和带负电的微粒；

-振动或搅拌；

-允许感兴趣的生物分子吸附/结合；

-允许所述颗粒形成絮凝物；

-通过例如沉淀、离心或过滤从所述生物流体中去除该絮凝物；。

-清洗该去除的絮凝物以分离液体中的残留杂质；

-加入适当的解吸缓冲液；

-振动或搅拌；

-通过例如沉淀、离心或过滤从所述解吸缓冲液中去除所述絮凝物。

-清洗该絮凝物以从该絮凝物中获得残留生物分子；

-从该絮凝物中解吸生物分子。

培养能产生生物分子的细胞(即“产物”)

在应用本发明的吸附剂之前，本文所定义和描述的获得生物分子的方法可任选包括培养(宿主)细胞的步骤，其会产生例如表达生物分子(所述“产物”)，优选表达产物诸如蛋白质或多核苷酸。在本发明的宿主细胞的描述中，在培养基(或者有血清或者没有血清)中，术语“细胞的培养”或“培养细胞”分别是指将细胞接种于培养容器中；是指在贴壁培养的情况下细胞在培养基中生长直至形成单分子层，或在悬浮液培养液的情况下，细胞在培养基中生长直至建立足够的细胞密度；和/或是指一旦形成单分子层时在培养基中维持细胞或是指在悬浮液中维持细胞。在培养基中，术语“细胞的培养”或“培养细胞”还包括使用无血清培养基来进行上述所提及的所有步骤，以便在细胞的整体培养过程中，不存在或本质上不存在动物血清产物。培养细胞可通过指数喂养、或线性、或常数喂养，或其它类型的喂养、补料分批培养或高密度培养来进行培养。还可选择的是，上述提及的步骤还可使用包含血清的培养基进行。

核苷酸序列和/或编码的多肽相对于细胞可以是或可以不是异源的。所谓“异源”的意思是源自具有不同基因组背景的细胞或生物体，或者相对于(宿主)细胞是同源的，但是相比于自然发生对应的所述核苷酸序列，其位于不同的基因组环境。这意味着，如果核苷酸序列相对于宿主是同源的，则它不位于它在所述宿主的基因组中的天然位置，尤其是它被不同的基因所包围。

本文使用的“细胞”是指能够产生生物分子的细胞。所述细胞应用于本发明的方法和用途中。为了这样的目的，如果该细胞是要表达多核苷酸或多肽，则用于产生多核苷酸或多肽的核苷酸序列被引入该细胞。

回收的生物分子中的细胞或者是原核细胞、真核细胞，或者既有原核细胞又有真核细胞。更优选地，应用于本发明的方法中的细胞是包括哺乳动物、鸟类、两栖类、鱼类细胞和昆虫细胞的脊椎动物细胞。该术语细胞还包括真核细胞。典型地，真核细胞为人类细胞系、哺乳动物细胞、鸟类细胞或昆虫细胞。细胞还包括酵母细胞或真菌细胞。然而，该细胞优选为原核细胞，该原核细胞包括来自革兰氏阴性细菌的细菌细胞，例如来自肠杆菌科如大肠埃希杆菌或假单胞菌科如恶臭假单胞菌、荧光假单胞菌的细胞；或来自革兰氏阳性细菌得细菌细胞，例如来自乳酸细菌或芽孢杆菌的细胞。然而，最优选地，该细胞为大肠埃希杆菌。

在本发明一个优选的实施方案中，所述表达产物是蛋白质的产物。本文使用的“蛋白质的”是指任意一组复合有机大分子，其包括碳、氢、氧、氮，通常还包括硫，由一条或多条氨基酸链所组成。优选的蛋白质的表达产物为多肽(感兴趣的)。因此，术语“蛋白质的”还意为与蛋白质相关的、由蛋白质组成的、类似蛋白质的或与蛋白质有关的。在本发明一个更优选的实施方案中，所述产物可以是感兴趣的多肽，其被表达并由此产生。优选地是，所述产物是具有生物活性的。所述蛋白质产物可以是酸性或碱性。

所述表达产物可以是核苷酸序列转录和/或翻译的产物，优选在基因工程的宿主细胞中通过本领域已知的常规手段和方法被外源添加至细胞的核苷酸序列。所述产物可以是包括例如质粒、微环DNA、粘粒、BAC、单链DNA或双链DNA序列或RNA序列(核酶、反义RNA、siRNA、iRNA、miRNA，诸如此类)的核苷酸序列，所有这些能够在所述宿主细胞中产生，或者其可以是通过在细胞中翻译转录的RNA的方式产生的多肽。

“多肽”包括蛋白质、多肽及其片段，所述片段优选是生物活性的。术语“多肽”和“蛋白质”可交替使用，其是指具有任意长度，通常具有多于约10、20或30个氨基酸的聚合物。这些术语还包括通过包括糖基化、乙酰化和磷酸化反应翻译后修饰的蛋白质。所述多肽类可以是融合于用于延长半衰期的融合伴侣的融合多肽，例如作为亲和色谱的亲和标记物的Fc融合、白蛋白融合或融合伴侣，或者用于提供正确的N-末端或用于增加感兴趣的蛋白的产量的融合伴侣。术语“肽”是指较短的氨基酸，通常少于约30个氨基酸。多肽可作为激动剂或拮抗剂，和/或具有治疗或诊断的用途。

