WO2020045290A1 - 抗体または抗体様分子の精製方法 - Google Patents

抗体または抗体様分子の精製方法 Download PDF

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WO2020045290A1
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antibody
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aqueous solution
impurities
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PCT/JP2019/033086
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史憲 鴻池
和信 水口
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株式会社カネカ
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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
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    • C12Y—ENZYMES
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    • C12Y301/30—Endoribonucleases active with either ribo- or deoxyribonucleic acids and producing 5'-phosphomonoesters (3.1.30)
    • C12Y301/30002—Serratia marcescens nuclease (3.1.30.2)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a method for reducing impurities in a composition containing impurities and improving the purity of a target antibody or antibody-like molecule.
  • useful proteins such as antibodies extracted from biological samples and antibodies produced using genetic recombination technology have been used in many applications, including pharmaceuticals, food and industrial enzymes, adsorbents, and sensors. Its efficient high-purity purification is a challenge. Impurities often affect the function of the target useful protein and cause side effects.To ensure the usefulness and safety of the useful protein, it is necessary to remove these impurities and to purify them highly. is there.
  • useful proteins such as recombinant proteins and peptides as the main drug
  • After the target useful protein is recombinantly expressed using animal cells, plant cells, and bacterial cells as hosts by genetic recombination technology Purification is performed with high purity.
  • Useful proteins produced by culturing recombinant animal cells, plant cells, or bacterial cells include those secreted in the culture supernatant, those expressed soluble in cells, and those insoluble expressed as inclusion bodies in cells. is there.
  • the useful protein expressed in the culture supernatant is separated from host animal cells, plant cells, bacterial cells, fragments thereof, and other insoluble components by centrifugation or membrane treatment, and then purified by chromatography or membrane separation processes. Purified.
  • the useful protein solublely expressed in the cell is extracted by a technique such as lysis or disruption of the cell, and after removing insoluble components by centrifugation or membrane treatment, the protein is purified to a high purity by chromatography or membrane separation process.
  • the useful protein expressed insoluble in the cells is extracted by a method such as lysis or disruption of the cells, and then the soluble component is removed from the residue obtained by centrifugation or membrane treatment. It is highly purified by lithography and membrane separation processes.
  • Solutions containing useful proteins used in chromatography and membrane separation processes contain large amounts of impurities such as host-derived contaminating proteins, nucleic acids, membrane fragments of cells and organelles, and medium components.
  • the load is large, leading to a decrease in the adsorption capacity of the chromatographic carrier, a decrease in the separation ability, a decrease in the processing speed due to an increase in the back pressure, and a decrease in the life of the carrier due to a decrease in the washing and regeneration efficiency.
  • the processing capacity per unit membrane area is reduced, the back pressure is increased, the processing speed is reduced, and the life of the carrier is reduced due to the reduced washing and regeneration efficiency. Since a large amount of impurities imposes a heavy load on high-purity purification by chromatography and membrane separation processes, reducing impurities before these treatments is important for reducing the load on subsequent processes.
  • Non-Patent Document 1 Polyamines
  • Non-Patent Document 2 chitosan
  • Patent Document 1 A method of adding a water-soluble additive such as polydiallyldimethylammonium chloride (PDACMAC, Non-patent Document 3) and endonuclease (Non-patent Document 4), pH adjustment (Non-patent Document 5), and heat treatment (Patent Document 2) ) Is known.
  • PDACMAC polydiallyldimethylammonium chloride
  • Non-patent Document 4 A method of adding a water-soluble additive such as polydiallyldimethylammonium chloride (PDACMAC, Non-patent Document 3) and endonuclease
  • pH adjustment Non-patent Document 5
  • Patent Document 2 heat treatment
  • useful proteins such as antibodies are usually purified in an aqueous system
  • removal of water-soluble additives in a subsequent step is an issue.
  • it is difficult to establish a removal process in the subsequent stage for example, the additives and fragments thereof are adsorbed to useful proteins, and safety and numerical control of the residue are issues.
  • the useful protein is a drug
  • it must be highly purified from the viewpoint of safety and the Food and Drug Administration (Food and Drug Administration) strictly controls residual impurities in the Q3A guidelines.
  • Endonuclease is excellent because it can be easily removed by setting chromatography conditions when removing impurities such as other contaminating proteins.
  • endonuclease is capable of fragmenting and invalidating DNA, and is effective in improving the efficiency of chromatography and membrane separation of fragmented DNA, but has no effect in removing contaminating proteins and the like.
  • it is not sufficient as a technique for removing impurities.
  • the pH treatment or heat treatment has a high risk of deteriorating, denaturing, aggregating, and degrading the function of the target useful protein. Aggregates, fragments, and modified products derived from the target produced by strict control of the process parameters and treatment. Removal of such impurities has become a new issue.
  • an object of the present invention is to provide an additive which is effective for removing impurities from a useful protein solution such as an antibody and also has a small load on a subsequent process, and a method of using the additive.
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems. As a result, by adding a specific water-insoluble inorganic compound to the aqueous solution or suspension of the antibody or antibody-like molecule containing impurities, impurities can be effectively reduced while maintaining the target antibody or antibody-like molecule in the aqueous solution side.
  • water-insoluble inorganic compounds can be easily separated from the system by spontaneous sedimentation, centrifugation, membrane separation, etc., and completed the present invention. That is, the present invention is as follows.
  • a method for purifying an antibody or an antibody-like molecule comprising treating an aqueous solution or suspension of an antibody or antibody-like molecule containing impurities with a water-insoluble inorganic compound containing one or more elements selected from magnesium, calcium, and aluminum.
  • a water-insoluble inorganic compound containing one or more elements selected from magnesium, calcium, and aluminum.
  • the water-insoluble inorganic compound is one or more selected from magnesium carbonate, magnesium hydroxide, magnesium oxide, magnesium phosphate, calcium sulfate, and aluminum oxide.
  • impurities can be efficiently removed from an aqueous solution or suspension of an antibody or an antibody-like molecule containing the impurities. Not only can this method be used alone to prepare a crude purified product, but when combined with other advanced purification processes, the load on the subsequent purification process can be reduced.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of reducing the amount of impurities when the present invention and an existing method are used.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the amount of basic magnesium carbonate, which is a water-insoluble inorganic compound, and the IgG concentration and the amount of host cell protein (HCP) remaining as impurities.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the amount of basic magnesium carbonate, which is a water-insoluble inorganic compound, and the IgG concentration and the amount of residual DNA, which is an impurity.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between various water-insoluble inorganic compounds alone or in combination with activated carbon, and the IgG concentration and the residual amount of HCP as an impurity.
  • FIG. 1 is a graph showing the effect of reducing the amount of impurities when the present invention and an existing method are used.
  • FIG. 2 is a graph showing the relationship between the amount of basic magnesium carbonate, which is a water-insoluble inorgan
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between various water-insoluble inorganic compounds alone or in combination with activated carbon, and the IgG concentration and the residual amount of DNA as an impurity.
  • FIG. 6 is a graph showing the relationship between the combination of basic magnesium carbonate, which is a water-insoluble inorganic compound, and a carrier for antibody purification, and the IgG recovery rate and the residual amount of HCP, which is an impurity.
  • FIG. 7 is a graph showing the relationship between the combination of basic magnesium carbonate, which is a water-insoluble inorganic compound, and a carrier for antibody purification, the IgG recovery rate, and the residual amount of DNA, which is an impurity.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the combination of a basic magnesium carbonate, which is a water-insoluble inorganic compound, and a carrier for antibody purification, and the amounts of impurities HCP and DNA in a carrier washing solution.
  • FIG. 9 is a graph showing the HCP concentration and the IgG concentration in the culture supernatant before and after passage through a column filled with basic magnesium carbonate.
  • FIG. 10 is a graph showing the DNA concentration and the IgG concentration in the culture supernatant before and after passage through a column filled with basic magnesium carbonate.
  • the present invention relates to a method for purifying an antibody or an antibody-like molecule, which comprises removing an impurity by treating an aqueous solution or suspension of an antibody or an antibody-like molecule containing an impurity with a specific water-insoluble inorganic compound.
  • a method for purifying an antibody or an antibody-like molecule which comprises removing an impurity by treating an aqueous solution or suspension of an antibody or an antibody-like molecule containing an impurity with a specific water-insoluble inorganic compound.
  • an aqueous solution or suspension containing the antibody or antibody-like molecule to be purified is prepared.
  • This step is optional, and need not be performed when such an aqueous solution or suspension has already been obtained.
  • An aqueous solution refers to a solution in which an antibody or antibody-like molecule is dissolved in water as a solvent and contains no insoluble components.
  • a suspension is a solution in which the antibody or antibody-like molecule is dissolved in water as a solvent.
  • a solution containing insoluble components such as cells, crushed products, aggregates of cell-derived components, and aggregated proteins. The insoluble component may be dispersed in the solution or may be settled.
  • the ⁇ antibody or antibody-like molecule '' to be purified in the present invention may be any antibody or antibody-like molecule that is useful for industrial use, and is a functional protein having a polypeptide structure, such as ⁇ -helix or In addition to those having a secondary structure such as a ⁇ -sheet structure in the molecule, those having a sugar chain, those modified by sugar, those modified by phosphorylation or tyrosine, and those coordinated with metal are included. Also, in addition to naturally occurring proteins and peptides, those produced by genetic recombination techniques, those with improved functions, structures consisting only of functional sites, and concatenations of different functional sites, Includes conjugates of the same functional site.
  • those which are intramolecularly crosslinked by disulfide bonds due to intramolecular cysteine residues those which are intermolecularly crosslinked by disulfide bonds due to intermolecular cysteine residues, those which non-covalently contain a subunit structure, It includes proteins linked by modification, and proteins that have been imparted with functions by chemical modification of proteins or addition of functional molecules.
  • the antibody or antibody-like molecule is not particularly limited, and may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a human antibody, a humanized antibody, a chimeric antibody, a single-chain antibody, a heavy-chain antibody, a multivalent antibody, Fab, F ( ab ′), F (ab ′) 2 , Fc, Fc fusion protein, bispecific antibody, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , disulfide bond Fv (sdFv), Diabody, antibody-like molecule target peptide (micro antibody) and the like.
  • these antibodies or antibody-like molecules may be Fc-containing proteins such as immunoglobulins and Fc fusion proteins having an Fc portion, and the Fab, F (ab ′), F (ab ′) 2 , Fc, heavy chain (H chain), light chain (L chain), single chain Fv (scFv), sc (Fv) 2 , disulfide-bonded Fv (sdFv), single chain antibody, heavy chain antibody, multivalent antibody, bichain
  • Fc-containing proteins such as immunoglobulins and Fc fusion proteins having an Fc portion
  • an aqueous solution or suspension of an antibody or antibody-like molecule containing impurities '' is not particularly limited, and contains the antibody or antibody-like molecule, It is not particularly limited as long as it is an aqueous solution or suspension containing contaminants as impurities, and examples thereof include a culture solution, a culture supernatant, a suspension of cultured cells and their crushed products in water, and extracts thereof. And biological extracts. It does not prevent the coexisting organic solvent as an aqueous solution or suspension.
  • the contaminant is not particularly limited as long as it is a compound other than the antibody or antibody-like molecule to be purified, and examples thereof include host-derived proteins and nucleic acids.
  • the cells to be cultured may be cells of natural origin, but are preferably recombinant host cells.
  • the host is an animal, plant or bacterial cell used for recombinant production of an antibody or an antibody-like molecule, and is transformed with an expression vector or a gene fragment containing a DNA encoding the antibody or the antibody-like molecule.
  • an expression vector or a gene fragment containing a DNA encoding the antibody or the antibody-like molecule There is no particular limitation as long as it is a cell or microorganism derived from animals and plants that can produce useful proteins by expressing the introduced DNA.
  • the recombinant in the present invention refers to an expression vector or a gene comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of an antibody or antibody-like molecule of interest, and a promoter operably linked to the nucleotide sequence in a host.
  • the transformed host cell into which the fragment has been introduced The antibody or antibody-like molecule is not particularly limited, as long as the useful protein is recombinantly expressed in either transient expression or constant expression.
