JP2020019799A - 細胞の破砕及び/又は生体分子の回収のための微粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概して、生体分子の回収及び細胞の破砕の分野に関し、特に、細胞懸濁液からの細胞内生体分子(例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド)の回収に関する。それは、生体液などの液体から生体分子を回収する方法を包含する。更なる局面では、本発明は、細胞培養、及び細胞培養物からの生体分子の精製の分野に関する。
人工生産システムの開発に関するあらゆる過去の努力にもかかわらず、細胞などの生物学的実体は、抗生物質、タンパク質及び核酸などの複雑な物質を産生するそれらの能力の点で無類のものである。今日の工業的に生産されたほぼ全ての細胞起源の物質は、細胞内で産生された後に環境に排出される細胞外産物である。しかしながら、潜在的に有用な物質の大部分は、細胞内に残る。細胞内物質を放出させるために、典型的には、機械的、物理的、化学的又は酵素的な手段によって、細胞を分解する。価値ある細胞産物の回収効率は、生体系内におけるそれらの形成、位置及びそれらの相互作用に密接に関連している。過去数十年間において、分子構造及びこれらの細胞系内におけるそれらの機能の調査により、このような産物及びそれらの大規模処理の多様性が高まってきた。同時に、産物の品質に関する要求により、特に医療分野では、明確に定義された有効かつ高純度の物質を送達する必要性が生じた。
本発明は、生体分子を得る(生体分子の回収とも称される)ための新規な方法であって、上記欠点の1つ以上を克服する新規な方法を提供する。前記方法は、液体及び流体、例えば細胞培養物、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞懸濁液、発酵ブロス、培養ブロス、発酵上清、培養上清、細胞上清、例えばE. coli、Pichia pastoris及びCHO細胞上清から生体分子を得るために使用され得る。更に、本発明は、細胞に含まれる生体分子を放出させるために使用され得る細胞破砕方法を含む。本明細書に示されるように、本発明は、細胞の破砕及び細胞内生体分子の回収に特に有用である。本明細書に開示される方法は、簡便でコスト効率がよく、工業的適用のために容易に拡張可能である。前記方法は、生体分子を選択的に回収するための簡単な方法であって、複雑な装置も可溶性添加剤(緩衝剤及び塩を除く)も必要としない方法を提供する。前記のように、細胞懸濁液から生体分子を回収するための従来技術の方法は、機械的応力及び/又は化学的添加剤のいずれかを含む。今日では工業規模で適用される従来の方法とは対照的に、本発明の方法は穏やかであり、細胞及び/又は所望の生体分子産物を過酷な条件に供さない。したがって、本明細書に開示される方法は、夾雑残屑の量を減少させ、所望の生体分子に対する潜在的に有害な機械的応力及び物理的応力をより一層与えない。
キレート陽イオン交換樹脂由来の負に荷電した粒子の場合、このような粒子は陽イオン(特に、カルシウム及び/又はマグネシウム)に結合し、それにより、細胞膜を構築する一連の分子を不安定化すると想定される。疎水性微粒子の場合、それらはフロックを形成することも見出された。
本発明はまた、以下の項目によって特徴付けられ得る:
本発明は、生体分子を回収するための、及び/又は細胞を破砕するための方法であって、本明細書に記載される荷電した微粒子又は疎水性微粒子を使用する簡便かつ高速な方法を提供する。それは、微粒子、特に荷電した微粒子が細胞を破砕し得、更に、細胞から生体分子を放出させ及び吸着し得ることにより、生体分子の高速かつ効率的な回収を可能にするという驚くべき知見に部分的に基づくものである。更に、微粒子が細胞と相互作用し得/細胞に吸着し得、及び/又は生体分子を吸着し得るように生体液に添加した場合に、荷電した微粒子は、大直径(例えば、少なくとも5μm)のフロックを即座に形成することが見出されたが、これは、微粒子並びに/又は微粒子及び生体分子によって構築されたフロックに吸着した生体分子の容易な分離を可能にする。同じことが、疎水性微粒子の場合にも当てはまる。
上記のように、本発明は、生体液などの流体から生体分子を回収するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、生体液中の細胞を破砕すること、及び該細胞から生体分子を放出させることを含む。生体分子は、好ましくは、細胞内生体分子、例えばタンパク質又はプラスミドである。続いて、放出された生体分子を生体液から回収し得る。