此外，尽管也能够生产微生物和酵母产品，但在本发明的细胞中所表达的多肽可以是哺乳动物起源。

哺乳动物多肽或蛋白质的实例包括激素，细胞因子，淋巴因子，抗体如抗原结合片段(Fabs)、纳米抗体、单域抗体(dAbs)、单链抗体(scFvs)，受体，粘附分子和酶及其片段。所期望产物的非详尽的列表包括例如人生长激素，甲状旁腺素，促甲状腺激素，卵泡刺激素生长，黄体化激素，激素释放因子，脂蛋白，α1-抗胰蛋白酶，胰岛素A链，胰岛素B链，胰岛素原，降血钙素，胰高血糖素，分子诸如肾素，凝结因子如VIIIC因子、IX因子，组织因子，血管性血友病因子(vonWillebrandsfactor)，抗凝血因子如蛋白C，心房钠尿因子，肺表面活性物质，纤溶酶原激活物如尿激酶、或人尿、或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)，铃蟾肽，凝血酶，造血生长因子，肿瘤坏死因子α和β，脑啡肽酶，RANTES(正常T细胞表达和分泌的活性调节)，人巨噬细胞炎性蛋(MIP-1-α)，血清白蛋白例如人血清清蛋白，副中肾管抑制物质，松弛素A或B链，前松弛素(prorelaxin)，小鼠促性腺激素相关肽，脱氧核糖核酸酶(DNase)，抑制素，激活素，激素或生长因子受体，整联蛋白，蛋白A或D，类风湿因子，神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，包括血管内皮生长因子(VEGF)的生长因子，神经生长因子如NGF-，血小板源性生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子如aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-5、FGF-6，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，其包括TGF-pl、TGF-p2、TGF-p3、TGF-p4或TGF-p5，胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-11)，des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白，CD蛋白质如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19，红细胞生成素，骨诱导因子，免疫毒素，骨形态发生蛋白(BMP)，干扰素如干扰素α、β和γ，集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF，白细胞介素类(IL)例如IL-1至IL-10，超氧化物歧化酶，红细胞生成素，T-细胞受体，表面膜蛋白例如HER2，诱饵加速因子，病毒抗原诸如例如AIDS包膜部分，运输蛋白，归巢受体，禀呈素，调节蛋白，抗体，嵌合蛋白如免疫粘附素，以及上述所列举任一项多肽的片段。

本文优选的多肽和蛋白质是具有治疗作用的蛋白质，诸如TGF-β、TGF-α、PDGF、EGF、FGF、IGF-I、DNase；纤溶酶原激活剂，如t-PA；凝结因子，如组织因子和VIII因子；激素，如松弛素和胰岛素；细胞因子，如IFN-y；嵌合蛋白，如TNF受体IgG免疫粘附素(TNFr-IgG)或抗体如双特异性抗体、骆驼抗体及其片段、V_HH域抗体、域抗体；免疫球蛋白类，如抗-IgG、抗-IgA、抗-IgM、抗-IgD或抗-IgE。优选的具有治疗作用的蛋白质是人源蛋白质或“人源化”蛋白质，如本文所述的人源化抗体。

如果产物是多肽，该多肽可以优选允许所述多肽分离和/或纯化的异源多肽标记，即融合。所述异源多肽可以例如是组氨酸标签、Flag-标签、链霉亲和素标签、链球菌II标签、内含肽、麦芽糖结合蛋白质、IgA或IgGFc部分、蛋白质A或蛋白质G。

如果所述产物是包括核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列可与异源核苷酸序列融合，该异源核苷酸序列允许所述作为核苷酸序列的表达产物分离和/或纯化。例如，所述异源核苷酸序列能够结合至互补的核苷酸序列，由此允许所述核苷酸序列的分离和/或纯化。当在异源多肽或核苷酸序列的描述中使用“异源”时，其意为多肽或核苷酸序列不同于所需要产物的多肽或核苷酸序列。

作为多核苷酸的实例，如果所述产物为质粒，则所述质粒对于基因治疗或DNA疫苗是有用的，或所述质粒可编码具有治疗作用的蛋白质，例如本文所述的蛋白质。

在另一方面，所述细胞可表达病毒，也就是说该细胞作为生产细胞系能提供例如适当的病毒复制和/或被传播的环境。因此，所述产物可以是病毒。事实上，任何病毒能够被本发明的方法回收，例如dsDNA病毒(例如腺病毒、疱疹病毒,痘病毒类)、ssDNA病毒(例如细小病毒)、dsRNA病毒(例如呼肠孤)、(+)ssRNA病毒(例如小核糖核酸病毒、披膜病毒)、(-)ssRNA(例如正粘病毒、弹状病毒)、ssRNA-RT病毒(例如逆转录病毒)和dsDNA-RT病毒(例如嗜肝病毒)。病毒复制的术语用于描述在靶细胞中的感染和繁殖的过程中形成病毒。从病毒的角度看，病毒复制的目的是为了允许这种类型的病毒的生产和生存。通过产生其基因组的丰富副本以及将这些副本包装到病毒中，该病毒能够继续感染新的宿主。本发明的上下文中，优选地，通过适当宿主细胞产生的病毒不能够或本质上不能够退出宿主细胞，例如通过裂解或萌芽。

如前所述，所述产物可以是病毒。“病毒”包括“天然”病毒和“重组”病毒，其中，“天然”意为从自然中分离但不是通过基因工程(例如临床分离)得到的病毒，或能够在自然(也就是说，自然发生的)中发现的病毒，或典型地建立的病毒株，例如用于免疫目的(例如致弱病毒)。

因此本发明提供了快速、高效和廉价的能够容易地应用于工业规模的方法。

带正电的微粒和带负电的微粒的用途

在另一方面，本发明还涉及带正电的微粒和带负电的微粒的用途。具体而言，本发明提供了带正电的微粒和带负电的微粒或疏水性微粒在吸附分子中的用途，所述分子优选为生物分子，更优选为蛋白质。所述蛋白质优选来自细胞匀浆或来自表达和分泌感兴趣蛋白质的细胞的液体培养基。同样的实施方案适用于所述疏水性微粒。

本发明的手段和方法的描述中所述的实施方案，如做适当调整，同样适用于上述的用途。

试剂盒

本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包括本发明的带正电的微粒和带负电的微粒或疏水性微粒或二者，以及任选地用于悬浮所述的微粒的装置。该试剂盒可包括例如包含所述微粒的离心瓶。

所述微粒可以是粉末的形式，或可选择地，其是在液体培养基中，例如在浆体或悬浮液中。所述微粒优选为非凝胶形式。此外，所述试剂盒可包括装有解吸缓冲液的单独的瓶子。

本发明的带正电和带负电的微粒或疏水性微粒可作为混合物被提供或分别地被提供。后者中，所述带正电的微粒和带负电的微粒分别被加入至所述生物流体中。它们不互相接触直至它们被加入至该流体中。因此，本发明还包括包含带正电的微粒和带负电的微粒的生物流体。

实施例

实施例1：从离子交换树脂中制备微颗粒

不同类型的离子交换树脂购自SigmaAldrich和DIAION。

以下为所使用的阴离子交换树脂：AmberliteIRA-400、AmberliteIRA-743、Dowex1X2-100、Dowex1X2-400、Dowex1X8-100、MarathonA2、DIAIONSA20A、DIAIONSA10A、DIAIONSA312。

以下为所使用的阳离子交换树脂：Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonC、MarathonMSC、DIAIONPK216、DIAIONSK110。