  • Usable animal-derived cells include, for example, adherent cells such as HEK and HeLa; suspension cells such as 293-F, 293-FT and Jurkat; mouse-derived cells such as CHO and MC Sf strains established from Spodoptera frugiperda such as Sf-9 and Sf-21, and insect cells such as silkworms (Nature, 315, 592-594 (1985)).
  • adherent cells such as HEK and HeLa
  • suspension cells such as 293-F, 293-FT and Jurkat
  • mouse-derived cells such as CHO and MC Sf strains established from Spodoptera frugiperda such as Sf-9 and Sf-21
  • insect cells such as silkworms (Nature, 315, 592-594 (1985)).
  • CHO cells or HEK cells are preferred.
  • a system that expresses a large amount of a heterologous protein in plants such as rapeseed, corn, potato, and banana has been developed, and cells of these plants can also be suitably used.
  • Examples of usable microorganisms include, for example, genus Escherichia, genus Bacillus, genus Pseudomonas, genus Serratia, genus Brevibacterium, genus Corynebacterium, Corynebacterium brevium.
  • Bacteria whose host vector system is being developed such as Bacillus, Brevibacillus, Streptococcus, and Lactobacillus; host vectors that have been developed by the genus Rhodococcus and Streptomyces.
  • yeasts for which host vector systems such as the genus Candida have been developed; host vectors such as the genus Neurospora, the genus Aspergillus, the genus Cephalosporium, and the genus Trichoderma. Molds that are being developed are listed. These microorganisms are not particularly limited to gram-negative microorganisms and gram-positive microorganisms. Preferred examples of gram-negative bacteria include Escherichia coli, and gram-positive bacteria include yeasts or Brevibacillus family bacteria.
  • a culture solution of a recombinant host cell as described above, a crushed product or an extract of the recombinant host cell, and a culture supernatant obtained by centrifuging or membrane-treating them are referred to as ⁇ antibody or antibody containing impurities.
  • ⁇ antibody or antibody containing impurities e.g., ⁇ antibody or antibody containing impurities.
  • Aqueous solution or suspension of like molecules e.g., A culture solution of these recombinant host cells, a crushed product or extract of the recombinant host cells, a culture supernatant obtained by centrifuging or membrane-treating them, and other extracts from biological samples include the antibody or antibody of interest. Many unnecessary impurities are contained in addition to the molecule.
  • Such impurities include, for example, cells, cell debris, organelle membrane fragments, contaminating proteins and their fragments and aggregates, protein aggregates, lipids (eg, cell wall material), nucleic acids (eg, chromosomal DNA or extrachromosomal DNA). , Ribonucleic acid (t-RNA or mRNA), medium components, or combinations thereof.
  • lipids eg, cell wall material
  • nucleic acids eg, chromosomal DNA or extrachromosomal DNA
  • t-RNA or mRNA Ribonucleic acid
  • the location of expression of the recombinant protein differs depending on the type of host. For example, some hosts secrete and express extracellularly, and some hosts express and accumulate intracellularly. There is also.
  • Many Gram-negative bacteria can accumulate the desired antibody or antibody-like molecule in the periplasmic fraction between the inner and outer membranes of the cell.
  • a host that expresses an antibody or an antibody-like molecule in the periplasm fraction or cells
  • it is necessary to extract the desired antibody or antibody-like molecule by dissolving or disrupting the membrane component of the host cell.
  • the antibody or antibody-like molecule is expressed in the host as an insoluble fraction such as an inclusion body, the host cells are collected by centrifugation or membrane separation, and then the host cells are dissolved or disrupted and the soluble fraction is centrifuged or subjected to membrane separation. It is necessary to extract the antibody or antibody-like molecule from the residue removed by the method.
  • an aqueous solution such as a buffer solution may be used in addition to water.
  • the buffer include phosphoric acid, citric acid, 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), Bis-Tris, N- (2-Acetamido) iminodiacetic acid (ADA), Piperazine-1, 4-bis ( 2-ethanesulphonic acid (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoaminosulphonic acid (ACES), 3- (N-Morpholino) -2-hydroxypropanesulphonic acid (MOPSO), N-hydroxy, Ny-hydroxy, N-hydoxy, N-hydoxy, N-hydoxy, N-hydoxy ) -2-Aminoethanesulfonic acid (BES), 3- (N-morpholino) Ropenesulfonic acid (MOPS), N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-a
  • treatment step with water-insoluble inorganic compound the aqueous solution or suspension of the antibody or antibody-like molecule containing impurities is treated with the water-insoluble inorganic compound containing one or more elements selected from magnesium, calcium, and aluminum.
  • impurities other than the antibody or antibody-like molecule to be purified are selectively adsorbed to the water-insoluble inorganic compound, and the antibody or antibody-like molecule is purified.
  • purification means that the ratio of impurities to antibodies or antibody-like molecules in an aqueous solution or suspension before contact with a water-insoluble inorganic compound is reduced.
  • Treatment refers to bringing an aqueous solution or suspension of an antibody or an antibody-like molecule containing impurities into contact with a water-insoluble inorganic compound.
  • an aqueous solution or suspension of an antibody or an antibody-like molecule containing impurities may be abbreviated as “antibody-containing solution”.
  • water-insoluble means the degree of dissolution within 30 minutes when a powder of an inorganic compound is put into purified water and shaken vigorously at 20 ⁇ 5 ° C. every 5 minutes for 30 seconds, specifically, 1 g of the inorganic compound Means that the amount of purified water required to dissolve is 100 mL or more.
  • the water-insoluble inorganic compound contains at least one element selected from magnesium, calcium, and aluminum, and includes, for example, insoluble carbonates, insoluble sulfates, insoluble phosphates, and oxides thereof.
  • Magnesium hydroxide, magnesium oxide, calcium sulfate, magnesium phosphate, and aluminum oxide are preferred, and a water-insoluble magnesium salt is more preferred.
  • basic magnesium carbonate which is a mixture of magnesium hydroxide and magnesium carbonate, is also suitably used.
  • phosphates other than magnesium phosphate such as calcium phosphate are not preferred because they may have relatively high water solubility or may adsorb the target antibody or antibody-like molecule.
  • magnesium carbonate is used for gastric and duodenal ulcers, gastritis (including acute / chronic gastritis, drug-induced gastritis), abnormal upper gastrointestinal tract function (including anorexia nervosa, so-called gastroptosis, hyperacidity) and constipation.
  • gastritis including acute / chronic gastritis, drug-induced gastritis
  • abnormal upper gastrointestinal tract function including anorexia nervosa, so-called gastroptosis, hyperacidity
  • constipation Several g of ethical drugs are administered per day, and its safety has been confirmed. In addition, it can be easily removed by standing sedimentation, centrifugation or membrane separation, and a small amount of spills can be separated by membrane separation. It is also excellent in that it can be easily separated and removed from the target antibody or antibody-like molecule by chromatography.
  • the size of the water-insoluble inorganic compound may be appropriately adjusted, and for example, the average particle diameter can be set to 0.1 ⁇ m or more and 1000 ⁇ m or less. If the average particle size is 1000 ⁇ m or less, the specific surface area of the water-insoluble inorganic compound is sufficiently large, and the impurities can be more efficiently adsorbed. No energy is required. Further, from the viewpoint of handleability at the time of packing in a column or the like, the average particle diameter is preferably 1 ⁇ m or more. In the present disclosure, the average particle diameter is measured by a laser diffraction type particle size distribution analyzer, and the standard of the average particle diameter includes a volume basis, a weight basis, and a number basis, but a volume basis is preferable.
  • the amount of the water-insoluble inorganic compound to be used may be adjusted depending on the concentration of the antibody-containing solution, and for example, the water-insoluble inorganic compound may be used in an amount of 0.1 g to 20 g per 100 mL of the antibody-containing solution.
  • the ratio is preferably 15 g / 100 mL or less.
  • 0.1% by mass or more and 20% by mass or less of a water-insoluble inorganic compound can be used with respect to the antibody-containing solution, and the ratio is preferably 1% by mass or more and 15% by mass or less.
  • a biological sample, a culture solution or an extract is allowed to stand or centrifuged, and dead-end filtration is performed.
  • the clarified liquid can be separated from host cells or fragments of host cells (clarification step).
  • the purification method of the present invention can be suitably used in combination with the treatment in the clarification step or alone. Note that these dead-end filtration, cross-flow filtration, treatment by acoustic wave separation, and purification according to the present invention may be performed after the culture solution or extract is centrifuged, or the culture solution or extract may be directly processed. May be.
  • the dead-end filtration is a filtration method in which a feed solution moves perpendicularly to a membrane, and a filtrate passes through the membrane.
  • Methods for recovering a solution containing an antibody or an antibody-like molecule by dead-end filtration include microfiltration or ultrafiltration using a bottle top filter or a centrifugal filter unit, but are not limited to this method. Absent.
  • Cross-flow filtration is a filtration method in which a feed solution moves parallel to the membrane surface, and the filtrate passes through a membrane.
  • a method for collecting a solution containing an antibody or an antibody-like molecule by cross-flow filtration include, but are not limited to, microfiltration or ultrafiltration using a cassette membrane or hollow fiber.
  • the treatment by the acoustic wave separation means that the insolubles in the feed solution are separated from the supernatant by irradiating the feed solution with a standing wave to collect and settle insolubles at the nodes of the standing wave.
  • a method of recovering a solution containing an antibody or an antibody-like molecule by acoustic wave separation include a method of treating a solution containing an antibody or an antibody-like molecule by an acoustic wave separator, but are not limited to this method. Absent.
  • the centrifugal filter units for performing the dead-end filtration include Vivaspin 20-3K (GE Healthcare Life Sciences), Vivaspin 20-5K (GE Healthcare Life Sciences), and Vivaspin EcoRes. Vivaspin 20-30K (GE Healthcare Life Sciences Inc.), Vivaspin 20-50K (GE Healthcare Life Sciences Inc.), Vivaspin 20-100K (GE Healthcare USA Medical Insurance Co., Ltd. CK MILLIPORE Corp.), Amicon Ultra-15 10kDa (MERCK MILLIPORE Corp.), Amicon Ultra-15 30kDa (MERCK MILLIPORE Corp.), Amicon Ultra-15 50kDa (MERCK MILLIPORE Corp.), Amicon Ultra-15 100kDa (MERCK MILLIPORE Corp.), and the like But not limited thereto.
  • Examples of the hollow fiber for performing the cross-flow filtration include MidGeee Cartridge, 0.1 micron (GE Healthcare Life Sciences), Midgee Cartridge, 0.2 micron (GE Healthcare, Germany, Germany, Canada, Canada). Life Sciences Inc.), Midgee Cartridge, 0.65 micron (GE Healthcare Life Sciences), Midgee Cartridge, 1kD (GE Healthcare, Germany, Germany, Germany, Germany, Germany) Healthcare Life Sciences, Inc.), MidGee Cartridge, 10kD (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), MidGee Cartridge, 30kD (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), MidGee Cartridge, 50kD (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), MidGee Cartridge, 100kD (GE Healthcare Life Sciences), but are not limited thereto.
  • ⁇ Examples of the acoustic wave separator include, but are not limited to, Cadence @ Acoustic @ Separator (PALL).
  • the method of contacting the antibody-containing solution with the water-insoluble inorganic compound may be appropriately selected.
  • a water-insoluble inorganic compound may be added to the antibody-containing solution and shaken or stirred.
  • the temperature at that time may be room temperature, specifically, it can be set to 0 ° C or more and 40 ° C or less.
  • the temperature is preferably 1 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher, or 15 ° C. or higher, and is preferably 30 ° C. or lower, more preferably 25 ° C. or lower.
  • the contact time can be set to 1 to 10 hours.
  • the water-insoluble inorganic compound may be separated from the antibody-containing liquid by centrifugation or filtration.
  • the antibody or antibody-like molecule is mainly dispersed in the liquid, and all or some of the other impurities are mainly adsorbed by the water-insoluble inorganic compound.
  • a part of the antibody or antibody-like molecule may be adsorbed to the water-insoluble inorganic compound, and some of the other impurities may be dissolved in the liquid, but at least the total amount of impurities in the liquid may be reduced.
  • the antibodies or antibody-like molecules in the fluid are concentrated.
  • Impurities adsorbed on the water-insoluble inorganic compound in this step are not particularly limited as long as they are compounds other than the antibody or the antibody-like molecule, and include, for example, an aggregated antibody or an aggregated antibody-like molecule, host cell contaminants, and cell culture. Contaminants.