本明細書で定義される「荷電した微粒子」は、正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子である。「正に荷電した」微粒子は、中性pHで、少なくとも1の(より典型的には、1より多い)陽子の電気素量を有する。「負に荷電した」微粒子は、中性pHで、少なくとも1の(より典型的には、1より多い)電子の電気素量を有する。
微粒子は、陰イオン交換樹脂及び/又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得るか、又は得られる。好ましくは、本発明の微粒子は、樹脂を粉砕し、樹脂をコンディショニングすることによって得られ得る(又は、によって得られる)。
−1×50%EtOH(有機残留物の希釈)
−3×脱イオン水(EtOHの希釈)
限定されないが、粉砕デバイス、例えば粉砕ミル(ジェットミル、ボールミル、ハンマーミルなどを含む)による、又は例えば乳鉢及び乳棒を用いて手によることを含む、当技術分野で公知の任意の方法で粉砕を行い得る。本明細書で使用される「粉砕」は、粒子径の減少につながる操作を指す。当業者であれば、樹脂を調製するための粉砕方法を容易に選択し得る。例えば、一実施態様では、乳鉢内で1つ以上の乳棒を動かすことによって、樹脂を自動化された様式で湿式粉砕する。得られる粒子の大部分が約10μm未満、例えば9μm未満、8μm未満、7μm未満、6μm未満、5μm未満、4μm未満、3μm未満、2μm未満、1μm未満、0.5μm未満のサイズを有するまで、粉砕プロセスを継続し得る。大部分とは、50%超、例えば60%超、70%超、80%超、90%超又は95%超を意味する。他の実施態様では、粒子の大部分は、少なくとも0.1μm、例えば0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1.0μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2.0μm、3μm、4μm又は5μmの平均粒子径を有する。
第1の工程では、微粒子を生体液に添加する。開示される本微粒子は、実験室規模、パイロット規模又は工業規模で使用され得る。本明細書で使用される「実験室規模」は、流体約1又は10mlから流体約1000mlまでの生体分子のバッチ吸着を含む。本明細書で使用される「パイロット規模」は、流体約1リットルから流体約10リットルまでの生体分子のバッチ吸着を含む。本明細書で使用される「工業規模」又は大規模は、流体約10リットルから流体約1000リットル又は更に10000リットル又はそれ以上までの生体分子のバッチ吸着を含む。
微粒子を生体液に添加する場合、細胞の最適な体積濃度(各体積割合の比を指す「%(v/v)」によって示される)を調整し得る。いくつかの実施態様では、体積細胞濃度は、30%(v/v)未満、例えば約25%(v/v)未満、約20%(v/v)未満、約15%(v/v)未満、約10%(v/v)未満、約9%(v/v)未満、約8%(v/v)未満、約7%(v/v)未満、約6%(v/v)未満、約5%(v/v)未満、約4%(v/v)未満、約3%(v/v)未満、約2%(v/v)未満又は約1%(v/v)未満である。混合は、細胞及び微粒子の均質な混合物を得るために有用であり得る。
いくつかの実施態様では、微粒子を生体液に添加した後の次の工程は、フロックの形成を可能にすることである。驚くべきことに、微粒子は、微粒子に対する細胞及び/又は生体分子の吸着により、生体液中の細胞及び/又は生体分子と大直径のフロックを迅速に形成し得ることが見出された。
本明細書で使用される「吸着容量」は、平衡状態において、樹脂1ml当たりに吸着した生体分子の量(mg単位)と定義される。本明細書で使用される平衡は、吸着速度が脱離速度に等しい状態である。所望の生体分子(特に、可溶性のポリペプチド又はポリヌクレオチド)に対する微粒子の吸着容量は、例えば、生体分子の溶出の前後に、例えば蛍光又は分光光度法によって、上清中の前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドを定量することによって決定され得る。次いで、生体分子の量の差分が微粒子に吸着されたとみなす。当業者であれば理解するように、吸着容量は、様々なパラメータ、例えば微粒子の特性、生体分子、pH、温度、塩濃度及び他のパラメータ又はそれらの組み合わせに依存し得る。いくつかの実施態様では、正に荷電した微粒子は、実施例3.1.5に記載されている条件下において、樹脂1ml当たりGFP少なくとも5mg、例えば少なくとも6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mgを吸着し得る。他の実施態様では、正に荷電した微粒子は、実施例4.1.3に記載されている条件下において、樹脂1ml当たりSOD少なくとも5mg、例えば少なくとも6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mgを吸着し得る。
