TW201738257A - 標的蛋白質之純化方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於使用以下之通式(I)所表示之層狀雙氫氧化物(Layered Double Hydroxide)而將標的蛋白質純化之方法。通式(I)：[M2+1-xM3+x(OH)2][An-x/n．mH2O](於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子。x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示，x為0.1~0.9，n為1~3，m為0~100)
Description
本發明係關於一種使用層狀雙氫氧化物(Layered Double Hydroxide，以下稱為LDH)而自混合存在多種蛋白質之溶液中將目標蛋白質(標的蛋白質)進行純化之方法，進而係關於一種使用該純化方法之疫苗之製造方法。
本申請案請求藉由參照而引用至此之日本申請案、日本專利申請特願2016-56780號優先權。
蛋白質係以由胺基酸構成之多肽為主體之高分子化合物，有各種各樣之種類、功能。蛋白質不僅為生命科學中之重要研究對象，而且於包括醫療領域在內之各種領域亦有所應用。
蛋白質可以人工方式大量生產，作為醫藥投予至活體中而加以利用。作為蛋白質醫藥，例如可列舉：糖尿病治療藥之胰島素、貧血治療藥之紅血球生成素、病毒性肝炎之治療藥之干擾素類等。進而，作為利用人類之免疫功能之抗體醫藥，利妥昔單抗(Rituximab)或曲妥珠單抗(Trastuzumab)等抗癌劑被用於癌症治療。又，蛋白質於活體內亦以具有免疫引發功能之抗原的形式而發揮功能，因此被用作疫苗。疫苗接種係用
以預防由細菌或病毒等病原體之感染引起之感染症之最重要手段。於疫苗之製造中，必須穩定且大量地製造蛋白質等抗原。
大量生產蛋白質後，為了製造疫苗等醫藥，必須將標的蛋白質純化並回收。先前，於將蛋白質純化時，使用具有固定電荷之粒子體，例如使用DEAE(Diethylaminoethyl，二乙胺基乙基)等陰離子交換管柱、磷酸鋁或磷酸鈣等。以作為磷酸鈣之結晶之一的羥磷灰石作為填充劑之液相層析法亦用於蛋白質之純化。然而，為了僅將標的蛋白質純化，存在需要大量之純化步驟而複雜且繁雜之問題。
作為將標的蛋白質選擇性地純化之方法，已知有親和純化。所謂親和純化係使能夠特異性地吸附抗體等目標物質之蛋白質與載體結合而將目標物質純化之方法。然而，親和純化存在難以應用於抗體以外之問題，又，結合有蛋白質之載體非常昂貴。
LDH係具有陰離子交換能力之持有無機骨架(金屬氫氧化物層)之層狀化合物。
於獨立行政法人產業技術綜合研究所主頁(https：//unit.aist.g0.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html)中，包括結構等在內，對LDH有詳細說明。LDH雖然天然之產出並不多，但是合成相對簡單，因此使用合成物進行大量研究、探討，作為制酸劑而用於胃腸藥，或者用作氯乙烯之穩定劑。專利文獻1中揭示有LDH粒子群及其製造方法、LDH分散液、以及添加有LDH之樹脂。專利文獻2中揭示有使LDH吸附水中之微生物，將微生物自水中除去而進行淨化之方法。
由於LDH具有陰離子交換能力，因此以陰離子回收、除去
為目的而對其進行探討。非專利文獻1中揭示可藉由LDH吸附鉻酸鹽。專利文獻3中揭示藉由含有水滑石之層狀無機化合物吸附作為低分子化合物之色素。非專利文獻2中揭示可藉由合成水滑石吸附血紅蛋白或人血清白蛋白、及可藉由pH值為10之碳酸緩衝液將所吸附之蛋白質溶出。然而，LDH可自混合存在多種蛋白質之溶液中將標的蛋白質選擇性地純化一事尚屬未知。
[非專利文獻1]Lazaridis NK, Matis KA, Webb M., Chemosphere. 2001 Feb; 42(4): 373-8.
[非專利文獻2]Ralla K, Sohling U, Suck K, Sander F, Kasper C, Ruf F, Scheper T., Colloids Surf B Biointerfaces. 2011 Oct 15; 87(2): 217-25. doi: 10.1016/j.colsurfb.2011.05.021. Epub 2011 May 19.