  • Host cell contaminants include host cell-derived nucleic acids, plasmids, and host cell-derived proteins.
  • Cell culture contaminants include medium components, serum albumin, and other serum proteins, and plasmid DNA for transfection.
  • impurities other than the antibody or the antibody-like molecule may be adsorbed to the water-insoluble inorganic compound by filling the column with the water-insoluble inorganic compound and flowing the antibody-containing solution.
  • the adsorption of the impurities and the separation of the liquid component from the water-insoluble inorganic compound can be performed simultaneously. It is preferable that the filling amount of the water-insoluble inorganic compound in the column and the flow rate of the antibody-containing liquid are adjusted within a range in which impurities are sufficiently adsorbed to the water-insoluble inorganic compound.
  • Step of Contacting with Activated Carbon an aqueous solution or suspension of an antibody or an antibody-like molecule containing impurities is brought into contact with activated carbon.
  • This step may be performed before or after the above-described processing step, or may be performed simultaneously using a water-insoluble inorganic compound and activated carbon in combination. However, this step is optional.
  • Activated carbon is obtained by firing charcoal, coconut shell, or the like to develop pores to make it porous, and has excellent adsorption performance.
  • Typical specific surface area of activated carbon is about 800 m 2 / g or more and 2500 m 2 / g or less.
  • activated carbon examples include mineral activated carbon and plant activated carbon.
  • Examples of the mineral activated carbon include coal activated carbon and petroleum activated carbon.
  • Examples of the plant-based activated carbon include wood-based activated carbon and coconut shell activated carbon, and preferably wood-based activated carbon.
  • the raw material of the activated carbon is not particularly limited as long as it is a carbonaceous substance.
  • woody materials such as sawdust, charcoal, ash, peat, wood chips, etc .; coconut shell; coal such as lignite, lignite, anthracite; petroleum pitch Oil carbon; organic compounds such as rayon, acrylonitrile, and phenolic resin.
  • the method for producing activated carbon is not particularly limited.
  • a chemical solution activation method in which zinc chloride or phosphoric acid is added to a raw material at a high temperature and a carbonization reaction is performed at a high temperature, or a carbonized raw material and steam, carbon dioxide, air or combustion gas, etc.
  • Gas activation method in which the above-mentioned gas is reacted at a high temperature.
  • a zinc chloride activation method, an acid activation method using phosphoric acid, a steam activation method, and the like are used.
  • the shape of the activated carbon is not particularly limited, for example, granular activated carbon such as pulverized carbon, granular carbon, spheroidal carbon, and pellet carbon; fibrous activated carbon such as fiber and cloth; special molding such as sheet, molded body, and honeycomb Activated carbon; and powdered activated carbon.
  • activated carbon to which a positive or negative charge has been added and activated carbon modified with a surface modifier such as polyhydroxyethyl methacrylate (PHEMA), heparin, cellulose, or polyurethane are also included in the activated carbon used in the purification method of the present invention.
  • activated carbon used in the purification method of the present invention also includes a carbon gel produced by a sol-gel method.
  • Raw materials used in the sol-gel method include, for example, phenol, melamine, resorcinol, formaldehyde, and the like.
  • the average pore size of the activated carbon is not particularly limited, but is usually 0.1 nm or more and 20 nm or less, preferably 0.5 nm or more and 5.0 nm or less, more preferably 2.0 nm or more and 5.0 nm or less, and still more preferably It is 3.0 nm or more and 5.0 nm or less.
  • the average pore diameter of activated carbon can be calculated from the nitrogen adsorption isotherm curve using the BJH method.
  • the means of the purification method using the activated carbon of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a batch method, a membrane treatment method, and a column chromatography method, and an appropriate form of the activated carbon is selected according to each means. You. If necessary, in the form of particles or the like in which activated carbon is encapsulated in a porous polymer or gel, in the form of a film in which activated carbon is adsorbed, fixed or molded using a support agent or fiber such as polypropylene or cellulose, or in the form of a cartridge or the like Can also be used.
  • the membrane or cartridge containing activated carbon include, for example, CUNO activated carbon filter cartridge, Zetaplus activated carbon filter cardridge (manufactured by Sumitomo 3M, CUNO and Zetaplus are registered trademarks); Supra AKS1 filter, AKS1 filter, Stax (trademark) AKS1 (manufactured by Pall); Adol (manufactured by Unitika); K filter (registered trademark), activated carbon sheet (manufactured by Merck Millipore) Hemax (manufactured by Kuraray Co., Ltd.); Hemosorber (registered trademark) (manufactured by Asahi Kasei Medical Co., Ltd.); Hemocolumn (manufactured by Terumo Co., Ltd.); Not limited.
  • CUNO activated carbon filter cartridge Zetaplus activated carbon filter cardridge (manufactured by Sumitomo 3M, CUNO and Zetaplus are registered trademarks)
  • examples of the membrane or cartridge containing wood-based activated carbon include, for example, Zetaplus activated carbon filter cartridge (manufactured by Sumitomo 3M, Zetaplus is a registered trademark); Supra AKS1 filter, AKS1 filter, or Stax (trademark) @ AKS1 (or more) And Pall Corporation).
  • the packing density, particle size, hardness, loss on drying, residue on ignition, specific surface area or pore volume of the activated carbon to be used can be appropriately selected.
  • the amount of activated carbon used may be adjusted depending on the concentration of the antibody-containing solution, and for example, 0.5 g or more and 5 g or less of activated carbon may be used per 100 mL of the antibody-containing solution.
  • the contact method between the antibody-containing liquid and the activated carbon may be the same as in the case of the water-insoluble inorganic compound, by adding the activated carbon to the antibody-containing liquid and shaking or stirring, or by filling the column with activated carbon.
  • a water-insoluble inorganic compound and activated carbon may be mixed and used.
  • treatment step with flocculant an aqueous solution or suspension of the antibody or antibody-like molecule containing impurities is treated with the flocculant.
  • This step may be performed before or after the treatment step with the water-insoluble inorganic compound and / or the contacting step with the activated carbon, or the water-insoluble inorganic compound and / or the activated carbon and flocculant may be used. It may be carried out simultaneously in combination. However, this step is optional.
  • flocculants examples include caprylic acid, polyamine, divalent cation, polyetherimine, chitosan, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, pDACMAC, and the like.
  • divalent cation examples include Ca 2+ , Mg 2+ , Cu 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ , Be 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ , Ra 2+ , Zn 2+ , Cd 2+ , Ag 2+ , Pd 2+ , and Rh 2+ . These divalent cations can be used in a free state or as a hydrochloride, sulfate, citrate, or the like.
  • the amount of flocculant used may be adjusted depending on the concentration of the antibody-containing solution. For example, when the flocculant is a polyamine or polyether imine, a flocculant of 0.01 w / v% or more and 10 w / v% or less is used. It is sufficient to use a flocculant of 0.1 w / v% or more and 1 w / v% or less.
  • the flocculant is caprylic acid, chitosan, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or polyvinylpyrrolidone, a flocculant of 0.01 w / v% or more and 10 w / v% or less may be used, and more preferably 1 w / v% or more and 5 w / V% or less of flocculant may be used.
  • the flocculant is pDACMAC
  • a flocculant of 0.01 w / v% or more and 0.1 w / v% or less may be used, and more preferably 0.1 w / v% or more and 0.5 w / v% or less. May be used.
  • the flocculant is a divalent cation
  • the amount of the divalent cation may be 1 mM or more and 100 mM or less, more preferably 2 mM or more and 50 mM or less.
  • the contact method between the antibody-containing solution and the flocculant may be the same as in the case of the water-insoluble inorganic compound, by adding the flocculant to the antibody-containing solution and shaking or stirring, or by filling the column with the flocculant.
  • flocculant may be mixed with the water-insoluble inorganic compound and / or activated carbon.
  • Step of treatment with endonuclease an aqueous solution or suspension of the antibody or antibody-like molecule containing impurities is treated with endonuclease.
  • This step may be performed before or after each of the above steps, or may be performed at the same time using a water-insoluble inorganic compound, activated carbon and one or more selected from flocculant and flocculant and endonuclease simultaneously. May be implemented. However, this step is optional.
  • Endonuclease is one of DNA degrading enzymes and has a function of decomposing even at the center of the base sequence.
  • Examples of commercially available products include benzonase (Millipore) and Kaneka endonuclease (Kaneka).
  • the amount of the endonuclease to be used may be adjusted depending on the concentration of the antibody-containing solution, for example, preferably 10 U / mL or more, more preferably 100 U / mL or more, based on the antibody-containing solution.
  • the upper limit is not particularly limited, but is preferably 10,000 U / mL or less.
  • the above steps are not limited to the pre-stage or post-stage of a general antibody or antibody-like molecule purification process such as membrane or column treatment shown below, and can be suitably used.
  • it can be expected to reduce the adsorption capacity of the chromatographic carrier, decrease in separation ability, decrease in processing speed and washing due to increased back pressure, and decrease in carrier life due to decrease in regeneration efficiency,
  • the membrane filtration process it can be expected that a decrease in the processing capacity per unit membrane area, an increase in the back pressure, a reduction in the processing speed, and a decrease in the life of the carrier due to a decrease in the washing and regeneration efficiency can be expected.
  • the antibody or antibody-like molecule purified by the above steps is also a preferred embodiment of the present invention, in other words, as a pretreatment of the column treatment or membrane filtration treatment,
  • the purification method of the present invention can also be used.
  • the above steps decrease the adsorption capacity of the chromatographic carrier, decrease the separation ability, decrease the treatment speed due to the increase in back pressure, and wash and regenerate It can be expected to reduce the life of the carrier due to a decrease in efficiency, and also in the membrane separation process, a decrease in the processing capacity per unit membrane area, an increase in the back pressure, a decrease in the processing speed, and a decrease in the cleaning and regeneration efficiency It is excellent in that a reduction in the life can be suppressed.
  • the water-insoluble inorganic compound used in the present invention is a water-insoluble additive, which can be easily removed by spontaneous sedimentation, centrifugation or membrane separation. It can be easily removed by a lithography process, and furthermore, there is no concern about side effects of spills and the like, which is industrially excellent.
  • the antibody-containing solution can be purified by column treatment such as chromatography.
  • the chromatography used is not particularly limited as long as it can recover and purify the desired antibody or antibody-like molecule.Anion exchange chromatography, cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite chromatography, mixed Examples include chromatography such as mode chromatography and affinity chromatography, and these may be used alone or in combination.
  • the above steps, especially the above-mentioned treatment steps can be suitably used also in the former stage or the latter stage of the chromatography step.
  • the anion exchange resin used in the anion exchange chromatography is not limited as long as it exhibits an anion exchange action.
  • the anion exchange resin Capto Q (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Capto DEAE (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Capto Q ImpRes (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Capto Q Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences, Inc.) RESOURCE Q (GE Healthcare Life Sciences), SOURCE 30Q (GE Healthcare Life Sciences), YMC BioPro Q (YMC), YMC BioPro DA (YMC) upperQ-650 (TOSOH), TOYOPEARL GigaCapQ-650 (TOSOH), TOYOPEARL DEAE-650 (TOSOH), TOYOPEARL GigaCap DEAE-650 (TOSOH), CelluFineXe-Mine-XE-FineXe-Mine-XE-FineXMine h (JNC), Cellufine @ MAX @ DEAE (JNC), and the like, but are not limited thereto.
  • the cation exchange resin used in the cation exchange chromatography is not limited as long as it exhibits a cation exchange action.
  • the cation exchange resin Capto S (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Capto SP ImpRes (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), SP Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), RESOURCE S (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), SOURCE 30S (GE Healthcare Life Sciences), YMC BioPro S (YMC), YMC BioPro CM (YMC), TOYOPEARL SP-650 (TOSOH), TOYOPEARL OSGigaCap , TOYOPEARL CM-650 (TOSOH), TOYOPEARL GigaCap CM-650 (TOSOH), Cellufine MAX Sr (JNC), Cellufine MAX Sh (JNC), CelluFN, etc. But not limited to these.
  • the hydrophobic chromatography resin used in the hydrophobic chromatography is not limited as long as it exhibits hydrophobic interaction.