一般に、液体(例えば、生体液又は緩衝液)からのフロックの除去は、ろ過、遠心分離、沈殿又は任意の他の適切な手段によって実施され得る。当業者であれば、流体からフロックを分離又は脱離するために使用され得る方法を容易に決定することができる。例えば、パイロット及び工業規模の操作の場合、バケット遠心分離機(実験室規模)、管状遠心機、デカンター又はディスクスタック遠心分離機のいずれかで、フロックの懸濁液を処理し得る。同様に、フロックを保持するろ過によって、又は沈殿若しくは抽出によって、フロックを除去することが可能である。向流抽出デカンター、ミキサーセトラー又はカラム抽出器によって、脱離を達成し得る。他の有用な除去方法は、タンジェンシャルフローろ過、深層ろ過、デッドエンドろ過であり得るか、又はフィルタープレス、ヌッチェフィルターの使用を含む方法であり得る。
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、脱離を行い得る。例えば、タンパク質のような生体分子の脱離を可能にする緩衝液(脱離緩衝液)にフロックを再懸濁することによって、脱離を行い得る。管状(静的)ミキサー又は他の混合デバイス、例えば撹拌タンクを含む当技術分野で公知の任意の手段を使用することによって、これを達成し得る。また、向流抽出デカンター、ミキサーセトラー又はカラム抽出器によって、脱離を達成し得る。
本発明は、生体液及び/又は細胞から生体分子を回収するために使用され得る。生体分子の回収は、その全ての文法形において、生体分子を得、採取し、獲得し、受け取り、又は入手することを意味し得る。生体分子は、プラスミド、ポリヌクレオチド又は発現産物、例えばペプチド、タンパク質(グリコシル化又は翻訳後(post-transnationally)修飾されたタンパク質を含む)であり得る。当技術分野で公知の及び/又は本明細書に記載される手段及び方法によって、生体分子を単離及び/又は更に処理(例えば、更に精製)し得る。更に、回収は、細胞を破砕して細胞から生体分子を放出させ、細胞培養物からのその分離を可能にする実施態様も含む。後の工程として、生体分子の更なる精製及び/又は濃縮を行い得る。
本発明は更に、荷電した微粒子を細胞懸濁液に添加することによって、細胞を破砕するための方法を提供する。細胞から生体分子が放出される程度に細胞を透過性にするための方法又はプロセスに関して、「細胞破砕」又は「細胞の破砕」という用語は、本明細書では互換的に使用される。細胞破砕は、細胞死を伴うものでもよいし、又は細胞死を伴わないものでもよい。好ましくは、細胞破砕は、細胞構造、例えば細胞壁の完全なフラグメント化を伴わないので、細胞のフラグメント化が減少し、これは望ましくない夾雑物(細胞残屑を含む)のレベルを低下する。本発明のいくつかの実施態様では、本明細書に記載される方法によって破砕されている細胞は生体分子を放出し、依然として生存可能である。「生存可能な」という用語は、適切な成長条件下で増殖することができる細胞を指す。
本発明の方法は、従来の細胞破砕方法によって得られる生体分子と比較して高い純度の生体分子を提供し得る。特に、本発明の方法は、回収される生体分子画分中の非ターゲット物質の量が少ないので、従来技術で使用される従来の方法よりも高い選択性を有する。回収される生体分子の高い純度は、更なる連続する精製工程の必要性を除去し得るので好ましい。好ましくは、本発明の方法は、非ターゲット生体分子に比較して30%超、例えば40%超、50%超、60%超、70%超、80%超、90%超又は更に100%濃縮された生体分子を提供する。非ターゲット生体分子と比較した所定の生体分子の純度を評価するための方法は、当業者に利用可能である。ポリペプチドの場合、例示的な方法は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−Page)による分離後にクーマシーブルーで染色されたタンパク質の定量的デンシトメトリーである。
本発明の吸着剤を適用する前に、本明細書に定義及び記載される生体分子を得る方法は、生体分子(「産物」)、好ましくは発現産物、例えばタンパク質又はポリヌクレオチドを産生(例えば、発現)する(宿主)細胞を培養する工程を場合により含み得る。本発明の宿主細胞との関連では、培地(血清又は無血清のいずれか)中での「細胞の培養」又は「細胞を培養する」という用語は、それぞれ、細胞を培養容器に播種すること、接着培養の場合には単層が形成されるまで、若しくは懸濁培養の場合には十分な細胞密度が確立されるまで培地中で細胞を成長させること、及び/又は単層が形成されたら可能な限りすぐに培地中で細胞を維持すること、若しくは懸濁液中で細胞を維持することを指す。培地中での「細胞の培養」又は「細胞を培養する」という用語はまた、細胞の培養プロセス全体にわたって動物血清産物が全く存在しないように、又は本質的に存在しないように、無血清培地を用いて上記工程の全てを実施することを含む。指数的フィード又は直線的フィード又は一定フィード又は他の種類のフィード、フェドバッチ培養又は高密度培養によって、細胞を培養し得る。しかし、あるいは、血清含有培地を用いても、上記工程を実施もし得る。