[專利文獻1]日本特開2013-112560號公報
[專利文獻2]國際公報WO2002/076577號
[專利文獻3]日本專利第3446796號公報
本發明之課題在於提供一種效率良好且簡便地將標的蛋白
質純化之方法。
本發明者為了解決上述課題而反覆進行了努力研究，結果發現，若LDH所具有之陽離子之含量比率發生變化，則蛋白質吸附能力出現差異，且發現藉由使LDH選擇性地吸附蛋白質，而可用於標的蛋白質之純化，從而完成本發明。
即，本發明由以下構成。
1.一種將標的蛋白質純化之方法，其係使用以下之通式(I)所表示之LDH，將標的蛋白質純化：通式(I)：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n．mH2O]
(於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子。x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示，x為0.1~0.9，n為1~3，m為0~100)。
2.如前項1所記載之將標的蛋白質純化之方法，其包括以下步驟：
1)使含有標的蛋白質與雜質之溶液與LDH接觸之步驟；
2)將LDH與溶液分離之步驟。
3.如前項1或2所記載之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，An-係選自由PO4 3-、CO3 2-、OH-、F-、Cl-、Br-、NO3 -及核酸所組成之群中之至少1種以上。
4.如前項1至3中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，M2+係選自由Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Li2+、Ni2+、Co2+及Cu2+所組成之群中之至少1種以上。
5.如前項1至4中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，M3+係選自由Al3+、Fe3+、Mn3+及Cr3+所組成之群中之任意1種以上。
6.如前項1至5中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，An-為PO4 3-。
7.如前項1至6中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，其中，標的蛋白質包含抗原或抗體。
8.如前項1至7中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，其中，標的蛋白質含有選自肺炎球菌疫苗、流行性感冒疫苗、日本腦炎疫苗、白喉疫苗、百日咳疫苗、破傷風疫苗、b型流行性感冒桿菌疫苗、及B型肝炎疫苗中之至少1種以上之疫苗所含之成分。
9.如前項1至8中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，其包括以下之步驟：1)使含有標的蛋白質與雜質之溶液與LDH接觸而使LDH吸附蛋白質之步驟；2)將LDH與溶液分離之步驟；3)將標的蛋白質回收之步驟。
10.一種製造疫苗之方法，其係使用前項1至9中任一項所記載之將標的蛋白質純化之方法，製造疫苗。
11.一種標的蛋白質純化用載體，其於表面載持有以下之通式(I)所表示之LDH：通式(I)：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n．mH2O]
(於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子。x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示，x為0.1~0.9，n為1~3，m為0~100)。
根據本發明之標的蛋白質之純化方法，可將標的蛋白質自雜質中選擇性地分離。