  • the hydrophobic chromatography resin Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Buthyl Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences, Inc.), Buthyl Sepharose 6 Fast Flow ( GE Healthcare Life Sciences Inc.), Octyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences Inc.), Butyl Seph.
  • hydroxyapatite resin used for the hydroxyapatite chromatography examples include Ceramic Hydroxyapatite (Bio-Rad Laboratories), Ceramic FluoPalate (Bio-Rad Laboratories), and MPC BioRadio Laboratories. ), But are not limited to these.
  • the resin used in the mixed mode chromatography is not particularly limited as long as it is a mixture of two or more that show different interactions.
  • resins for mixed mode chromatography include Capto MMC (GE Healthcare Life Sciences), Capto Adhere (GE Healthcare Life Sciences), and Eshumno HCX (not limited to Merck Millipore).
  • the resin used for affinity chromatography is not particularly limited as long as it has an affinity for the substance to be adsorbed.
  • resins for affinity chromatography KANEKA @ KanCapA (Kaneka), KANEKA @ KanCapA @ 3G (Kaneka), KANEKA @ KanCapG (Kaneka), KANEKA @ KanCapL (Kaneka), MabSelect.
  • the amount of solvent may be reduced to concentrate the antibody or antibody-like molecule, or the solvent may be exchanged.
  • impurities can be quantified using a commercially available assay kit in addition to using absorbance analysis, electrophoresis, HPLC, or the like.
  • a commercially available assay kit manufactured by Cygnus
  • host-derived proteins derived from CHO cells can be quantified.
  • a desired detection system can be prepared by immunizing an animal such as a chicken with the contaminating protein.
  • impurities such as DNA can be quantified by a technique such as qPCR.
  • Example 1 Treatment of animal cell-derived culture solution with basic magnesium carbonate
  • Basic magnesium carbonate was added to a concentration of 10 wt% in a buffer (pH 7.0) containing 0.025 mol / mL sodium phosphate, By dispersing, a basic magnesium carbonate dispersion was prepared.
  • An animal cell-derived culture solution containing the same amount of monoclonal antibody (IgG) was added to the basic magnesium carbonate dispersion, and the mixture was stirred well, and then allowed to stand in a 25 ° C. incubator for 1 hour. Thereafter, the treated solution was centrifuged at 15,000 rpm at 15 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was recovered.
  • IgG monoclonal antibody
  • Test Example 1 Measurement of Antibody Concentration, DNA and Host Cell Protein (HCP) Content
  • HCP Host Cell Protein
  • the HCP content was measured using CHO Host Cell Protein ELISA Kit, 3rd Generation, manufactured by Cygnus, according to the attached protocol.
  • the DNA content was measured using CHO DNA Amplification Kit in Tubes manufactured by Cygnus according to the attached protocol.
  • FIG. 1 and Table 1 show the amounts of HCP before and after the treatment.
  • Example 2 Evaluation of the effect of the addition amount of basic magnesium carbonate on the removal rate of impurity protein 1% w / v%, 5w / v%, or 10w / v% of basic magnesium carbonate in a culture supernatant derived from animal cells containing a monoclonal antibody The mixture was added and stirred at room temperature for 18 hours using a mix rotor. Thereafter, the supernatant was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes to obtain a treatment liquid. IgG, HCP and DNA concentrations were quantified. The results are shown in Table 2, FIG. 2 and FIG.
  • Example 3 Effect of Combining Water-Insoluble Inorganic Compound with Removal of Impurities and Activated Carbon 1% by weight of water-insoluble inorganic compound and 0.67% by weight of activated carbon were added to a culture supernatant derived from animal cells containing a monoclonal antibody at room temperature. The mixture was stirred for 18 hours using a mixing rotor, and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to collect a supernatant, thereby obtaining a treated liquid.
  • As the water-insoluble inorganic compound basic magnesium carbonate, magnesium oxide, magnesium hydroxide, calcium sulfate, or aluminum oxide was used. IgG concentration and HCP and DNA content were quantified. The results are shown in Table 3, FIG. 4 and FIG.
  • Example 4 Improvement of protein A capture step by addition of basic magnesium carbonate 1 wt% of basic magnesium carbonate was added to animal cell-derived culture supernatant containing a monoclonal antibody, and the mixture was stirred at room temperature for 18 hours using a mix rotor. did.
  • Example 5 Removal of impurities using a basic magnesium carbonate-filled column A 1-mL chromatography column was packed with basic magnesium carbonate, and a culture supernatant derived from animal cells containing a monoclonal antibody was passed through to remove IgG, HCP and DNA content. Quantified. The results are shown in Table 5, FIG. 9 and FIG.
  • Example 6 Removal of impurities from VHH-containing Pichia-derived culture supernatant with basic magnesium carbonate 0.67 wt% of activated carbon and / or 1 wt% of basic magnesium carbonate was added to Pichia culture supernatant containing heavy chain antibody (VHH). In addition, the mixture was stirred for 2 hours with a mix rotor, and then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to collect a supernatant, thereby obtaining a treatment liquid. The culture solution and the treatment solution before the treatment were analyzed by SDS-PAGE.
  • Example 7 Removal of impurities from scFV-containing pichia-derived culture supernatant with basic magnesium carbonate 0.67 wt% activated carbon and / or 1 wt% or 10 wt% base in Pichia culture supernatant containing single-chain antibody (scFV) Magnesium carbonate was added, and the mixture was stirred with a mixing rotor for 2 hours, and then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to collect a supernatant, thereby obtaining a treated liquid. The culture solution and the treatment solution before the treatment were analyzed by SDS-PAGE. From the obtained SDS-PAGE, the band around 30 kDa of scFV as the target substance and the other band intensity as impurities were read, and the VHH recovery rate and the impurity remaining rate were determined. Table 7 shows the obtained results.
  • Example 8 Removal of impurities from VHH-containing Escherichia coli-derived culture supernatant using basic magnesium carbonate 1 wt% or 10 wt% of basic magnesium carbonate was added to the VHH-containing Escherichia coli culture supernatant, and the mixture was stirred for 2 hours with a mix rotor. The supernatant was collected by centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes to obtain a treatment liquid. The culture solution and the treatment solution before the treatment were analyzed by SDS-PAGE. From the obtained SDS-PAGE, the band around 30 kDa of scFV as the target substance and the other band intensity as impurities were read, and the VHH recovery rate and the impurity remaining rate were determined. Table 8 shows the obtained results.
  • Example 9 Removal of impurities from Fab-containing culture solution using basic magnesium carbonate 0 wt%, 1 wt% or 10 wt% of basic magnesium carbonate was added to the Fab-containing CHO culture supernatant, and the mixture was stirred with a mix rotor for 2 hours. After centrifugation at 15,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was collected as a treated liquid. The concentrations of Fab, HCP and DNA in the treated solution were measured. The Fab concentration was measured by protein G chromatography.
  • Example 10 Removal of aggregates from antibody-containing culture solution with basic magnesium carbonate 0 wt% or 1 wt% of basic magnesium carbonate was added to the monoclonal antibody-containing CHO culture supernatant, and the mixture was stirred for 18 hours with a mix rotor, and then mixed. After centrifugation at 2,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was collected as a treated liquid. The IgG concentration and the aggregate content in the treated liquid were measured. The aggregate content was measured by gel filtration chromatography.
  • Example 11 Removal of impurities by a combination of basic magnesium carbonate and endonuclease 1 wt% of basic magnesium carbonate and / or 100 U / mL Kaneka endonuclease were added to the monoclonal antibody-containing CHO culture supernatant, and the mixture was mixed for 18 hours using a mixing rotor. After stirring, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to collect a supernatant as a treated liquid. The IgG concentration, HCP concentration and DNA concentration in the treated solution were measured.