水処理のための樹脂ビーズは、DOWから購入した。試験した樹脂の概要を表1に示す。
表1
表2 粒子径分布
実施例2.1:CSPEによるターゲットタンパク質の回収
E. coli(HMS174)細胞を37℃(GFPmut3.1)及び30℃(SOD)でフェドバッチ培養した。組換えタンパク質の発現をIPTG誘導した。遠心分離によって、細胞を回収した。室温でアリコートを用いて、タンパク質抽出実験を実施した。最初、体積細胞濃度(湿潤充填層)は、約10%v/vであった。懸濁液50mlを4000rcfで10分間遠心分離することによって、これを決定した。様々な細胞及び塩濃度による実験の場合、各緩衝液中で激しく混合することによって、ペレットを懸濁した。10×ストック溶液を50%懸濁液に添加し、ddH2Oで作業容量(20ml)に希釈することによって、最終的な細胞、粒子、緩衝液及び塩の濃度を調整した。撹拌ビーカー(混合)中で、又はチューブ(静的)中で、インキュベーションを室温(約23℃)で最大3時間実施した。両方とも、同様の高さ:直径の比を有していた。簡便なマグネチックスターラーを底に入れて、混合強度を800rpmに調整した。放出されたタンパク質を定量するために、各緩衝液で1mlアリコートを1:2希釈した。その上で、サンプルを8000rcfで最大10分間(約23℃)遠心分離し、更なる調査のために上清を収集した。
E. coli(HMS174)細胞を37℃(GFPmut3.1)及び30℃(SOD)でフェドバッチ培養した。細胞を緩衝液(50mM Tris、pH8.0、100mM NaCl)に懸濁して25%v/vにし、高圧ホモジナイゼーション(Niro-Soave Panda 2k、100MPaで2回通過)によって破砕した。
実施例3.1 蛍光
陰イオン交換(AIEX CaptoQ)、疎水性相互作用(ButylSepharose)及びゲルろ過(SuperdexG75 prep. grade)クロマトグラフィーを用いて、(10000rcfで60分間遠心分離し、0.2マイクロでろ過した)清澄化E. coliホモジネートから逐次精製することによって、GFPmut3.1標準(>95%)を調製した。280nmの吸光度から、濃度を決定した(8M尿素によって100℃で10分間変性させた)。プレートリーダー(Tecan GENios Pro)によって、485nm(励起)及び535/20nm(発光)の標準的なキャリブレーションから、同等の蛍光を決定した。
粉砕したMarathon A2(MA2)に吸着させ、NaClで溶出することによって回収したE.coli細胞由来のGFPの回収を決定した。遠心分離によって細胞ブロスから細胞を分離し、体積濃度20%(v/v)、6%(v/v)及び1%(v/v)で50mM TRIS(pH8.0)に懸濁した。細胞懸濁液を様々な体積比200%、100%、50%及び0%の樹脂と混合し、1時間静的インキュベーションした。2M NaClで懸濁液アリコートを1:2希釈することによって、溶出を実施した。蛍光によって、水相中のGFPを定量した。陽イオン性樹脂との比較のために、粉砕したMarathon MSC(MMSC)を同じ条件で使用した。
異なる樹脂:細胞の体積比において、粉砕したMarathon A2(MA2)に吸着させ、NaClで溶出することによって回収したE.coli細胞由来の抽出GFPの回収を決定した。遠心分離によって細胞ブロスから細胞を分離し、10%(v/v)で50mM TRIS(pH8.0)に懸濁した。細胞懸濁液を様々な体積比200%、100%、70%、50%、30%及び0%の樹脂と混合し、1時間静的インキュベーションした。2M NaClで懸濁液のアリコートを1:2希釈することによって、溶出を実施した。蛍光によって、水相中のGFPを定量した。
異なるpH値及び異なるインキュベーション時間において、粉砕したMarathon A2(MA2)に吸着させ、NaClで溶出することによって回収したE.coli細胞由来の抽出GFPの回収を決定した。NaOHを添加することによって、細胞ブロス懸濁液のpHを7.5、8.0及び8.5に調整した。細胞懸濁液を体積比100%の樹脂と混合し、3時間静的インキュベーションした。2M NaClで懸濁液のアリコートを1:2希釈することによって、定期的な(10分間、60分間、120分間、180分間)溶出を実施した。蛍光によって、水相中のGFPを定量した。最大3時間のインキュベーション後において、pH7.5及び8.0では、総可溶性GFPの約40%及び70%を細胞ブロスから回収することができた。pH8.5においてのみ、100%の回収が達成された。