圖1係表示LDH(MAP46)對PspA融合蛋白質之選擇性吸附能力之確認結果的照片。(實施例2)
圖2係表示LDH(MAP或CAP)之陽離子之含量比率對PspA融合蛋白質之選擇性吸附能力之影響之確認結果的照片。(實施例3)
圖3係表示LDH(MAC或CAC)之陽離子之含量比率對PspA融合蛋白質之選擇性吸附能力之影響之確認結果的照片。(實施例4)
圖4係表示LDH(MAP)對PspA單抗原之選擇性吸附能力之確認結果的照片。(實施例5)
圖5係表示LDH(MAP、CAP、MAC、或CAC)對源自黴漿菌之P30蛋白質之選擇性吸附能力之確認結果的照片。(實施例8)
本發明係關於使用下述通式(I)所表示之LDH之標的蛋白質之純化方法。
通式(I)：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n．mH2O]
(於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子。x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示，x為0.1~0.9，n為1~3。m為0~100，較佳為m為1~100)
於本說明書中，通式(I)所示之x如上所述為0.1~0.9。LDH中通常設x為0.2~0.33之範圍。然而，本發明者驚訝地發現，於將LDH用於蛋白質之純化之情形時，x較佳為較通常之LDH之x之範圍更廣泛的0.1~0.9之範圍。再者，[M2+]表示M2+之莫耳數或莫耳濃度，[M3+]表示M3+之莫耳數或莫耳濃度。
於本說明書中，通式(I)所表示之所謂LDH係於二價之金屬氫氧化物中固溶有三價之金屬離子之雙氫氧化物，且為下述積層結構之化合物，即由於金屬氫氧化物層(主體層)具有正電荷，因此於主體層與主體層之間(層間)夾著帶負電之客體物質。通式前半部分[M2+ 1-xM3+ x(OH)2]為主體層，x帶正電。為了補償該正電荷而於該等層間存在作為客體物質之陰離子與水分子。LDH亦有以四價金屬置換三價金屬之一部分而成之組成、或作為一價~三價之組合之[Li1/3Al2/3(OH)2][An- 1/(3×n)．mH2O]等。主體層中之金屬亦可為3種以上之多元系之構成。將藉由「主體-客體反應」而於保持主體層之狀態下對層間引入原子、分子、離子等客體物質之過程稱為「嵌入」。
於本說明書中，通式(I)所示之M2+可選自由Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Li2+、Ni2+、Co2+及Cu2+所組成之群，較佳可選自由Mg2+、Fe2+、Zn2+、及Ca2+所組成之群，進而較佳為Mg2+或Ca2+，更佳為Mg2+。M2+可單獨使用
選自上述中之任意1種，亦可組合2種以上而使用。
於本說明書中，通式(I)所示之M3+可選自由Al3+、Fe3+、Mn3+及Cr3+所組成之群，較佳為Al3+或Fe3+，更佳為Al3+。M3+可單獨使用選自上述中之任意1種，亦可組合2種以上而使用。
於本說明書中，通式(I)所示之An-係引入至層間之客體物質。可對層間嵌入陰離子或不具有負電荷之有機分子等作為客體物質。作為客體物質，只要含有陰離子即可，陰離子之種類並無特別限定。An-例如可選自由PO4 3-、CO3 2-、OH-、F-、Cl-、Br-、NO3 -及核酸所組成之群。作為核酸之例，可列舉DNA或RNA，更具體而言，可列舉：poly I：C(TLR3配體)、DNA之非甲基化CpG之寡核苷酸(CpG ODN)等。通式(I)所示之An-較佳可選自由PO4 3-、CO3 2-及OH-所組成之群，更佳為PO4 3-或CO3 2-，最佳為PO4 3-。An-可單獨使用選自上述中之任意1種，亦可組合2種以上而使用。有存在於相同層間之情況，亦有規則地存在於不同層間之情形。