  • Example 12 Removal of impurities by trimagnesium phosphate To a culture supernatant derived from animal cells containing a monoclonal antibody, 1 wt% or 10 wt% of trimagnesium phosphate and 0.67 wt% of activated carbon were respectively added, and a mix rotor was added at room temperature. The mixture was stirred for 18 hours and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes to collect a supernatant as a treated liquid. The IgG concentration, HCP and DNA content in the treated solution were quantified. Table 12 shows the results.
  • trimagnesium phosphate also had an impurity removing ability, and the impurity removing ability could be further enhanced by adding activated carbon.

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Abstract

本発明は、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液からの効率的な不純物の除去を可能にする方法を提供することを目的とする。本発明に係る抗体または抗体様分子の精製方法は、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含む水不溶性無機化合物で処理する工程を含むことを特徴とする。

Description

抗体または抗体様分子の精製方法
　本発明は、不純物を含む組成物から不純物を低減し、目的とする抗体または抗体様分子の純度を向上させる方法に関する。
　近年、生体試料からの抽出や、遺伝子組換え技術を用いて生産される抗体などの有用タンパク質が、医薬品を始め、食品や工業用酵素、吸着剤、センサーなど多くの用途に用いられており、その効率的な高純度精製が課題となっている。不純物は、目的とする有用タンパク質の機能に影響を及ぼすことや、副作用の原因となることが多く、有用タンパク質の有効性と安全性の確保には、これら不純物を取り除き、高度に精製する必要がある。例えば、組換えタンパク質やペプチドといった有用タンパク質を主薬とするバイオ医薬品の分野においては、遺伝子組換え技術により目的の有用タンパク質を動物細胞や植物細胞、細菌細胞を宿主として組換え発現させたのちに、高純度に精製が行われる。組換え動物細胞や植物細胞、細菌細胞を培養して生産される有用タンパク質は、培養上清中に分泌されるもの、細胞内に可溶性発現するもの、細胞内に封入体として不溶性発現するものがある。培養上清中に発現した有用タンパク質は、遠心分離や膜処理により、宿主の動物細胞や植物細胞、細菌細胞やその断片や他の不溶性成分から分離され、その後、クロマトグラフィーや膜分離プロセスにより高純度精製される。細胞内に可溶性発現した有用タンパク質は、細胞を溶解または破砕する等の手法により抽出され、不溶性成分を遠心分離や膜処理により除去した後に、クロマトグラフィーや膜分離プロセスにより高純度精製される。細胞内に不溶性発現した有用タンパク質は、細胞を溶解または破砕する等の手法により抽出された後に、可溶性成分を遠心分離や膜処理により除去した残渣から可溶化抽出した不純物を含む有用タンパク質溶液からクロマトグラフィーや膜分離プロセスにより高純度精製される。
　クロマトグラフィーや膜分離プロセスに供される有用タンパク質を含む溶液は宿主由来の夾雑タンパク質、核酸、細胞やオルガネラの膜断片および培地成分等の多量の不純物を含むため、クロマトグラフィーや膜分離プロセスへの負荷が大きく、クロマトグラフィー担体の吸着容量の低下、分離能の低下、背圧上昇による処理速度の低下や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下に繋がる。また、膜分離プロセスにおいても、単位膜面積当たりの処理容量の低下、背圧上昇、処理速度の低下や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下に繋がる。大量の不純物は、クロマトグラフィーや膜分離プロセスによる高純度精製に大きな負荷を与えることから、これらの処理前に不純物を低減することは、後段プロセスの負荷低減に重要である。
　不純物を含む有用タンパク質溶液を処理し不純物を低減する技術としては、ポリアミン（非特許文献１）、キトサン（非特許文献２）、低ｐＨ下での遊離の２価陽イオン（特許文献１）、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ＰＤＡＣＭＡＣ，非特許文献３）、エンドヌクレアーゼ（非特許文献４）等の水溶性の添加剤を添加処理する方法や、ｐＨ調整（非特許文献５）や熱処理（特許文献２）により不純物を沈殿除去する手法が知られている。
　抗体などの有用タンパク質の精製は通常水系で行われることから、水溶性の添加剤は後段工程での除去が課題となる。加えて添加剤やその断片自体が有用タンパク質に吸着する等、その後段での除去プロセスの構築が困難であると共に、残留物の安全性や数値管理が課題となる。例えば有用タンパク質が医薬品である場合は、安全性の観点から高度に精製しておく必要があり、アメリカ食品医薬品局（Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）はＱ３Ａガイドラインに厳しく残留不純物の管理を求めている。エンドヌクレアーゼは、他の夾雑タンパク質等の不純物除去時にクロマトグラフィーの条件設定により容易に除去できることから優れている。一方で、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを断片化し無効化が可能であると共に、断片化したＤＮＡのクロマトグラフィーや膜分離除去効率の向上には効果があるものの、夾雑タンパク質等の除去には効果が無く、不純物除去手法としては不十分である。また、ｐＨ処理や熱処理は、目的の有用タンパク質の機能を低下や変性、凝集、分解するリスクが高く、厳密な工程パラメーターの管理や処理により生じた目的物に由来する凝集体、断片および修飾体といった不純物の除去があらたな課題となっている。
特表２０１０－５０８３５２号公報 特開昭６３－２７５６００号公報
Ｐｅｒａｍ　Ｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｐｒｏｇ，２６（５）：１３２２－１３３１ Ｒｉｓｋｅ　Ｆら，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１２８（４）：８１３－８２３ ＭｃＮｅｒｎｅｙ　Ｔら，２４１st　ＡＣＳ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ＆Ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ，Ａｎａｈｅｉｍ，ＣＡ，ＢＩＯＴ－３０２ Ｄ．Ｗ．Ｚａｂｒｉｓｋｉｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３２，１００－１０４ Ｈｊｅｌｍら，ＦＥＢＳ．ＬＥＴＴ．，１９７２，２８：７３－７６
　上記従来技術の多くが、抗体などの有用タンパク質の精製のために水溶性の高い添加剤を用いており、目的とする有用タンパク質から、上記添加剤やその分解物を後段プロセスで除去することが困難だったり、残留物の管理などに課題がある。またｐＨ処理や熱処理は、有用タンパク質の機能を低下や変性、凝集、分解するリスクが高く、厳密な工程パラメーターの管理や処理により生じた目的物に由来する凝集体や断片および修飾体といった不純物の除去があらたな課題を生じるため、高純度精製前の粗精製手法として問題がある。
　そこで本発明は、抗体などの有用タンパク質溶液からの不純物の除去に有効で、その後の後段プロセスへの負荷も軽い添加剤とその利用方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、不純物を含む抗体または抗体様分子水溶液または懸濁液に、特定の水不溶性無機化合物を添加することで、目的の抗体または抗体様分子を水溶液側に維持したまま不純物を効果的に低減できるだけでなく、水不溶性無機化合物は自然沈降、遠心、膜分離などによって容易に系から分離できることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、以下のとおりである。
　［１］　抗体または抗体様分子を精製するための方法であって、
　不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含む水不溶性無機化合物で処理する工程を含むことを特徴とする方法。
　［２］　前記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される１以上である上記［１］に記載の方法。
　［３］　更に、前記水溶液または懸濁液を活性炭に接触させる工程を含む上記［１］または［２］に記載の方法。
　［４］　前記水溶液または懸濁液が、抗体または抗体様分子を含む培養液である上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
　［５］　前記水溶液または懸濁液が、培養液を遠心処理または膜処理して得られる培養上清である上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
　［６］　前記培養液が、抗体または抗体様分子を生産する組換え宿主細胞の培養液である上記［４］または［５］に記載の方法。
　［７］　前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物である上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
　［８］　前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物を遠心または膜処理して得られる上清である上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
　［９］　前記水溶液または懸濁液が、生体抽出物である上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
　［１０］　前記抗体または抗体様分子がＦｃ含有タンパク質である上記［１］～［９］のいずれか１項に記載の方法。
　［１１］　前記抗体または抗体様分子が低分子化抗体である上記［１］～［１０］のいずれか１項に記載の方法。
　［１２］　更に、前記水溶液または懸濁液をフロキュラントで処理する工程を含む上記［１］～［１１］のいずれか１項に記載の方法。
　［１３］　更に、前記水溶液または懸濁液をエンドヌクレアーゼで処理する工程を含む上記［１］～［１２］のいずれか１項に記載の方法。
　［１４］　精製された抗体または抗体様分子を、更にカラム処理又は膜ろ過処理する工程を含む上記［１］～［１３］のいずれか１項に記載の方法。
　本発明によれば、特定の水不溶性無機化合物を用いることで、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液から不純物を効率的に除去することができる。本手法単独でも粗精製物の調製が可能となるだけでなく、他の高度な精製プロセスと組み合わせた場合は、後段の精製プロセスの負荷を低減可能である。
図１は、本発明と既存の手法を用いた際の不純物量の低減効果を示すグラフである。 図２は、水不溶性無機化合物である塩基性炭酸マグネシウムの添加量と、ＩｇＧ濃度および不純物であるホストセルプロテイン（ＨＣＰ）の残留量との関係を示すグラフである。 図３は、水不溶性無機化合物である塩基性炭酸マグネシウムの添加量と、ＩｇＧ濃度および不純物であるＤＮＡの残留量との関係を示すグラフである。 図４は、様々な水不溶性無機化合物単独または活性炭との組み合わせと、ＩｇＧ濃度および不純物であるＨＣＰの残留量との関係を示すグラフである。 図５は、様々な水不溶性無機化合物単独または活性炭との組み合わせと、ＩｇＧ濃度および不純物であるＤＮＡの残留量との関係を示すグラフである。 図６は、水不溶性無機化合物である塩基性炭酸マグネシウムおよび抗体精製用担体との組み合わせと、ＩｇＧ回収率および不純物であるＨＣＰの残留量との関係を示すグラフである。 図７は、水不溶性無機化合物である塩基性炭酸マグネシウムおよび抗体精製用担体との組み合わせと、ＩｇＧ回収率および不純物であるＤＮＡの残留量との関係を示すグラフである。 図８は、水不溶性無機化合物である塩基性炭酸マグネシウムおよび抗体精製用担体との組み合わせと、担体洗浄液における不純物であるＨＣＰおよびＤＮＡの量との関係を示すグラフである。 図９は、塩基性炭酸マグネシウムを充填したカラムへの通液前後における培養上清中のＨＣＰ濃度とＩｇＧ濃度を示すグラフである。 図１０は、塩基性炭酸マグネシウムを充填したカラムへの通液前後における培養上清中のＤＮＡ濃度とＩｇＧ濃度を示すグラフである。
　本発明は、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、特定の水不溶性無機化合物で処理することで、不純物を除去する、抗体または抗体様分子の精製方法に関するものである。以下、本発明方法を工程に分けて説明するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
　１．抗体／抗体様分子含有液の調製工程
　本工程では、精製対象である抗体または抗体様分子を含む水溶液または懸濁液を調製する。本工程の実施は任意であり、既にかかる水溶液または懸濁液が得られている場合などには本工程を実施する必要は無い。水溶液は、抗体または抗体様分子が溶媒である水に溶解しており且つ不溶性成分を含まない溶液をいい、懸濁液は、抗体または抗体様分子が溶媒である水に溶解している一方で、細胞、その破砕物、細胞由来成分の凝集物、凝集タンパク質などの不溶性成分を含む溶液をいう。なお、不溶性成分は、溶液中に分散していてもよく沈降していてもよい。
　本発明において精製の対象となる「抗体または抗体様分子」は、産業利用上有用とされている抗体または抗体様分子であればよく、ポリペプチド構造を有する機能的タンパク質であって、αヘリックスやβシート構造等の二次構造を分子内に含むものの他に、糖鎖を有するもの、糖修飾されたもの、リン酸化やチロシン化等の修飾を受けたもの、金属配位したものを含む。また、天然に存在するタンパク質やペプチドの他に、遺伝子組換え技術により生産されたもの、その機能を改良されたもの、機能的部位のみからなる構造体、および、異なる機能部位の連結体や、同一の機能部位の連結体を含む。また、分子内のシステイン残基によるジスルフィド結合により分子内架橋されたもの、分子間のシステイン残基によるジスルフィド結合により分子間架橋されたもの、非共有結合的にサブユニット構造を含むものの他、化学修飾により連結されたタンパク質や、タンパク質の化学修飾や機能性分子の付加により機能付与されたものを含む。
　本発明における、抗体または抗体様分子としては、特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、Ｆｃ融合タンパク質、バイスペシフィック抗体、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）などが挙げられる。本発明においては、これら抗体または抗体様分子として、免疫グロブリン、Ｆｃ部を有するＦｃ融合タンパク質などのＦｃ含有タンパク質であってもよく、上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、バイスペシフィック抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）といった低分子化抗体であっても、いずれも好ましく対象とすることが出来る。
　本発明において、特定の水不溶性無機化合物で処理する、「不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液」としては特に限定されず、上記抗体または抗体様分子を含有し、それ以外の夾雑物を不純物として含む、水溶液あるいは懸濁液であれば特に限定されないが、例えば、培養液、培養上清、培養物である細胞やその破砕物を水に懸濁させたものやその抽出物、生体抽出物などが挙げられる。また水溶液や懸濁液として、共存する有機溶媒の存在を妨げるものではない。夾雑物は、精製対象である抗体または抗体様分子以外の化合物であれば特に制限されないが、例えば、宿主由来のタンパク質や核酸が挙げられる。
　上記培養される細胞としては、天然由来の細胞であってもよいが、組換え宿主細胞であるのが好ましい。ここで宿主とは、抗体または抗体様分子を組換え生産するために用いられる動物、植物または細菌の細胞であって、抗体または抗体様分子をコードするＤＮＡを含む発現ベクターや遺伝子断片により形質転換され、導入されたＤＮＡを発現して有用タンパク質を生産することができる動植物由来の細胞あるいは微生物であれば、特に制限するものではない。本発明における遺伝子組換え体とは、目的とする抗体または抗体様分子のアミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む発現ベクターまたは遺伝子断片が導入され形質転換された宿主細胞である。抗体または抗体様分子は、一過性発現でも定常的発現でも有用タンパク質が組換え発現する限り、特に制限されない。
　利用可能な動物由来の細胞（動物細胞）としては、例えば、ＨＥＫ、ＨｅＬａなどの付着系の細胞；２９３－Ｆ、２９３－ＦＴ、Ｊｕｒｋａｔなどの浮遊系の細胞；ＣＨＯ、ＭＣなどのマウス由来細胞；Ｓｆ－９、Ｓｆ－２１などのスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から確立されたＳｆ株、蚕等の昆虫細胞（Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２－５９４（１９８５））が挙げられる。このなかでもＣＨＯ細胞またはＨＥＫ細胞が好ましい。
　利用可能な植物としては、菜種、トウモロコシ、ジャガイモ、バナナなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、これら植物の細胞も好適に利用できる。
　利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属など宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属など宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。これら微生物は、グラム陰性微生物でも、グラム陽性微生物でも特に限定されないが、グラム陰性菌としては大腸菌が、グラム陽性菌としては酵母またはブレビバチルス族細菌が好ましい例としてあげられる。