树脂在涂层陶瓷研钵中被手动湿式研磨(1/2小时磨碎20g)约30分钟。磨碎的树脂在水中(添加50ml)悬浮。一段时间(约96小时)后，树脂沉淀物的上清液被移至试管中。上清液在7000rcf下被分段(1ml)离心15分钟直至每个试管有约200μl的树脂被收集。树脂在2M氯化钠(1.5ml)中重新悬浮，并且离心(7000rcf)1分钟。丢弃1分钟离心分离的微粒(除AmberliteIRA-743之外)。转移上清液并再次离心分离15分钟(7000rcf)。丢弃15分钟离心分离后的上清液。将微颗粒(约200μl)也在2M氯化钠中离心分离。将微颗粒(约150μl)和其它磨碎的树脂(50-200μl)在水中重新悬浮(1：4)并且将其中一部分(50μl树脂)移入试管中。

等量的树脂在7000rcf下经离心分离，丢弃上清液，树脂在20倍体积(约1ml)的水性冲洗液中重新悬浮。在溶液中培养的时间为30分钟。

清洗顺序：

-1x50％EtOH(稀释有机残留物)；

-3x去离子水(稀释EtOH)；

-检查接近中性pH；

-微颗粒重新悬浮并在去离子水中磨碎树脂(约70％v/v)；

-在相应的缓冲液中平衡树脂用于特定试验。

使用光学显微镜确定粒径

使用基于软件的尺寸测定法，通过光学显微镜确定所制备的微粒的粒径。通过估算相对直径测量100倍放大下磨碎的材料和微颗粒的粒径。1％v/v下，通过比较1000-5000个颗粒的直径尺寸来计算分布。结果如表1所示。

阴离子交换剂类型	配体	d(mm)	q BSA
				Amberlite IRA-400	-N⁺-(CH₃)₃(类型1)	0.3-1.2	0.3±0.11
Amberlite IRA-743	甲葡糖胺	0.5-0.7	6.1±0.2520 -->
				Dowex 1X2-100	-N⁺-(CH₃)₃(类型1)	0.1-0.5	0.5±0.18
Dowex 1X2-400	-N⁺-(CH₃)₃(类型1)	0.04-0.07	0.8±0.01
				Dowex 1X8-100	-N⁺-(CH₃)₃(类型1)	0.1-0.5	0.4±0.03
Marathon A2	-N⁺-(CH₂-CH₂OH)-(CH₃)₂(类型2)	0.4-0.6	0.2±0.02
				DIAION SA20A	二甲基乙醇胺	0.3–1.18	n.a.
DIAION SA10A	三甲胺	0.3–1.18	n.a.
				DIAION SA312	三甲胺	0.3–1.18	n.a.
阳离子交换剂类型	配体	d(mm)
				Dowex 50WX2-100	-SO₃ ^-	n.a.	n.a.
Dowex 50WX8-100	-SO₃ ^-	n.a.	n.a.
				Marathon C	-SO₃ ^-	1.2	n.a.
Marathon MSC	-SO₃ ^-	1.2	n.a.
				DIAION PK216	酸性硫酸基(Sulphonic)	0.3–1.18	n.a.
DIAION SK110	酸性硫酸基(Sulphonic)	0.3–1.18	n.a.

表1列出了用于制备微粒的树脂。

图1a-b示出了阴离子交换剂Dowex1X8-400的具有代表性的图和评价。如图2所示，获得了所有材料的类似粒径范围。

形态学

通过AFM测量来可视化由MARATHONA2和MARATHONMSC制备的微粒。样品以乙醇清洗并在显微玻璃载片上干燥。使用开放源代码软件Gwyddion(v2.30)来可视化与分析由AFM测量产生的数据。

实施例2：使用由NETZSCH公司提供的实验室研磨机制备微粒

使用NETZSCHLabstarLS1研磨机湿研磨MarathonMSC树脂。2kg树脂与3kg水混合。经200分钟后达到1μm的d₅₀。在研磨过程中利用动态光散射仪分析尺寸分布。

由于较高的机械稳定性，MARATHONA2树脂经涂层陶瓷研钵预研磨12小时，随后使用NETZSCHLabstarLS1研磨机湿研磨，。

图5a-b中绘制了研磨处理的持续时间与MarathonMSC的尺寸分布以及平均直径(d₅₀)之间的图。研磨期间的尺寸分布开始分散，从200分钟时变窄，在约300分钟成为单峰。在这阶段的平均直径为约300nm。MarathonMSC经LabstarLS1研磨机研磨至其全部的d₅₀为1-2μm，通常产生至少一个双峰分布。200分钟时，在全部的1μm的d₅₀中，1-2μm的d₅₀的颗粒部分约占30％。小于1μm的颗粒约占55％，而约15％颗粒的d₅₀在2μm和5μm之间。给出的百分比作为各自的体积分数(v/v)比率。在使用LabstarLMZ(2mm珠)研磨之前，使用LME30研磨机研磨MarathonA2至d₅₀为～4μm(5mm珠)引起1μm的d₅₀的单峰分布。

实施例3：微粒的吸附动力学

从Dow得到的等量的磨碎形式的树脂在7000相对离心力(rcf)下经离心分离，丢弃上清液，树脂在10倍量(约1ml)的水性冲洗液中重新悬浮。在溶液中孵化的时间为30分钟。该冲洗如下列进行：

-1x50％EtOH(稀释有机残留物)；

-3x去离子水(稀释EtOH)；

-1x0.5MNaOH(置换阴离子为OH^-)；

-4x去离子水(稀释组织液中的阴离子)；

-微粒在去离子水中重新悬浮(约20％v/v)。

吸附动力学由间歇吸附以及在不同的、很短的时间间隔内抽取样品来确定。将胰蛋白抑制剂(TI)和IgG的储备液调整为20mMTris，pH7.5中5mg蛋白质/ml。各蛋白质的另外的储备液以缓冲液稀释至浓度达到0.1和0.5mg蛋白质/ml。将微粒(20％v/v)稀释达到20mMTris，pH7.5中4％v/v。估算微粒的容量，调节添加的微粒的量以在平衡处吸附蛋白质量的一半。试验的最终总体积为10ml。该体积被分成两个5ml的半份(第一个半份包含蛋白质，第二个半份包含微粒)。这两个半份以0.25ml的部分在SpinX离心管中进行混合，其中在不同时间间隔内进行培养。经过所定义的时间间隔后，过滤该混合物以阻止蛋白质吸附在微粒上。所吸附的蛋白质的量通过在微孔板上测量280nm处的吸光度来确定。

如图4所示，吸附动力学非常快。在不到10秒钟内达到几乎90％的平衡容量。因此，蛋白质种类的差异不能通过实验观察得到。通过使用适当的吸附模型来量化也是不可能的。使用类似的试验条件的常规色谱材料显示在30分钟至6小时的时间段内不能达到平衡。该观察支持了SEM测量的结果：所述微粒不具有中孔。