通式(I)所表示之LDH之吸附能力可藉由根據標的蛋白質之種類而適當變更M2+、M3+、An-之種類或比率進行調節。例如於An-為PO4 3-之情形時，於x為0.1~0.9、較佳為0.3~0.9、更佳為0.5~0.7時可將標的蛋白質進一步選擇性地純化。於An-為CO3 2-之情形時，於x為0.1~0.9、較佳為0.1~0.7、更佳為0.1~0.3時可將標的蛋白質進一步選擇性地純化。又，於使LDH吸附雜質之情形時，於An-為PO4 3-之情形時，可使用x為0.1~0.9、較佳為0.6~0.9之LDH，於An-為CO3 2-之情形時，可使用x為0.1~0.9、較佳為0.6~0.9、更佳為0.6~0.7之LDH。
本說明書中之LDH根據標的蛋白質之種類，較佳為通式(I)
中，M2+為Mg2+或Ca2+，M3+為Al3+，且An-為PO4 3-或CO3 2-，進而更佳為M2+為Mg2+或Ca2+，M3+為Al3+，且An-為PO4 3-。M2+與M3+之比率可根據LDH所吸附之蛋白質之種類而適當變更。
本說明書中之將標的蛋白質純化之方法包括以下之步驟1)及步驟2)。
1)使含有標的蛋白質與雜質之溶液與LDH接觸之步驟。
2)將LDH與溶液分離之步驟。
所謂標的蛋白質係成為純化對象之蛋白質。所謂蛋白質係以由胺基酸構成之多肽作為主體之高分子化合物。本說明書中之蛋白質中除了僅由胺基酸構成之蛋白質以外，亦包含與其他物質，例如核酸、磷酸、脂質、糖、金屬等結合之蛋白質。本說明書中之標的蛋白質係於溶液中具有負電荷者，標的蛋白質之分子量並無特別限定。標的蛋白質可為天然存在者，亦可為藉由基因重組而製作之重組蛋白質。標的蛋白質可為抗原、抗體、酵素、色素、膜構成成分、傳輸蛋白、結構蛋白、運動蛋白、結合蛋白、受體等具有任何功能者。本說明書中之標的蛋白質較佳為摻合於醫藥中之成分，更佳為抗原、抗體等，尤佳為抗原。
於步驟1)中，使含有標的蛋白質與雜質之溶液與LDH接觸。所謂雜質意指標的蛋白質以外之夾雜物。雜質中包含標的蛋白質以外之蛋白質。根據本發明之純化方法，可自多種蛋白質中將標的蛋白質選擇性地純化。作為雜質之蛋白質可列舉：源自微生物、植物、或動物者；源自宿主細胞者；或溶存於溶液中者。根據本發明之純化方法，可將雜質之一部分或全部除去。本發明之純化方法由於具有選擇性，故而能夠將全部
蛋白質中之標的蛋白質純化至90~95%左右之純度。
於步驟1)中，使LDH吸附標的蛋白質或雜質之任一者，於步驟2)中，將LDH與溶液分離。藉由步驟2)可將標的蛋白質自雜質分離而純化。於使LDH吸附標的蛋白質之情形時，只要於步驟2)之後將標的蛋白質自LDH溶出並回收即可。或者，於使LDH吸附雜質之情形時，只要將LDH除去並回收溶液即可。
將標的蛋白質自LDH溶出之手段並無特別限定，可使用本身公知之手段或今後所開發之手段。例如可藉由使pH值6.0~8.0之緩衝液與LDH接觸而使標的蛋白質溶出。作為pH值6.0~8.0之緩衝液，可例示檸檬酸緩衝液、高鹽濃度溶液、或含有具有多元羧酸之有機物之溶液。作為具有多元羧酸之有機物，可例示EDTA。於本發明中，由於可使用不會對活體造成不良影響之物質將標的蛋白質自LDH溶出，故而有利。
於標的蛋白質之純化中，亦可於本說明書之純化方法之步驟1)及步驟2)之前後包括其他純化步驟或處理步驟。作為步驟1)及步驟2)以外之其他純化步驟或處理步驟，可例示：過濾器過濾、超過濾、超濃縮、離心分離、密度梯度離心分離、管柱層析法、薄膜層析法、親和層析法、或藉由添加藥品進行之分離等。
疫苗係藉由「將抗原純化而製作疫苗原液，並將其製劑化」而製造。抗原係能夠藉由投予而對活體誘導免疫反應者，成為疫苗之有效成分。再者，於本說明書中，通常提及抗原之情形時，存在以亦包含疫苗之含義使用之情形。本說明書之純化方法藉由應用於通常之疫苗之製造中的抗原純化過程中，而能夠簡化純化步驟，於短時間內將抗原純化。
疫苗所含之抗原例如可為源自細菌、源自病毒、源自真菌、源自原生動物、源自寄生蟲(例如源自黴漿菌等)、或源自感染性因子(例如源自傳染性蛋白顆粒等)之蛋白質之任一者。本說明書中之抗原可為本身公知之疫苗所含之有效成分或今後所開發之疫苗所含之有效成分之任一者，並無特別限定。例如可為活毒疫苗(live vaccine)、非活化疫苗或成分疫苗之任一者所含之有效成分。作為疫苗，例如可為選自日本腦炎疫苗、白喉疫苗、百日咳疫苗、破傷風疫苗、b型流行性感冒桿菌疫苗、肺炎球菌疫苗、流行性感冒疫苗及B型肝炎疫苗中之任意1種疫苗、或由2種以上之疫苗之組合構成之疫苗。