　本発明においては、上記のような組換え宿主細胞の培養液、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物、それらを遠心または膜処理して得られる培養上清を、「不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液」として好ましく使用できる。これら組換え宿主細胞の培養液、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物、それらを遠心または膜処理して得られる培養上清、そのほか生体試料からの抽出物には、目的とする抗体または抗体様分子の他に、不必要な不純物が多く含まれている。そのような不純物としては、例えば、細胞、細胞破片、オルガネラの膜断片、夾雑タンパク質およびそのフラグメントや凝集体、タンパク質の凝集体、脂質（例えば細胞壁物質）、核酸（例えば染色体ＤＮＡもしくは染色体外ＤＮＡ）、リボ核酸（ｔ－ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ）、培地成分またはそれらの組み合わせなどが挙げられる。例えば、抗体または抗体様分子が組換えタンパク質の場合、宿主の種類により組換えタンパク質が発現する場所が異なる、例えば、細胞外に分泌発現する宿主もあれば、細胞内に発現して蓄積する宿主もある。グラム陰性菌の多くは、細胞内膜と外膜の間のペリプラズム画分に目的の抗体または抗体様分子を蓄積することができる。ペリプラズム画分あるいは細胞内に抗体または抗体様分子を発現する宿主の場合、宿主細胞の膜成分の溶解または破砕により、目的の抗体または抗体様分子を抽出する必要がある。抗体または抗体様分子が封入体等の不溶性画分として宿主内に発現する場合は、宿主細胞を遠心または膜分離により回収した後に、宿主細胞を溶解または破砕して可溶性画分を遠心または膜分離により除去した残渣から抗体または抗体様分子を抽出する必要がある。
　上記水溶液および懸濁液の溶媒としては、水の他、緩衝液などの水溶液を用いても良い。緩衝液としては、例えばリン酸、クエン酸、２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＥＳ）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＤＡ）、Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）、３－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＥＳ）、３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）、Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＥＳ）、４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）を含む緩衝液、およびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水が挙げられる。不純物を含む抗体または抗体様分子水溶液または懸濁液を水不溶性無機化合物で処理する際のｐＨは４以上、１２以下であることが好ましく、５以上、１０以下であることがより好ましい。
　２．水不溶性無機化合物による処理工程
　本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含む水不溶性無機化合物で処理することにより、精製対象である抗体または抗体様分子以外の不純物を選択的に水不溶性無機化合物に吸着させ、抗体または抗体様分子を精製する。なお、「精製」とは、水不溶性無機化合物に接触させる前の水溶液または懸濁液における抗体または抗体様分子に対する不純物の割合が、低減されることをいう。また、「処理」とは、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、水不溶性無機化合物に接触させることをいう。以下、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を「抗体含有液」と略記する場合がある。
　本開示において水不溶性とは、無機化合物の粉末を精製水に入れ、２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶ける度合をいい、具体的には無機化合物１ｇを溶かすに要する精製水の量が、１００ｍＬ以上であることをいう。
　水不溶性無機化合物は、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含むものであり、これらの不溶性炭酸塩、不溶性硫酸塩、不溶性リン酸塩、酸化物などが挙げられ、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、リン酸マグネシウム、および酸化アルミニウムから選択される１以上が好ましく、水不溶性マグネシウム塩がより好ましい。例えば、水酸化マグネシウムと炭酸マグネシウムの混合物である塩基性炭酸マグネシウムも好適に用いられる。但し、リン酸カルシウムなど、リン酸マグネシウムを除くリン酸塩は、水溶性が比較的高かったり、目的の抗体または抗体様分子を吸着してしまうおそれがあり得るため、好ましくない。
　特に炭酸マグネシウムは、胃・十二指腸潰瘍、胃炎（急・慢性胃炎、薬剤性胃炎を含む）、上部消化管機能異常（神経性食思不振、いわゆる胃下垂症、胃酸過多症を含む）、便秘症に医療用医薬品として１日に数ｇの投与が行われており、安全性が確認されている他、静置沈殿、遠心や膜分離で容易に除去でき、また、微量の漏出物も膜分離やクロマトグラフィー処理により容易に目的の抗体または抗体様分子から分離除去できる点でも優れている。
　水不溶性無機化合物の大きさは適宜調整すればよいが、例えば、平均粒子径を０．１μｍ以上、１０００μｍ以下とすることができる。当該平均粒子径が１０００μｍ以下であれば、水不溶性無機化合物の比表面積は十分に大きく、不純物をより効率的に吸着することができ、また、０．１μｍ以上であれば、粉砕のために過剰なエネルギーが必要無い。また、カラムへの充填の際などにおける取扱性の観点から、上記平均粒子径としては１μｍ以上が好ましい。なお、本開示において平均粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置により測定するものとし、平均粒子径の基準としては、体積基準、重量基準、数基準などがあるが、体積基準が好ましい。
　水不溶性無機化合物の使用量は、抗体含有液の濃度などにより調整すればよいが、例えば、抗体含有液１００ｍＬに対して０．１ｇ以上、２０ｇ以下の水不溶性無機化合物を用いればよい。当該割合としては、１５ｇ／１００ｍＬ以下が好ましい。また、抗体含有液に対して０．１質量％以上、２０質量％以下の水不溶性無機化合物を用いることができ、当該割合としては１質量％以上、１５質量％以下が好ましい。
　一般に、抗体または抗体様分子を含む培養液などと、培養に使用した宿主細胞あるいは宿主細胞の破片を分離する方法としては、生体試料、培養液または抽出物を静置または遠心分離、デッドエンドろ過、クロスフローろ過、アコースティックウェーブセパレーションによって処理したのちに清澄化液を回収することで宿主細胞あるいは宿主細胞の破片と分離することができる（清澄化工程）。本発明の精製方法は前記清澄化工程の処理と併用してあるいは単独にて好適に用いることが出来る。なお、これらデッドエンドろ過、クロスフローろ過、アコースティックウェーブセパレーションによる処理および本発明による精製は、該培養液または抽出物を遠心分離した後に行なっても良いし、該培養液または抽出物をそのまま処理しても良い。
　前記デッドエンドろ過とは、フィード溶液がメンブレンに対して垂直に移動するろ過方式であり、ろ液はメンブレンを通過する。デッドエンドろ過により、抗体または抗体様分子を含む溶液を回収する方法としては、ボトルトップフィルターや遠心式フィルターユニットを用いた精密ろ過または限外ろ過が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
　前記クロスフローろ過とは、フィード溶液が膜表面に平行に移動するろ過方式であり、ろ液はメンブレンを通過する。クロスフローろ過により、抗体または抗体様分子を含む溶液を回収する方法としては、カセットメンブレンあるいは中空子を用いた精密ろ過または限外ろ過が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
　前記アコースティックウェーブセパレーションによる処理とは、フィード溶液に定在波を照射することにより、定在波の節の位置に不溶物を集め、沈降させることで、フィード溶液中の不溶物と上清を分離する方法である。アコースティックウェーブセパレーションにより、抗体または抗体様分子を含む溶液を回収する方法としては、アコーステッィクウェーブセパレーターによって抗体または抗体様分子を含む溶液を処理する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
　前記デッドエンドろ過を行なう場合のボトルトップフィルターとしては、Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　ＰＥＳ　膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター　０．４５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　ＰＥＳ　膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター　０．２μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＩＷＡＫＩ　ボトルトップフィルター５００ｍＬ　ＰＥＳ　０．２２μｍ　３３口径（ＡＧＣテクノグラス・ＩＷＡＫＩ社）、Ｂｏｔｔｌｅ　ｔｏｐ　ｖａｃｕｕｍ　ｆｉｌｔｅｒ　０．２２μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、Ｂｏｔｔｌｅ　ｔｏｐ　ｖａｃｕｕｍ　ｆｉｌｔｅｒ　０．４５μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記デッドエンドろ過を行なう場合の遠心式フィルターユニットとしては、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－３Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－５Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－１０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－３０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－５０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　３ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　１０ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　３０ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　５０ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　１００ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記クロスフローろ過を行なう場合のカセットメンブレンとしては、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．６５μｍ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．２２μｍ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．４５μｍ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．１０μｍ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０ｃｍ2，５ＫＤ，ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０ｃｍ2，１０ＫＤ，ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０ｃｍ2，３０ＫＤ，ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０ｃｍ2，５０ＫＤ，ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０ｃｍ2，１００ＫＤ，ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ・Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　５ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ・Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　８ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ・Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　１０ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ・Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　３０ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ・Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　５０ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）、Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ・Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　１００ｋＤａ（ＭＥＲＣＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記クロスフローろ過を行なう場合のホロファイバーとしては、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，０．１ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，０．２ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，０．４５ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，０．６５ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，１ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，３ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，１０ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，３０ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，５０ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，１００ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記アコースティックウェーブセパレーターとしては、ケイデンス　Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＰＡＬＬ社）などが挙げられるが、これに限定されない。
　抗体含有液と水不溶性無機化合物との接触方法は、適宜選択すればよい。例えば、抗体含有液に水不溶性無機化合物を加え、振とうや攪拌すればよい。その際の温度は常温でよく、具体的には０℃以上、４０℃以下とすることができる。当該温度としては、１℃以上が好ましく、１０℃以上または１５℃以上がより好ましく、また、３０℃以下が好ましく、２５℃以下がより好ましい。また、接触時間としては、１秒間以上、１０時間以下とすることができる。
　接触後は、遠心分離や濾過などにより抗体含有液から水不溶性無機化合物を分離すればよい。この際、抗体または抗体様分子は主に液分に分散しており、それ以外の不純物の全部または一部は主に水不溶性無機化合物に吸着されている。また、抗体または抗体様分子の一部が水不溶性無機化合物に吸着され、それ以外の不純物の一部が液分に溶解していることもあるが、少なくとも液分における不純物の総量は低減することができ、液分における抗体または抗体様分子は濃縮される。
　本工程により水不溶性無機化合物に吸着される不純物は、抗体または抗体様分子以外の化合物であれば特に制限されないが、例えば、凝集した抗体または凝集した抗体様分子、宿主細胞夾雑物、および細胞培養夾雑物が挙げられる。宿主細胞夾雑物としては、宿主細胞由来の核酸、プラスミド、宿主細胞由来のタンパク質が挙げられる。細胞培養夾雑物としては、培地成分、血清アルブミン、および他の血清タンパク質、トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡが挙げられる。
　また、水不溶性無機化合物をカラムに充填し、抗体含有液を流通させることにより抗体または抗体様分子以外の不純物を水不溶性無機化合物に吸着させてもよい。この場合、不純物の吸着と、水不溶性無機化合物からの液分の分離を同時に行うことができる。カラムにおける水不溶性無機化合物の充填量や、抗体含有液の流速は、不純物が水不溶性無機化合物に十分に吸着される範囲で調整することが好ましい。
　３．活性炭との接触工程
　本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を活性炭に接触させる。本工程は、前述の処理工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、或いは水不溶性無機化合物と活性炭とを併用して同時に実施してもよい。但し、本工程の実施は任意である。
　活性炭とは、木炭やヤシ殻などを焼成して細孔を発達させて多孔質としたものであり、吸着性能に優れたものである。活性炭の一般的な比表面積は、８００ｍ2／ｇ以上、２５００ｍ2／ｇ以下程度である。
　活性炭としては、鉱物系活性炭および植物系活性炭が挙げられる。鉱物系活性炭としては、例えば、石炭系活性炭や石油系活性炭が挙げられる。植物系活性炭としては、例えば、木質系活性炭およびやし殻活性炭が挙げられ、好ましくは木質系活性炭が挙げられる。