实施例4：平衡容量

实施例4.1

实施例1制备的微粒用于吸附胰蛋白酶抑制剂(TI)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)以及绿色荧光蛋白(GFP)。评估平衡容量和吸附等温线。调节胰蛋白抑制剂(TI)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白G(IgG)和绿色荧光蛋白(GFP)的储备液至约1mg蛋白质/ml。吸附条件为：20mMTris，pH8.0；或20mM醋酸钠(NaAc)，pH6.0。磨碎的树脂(10％v/v)被添加至各自的1ml的蛋白质溶液中，在约23℃、20rpm翻滚转动下培养。30分钟后从试管中拿出1ml的样品，以0.2μm过滤。通过在微孔板上测量280nm处的吸光度或在GFP情况下通过荧光来确定所吸附的蛋白质的量。

图6显示了不同阴离子交换微粒对胰蛋白抑制剂(图6a)和BSA(图6b)的平衡容量。DIAIONSA20和DIAIONPA312显示出几乎相同的容量，而DIAIONSA10的容量较低。

图7显示了不同阳离子交换微粒对于溶菌酶(图7a)和多克隆的IgG(图7b)的平衡容量。NuviaS作为参考被包含在内，代表常规珠状材料。相比于Dow树脂(40-100mg/ml)以及还相比于NuviaS(约150mg/ml)，这两种阳离子交换剂DIAIONPK216和DIAIONSK110具有显著较低的容量(15-25mg/ml)。

图8显示了不同阴离子交换微粒对于来自渗滤的GFP匀浆的GFP的平衡容量。MarathonA2、DIAIONSA20和DIAIONPA312(40-50mgGFP/ml)的容量几乎相等，而DIAIONSA10具有降低的～20-25mg/ml的容量。

实施例4.2

在提高的盐水平(电导率为约3.5mS/cm和约17mS/cm之间)下评估MARATHONMSC和NuviaS(Biorad)的平衡容量。与NuviaS相比，多克隆IgG对于MARATHONMSC的平衡容量在整个盐浓度范围内几乎保持不变。这显示磨碎的微粒由此非常适合于从细胞培养上清液中直接捕获IgG。图9描绘了对于NuviaS树脂(图9a)和MARATHONMSC微粒(图9b)的多克隆IgG的平衡容量相对于吸附缓冲液电导率之间的图。

实施例5：吸附和粒径

研究粒径对平衡容量的影响。在对向流中制备所述微粒或分次离心分离所述微粒来获得不同尺寸的微粒。

图10中，描绘了MarathonMSC对于多克隆IgG的容量相对于平均粒径(d₅₀)之间的图。如图所示，尽管小于1μm微粒可能会引致较高的容量，但该容量从2μm的d₅₀处大幅度减少。然而，这种限制可通过包括带相反电荷的微粒来克服。

实施例6：从大肠杆菌匀浆中吸附/解吸GFP

使用MARATHONA2并通过以下步骤从大肠杆菌匀浆中间歇吸附重组GFP。

细胞破碎：

冷却大肠杆菌细胞悬浮液至4℃过夜，在4000rcf、4℃下离心分离15分钟。丢弃上清液，细胞颗粒在50mMTris，pH7.5，50mMNaCl中悬浮至165g湿量/kg(～30g干量/kg)。细胞在1000bar下通过两个通道高压匀质化而被破坏。匀浆于10000rcf和4℃下离心分离30分钟，上清液经0.2μm过滤。匀浆经50mMTris，pH7.5，50mMNaCl稀释为1：5并于4℃下保存。

吸附/解吸

在试管中，将小规模1ml，～1mg/mlCGFP在具有1.5μmd₅₀(MA2)的磨碎的DowexMarathonA(氯化物形式)上进行间歇吸附/解吸。匀浆的起始电导率为～9mS/cm。向1ml的匀浆中加入100μl的50％v/v的MA2。样品在旋转振动筛上经培养至少15分钟。之后样品在7000rcf下经离心分离5分钟(吸附)或15分钟(解吸)，上清液被移入其它试管中。1ml的缓冲液被加入到微粒中，树脂经激烈搅拌悬浮。

方案：

吸附

-1ml匀浆

-1ml50mMTris，pH7.5；

洗脱

-1ml50mMTris，pH7.5，0.5MNaCl；

再生

-1ml50mMTris，pH7.5，1.0MNaCl；

-1ml50mMTris，pH7.5，2.0MNaCl；

清洗

-3x1mlddH₂O

所有的步骤重复三次，但是树脂和试管不变(通过01-03)。

分析

通过荧光法(微孔板)、SDS-Page密度法(银染和考马斯染色)和Picogreen测试(微孔板)来量化绿色荧光蛋白(GFP)、宿主细胞蛋白(HCP)和双链DNA(dsDNA)。

GFP的确定

在微孔板中将样品稀释为1：2、1：4、1：8和1：16。在485nm激发波长和535nm发射波长处测量荧光。使用高达18000FLU(约80μgGFP/ml)的GFP标准校准液(GFPstandardcalibration)来确定浓度。

双链DNA(dsDNA)的确定

在微孔板中将样品稀释为1:2、1:4、1:8和1:16。运用PicogreenDNA检测通过在485nm激发波长和535nm发射波长处测量荧光来确定dsDNA。使用高达10000FLU(约10μgdsDNA/ml)的λdsDNA标准校准液来确定浓度。

内毒素的确定

通过端点荧光分析(PyroGene，rFCEndotoxinDetectionSystem，Lonza)测量内毒素。

HCP的确定

通过在SDS样品缓冲液4x(25％)，2MDTT(10％)中稀释(65％)并在100℃下加热10分钟来制备电泳样品。使用MES-SDS电泳缓冲液在NuPage10-20％丙烯酰胺凝胶(200V，400mA，50min)中进行电泳。使用酸甲醇溶液将蛋白质固定在凝胶上10分钟，使用Coomassie-Bismarkbraun(ChoiJ-K，YoonS-H，HongH-Y，ChoiD-K，YooG-S(1996)AnalBiochem236:82)染色。通过光密度分析来确定染色的光密度并计算蛋白质每一条可见条带的光密度。通过该分析来估算能代表其它所有蛋白质的GFP纯度和HCP的量。