所謂含有標的蛋白質與雜質之溶液係成為用以製作例如疫苗原液之原料之溶液。於疫苗之製造中，藉由孵化雞蛋培養法、或動物接種法、細胞培養法、菌體培養法、或利用基因重組使標的蛋白質表現之方法等而使抗原增殖。於孵化雞蛋培養法中，孵化雞蛋之尿囊絨毛膜腔液中含有抗原，於細胞培養法中，細胞之培養溶液或細胞內含有抗原，而製備含有抗原之細胞破碎液。於如上所述般使抗原增殖之過程中，除了抗原以外均含有雜質，故而必須將抗原自雜質分離而製備疫苗原液。含有標的蛋白質與雜質之溶液可直接為尿囊絨毛膜腔液或細胞培養溶液、細胞或菌體之細胞破碎液，亦可為藉由使用離心分離或其他層析法等之純化步驟將雜質之一部分除去而成之粗抗原溶液。藉由本說明書中之純化方法所獲得之含有標的蛋白質之溶液，可進一步供於其他層析法等純化步驟。
關於由疫苗原液製造疫苗製劑，可藉由本身公知之方法或今後所開發之所有方法而製造。疫苗製劑藉由除了抗原以外亦含有佐劑、或
藥理學上可容許之載體、稀釋液及/或賦形劑等，可以免疫組成物之形式進行製劑化。本發明之疫苗製劑可包含適於經口、直腸、鼻、局部(包括臉頰及舌下)、經皮、陰道或非經口(包括肌內、皮下及靜脈內)之投予者，或者適於藉由吸入或氣體注入進行之投予之形態者。作為劑型，例如可製成液劑、懸浮劑、粉末劑等。作為液劑，可列舉溶解於純化水、緩衝液等中而成者等。作為懸浮劑，可列舉與甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮、明膠、酪蛋白等一併懸浮於純化水、緩衝液等中而成者等。作為粉末劑，可列舉與甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素等一併混合而成者等。該等疫苗製劑中，可視需要添加通常所使用之吸收促進劑、界面活性劑、防腐劑、穩定劑、防濕劑、保濕劑、溶解劑等。藉由本發明之純化方法所製備之疫苗製劑可藉由藥學之技術領域中充分周知之任意方法而製備。
本發明之疫苗製劑之投予量可考慮投予對象、投予部位、投予方法及投予間隔而適當設定，例如於對象為人類之情形時，可考慮年齡、性別、體重、以及醫師所公知之其他因子而適當設定。將本發明之疫苗製劑用於感染症之預防及/或治療時之藥學上有效之量係根據醫療領域中公知之此種應考慮之事項而決定。投予對象可根據疫苗製劑所含之抗原之種類而適當決定。例如除了人類以外，可對人類以外之哺乳類、鳥類、甲殼類等投予。
又，本發明亦關於表面載持有通式(I)所表示之LDH之標的蛋白質純化用載體。該載體可用於液相層析法。本發明亦關於包含表面載持有通式(I)所表示之LDH之標的蛋白質純化用載體的組成物。進而，
本發明亦關於使用標的蛋白質純化用載體或包含該載體之組成物之將標的蛋白質純化之方法。
為了幫助理解本發明，以下例示實施例而具體說明本發明，但本發明並不限定於本實施例。
(實施例1)
於本實施例中，製作下述通式(I)所表示之LDH。
通式(I)：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n．mH2O]
(於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子。x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示)
LDH係依照專利文獻1所揭示之方法而製作，並確認鋁含量。具體而言，將0.1mol/L之MgCl2．6H2O與0.1mol/L之AlCl3．6H2O以9：1~1：9之比例加以混合，並混合與所獲得之混合液之總量等量之0.1mol/L之Na2HPO4．12H2O。其後，藉由1/500mol/L之PBS進行離心並洗淨，從而製作鎂-鋁-磷酸系之LDH(以下稱為MAP)。除了將0.1mol/L之MgCl2．6H2O變更為0.1mol/L之CaCl2．6H2O以外，藉由與上述同樣之手法，製作鈣-鋁-磷酸系之LDH(以下稱為CAP)。又，除了將0.1mol/L之Na2HPO4．12H2O變更為0.1mol/L之Na2CO3以外，藉由同樣之手法，製作鎂-鋁-碳酸系之LDH(以下稱為MAC)或鈣-鋁-碳酸系之LDH(以下稱為CAC)。