　活性炭の原料は、炭素質の物質であれば特に制限されないが、例えば、おが屑、木炭、素灰、草炭、ピート若しくは木材チップ等の木質；ヤシ殻；亜炭、褐炭、無煙炭などの石炭；石油ピッチ；オイルカーボン；レーヨン、アクリロニトリル、フェノール樹脂などの有機化合物が挙げられる。 
　活性炭の製造方法は、特に制限されないが、例えば、原料に塩化亜鉛または燐酸などを高温で添加し、高温で炭化反応させる薬液賦活法や、炭化した原料および水蒸気、二酸化炭素、空気または燃焼ガス等のガスを高温で反応させるガス賦活法が挙げられる。好ましくは、塩化亜鉛賦活化法、燐酸を用いた酸賦活化法、および水蒸気賦活化法などが挙げられる。
　活性炭の形状は特に制限されないが、例えば、粉砕炭、顆粒炭、球状炭、およびペレット炭などの粒状活性炭；ファイバー、クロス等の繊維状活性炭；シート状、成形体、およびハニカム状などの特殊成形活性炭；および粉末活性炭が挙げられる。 
　プラスまたはマイナスの電荷が付加された活性炭、およびポリヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）、ヘパリン、セルロース、またはポリウレタン等の表面修飾剤で修飾された活性炭も本発明の精製方法に用いられる活性炭に含まれる。更に、ゾル－ゲル法により作製したカーボンゲルも本発明の精製方法に用いられる活性炭に含まれる。ゾル－ゲル法に用いられる原料としては、例えば、フェノール、メラミン、レゾルシノール、またはホルムアルデヒド等が挙げられる。
　活性炭の平均細孔径は特に限定されないが、通常は０．１ｎｍ以上、２０ｎｍ以下、好ましくは０．５ｎｍ以上、５．０ｎｍ以下、より好ましくは２．０ｎｍ以上、５．０ｎｍ以下、より更に好ましくは３．０ｎｍ以上、５．０ｎｍ以下である。活性炭の平均細孔径は窒素吸着等温吸着曲線よりＢＪＨ法を用いて算出することができる。
　本発明の活性炭を用いる精製方法の手段としては、特に限定されないが、例えば、バッチ法、膜処理法またはカラムクロマトグラフィー法等が挙げられ、それぞれの手段に応じて適切な活性炭の形状が選択される。必要に応じて、多孔性ポリマーまたはゲルに活性炭を封入した粒子等の形態、ポリプロピレンまたはセルロース等のサポート剤または繊維などを用いて活性炭を吸着、固定または成形した膜、またはカードリッジ等の形態にて使用することもできる。
　活性炭を含む膜またはカードリッジとしては、具体的には、例えば、ＣＵＮＯ活性炭フィルターカードリッジ、ゼータプラス活性炭フィルターカードリッジ（住友スリーエム社製、ＣＵＮＯおよびゼータプラスは登録商標）；ミリスタックプラス活性炭フィルター（メルクミリポア社製、ミリスタックは登録商標）；スープラＡＫＳ１フィルター、ＡＫＳ１フィルター、Ｓｔａｘ（商標）　ＡＫＳ１（以上、Ｐａｌｌ社製）；アドール（ユニチカ社製）；Ｋフィルター（登録商標）、活性炭シート（以上、東洋紡社製）；へマックス（クラレ社製）；ヘモソーバ（登録商標）（旭化成メディカル社製）；へモカラム（テルモ社製）；またはへセルス（帝人社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。このうち、木質系の活性炭を含む膜またはカートリッジとしては、例えば、ゼータプラス活性炭フィルターカートリッジ（住友スリーエム社製、ゼータプラスは登録商標）；スープラＡＫＳ１フィルター、ＡＫＳ１フィルター、またはＳｔａｘ（商標）　ＡＫＳ１（以上、Ｐａｌｌ社製）等が挙げられる。
　用いる活性炭の充填密度、粒度、堅度、乾燥減量、強熱残分、比表面積または細孔容積などは、適宜選択することもできる。
　活性炭の使用量は、抗体含有液の濃度などにより調整すればよいが、例えば、抗体含有液１００ｍＬに対して０．５ｇ以上、５ｇ以下の活性炭を用いればよい。
　抗体含有液と活性炭との接触方法は、水不溶性無機化合物の場合と同様に、抗体含有液に活性炭を加えて振とうまたは攪拌してもよいし、カラムに活性炭を充填してもよい。本工程と上記処理工程を同時に行う場合には、水不溶性無機化合物と活性炭を混合して用いればよい。
　４．フロキュラントによる処理工程
　本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液をフロキュラントで処理する。本工程は、水不溶性無機化合物による処理工程および／または活性炭との接触工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、或いは水不溶性無機化合物および／または活性炭とフロキュラントとを併用して同時に実施してもよい。但し、本工程の実施は任意である。
　上記フロキュラント（ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ）としては、カプリル酸、ポリアミン、２価の陽イオン、ポリエーテルイミン、キトサン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ｐＤＡＣＭＡＣなどが挙げられる。２価の陽イオンとしては、例えば、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｃｕ2+、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｎｉ2+、Ｂｅ2+、Ｓｒ2+、Ｂａ2+、Ｒａ2+、Ｚｎ2+、Ｃｄ2+、Ａｇ2+、Ｐｄ2+、Ｒｈ2+であり、これら２価陽イオンは遊離状態で、あるいは塩酸塩や、硫酸塩、クエン酸塩などとして使用できる。
　フロキュラントの使用量は、抗体含有液の濃度などにより調整すればよいが、例えば、フロキュラントがポリアミンまたはポリエーテルイミンである場合は、０．０１ｗ／ｖ％以上、１０ｗ／ｖ％以下のフロキュラントを用いればよく、より好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上、１ｗ／ｖ％以下のフロキュラントを用いればよい。フロキュラントがカプリル酸、キトサン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンである場合は、０．０１ｗ／ｖ％以上、１０ｗ／ｖ％以下のフロキュラントを用いればよく、より好ましくは１ｗ／ｖ％以上、５ｗ／ｖ％以下のフロキュラントを用いればよい。フロキュラントがｐＤＡＣＭＡＣである場合は、０．０１ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％以下のフロキュラントを用いればよく、より好ましくは０．１ｗ／ｖ％以上、０．５ｗ／ｖ％以下のフロキュラントを用いればよい。フロキュラントが２価の陽イオンである場合は、２価の陽イオン濃度が１ｍＭ以上、１００ｍＭ以下となる量を添加すればよく、より好ましくは２ｍＭ以上、５０ｍＭ以下となる量を添加すればよい。
　抗体含有液とフロキュラントとの接触方法は、水不溶性無機化合物の場合と同様に、抗体含有液にフロキュラントを加えて振とうまたは攪拌してもよいし、カラムにフロキュラントを充填してもよい。本工程と水不溶性無機化合物による処理工程および／または活性炭との接触工程を同時に行う場合には、フロキュラントと水不溶性無機化合物および／または活性炭を混合して用いればよい。
　５．エンドヌクレアーゼによる処理工程
　本工程では、不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液をエンドヌクレアーゼで処理する。本工程は、上記各工程の前に実施してもよいし、後に実施してもよいし、或いは水不溶性無機化合物、活性炭とフロキュラントおよびフロキュラントから選択される１以上とエンドヌクレアーゼを併用して同時に実施してもよい。但し、本工程の実施は任意である。
　エンドヌクレアーゼはＤＮＡの分解酵素の一つであり塩基配列の中心部でも分解する機能を持つ、例えば、市販品としてはベンゾナーゼ（ミリポア社製）、カネカエンドヌクレアーゼ（カネカ社製）が挙げられる。
　エンドヌクレアーゼの使用量は、抗体含有液の濃度などにより調整すればよいが、例えば、抗体含有液に対して１０Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、１００Ｕ／ｍＬ以上が更に好ましい。一方、上限は特に制限されないが、１０，０００Ｕ／ｍＬ以下が好ましい。
　６．その他の精製工程
　以上の工程は、以下に示す膜やカラム処理といった一般的な抗体または抗体様分子の精製工程の前段あるいは後段に限らず、好適に用いることができるが、膜やカラム処理の前段に以上の工程を行う場合に、クロマトグラフィー担体の吸着容量の低下、分離能の低下、背圧上昇による処理速度の低下や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下を抑えることが期待でき、また、膜ろ過プロセスにおいても、単位膜面積当たりの処理容量の低下、背圧上昇、処理速度の低減や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下を抑えることが期待できる。すなわち、以上の工程によって精製された抗体または抗体様分子を、さらにカラム処理又は膜ろ過処理することも、本発明の好ましい一態様であり、言い換えるなら、カラム処理や膜ろ過処理の前処理として、本発明の精製方法を用いることも出来る。
　以上の工程、特に上記処理工程は、特に膜処理やカラム処理のための前処理法として、クロマトグラフィー担体の吸着容量の低下、分離能の低下、背圧上昇による処理速度の低下や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下を抑えることが期待でき、また、膜分離プロセスにおいても、単位膜面積当たりの処理容量の低下、背圧上昇、処理速度の低下や洗浄、再生効率の低下による担体寿命の低下を抑えることが期待できる点で優れている。さらに、本発明に用いる水不溶性無機化合物は、水不溶性の添加剤であり、自然沈降、遠心または膜分離により容易に除去することが可能である他、微量に漏出した成分も膜分離プロセスやクロマトグラフィープロセスで容易に除去可能であり、さらに漏出物の副作用等の心配がなく、産業上非常に優れている。
　抗体含有液は、クロマトグラフィーなどのカラム処理により精製することができる。使用するクロマトグラフィーとしては、目的とする抗体または抗体様分子を回収精製できる方法であれば特に限定されないが、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィーが挙げられ、これらを単独で使用しても良いし、組み合わせて使用しても良い。以上の工程、特に上記処理工程は、前記クロマトグラフィー工程の前段あるいは後段においても、好適に用いることができる。
　前記陰イオン交換クロマトグラフィーに用いられる陰イオン交換樹脂は、陰イオン交換作用を示すものであれば限定されない。陰イオン交換樹脂としては、Ｃａｐｔｏ　Ｑ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｃａｐｔｏ　ＤＥＡＥ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｃａｐｔｏ　Ｑ　ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｃａｐｔｏ　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ　Ｑ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＳＯＵＲＣＥ　３０Ｑ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　Ｑ（ＹＭＣ社）、ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　ＤＡ（ＹＭＣ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＳｕｐｅｒＱ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐＱ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＤＥＡＥ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　ＤＥＡＥ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｑ－ｒ（ＪＮＣ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｑ－ｈ（ＪＮＣ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　ＤＥＡＥ（ＪＮＣ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記陽イオン交換クロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂は、陽イオン交換作用を示すものであれば限定されない。陽イオン交換樹脂としては、Ｃａｐｔｏ　Ｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｃａｐｔｏ　ＳＰ　ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ　Ｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＳＯＵＲＣＥ　３０Ｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　Ｓ（ＹＭＣ社）、ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　ＣＭ（ＹＭＣ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＳＰ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　Ｓ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＣＭ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　ＣＭ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｓ－ｒ（ＪＮＣ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｓ－ｈ（ＪＮＣ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　ＣＭ（ＪＮＣ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記疎水クロマトグラフィーに用いられる疎水クロマトグラフィー樹脂は、疎水相互作用を示すものであれば限定されない。疎水クロマトグラフィー樹脂としては、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｂｕｔｈｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｂｕｔｈｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｏｃｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｂｕｔｈｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ　ＨＩＣ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｅｔｈｙｌ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＰＰＧ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｐｈｅｎｙｌ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｈｙｌ－６５０（ＴＯＳＯＨ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｐｈｅｎｙｌ（ＪＮＣ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｂｕｔｈｙｌ（ＪＮＣ社）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＬＳ（ＪＮＣ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、ハイドロキシアパタイト　クロマトグラフィーに用いられるハイドロキシアパタイト樹脂としては、Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｆｌｕｏｌｏａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＭＰＣ　Ｃｅｒａｍｉｃ　ＨｙｄｒｏｘｙＦｌｕｏｌｏａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ＨＡ　Ｕｌｔｒｏｇｅｌ（ＰＡＬＬ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、ミックスモードクロマトグラフィーに用いられる樹脂は、異なる相互作用を示す２以上の混合物であれば、特に限定されない。ミックスモードクロマトグラフィー用樹脂としては、Ｃａｐｔｏ　ＭＭＣ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｃａｐｔｏ　Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｅｓｈｕｍｕｎｏ　ＨＣＸ（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、アフィニティークロマトグラフィーに用いられる樹脂は、吸着対象物質に親和性を示すものであれば特に限定されない。アフィニティークロマトグラフィー用樹脂としては、ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐＡ（カネカ社）、ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐＡ　３Ｇ（カネカ社）、ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐＧ（カネカ社）、ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐＬ（カネカ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　Ｘｔｒａ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ＬＸ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ｐｃｃ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＰｒｉｓｍＡ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＬａｍｄａＦａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｃａｐｔｏ　Ｌ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＧＳＴｒａｐ　４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＩｇＧ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ－６５０Ｆ（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ－ＨＣ６５０Ｆ（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－ｒＰｒｏｔｅｉｎＬ－６５０Ｆ（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｒｅｄ－６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｃｈｅｌａｔｅ－６５０Ｍ（ＴＯＳＯＨ社）、Ａｍｓｐｈｅｒｅ　Ａ３（ＪＳＲライフサイエンス社）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　抗体または抗体様分子が精製された後は、溶媒量を低減して抗体または抗体様分子を濃縮したり、溶媒を交換するなどすればよい。