研究MARATHONA2微粒在高盐浓度下非变性再生后间歇吸附/解吸的重复性(3次，通过01-03)。结果示于图11a-c。尽管在每次之间GFP和HCP的结合力未显著变化，但是dsDNA的结合力从通过01次到通过03次稳定减少。图11显示在通过01、02和03吸附、洗脱和再生步骤后，磨碎的DOWEXMATATHONA2(MA2)的GFP、HCP和dsDNA的回收率(％)。

自制微颗粒的洗脱部分显示GFP回收率接近100％，与此同时，约60-70％的宿主细胞蛋白(HCP)被移除。在洗脱液(dsDNA在高盐条件cNaCl>1M下被回收)中没有发现双链DNA(dsDNA)。通过使用2MNaCl再生不能使微颗粒的结合力完全得到恢复。

在吸附/洗脱试验期间，评价上清液的内毒素浓度。吸附条件为20mMTris，pH7.5，100mMNaCl。在20mMTris，pH7.5下进行洗脱。使用20mMTris，pH7.5，100mMNaCl将滤过的细胞匀浆稀释为1：20。产生的GFP的浓度为0.5mg/ml。图12中描绘了在吸附和洗脱期间来自100μLMARATHONA2微粒(MA2)的内毒素的回收。在高达1000mMNaCl的盐水平下达到5个对数去除率。2MNaCl再生未被研究。

实施例7.1：多克隆IgG的吸附

在不同pH值和盐浓度(pH5.0和6.0；50mM至100mMNaCl)下，多克隆IgG在MARATHONMSC上被吸附。如实施例4所描述的，蛋白质浓度在0.3和1.3mg/mL之间变化，MARATHONMSC用于吸附多克隆IgG。总固体浓度在0.5％和2％之间变化。IgG浓度在0.2mg/mL和1.3mg/mL之间变化。所述吸附条件或者为20mM醋酸钠，pH5.0；或者为20mMMES，pH6.0。氯化钠浓度或者为50mM或者为100mM。洗脱条件为20mM磷酸钠，pH7.0和1MNaCl。在混合罐(EasyMax，MettlerToledo)内部进行沉淀。使用光学离心机(LumiSizer,L.U.MGmbH,Berlin)测量沉淀行为。

吸附步骤后形成絮凝物。样品使用5mL移液管(最小顶圆直径3mm)移取。2％固体浓度的絮凝的MARATHONMSC的典型实例如图13.1示出。

将MARATHONA2加入至MARATHONMSC(两种树脂体系；TRS)对形成的絮凝物的铃动力直径的影响以及因此对沉降速度(相对离心力平均290下)的正态分布的影响得到了进一步评价。图13.2显示了相对于MARATHONA2与MARATHONMSC不同体积比下10％百分位(90％的絮凝物较大)的铃动力直径的箱线图。将10％的MARATHONA2添加至MARATHONMSC对沉降速度(相对离心力平均290下)的正态分布和三个参数的高斯曲线的拟合参数的影响得到了进一步评价。图14.1描绘了采用拟合高斯曲线的絮凝的MARATHONMSC微粒的速度分布图。以吸附的多克隆IgG(圆形符号、红色虚线)单独以及添加了10％的MARATHONA2(三角符号，绿色实线)进行絮凝。平均沉降速度从150μm/s+/-39.0增加至2874μm/s+/-580。

吸附后添加MARATHONA2。使用光学离心机(LumiSizer，L.U.MGmbH,，Berlin)记录数据，使用SepView软件(LumiSizer，L.U.MGmbH，Berlin)分析数据。使用斯托克斯定律计算铃动力直径。假设计算中密度为1.5g/mL。使用matplotlib和scipy软件分别进行绘图和拟合。1.5倍四分位范围处描绘须线(Whisker)。本发明人由此已经惊奇的发现，通过加入10％MARATHONA2，实现了铃动力直径增加了一个数量级。铃动力直径的中值从0.7μm增加至40μm。尽管铃动力直径随着工艺条件的改变而改变，但如果工艺条件保持不变(其为比率为0.2的情况)，它仍然在一个精确的范围内。

可通过在吸附蛋白质之前或之后加入带相反电荷的微粒来实现以相反电荷的微粒进行絮凝。由于静电相互作用而形成大的絮凝物。

通过倒置离心管，MARATHONA2和MARATHONMSC之间形成的絮凝物能够容易地重新悬浮。

据发现，如果在吸附步骤后形成絮凝物，则MARATHONA2数量优选低于20％至30％的MARATHONA2。否则，MARATHONA2颗粒可以保持非絮凝。

在pH6.0和100mMNaCl下絮凝2分钟或更短时间对于多克隆IgG、MARATHONMSC和10％MARATHONA2似乎代表优选条件(在沉降速度方面)。微粒尺寸可在0.1μm和2μm(d₅₀)之间。在这些条件下，能够达到高比表面积和简单沉降行为的组合。

实施例7.2：通过使用磨碎的MarathonMSC和磨碎的MarathonA2从CHO细胞培养液中回收和纯化IgG。

在应用TRS(吸附IgG之前或之后向磨碎的MarathonMSC中加入磨碎的MarathonA2)中能够避免选择性的损失。如果例如用CIEX树脂捕获带正电荷的蛋白质(如IgG)，该树脂随后以AIEX树脂絮凝，则杂质如DNA或HCP也将发生结合而最终与靶蛋白共同洗脱。在从CHO细胞上清液和DNA中捕获IgG的情况下，能够观察到这种影响。IgG对离子交换剂具有高亲和性，由此只能在高盐浓度(1M盐，如NaCl)下进行洗脱。不幸的是，在1M盐浓度下，DNA将共洗脱，图14.2描述了该过程。使用2MHCl将细胞上清液的pH调节至6.0。随后将大约80μl的50％(v/v填充床)的MarathonMSC悬浮液加入至2mL的细胞上清液中，在旋转振动器上以20rpm进行2分钟后，加入8μl和40μl之间的MarathonA2(v/v填充床)。也就是说，MarathonA2与MarathonMSC的容积比率范围为10％至50％。所有的微粒在超纯水中悬浮。絮凝的微粒在1000rcf下离心分离5分钟后被分离。该微粒在0.5mL，50mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液中重新悬浮。这些微粒在1000rcf下离心分离5分钟后被分离。使用包含1MNaCl的0.5mL，50mM，pH7.0的磷酸盐缓冲液来进行洗脱。在所有的情况下，60-80％的原始CHO细胞上清液的DNA与IgG共洗脱。