0〜100%の間での樹脂:細胞の体積比の影響を更に調査した。NaOHを添加することによって、細胞ブロス懸濁液のpHを7.5、8.0及び8.5に調整した。細胞懸濁液を様々な樹脂:細胞の体積比100%、70%、50%、30%及び0%で混合し、3時間静的インキュベーションした。2M NaClで懸濁液のアリコートを1:2希釈することによって、定期的な(10分間、60分間、120分間、180分間)溶出を実施した。蛍光によって、水相中のGFPを定量した。
異なるNaCl濃度(0〜500mM)において、粉砕したMarathon A2(MA2)に吸着させ、NaClで溶出することによって回収したE.coli細胞由来の抽出GFPの回収を決定した。遠心分離によって細胞ブロスから細胞を分離し、10%v/vで50mM TRIS(pH8.0)に懸濁した。2M NaCl緩衝液で懸濁液のNaCl濃度を調整した。細胞懸濁液を樹脂:細胞の様々な体積比100%、70%、50%、30%及び0%の樹脂と混合し、1時間静的インキュベーションした。2M NaClで懸濁液のアリコートを1:2希釈することによって、溶出を実施した。蛍光によって、水相中のGFPを定量した。
また、E. coli細胞をキレート微粒子と共にインキュベーションして、タンパク質抽出も実証した(図7)。Marathon A2の強塩基性第4級基とは対照的に、Amberlite IRA 748から自作した微粒子のイミノ二酢酸基は、多価陽イオンに対して高い親和性を有する陽イオン交換体である。その場合、懸濁液の凝集は観察されなかった。
50mM TRIS緩衝液(pH8.0)中、細胞(5%v/v)に対して体積比30%、70%及び100%v/vの樹脂で2時間インキュベーションし、続いて1M NaClで溶出した後における、キレート(粉砕したAmberlite IRA 748)及び陽イオン微粒子(粉砕したMarathon A2)による細胞懸濁液(E. coli)からのGFP抽出を、塩で溶出しない以外は同じ条件下におけるGFP抽出と比較して決定した。50mM TRIS(pH8.0)中で、E. coli細胞を粉砕したAmberlite IRA 748と共に2時間インキュベーションすることによって、最大100%のGFP抽出収率が得られた(図8)。回収したGFPの収量は、添加したキレート微粒子の体積比と共に増加した。
塩で溶出せずに、攪拌ビーカー中の50mM TRIS緩衝液(pH8.0)中、20%、15%、10%及び5%体積細胞濃度の細胞に対して体積比70%v/vの樹脂でインキュベーションした後における、キレート樹脂(粉砕したAmberlite IRA 748)による細胞懸濁液(E. coli)からのタンパク質(GFP)抽出を決定した(図9)。懸濁液中のより高い細胞濃度は、キレート微粒子の抽出収率に好ましい影響を及ぼした。E.coliの乾燥生物量(dry biomass)(d.m.)に関する抽出したタンパク質量のGFP抽出動態を決定した(図10)。
4000rcfで15分間遠心分離することによって、E. coliホモジネートの重い固体画分を分離した。上清を移し、4000rcfで60分間遠心分離した後に、軽い画分を集めた。ペレットを脱イオン水に懸濁し、先のように2回逐次洗浄した。10M尿素(pH8.0)で細胞残屑及び粗ホモジネートの参照サンプルを1:5希釈し、ロータリーシェーカー上で1時間インキュベーションした。
Amberlite IRA458から得られた陽イオン微粒子と共にE. coli細胞をインキュベーションすることにより、タンパク質抽出を実証した。Marathon A2のスチレンジビニルベンゼン(PS/DVB)マトリックスとは対照的に、アクリル樹脂から得られた微粒子は、同じ充填層体積でより多くの水を含有していた。アクリル微粒子では、凝集が明らかにより強力であったが(より大きなフロック及びより早い沈殿)、これは詳細には調査しなかった。加えて、ターゲットタンパク質は、GFPではなくスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)であった。
チューブ内において、50mM TRIS緩衝液(pH8.0)[示してください(please indicate)]中、細胞(10%v/v)に対して体積比50、70及び100%v/vの樹脂で静的インキュベーションし、続いてNaClで溶出した後に、アクリル樹脂(粉砕したAmberlite IRA458)によって、細胞懸濁液(E. coli)から、タンパク質(SOD)の抽出収率を決定した。SDS−Pageの標準的なキャリブレーションから、デンシトメトリーによってタンパク質の量を推定した(図11)。アクリル樹脂と共に1時間静的インキュベーションした後に、SODの放出動態がほぼ終了した。同量の0.5M及び1.0M NaClを用いて、アクリル微粒子に吸着したSODを回収した。