　不純物は、いずれの段階においても、吸光度分析や電気泳動法、ＨＰＬＣ法等を用いる他、市販のアッセイキットによって定量することが可能である。例えば、ＣＨＯ　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ社製）を用いれば、ＣＨＯ細胞由来の宿主由来タンパク質を定量できる。市販のアッセイキットに所望する夾雑タンパク質のアッセイキットがない場合は、夾雑タンパク質を鶏などの動物に免疫することで、所望の検出系を作成可能である。また、ＤＮＡ等の不純物は、ｑＰＣＲ等の手法により定量することができる。
　本願は、２０１８年８月３１日に出願された日本国特許出願第２０１８－１６３２２８号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年８月３１日に出願された日本国特許出願第２０１８－１６３２２８号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、本発明の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。また、本実施例で用いる試薬については特に明記しない限り、市販品を用いた。
　実施例１：　塩基性炭酸マグネシウムを用いた動物細胞由来培養液の処理
　０．０２５ｍｏｌ／ｍＬのリン酸ナトリウムを含むバッファー（ｐＨ７．０）中に１０ｗｔ％となるよう塩基性炭酸マグネシウムを添加し、分散させ、塩基性炭酸マグネシウム分散液を作製した。その塩基性炭酸マグネシウム分散液に、同量のモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を含む動物細胞由来培養液を加えてよく攪拌した後、２５℃インキュベーター中にて１時間静置した。その後、処理した溶液を１５，０００ｒｐｍ、１５℃、１０分で遠心分離し、上澄みを回収した。
　比較例１：　ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライドを用いたＣＨＯ由来培養液の処理
　塩基性炭酸マグネシウムのかわりに、公知のフロキュラントである０．０１％のポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド（ｐＤＡＣＭＡＣ）を加えた以外は実施例１と同様に操作を行った。
　試験例１：　抗体濃度、ＤＮＡ及びホストセルプロテイン（ＨＣＰ）含量の測定
　以下に示す手法にて、処理前の培養上清、および実施例１および比較例１の溶液中のＩｇＧの濃度及び不純物であるＤＮＡ及びホストセルプロテイン（ＨＣＰ）含量を定量した。
　ＩｇＧ濃度はｐｒｏｔｅｉｎＡクロマトグラフィーにより評価した。ＧＥヘルスケア社製クロマトグラフィーシステム、ＡＫＴＡ　ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１０ＳにｐｒｏｔｅｉｎＡアフィニティーカラムとしてＴＯＳＯＨ社製ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ　ｍＡｂを取り付け、０．０２ｍｏｌ／ｍＬのリン酸ナトリウムおよび０．０１ｍｏｌ／ｍＬ硫酸ナトリウムを含むバッファー（ｐＨ６．７）を用いて室温下、流速０．７ｍｌ／ｍｉｎでカラムに通液し、ここに評価サンプルを５０μＬ添加し、洗浄液として０．０２ｍｏｌ／ｍＬのリン酸ナトリウムおよび０．０１ｍｏｌ／ｍＬ硫酸ナトリウムを含むバッファー（ｐＨ６．７）を５Ｃｏｌｕｍｎ　Ｖｏｌｕｍｅ（ＣＶ）送液した後、溶出液として０．０２ｍｏｌ／ｍＬのリン酸ナトリウムを含むバッファー（ｐＨ２．５）を１０ＣＶ送液した。溶出ピークの２８０ｎｍのＵＶ吸光度を、システムに付属のＵＶ吸光度計により計測した。
　ＨＣＰ含量はシグナス社製ＣＨＯ　Ｈｏｓｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ，３ｒｄ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎを用いて付属のプロトコルに従い計測した。
　ＤＮＡ含量はシグナス社製ＣＨＯ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｉｎ　Ｔｕｂｅｓを用いて、付属のプロトコルに従い計測した。
　図１と表１に処理前、および処理後のＨＣＰ量を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１と図１に示す結果のとおり、塩基性炭酸マグネシウムを添加することで目的とするＩｇＧを溶液中に残したまま、不純物であるＨＣＰを効果的に低減出来ることがわかった。このように、不純物を含む抗体または抗体様分子水溶液または懸濁液を塩基性炭酸マグネシウムにて処理することで不純物を低減できることが証明された。
　実施例２：　塩基性炭酸マグネシウム添加量の不純物タンパク質除去率への影響評価
　モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に塩基性炭酸マグネシウムを１ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、または１０ｗ／ｖ％添加して、室温下ミックスローターを用いて１８時間攪拌した。その後、１５，０００ｒｐｍ、５分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。ＩｇＧ、ＨＣＰおよびＤＮＡ濃度を定量した。結果を表２、図２および図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　評価の結果、塩基性炭酸マグネシウム１～１０ｗ／ｖ％の範囲では添加量が多いほど、ＨＣＰ濃度が低かった。ＤＮＡ濃度には差が無く、１ｗ／ｖ％添加で十分な不純物除去能があることが分かった。
　実施例３：　水不溶性無機化合物の不純物除去効果と活性炭との組み合わせ効果
　モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に１ｗｔ％の水不溶性無機化合物および０．６７ｗｔ％の活性炭をそれぞれ添加し、室温下ミックスローターを用いて１８時間攪拌し、１５，０００ｒｐｍ、５分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。水不溶性無機化合物としては、塩基性炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、または酸化アルミニウムを用いた。ＩｇＧ濃度とＨＣＰおよびＤＮＡ含量を定量した。結果を表３、図４および図５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　評価の結果、塩基性炭酸マグネシウムだけでなく、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、酸化アルミニウムの水不溶性無機化合物にも不純物タンパク質除去効果があった。これらは、いずれも医薬品や医療用に使用されている無機化合物であり、バイオ医薬品の製造での使用に好適である。また、活性炭を組み合わせるとＩｇＧ回収率が１０％程度低下するが、さらに不純物除去効果が高くなることが分かった。
　実施例４：　塩基性炭酸マグネシウムの添加処理によるプロテインＡキャプチャ工程の改善
　モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に１ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムを添加し、室温下ミックスローターを用いて１８時間攪拌した。その後、処理した溶液を、１５，０００ｒｐｍ、５分で遠心分離した後、フィルターろ過して上澄みを回収し、モノクローナル抗体医薬製造用ｒＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ担体（「Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　ＬＸ」ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）（１ｍＬ）を充填したカラム、または高機能プロテインＡクロマトグラフィー用担体（「ＫＡＮＥＫＡ　ＫａｎＣａｐＡ　３Ｇプレパックカラム」カネカ社製）（１ｍＬ）に負荷して５０ｍＭクエン酸バッファーにて溶出し、０．１Ｍ　ＮａＯＨで洗浄した。得られた負荷液、溶出液及び洗浄液中のＩｇＧ，ＨＣＰおよびＤＮＡを測定した。結果を表４、図６，図７および図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　評価の結果、塩基性炭酸マグネシウムで処理することで、プロテインＡ担体への不純物の蓄積を抑制し、抗体溶出液の品質を向上できることが分かった。
　実施例５：　塩基性炭酸マグネシウム充填カラムによる不純物の除去
　１ｍＬのクロマトグラフィーカラムに塩基性炭酸マグネシウムを充填し、モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清を通液し、ＩｇＧ、ＨＣＰおよびＤＮＡ含量を定量した。結果を表５、図９および図１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　評価の結果、カラムに充填しても塩基性炭酸マグネシウムはＨＣＰやＤＮＡといった不純物を低減できることが分かった。
　実施例６：　塩基性炭酸マグネシウムによるＶＨＨ含有Ｐｉｃｈｉａ由来培養上清からの不純物除去
　重鎖抗体（ＶＨＨ）を含むＰｉｃｈｉａ培養上清に０．６７ｗｔ％の活性炭および／または１ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて２時間攪拌した後、１５，０００ｒｐｍ、５分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。処理前の培養液と処理液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥから、目的物であるＶＨＨの１５ｋＤａ付近のバンド、不純物である１８、２５ｋＤａ付近のバンド強度を読み取り、ＶＨＨ回収率と不純物残存率を求めた。得られた結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　評価の結果、ＶＨＨ含有Ｐｉｃｈｉａ培養上清に対しても塩基性炭酸マグネシウムには不純物除去効果があり、活性炭と組み合わせることで高い不純物除去効果があることがわかった。
　実施例７：　塩基性炭酸マグネシウムによるｓｃＦＶ含有ｐｉｃｈｉａ由来培養上清からの不純物除去
　一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）を含むＰｉｃｈｉａ培養上清に０．６７ｗｔ％の活性炭および／または１ｗｔ％または１０ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて２時間攪拌した後、１５、０００ｒｐｍ、５分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。処理前の培養液と処理液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥから、目的物であるｓｃＦＶの３０ｋＤａ付近のバンド、不純物であるそれ以外のバンド強度を読み取り、ＶＨＨ回収率と不純物残存率を求めた。得られた結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　評価の結果、ｓｃＦＶ含有Ｐｉｃｈｉａ培養上清に対しても塩基性炭酸マグネシウムには不純物除去効果があり、活性炭と組み合わせることで収率を多少低下させるものの、高い不純物除去効果があることがわかった。
　実施例８：　塩基性炭酸マグネシウムによるＶＨＨ含有大腸菌由来培養上清からの不純物除去
　ＶＨＨ含有大腸菌培養上清に１ｗｔ％または１０ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて２時間攪拌した後、１５，０００ｒｐｍ、５分で遠心分離して上澄みを回収し、処理液を得た。処理前の培養液と処理液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。得られたＳＤＳ－ＰＡＧＥから、目的物であるｓｃＦＶの３０ｋＤａ付近のバンド、不純物であるそれ以外のバンド強度を読み取り、ＶＨＨ回収率と不純物残存率を求めた。得られた結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　評価の結果、ｓｃＦＶ含有Ｐｉｃｈｉａ培養上清に対しても塩基性炭酸マグネシウムには不純物除去効果があることがわかった。
　実施例９：　塩基性炭酸マグネシウムによるＦａｂ含有培養液からの不純物除去
　Ｆａｂ含有ＣＨＯ培養上清に０ｗｔ％、１ｗｔ％または１０ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて２時間攪拌した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のＦａｂ、ＨＣＰおよびＤＮＡの濃度を測定した。なおＦａｂ濃度はプロテインＧクロマトグラフィーにて測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　評価の結果、Ｆａｂ含有ＣＨＯ培養上清に対しても塩基性炭酸マグネシウムには不純物除去効果があることがわかった。
　実施例１０：　塩基性炭酸マグネシウムによる抗体含有培養液からの凝集体除去
　モノクローナル抗体含有ＣＨＯ培養上清に０ｗｔ％または１ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムを加え、ミックスローターにて１８時間攪拌した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のＩｇＧ濃度および凝集体含量を測定した。なお凝集体含量はゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　評価の結果、塩基性炭酸マグネシウムには凝集体除去効果があることがわかった。
　実施例１１：　塩基性炭酸マグネシウムとエンドヌクレアーゼの組み合わせによる不純物除去
　モノクローナル抗体含有ＣＨＯ培養上清に１ｗｔ％の塩基性炭酸マグネシウムおよび／または１００Ｕ／ｍＬのカネカエンドヌクレアーゼを加え、ミックスローターにて１８時間攪拌した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のＩｇＧ濃度、ＨＣＰ濃度およびＤＮＡ濃度を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　評価の結果、塩基性炭酸マグネシウムとエンドヌクレアーゼを組み合わせることで不純物除去能を更に高められることが分かった。
　実施例１２：　リン酸三マグネシウムによる不純物除去
　モノクローナル抗体を含む動物細胞由来培養上清に１ｗｔ％または及び１０ｗｔ％のリン酸三マグネシウムおよび０．６７ｗｔ％の活性炭をそれぞれ添加し、室温下ミックスローターを用いて１８時間攪拌し、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、処理済液として上澄みを回収した。処理済液中のＩｇＧ濃度とＨＣＰおよびＤＮＡ含量を定量した。結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　評価の結果、リン酸三マグネシウムにも不純物除去能があり、活性炭を添加することで更に不純物除去能を高められることが分かった。

Claims (14)

  1. 　抗体または抗体様分子を精製するための方法であって、
    　不純物を含む抗体または抗体様分子の水溶液または懸濁液を、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含む水不溶性無機化合物で処理する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 　前記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される１以上である請求項１に記載の方法。
  3. 　更に、前記水溶液または懸濁液を活性炭に接触させる工程を含む請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記水溶液または懸濁液が、抗体または抗体様分子を含む培養液である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記水溶液または懸濁液が、培養液を遠心処理または膜処理して得られる培養上清である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記培養液が、抗体または抗体様分子を生産する組換え宿主細胞の培養液である請求項４または５に記載の方法。
  7. 　前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記水溶液または懸濁液が、組換え宿主細胞の破砕物または抽出物を遠心または膜処理して得られる上清である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記水溶液または懸濁液が、生体抽出物である請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記抗体または抗体様分子がＦｃ含有タンパク質である請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記抗体または抗体様分子が低分子化抗体である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　更に、前記水溶液または懸濁液をフロキュラントで処理する工程を含む請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　更に、前記水溶液または懸濁液をエンドヌクレアーゼで処理する工程を含む請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　精製された抗体または抗体様分子を、更にカラム処理又は膜ろ過処理する工程を含む請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
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