在IgG被吸附到磨碎的MarathonMSC/磨碎的MarathonA2之前，为规避这种选择性的损失，CHO细胞与AIEX微粒发生絮凝。然后，该细胞能够容易地被分离。可能在几分钟内通过沉淀或者以5g和50g之间的相对离心力离心分离，来分离絮凝的细胞。杂质如DNA和其它带负电的蛋白质将结合至AIEX树脂。流程图14.3描述了这种方法。350μL的50％(v/v填充床)的MarathonA2悬浮液被加入至10mL的CHO上清液。在所选择的量以下，CHO细胞不完全絮凝并且分离效率降低。然后，所形成的絮凝物在5和50rcf之间的相对离心力下通过离心被分离。IgG的捕获和洗脱如前述段落中所述的来进行。

在以磨碎的MarathonA2絮凝细胞之后所获得的细胞上清液中几乎没有DNA，与此同时，在细胞捕获步骤期间，大约60％的宿主细胞蛋白质被分离。总得来说，超过87％的宿主细胞蛋白质可被分离。结果如表2所概括。

根据图3，表2测量了在捕获和洗脱过程中的IgG、DNA和宿主细胞蛋白质的浓度。使用以下方法来测量浓度：IgG：280nm处使用UV检测的SEC色谱分析法。DNA：Picogreen分析(Invitrogen)。宿主细胞蛋白质：HCP-ELISA(Cygnus)。使用包含1MNaCl的20mMPO₄缓冲液进行洗脱。

IgG的洗脱

由于IgG对MarathonMSC的高亲和力，其进行洗脱可能是困难的。离子交换剂的洗脱离子的亲和力越高，完全回收所需要的量越少。使用1MKCl与使用1.5MNaCl具有类似的影响。大于95％的IgG可使用20M的包含1MKCl的pH7.0的PO₄缓冲液进行回收。使用MarathonMSC和单克隆IgG的洗脱实验结果绘制于Fehler！Verweisquellekonntenichtgefundenwerden。

实施例8：与商购微球的比较

将磨碎的MarathonA2和MarathonMSC的吸附容量与具有类似官能团的阳离子交换剂CIEX(Polysciences硫酸盐微球1.00μm)和阴离子交换剂AIEX微球(微球白色功能化微球K6-100)进行比较。通过光学显微镜以1000x放大率确定颗粒尺寸。在<0.1mS/cm的ddH₂O中根据电泳迁移率(基于斯莫卢霍夫斯基公式)来估算zeta电势，该电泳迁移率通过MalvernZetaSizer纳米系列仪器上的动态光散射来测量。

如图所示，这些微球在尺寸上类似(图15)并且具有相似的zeta电势(图16)。

评价GFP对AIEX微球和磨碎的MarathonA2的结合容量，而评价多克隆IgG对CIEX微球和磨碎的MarathonMSC的结合容量。GFP和IgG的吸附条件分别为50mMTRIS，pH8.0和50mMMES，pH6.0。平衡蛋白浓度为约0.1mg/ml树脂。

使用如实施例4所描述条件来评价GFP对AIEX(带正电的微粒)的结合容量和多克隆IgG的结合容量。

虽然这些磨碎的微球在尺寸上类似(见图15)且对微球具有类似的zeta电势，但是它们的结合力被证明高出商购得到的微球很多。图17显示了磨碎的微粒的蛋白质结合力优于商购微球。

实施例9：疏水性微粒

制备疏水性微粒

吸附型树脂由DOW提供：AmberliteXAD4、AmberliteXAD7HP和AmberliteXAD761购于SigmaAldrich，Vienna，Austria，2011。

使用电动机驱动陶瓷涂层的研钵研磨树脂过夜(20g，～12小时)。研磨的树脂在水中(～10％v/v，添加50ml)悬浮。上清液在4000xg(相当于相对离心力)下离心30分钟。树脂在离心1分钟(4000xg)的2M氯化钠(50ml)中重新悬浮。丢弃离心1分钟后微粒。转移上清液，再次离心30分钟(4000xg)，丢弃上清液，磨碎的树脂在水中重新悬浮(1：2)，移入试管。在4000xg下离心树脂，丢弃上清液，树脂在50ml水性清洗液中重新悬浮。

清洗顺序为：

1x50％EtOH(稀释有机残留物)

3x去离子水(稀释EtOH)

疏水性微粒的粒径

通过测量1％v/v和600x倍放大下约500个颗粒的亮视野显微镜影像来从当量圆直径计算微粒的粒径分布。

微粒和常规色谱介质吸附/解吸的常规方案。

在1mL批量(匀浆或标准蛋白质溶液)中进行解吸和吸附的研究。将50％(v/v)微粒悬浮液(以μL计)的各种量加入2mL试管中的蛋白质溶液中。与蛋白质浓度和导电率相关的稀释因子被考虑在内。

培养微粒悬浮液30分钟，培养常规色谱介质悬浮液12小时。然后将微粒或常规色谱介质在7000xg下离心10分钟，通过加入1mL洗脱缓冲液进行结合蛋白洗脱，充分混合，培养30分钟。在某些情况下，包括使用洗脱缓冲液的第二步清洗步骤。洗脱后，微粒或常规色谱介质如前述被再次离心。上清液中的蛋白质浓度通过光度分析被量化，靶蛋白的纯度由SDS-PAGE检查。

实施例10

通过以下步骤，使用带正电的微粒(MPs)(磨碎的色谱树脂MARATHONA2(MA2))和带负电的微粒(MPs)(MarathonMSC(MMSC))从大肠杆菌匀浆中间歇吸附重组GFP。本实例使用GFP作为酸性细胞内可溶蛋白。

大肠杆菌菌株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)以5L规模分批补料工艺进行发酵。使用IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导细胞内可溶靶蛋白GFP(绿色荧光蛋白)表达。

收获和匀质化：将大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，在15000g下离心20分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒进一步处理。该细胞颗粒在50mMTris，pH7.5中重新悬浮，并稀释为生物质含量为20％wt的细胞/缓冲液。细胞通过高压匀质化在1000bar下被破坏两个通道(twopassages)，产生粗细胞裂解物。

还可能使用冷冻的生物质从所述裂解物进行间歇吸附。这种情况下，该生物质(20％w/v)在50mMTris，pH7.5中重新悬浮，其应用的破坏程序还可与新鲜发酵的大肠杆菌细胞在这种情况下的破坏程序相同。

室温下(rt)，以1mL体积的小规模在试管以及以高达100mL的规模在玻璃烧杯中进行间歇吸附。将MA2加入粗细胞裂解物中(每1μg细胞颗粒中加入1.2μL的50％v/vMA2)，在实验室漩涡混合器中混合～5秒，或在更大规模中以顶置式电子搅拌器混合～30秒。混合过程中，絮凝发生，MA2结合至靶蛋白以及杂质如DNA、hcp(宿主细胞蛋白质)和细胞片段。经过首次絮凝后，向混合物中加入带负电的MPs。那些带相反电荷的MPs作为交联剂会增大絮凝物的粒径和稳定性。该絮凝物能够被离心分离或过滤。