(實施例2)
針對實施例1所製作之LDH，確認標的蛋白質之吸附能力。於本實施
例中，使用鎂與鋁之莫耳比為4：6之MAP(以下稱為MAP46)作為LDH，使用國際公開公報WO2014/045621號所記載之肺炎球菌表面蛋白質A(PspA)之2個分支(clade)融合而成之蛋白質(PspA融合蛋白質)作為標的蛋白質(圖1)。
依照常規方法，於大腸桿菌中藉由基因重組而使標的蛋白質表現，從而製作含有標的蛋白質之大腸桿菌破碎液。將實施例1所製作之LDH(鋁含量約10mg/mL)與大腸桿菌破碎液(總蛋白質含量約1.5mg/mL)等量混合，攪拌後放置1小時。將代替LDH而以羥磷灰石進行過處理之樣品作為對照。羥磷灰石處理係改變鹽濃度(PBS濃度)及pH值進行實驗，而對吸附能力進行確認。鹽濃度及pH值如圖1所示。已知羥磷灰石對胺基酸、蛋白質、脂質、糖顯示出較高之吸附性。利用此種特性，而將羥磷灰石用於活體分子等之分離所使用之管柱層析法之填充劑或以將多餘之脂質或代謝廢物吸附而除去為目的之化妝品等。
進行利用LDH之處理或羥磷灰石處理後，回收經離心分離而獲得之上清液作為樣品。針對樣品，藉由使用有ATTO公司製造之E-T/R1020L(10~20%)凝膠之SDS-PAGE確認標的蛋白質之行為。凝膠之各區帶以總蛋白質之質量變得相等之方式應用樣品。
於圖1中，由四方形包圍之分子量之條帶(band)相當於標的蛋白質。圖1之樣品編號2~10應用進行羥磷灰石處理後之上清液，樣品編號11應用進行LDH處理後之上清液。又，樣品編號1應用進行各處理前之樣品。於任何鹽濃度、pH值下，羥磷灰石方面均檢測出標的蛋白質之條帶及其以外之蛋白質之條帶此兩者，可知無法選擇性地吸附標的蛋白質。
另一方面，於進行LDH處理之情形時，幾乎無法確認標的蛋白質之條帶，而檢測出其以外之蛋白質之條帶，故而可知LDH具有針對標的蛋白質之選擇性吸附能力。
(實施例3)
針對實施例1所製作之LDH，對改變金屬組成之情形時之標的蛋白質之吸附能力進行確認。於本實施例中，使用MAP或CAP作為LDH，使用PspA融合蛋白質作為標的蛋白質。
藉由與實施例2同樣之手法，製備含有標的蛋白質之大腸桿菌破碎液，將MAP或CAP與大腸桿菌破碎液加以混合，藉此進行LDH處理。MAP之鎂與鋁之含量比率(莫耳比)、CAP之鈣與鋁之含量比率(莫耳比)如圖2所示。
於圖2中，箭頭所指示之分子量之條帶相當於標的蛋白質。圖2之各區帶應用進行LDH處理後經離心分離而獲得之上清液作為樣品。再者，樣品編號1係代替LDH而藉由Ca3(PO4)2進行處理而獲得者，樣品編號10係代替LDH而藉由AlPO4進行處理而獲得者。
於CAP(樣品編號2~5)中，隨著鋁含量比率上升，而檢測出雜質之條帶，可知可將標的蛋白質與雜質分離。於MAP(樣品編號6~9)中，可知隨著鋁含量比率上升，吸附標的蛋白質，且不吸附作為雜質之低分子蛋白質。於MAP之情形時，可知於鎂與鋁之含量比率為5：5~3：7之情形時，選擇性地吸附標的蛋白質。顯示出使用陰離子為磷酸之磷酸系之LDH可將PspA融合蛋白質純化。
(實施例4)
針對實施例1所製作之LDH，對改變金屬組成之情形時之標的蛋白質之吸附能力進行確認。於本實施例中，使用MAC或CAC作為LDH，使用PspA融合蛋白質作為標的蛋白質。
除了使用MAC或CAC代替MAP或CAP以外，藉由與實施例3同樣之手法進行實驗。MAC之鎂與鋁之含量比率、CAC之鈣與鋁之含量比率(莫耳比)如圖3所示。
於圖3中，箭頭所指示之分子量之條帶相當於標的蛋白質。圖3之各區帶應用進行LDH處理後經離心分離而獲得之上清液作為樣品。再者，樣品編號1之所謂純化前液係進行LDH處理前之樣品。樣品編號2係代替LDH而以CaCO3進行過處理者。