短時間混合し、インキュベーション(50mM TRIS、pH8.0)し、続いてNaCl(0.0M、0.5M、0.1M)で溶出した後、Amberlite IRA 458微粒子(100%、70%、50%v/vの樹脂:細胞の体積比)と共にインキュベーションした後に、10%(v/v)細胞懸濁液から得られたE. coliホモジネートからのSOD回収を決定した。0.5M及び1.0Mによる溶出では、Amberlite IRA 458微粒子に吸着したSODを同量で回収した(図12)。
微粒子に結合したSODの量を調査した。
粉砕したMarathon A2に吸着させることによって抽出したGFPの純度を、SDS−Pageによって、ホモジネートと比較してチェックした。HPHの後、E. coliホモジネートの(例えば、GFP封入体を含有する)重い固体画分を、4000rcfで15分間遠心分離することによって分離した。上清を移し、4000rcfで60分間遠心分離した後に、軽いホモジネート画分を集めた。軽いホモジネートの画分は、細胞残屑及び膜タンパク質、例えば外膜Aタンパク質(OmpA)を含有し、細胞破砕の指標として機能する。ペレットを脱イオン水に懸濁し、先のように2回逐次洗浄した。10M尿素(pH8.0)で細胞残屑及び粗ホモジネートの参照サンプルを1:5希釈し、ロータリーシェーカー上で1時間インキュベーションした。粗ホモジネート、ホモジネート上清、及び50mM TRIS中で細胞を50%v/v粉砕したMarathon A2と共にpH8.0で3時間インキュベーションすることによって抽出した溶出タンパク質を用いて、SDS−Pageを実施した。200、250、300、350、400、450、500及び1000mM NaClで1:2希釈することによって、懸濁液のアリコートを溶出した。全てのサンプルのSDS−Pageを同じ希釈率で実施し、タンパク質の量を評価するために、クーマシー染色のデンシトメトリーを使用した。約39kDaの主要な膜タンパク質(OMP)のために、洗浄した細胞残屑をレファレンスとして適用した。
50mM TRIS緩衝液(pH8.0)中、細胞(10%v/v)に対して体積比70%v/vの樹脂で静的インキュベーションし、続いて0.5M NaClで溶出した後、細胞懸濁液(E. coli)及びホモジネートから抽出した後に、スチレン陽イオン微粒子Marathon A2(MA2)によって細胞から抽出したSODの酵素活性を決定した。上清を遠心分離(1ml、30分間、23℃及び16000rcf)し、ろ過(PVDF膜、0.2μm)し、各緩衝液で有効測定範囲まで1:10の段階希釈をした。Sigmaから購入した19160 SOD determination kitによって、SOD活性を決定した。MA2微粒子によって細胞から抽出したSODの酵素活性は、ホモジネートから捕捉したものと比較して平均で1ユニット増加した。
Invitrogenから購入したQuant-iT(商標)PicoGreen(登録商標)dsDNA Assay Kitを用いて、DNAを定量した。Lonzaから購入したPyroGene(商標)Recombinant Factor C Assayを用いて、エンドトキシンを定量した。全ての上清サンプルを遠心分離(1ml、30分間、23℃及び16000rcf)し、ろ過(PVDF膜、0.2μm)し、各緩衝液で有効測定範囲まで1:10の段階希釈をした。各キットの説明表記にしたがってプレートリーダー(TecanのGENios Pro又はInfinite 200M)によって、測定を実施した。
50mM TRIS緩衝液(pH8.0)中、細胞(10%v/v)に対して体積比50、70、100%v/vの樹脂で静的インキュベーションし、続いてNaClで溶出した後、アクリル(Amberlite IRA458)及び陽イオン性樹脂(MarathonA2)による細胞懸濁液(E. coli)からのタンパク質(SOD)の抽出中に、dsDNAの減少を決定した。上記のように、DNAを定量した。細胞を微粒子と共にインキュベーションすることによって、最大102より少ないdsDNAを放出させた。タンパク質溶出条件(0.5M NaCl)では、上清中のdsDNAの減少は、102〜103であった(図16)。
50mM TRIS緩衝液(pH8.0)中で静的インキュベーション(10%v/v)し、続いてNaClで溶出した後、陽イオン性樹脂(Marathon A2)による細胞懸濁液(E. coli)からのタンパク質(SOD)の抽出動態中に、エンドトキシンの減少を決定した。上記のように、エンドトキシンの量を定量した。
実施例8.1:原子間力顕微鏡検査(AFM)