清洗中，该絮凝物的颗粒在含75mMNaCl、pH7.5的50mMTris清洗缓冲液中再悬浮。经短时培养后，使用离心(13400g，3分钟)来分离该絮凝物。当使用过滤工艺进行分离时，滤饼不会再悬浮，而是通过穿过滤饼过滤清洗缓冲液来清洗滤饼(1.5bar，0.2μm滤板)。丢弃该上清液，进一步处理该颗粒/滤饼，用于洗脱步骤。低盐浓度能够洗脱结合强度低的杂质。

洗脱步骤中，经过清洗的絮凝物在含有400mMNaCl、pH7.5的50mMTris缓冲液中再悬浮。该絮凝物在平底杯中混合5分钟。在400mMNaCl浓度下，该靶蛋白从MPs洗脱，现在存在于上清液中。该上清液通过使用离心(13400g，3分钟)或经死端过滤(1.5bar，0.2μm滤板)被分离。丢弃包含结合了杂质的MPs的颗粒/滤饼，包含感兴趣的蛋白质(GFP)的上清液进行进一步处理。

实施例11

通过以下步骤，使用带正电的微粒(MPs)(磨碎的色谱树脂MARATHONA2(MA2)和带负电的微粒MarathonMSC(MMSC)从大肠杆菌匀浆中间歇吸附重组GFP。本实施例使用GFP作为酸性细胞内可溶蛋白质。

收获和匀质化：将大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，在15000g下离心20分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒进一步处理。该细胞颗粒在50mMTris，pH7.5中重新悬浮，稀释为质含量为20％wt的细胞/缓冲液。细胞通过高压匀质化在1000bar下被破坏两个通道，产生粗细胞裂解物。

室温下(rt)，以1mL体积的小规模在试管以及以高达100mL的规模在玻璃烧杯中进行间歇吸附。将MA2加入至粗细胞裂解物中(每1μg湿细胞微粒中加入1.2μL的50％v/vMA2)，在实验室漩涡混合器中混合～5秒，或在更大规模中以顶置式电子搅拌器混合～30秒。混合过程中，絮凝发生，MA2结合至靶蛋白以及杂质如DNA、hcp(宿主细胞蛋白质)和细胞片段。经过絮凝后，该样品在13400g下经离心3分钟或在具有顶置式压力的死端过滤器中经1.5bar、0.2μm滤板过滤。丢弃该上清液，该颗粒/滤饼进行进一步处理，用于清洗步骤。

该絮凝物的微粒在含75mMNaCl、pH7.5的50mMTris清洗缓冲液中重新悬浮。经短时培养后，使用离心(13400g，3分钟)来分离该絮凝物。当使用过滤工艺进行分离时，滤饼不会重新悬浮，而是通过穿过滤饼过滤清洗缓冲液来清洗滤饼(1.5bar，0.2μm滤板)。丢弃上清液，进一步处理该颗粒/滤饼，用于洗脱步骤。低盐浓度能够洗脱结合强度低的杂质。

洗脱步骤中，经过清洗的絮凝物在含有能够洗脱靶蛋白的盐浓度的50mMTris缓冲液中重新悬浮。现在将该悬浮液与带负电的微粒混合以产生更加稳定的絮凝物。(每1μg湿细胞颗粒中0.06μL的50％v/vMarathonMSC)所述靶蛋白从MPs中洗脱，现在存在于上清液中。该上清液可经离心或经死端过滤(1.5bar，0.2μm滤板)被分离。丢弃包含结合了杂质的MPs的颗粒/滤饼，包含感兴趣的蛋白质的上清液进行进一步处理。

实施例12

本实施例演示了使用来自磨碎的MARATHONA2(MA2)树脂的MPs从细胞匀浆回收重组表达碱性蛋白。蛋白干扰素γ、IFN-γ作为实例用于细胞内可溶性表达碱性蛋白。本实施例显示，带正电的交换树脂能够通过结合至多余的细胞结构和细胞内物质(被称为负净化)而用于回收生物分子。

通过分批补料发酵，IFN-γ在大肠杆菌中被表达为细胞内可溶的。

收获和匀质化

使用表达了干扰素γIFN-γ的细胞的冷冻生物质(20％w/v)，并在裂解缓冲液(20mMTris，10mMEDTA，1M尿素，0.1％β-巯基乙醇)中重新悬浮。细胞经950bar高压匀质化破坏三个通道，产生粗细胞裂解物。该细胞破碎也会以新鲜生物质来运作。

靶蛋白的负净化

室温下(rt)以2mL体积的小规模在试管中进行间歇吸附。该粗细胞裂解物与MA2混合，在实验室漩涡混合器(每1μg湿细胞颗粒含0.84μL的50％v/vMarathonA2)中混合～5秒。混合过程中，絮凝发生，其中MA2结合带负电的杂质，如DNA、hcp(宿主细胞蛋白质)和细胞片段。

第一次絮凝后，向混合物中添加带相反电荷的MPs(每1μg湿细胞颗粒含0.042μL的50％v/vMarathonMSC)，进行第二步混合的步骤。这些带相反电荷的MPs作为交联剂增加该絮凝物的粒径和稳定性。该絮凝物可经离心分离或过滤。丢弃包含结合了杂质的Mps的颗粒/滤饼，包含感兴趣的蛋白质的上清液进行进一步处理。

实施例13

本实施例显示了使用带正电和带负电的MPs(MA2和MMSC)从完整的大肠杆菌细胞中提取酸性带电细胞内重组蛋白。

大肠杆菌菌株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)和BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)通过5L规模分批补料工艺进行发酵。使用IPTG(异丙醇β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导表达细胞内可溶靶蛋白GFP(绿色荧光蛋白)。

收获所述细胞，在4℃下置于袋中储存过夜(～12小时)。将该大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，15000g下离心20分钟，后以50mM，pH7.5同时包含相同的生物质含量的Tris缓冲液重新悬浮，但是。

细胞絮凝物和蛋白质萃取

第一次絮凝中，带正电的MPs被加入至所述细胞悬浮液(每1mL细胞悬浮液含102μLMA2(50％v/v)，湿生物质含量30％)来结合和絮凝大肠杆菌细胞。当MPs与该细胞接触时，就会发生萃取，该靶蛋白(在这里为GFP)将在上清液中积累。经过培养2-3小时后完全萃取，所述带负电的MPs(带负电的MarathonMSC：在30％湿的生物质含量处每1mL细胞悬浮液5.4μL)被加入到絮凝的细胞。絮凝物的粒径增加，且该絮凝物的稳定性会增加。第二次絮凝步骤之后，能够使用过滤或离心来分离絮凝物。丢弃细胞颗粒/滤饼，进一步处理包含靶蛋白的上清液。

在第一次将带负电的MPs加入后，该上清液具有未结合的MPs(MA2的情况下)所引致的乳浊度。当带相反电荷的MPs(MMSC)被加入至该混合物后，所述浊度即消失，这说明了第二次絮凝步骤，细胞结合至MA2-MPs，这被带相反电荷的MPs(MMSC)稳定化。

实施例14

使用带正电的MPs(DIAIONSA20A)和带负电的MPs(DOW50WX2-100)来提取GFP。

如实施例1所述，带正电的MPs由DIAIONSA20A所制备，带负电的MPs由DOW50WX2-100所制备。

大肠杆菌菌株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)和BL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)在5L规模分批补料工艺中发酵。使用IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导表达细胞内可溶靶蛋白GFP(绿色荧光蛋白)。

收获所述细胞以及于4℃下袋中储存过夜(～12小时)。大肠杆菌悬浮液(生物质含量～30％wt)冷却至4℃，15000g下离心20分钟，后以50mM，pH7.5同时包含相同的生物质含量的Tris缓冲液重新悬浮。

第一次絮凝中，带正电的MPs被加入至所述细胞悬浮液来结合和絮凝该大肠杆菌细胞。当MPs与该细胞接触时，就会发生萃取，该靶蛋白(在这里为GFP)将在上清液中积累。经过培养2-3小时后萃取完全，所述带负电的MPs被加入到絮凝的细胞。该絮凝物的粒径增大，该絮凝物稳定性增加。经过第二次絮凝步骤后，该絮凝物可通过过滤或离心而被分离出。丢弃该细胞颗粒/滤饼，该包含靶蛋白的上清液经进一步处理。

实施例15

使用带正电的MPs(DIAIONSA312)和带负电的MPs(DOW50WX8-100)萃取GFP。

如实施例1所述，带正电的MPs由DIAIONSA312制备，带负电的MPs由DOW50WX8-100制备。

第一次絮凝中，带正电的MPs被加入至所述细胞悬浮液来结合和絮凝所述大肠杆菌细胞。当MPs与该细胞接触时，就会发生萃取，该靶蛋白将在上清液中积累。经过培养2-3小时后萃取完全，所述带负电的MPs被加入到絮凝的细胞。该絮凝物的粒径增大，该絮凝物稳定性增加。经过第二次絮凝步骤后，该絮凝物可通过过滤或离心而被分离出。该细胞颗粒/滤饼被丢弃，该包含靶蛋白的上清液经进一步处理。

实施例16：比较多克隆IgG对磨碎的MarathonMSC以及磨碎的MarathonMSC和磨碎的MarathonA2的混合物的结合容量

将多克隆IgG分别在50mM，pH6.0的包含50mMNaCl的MES和50mM，pH6.0的包含100mMNaCl的MES中吸附在磨碎的MarathonMSC(d50＝1μm)上。在一种情况中，在吸附步骤前(双树脂体系；TRS)，该树脂以磨碎的MarathonA2絮凝。在另外的情况中，只有MarathonMSC用于吸附蛋白质(单树脂体系；ORS)。将MarathonA2与MarathonMSC之间的比率调整为0.4。其它比率范围还可能为0.01至0.99。在旋转振荡器中进行吸附15分钟。随后该颗粒经离心被分离出。随后使用孔隙宽度为0.2μm的注射式过滤器进行过滤步骤以保证没有颗粒干扰该蛋白质的测量。通过在微量滴定板中280nm处的UV吸收来测定蛋白质浓度。该结果绘制于图18中。

使用ORS与TRS的蛋白质容量相当。多克隆IgG吸附之前，絮凝不会降低多克隆IgG的最大蛋白质容量。

所使用的多克隆IgG为：Octagam5％(OctapharmaAG)，通过使用相应的缓冲液稀释5％溶液来制备溶液。

Claims

1.一种包含带正电的微粒和带负电的微粒的组合物，其中所述带正电的微粒包含磨碎的聚合的阴离子交换树脂，其中所述带负电的微粒包含磨碎的聚合的阳离子交换树脂。

2.权利要求1所述的组合物，其中所述阳离子交换树脂为弱酸性或强酸性。

3.权利要求1所述的组合物，其中所述阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性。

4.前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述阴离子交换树脂和所述阳离子交换树脂为聚苯乙烯基的、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)基的、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)基的、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(pDMAEMA)基的、聚丙烯酰胺基的、甲基丙烯酸(MAA)基的。

5.前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂为以基于二乙烯基苯交联的聚苯乙烯。

6.前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述微粒的平均粒径小于约5μm。

7.前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述阴离子交换树脂为AmberliteIRA-485、AmberliteIRA-400、Dowex1X2-100、Dowex1-8-100、MarathonA2或DIAIONSA20A。

8.前述任一项权利要求所述的组合物，其中所述阳离子交换树脂为AmberliteIRC-748、Dowex50WX2-100、Dowex50WX8-100、MarathonMSC或DIAIONSK110。

9.前述任意一项权利要求所述的带正电的微粒和带负电的微粒吸附生物分子，优选为蛋白质或质粒的用途。

10.权利要求8所述的吸附生物分子的用途，优选蛋白质来自细胞匀浆或发酵上清液。

11.前述任一项权利要求所述的带正电的微粒和带负电的微粒破坏细胞的用途。

12.权利要求1-16所述的带正电的微粒和带负电的微粒破坏细胞和吸附分子的用途，所述分子优选生物分子，更优选多肽和质粒。

13.一种从包含所述生物分子的生物流体中获得生物分子的方法，包括：

e)将权利要求1-16中任一项所述的带正电的微粒和所述带负电的微粒加入至所述生物流体中，

f)允许所述微粒形成絮凝物，

g)从生物流体中将所述絮凝物移除，

h)回收所述生物分子。

14.一种包含权利要求1-8中任一项所定义的带正电的微粒和带负电的微粒以及任选用于悬浮液的装置的试剂盒。

15.一种包含有权利要求1-8中任一项所定义的生物分子、带正电的微粒和带负电的微粒的生物流体。