スクロース(50mM)溶液、脱イオン水及び微粒子の希釈懸濁液で正に荷電した顕微鏡スライドを逐次処理した。各工程の後、乾燥を65℃で24時間実施した。Department of Nanobiotechnology, BOKU (Dr. Gerhard Sekhot)において、測定を行った。
Vienna Institute of Biotechnology (VIBT)において、Leica 「Live Cell」 wide-field microscopeによって、共焦点顕微鏡検査及び蛍光顕微鏡検査を実施した。各緩衝液でサンプルを約1%v/vの固体濃度に希釈し、倍率1000倍(Leica HCX PL APO 100x 1.4 oil)で可視化した。
実施例9.1:BacLite
Marathon A2微粒子(70%の樹脂:細胞の体積比)と共に2時間静的インキュベーション(50mM TRIS、pH8.0)し、生理的緩衝液で1:10希釈した後のE. coli細胞(10%v/v)の生存率。「BacLite」(Invitrogen)で細胞を染色した。生細胞(緑色)及び死細胞(赤色)が図21に示されている。
50mM TRIS(pH8.0)中で、E. coli細胞(10%v/v)を、粉砕したMarathon A2及びAmberlite IRA 458から得られた微粒子(70%v/vの樹脂:細胞の比)と共に3時間静的インキュベーションした後に、細胞生存率を決定した。細胞(E. coli GFP)及び細胞/樹脂懸濁液(1mlアリコート)を徐々に希釈し、滅菌0.9%w/w NaCl中で激しく1:10で混合した。ddH2O中の微生物Merck 20g/l用栄養寒天(NA)を、121℃の蒸気オートクレーブ内で15分間加熱した。希釈した懸濁液のアリコート(1ml)を培養皿に注ぎ、55℃でテンパリングしたNA溶液と混合した。室温で30分経過した後、ゲル形成が完了したと考え、オーバーヘッドでプレートを37℃で30時間インキュベーションした。
疎水性微粒子の調製
1×50%EtOH(有機残留物の希釈)
3×脱イオン水(EtOHの希釈)
以下の工程によって、微粒子(MP)(粉砕したクロマトグラフィー樹脂MARATHON A2(MA2))を使用して、E. coliの粗ホモジネート由来の組換えGFPのバッチ吸着を実施した。本実施例では、酸性細胞内可溶性タンパク質としてGFPを使用する。
75mM NaClを含む50mM Tris洗浄緩衝液(pH7.5)に、凝集物のペレットを再懸濁した。短時間インキュベーションした後、遠心分離(13400gで3分間)を使用して、凝集物を分離した。ろ過プロセスを使用して分離を行った際、フィルターケーキを再懸濁しなかったが、洗浄緩衝液をフィルターケーキ(0.2μmフィルタープレート、1.5bar)に通してろ過することによって洗浄した。上清を廃棄し、溶出工程のために、ペレット/フィルターケーキを更に処理した。低い塩濃度は、結合強度が弱い不純物を溶出することができる。
本実施例では、粉砕したMARATHON A2(MA2)樹脂由来のMPを使用した、細胞ホモジネートからの組換え発現塩基性タンパク質の回収を実証する。タンパク質インターフェロンガンマ(IFN−γ)は、発現した細胞内可溶性塩基性タンパク質の例として機能する。本実施例では、望ましくない細胞構造及び細胞内物質に結合させることによって、正に荷電した交換樹脂を生体分子の回収に使用し得ることを示す(逆精製と称される)。
本実施例では、MA2から調製した正に荷電したMPを使用した、インタクトなE. coli細胞からの酸性細胞内可溶性タンパク質の抽出を示す。本実施例では、使用するターゲットタンパク質は、GFPである。異なるGFP分子(それぞれGFPmut3.1及びGFP.1)を有する2つの異なるE. coli株(HMS174(DE3)及びBL21)を使用して、タンパク質抽出を示した。タンパク質抽出のための2つの変異体を行った。
5Lスケールのフェッドバッチプロセスで、E. coli株HMS174(DE3)(pET11aGFPmut3.1)及びBL21(pBI1KT7ix.1_GFP.1)を発酵した。IPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)を使用して、細胞内可溶性ターゲットタンパク質GFP(緑色蛍光タンパク質)の発現を誘導した。
本実施例では、より多くの微粒子を細胞懸濁液に添加した。より多量の微粒子は、直接的にターゲットタンパク質の結合及び抽出を可能にした。
実施例1に記載されているように、Dowex M−A2陰イオン交換樹脂を粉砕して微粒子を得ることによって、正に荷電した微粒子を調製する。
キレート陽イオン交換樹脂Amberlite IRC748から、微粒子を調製する。
異なるタイプのイオン交換樹脂をSigma Aldrich及びDIAIONから購入した。
− 1×50%EtOH(有機残留物の希釈)
− 3×脱イオン水(EtOHの希釈)
− ほぼ中性pHのチェック
− 微粒子(micro particle)及び粉砕した樹脂を脱イオン水に再懸濁(約70%v/v)
− 特定の実験に使用した対応する緩衝液で樹脂を平衡化した。
ソフトウェアベースのサイズ決定を使用して光学顕微鏡検査によって、調製した微粒子の粒子径を決定した。相対直径の推定によって、粉砕した材料及び微粒子(micro particle)の粒子径を倍率1000倍で測定した。1%v/vにおける1000〜5000個の粒子の直径サイズの比較によって、分布を計算した。結果を表3に示す。
Claims (18)
- 生体分子を回収するための正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、使用。
- 生体分子がポリペプチド又はポリヌクレオチドである、請求項1に記載の使用。
- 該正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子がフロックを形成する、請求項1に記載の使用。
- 細胞を破砕するための正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子の使用であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、使用。
- 陰イオン交換樹脂及び陽イオン交換樹脂が、ポリスチレン系、ヒドロキシエチルメタクリラート(HEMA)系、ジメチルアミノエチルメタクリラート(DMAEMA)系、ジメチルアミノエチルメタクリラート(pDMAEMA)、ポリアクリルアミド系、メタクリル酸(MAA)系である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 陽イオン交換樹脂及び陰イオン交換樹脂が、ジビニルベンゼンと架橋したポリスチレンである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 微粒子が約5μm未満の平均粒子径を有する、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 正に荷電した微粒子又は負に荷電した微粒子が、ポリマー陰イオン交換及び/又は陽イオン交換樹脂を粉砕することによって得られ得る、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 陰イオン交換樹脂が、Amberlite IRA−400、Amberlite IRA−485、Dowex 1X2−100、Dowex 1−8−100、Marathon A2又はDIAION SA 20Aである、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 陽イオン交換樹脂が、Amberlite IRC−748、Dowex 50 WX2−100、Dowex 50 WX8−100、Marathon MSC又はDIAION SK 110である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 細胞が真核細胞又は原核細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の使用。
- 生体液から生体分子を得る方法であって、a)請求項1〜10のいずれか一項に定義される正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子を生体液に添加すること、並びに該生体液から該生体分子を回収することを含む、方法。
- b)前記微粒子にフロックを形成させること、c)生体液から該フロックを除去すること、及びd)から生体分子を脱離することを更に含む、請求項12に記載の方法。
- 細胞を破砕する方法であって、正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子を細胞懸濁液に添加することを含む、方法。
- 細胞から生体分子を放出させることを更に含む、請求項14に記載の方法。
- 生体分子がポリペプチド又はポリヌクレオチドである、請求項14又は15に記載の方法。
- 正に荷電した微粒子及び/又は負に荷電した微粒子を含む生体液であって、該正に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陰イオン交換樹脂を含み、該負に荷電した微粒子が粉砕したポリマー陽イオン交換樹脂を含む、生体液。
- フロックを更に含む、請求項17における液。
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