於CAC(樣品編號3~7)之情形時，可知於鈣與鋁之含量比率為7：3之情形時選擇性地吸附標的蛋白質。於MAC(樣品編號8~12)之情形時，可知於鎂與鋁之含量比率為9：1之情形時選擇性地吸附標的蛋白質。顯示出使用陰離子為碳酸之碳酸系之LDH可將作為標的蛋白質之PspA融合蛋白質純化。
(實施例5)
針對實施例1所製作之LDH，確認標的蛋白質之吸附能力。於本實施例中，使用MAP作為LDH，使用作為PspA分支2且未與其他分支融合之蛋白質(PspA單抗原)作為標的蛋白質。
除了使用PspA單抗原作為標的蛋白質以外，藉由與實施例2同樣之手法，製備含有標的蛋白質之大腸桿菌破碎液，將MAP與大腸桿菌破碎液加以混合，藉此進行LDH處理。MAP之鎂與鋁之含量比率(莫耳
比)如圖4所示。
圖4之各區帶應用進行LDH處理後經離心分離而獲得之上清液作為樣品。再者，樣品編號1係進行LDH處理前之樣品。
可知鋁含量比率較大之LDH亦吸附標的蛋白質以外之蛋白質。可知鎂與鋁之含量比率為7：3之LDH選擇性地吸附標的蛋白質。顯示出使用磷酸系之LDH可將PspA單抗原純化。
(實施例6)
與實施例1同樣地，依照以下之表1製作LDH。LDH係依照專利文獻1所揭示之方法而製作，並確認鋁含量。
(實施例7)
使用實施例6所製作之LDH，確認日本腦炎病毒抗原之吸附能力。將LDH(鋁含量500μg/mL)與含有作為標的蛋白質之日本腦炎病毒之溶液(蛋白質含量101μg/mL)等量混合，攪拌並放置3小時後，以吸光度(波長280nm)測定未被LDH吸附之上清液中之蛋白質量。
將其結果示於表2。可確認LDH對日本腦炎病毒抗原之吸附能力較高。
(實施例8)
除了使用0.1mol/L之CaCl2．2H2O代替0.1mol/L之CaCl2．6H2O以外，與實施例1同樣地製作LDH(MAP、CAP、MAC、CAC)，並確認鋁含量。
(實施例9)
針對實施例8所製作之LDH，確認對源自黴漿菌(Mycoplasma pneumoniae)之蛋白質之吸附能力。於本實施例中，使用MAP、CAP、MAC或CAC作為LDH，使用源自黴漿菌之P30蛋白質作為標的蛋白質。
按照常規方法將表現黴漿菌P30蛋白質之質體導入至大腸
桿菌中，使標的蛋白質表現。使經冷凍之大腸桿菌浮游於PBS中，藉由超音波將其破碎。破碎後，以最大離心加速度14310(×g)進行15分鐘之離心分離。以成為10%飽和之方式於離心分離後之上清液中添加硫酸銨，以最大離心加速度14310(×g)進行15分鐘之離心分離。以成為30%飽和之方式於離心分離後之上清液中添加硫酸銨，以最大離心加速度14310(×g)進行15分鐘之離心分離。使離心分離後之沈澱物於PBS中懸浮，製成以下之利用LDH之處理之純化前原料。
將實施例8所製作之LDH(鋁含量約10mg/mL)與純化前原料(總蛋白質含量約1.5mg/mL)等量混合，攪拌後放置1小時。進行利用LDH之處理後，回收經離心分離而獲得之上清液作為樣品。針對樣品，藉由使用ATTO公司製造之E-T/R1020L(10~20%)凝膠之SDS-PAGE，確認標的蛋白質之行為。凝膠之各區帶以總蛋白質量成為等量之方式應用樣品。
將結果示於圖5。於圖5中，箭頭所指示之分子量之條帶相當於標的蛋白質。圖5中，SM之區帶應用大小標準參照物(size marker)，未處理之區帶應用未進行利用LDH之處理之純化前原料。除此以外之區帶應用以各區帶所示之金屬組成之LDH對純化前原料處理後之上清液。
於LDH為MAC之情形時，於鋁與鎂之含量比率為1：9~4：6之LDH中未見蛋白質之特異性吸附。於5：5之LDH中觀察到少許雜質蛋白質之吸附。於6：4~9：1之LDH中，觀察到全部蛋白質之吸附。
於LDH為MAP之情形時，於鋁與鎂之含量比率為1：9~5：5之LDH中，隨著鋁含量增加，觀察到全部蛋白質之吸附。於6：4~9：1之LDH中，
標的蛋白質之吸附能力變低，觀察到雜質蛋白質之特異性吸附。
於LDH為CAC之情形時，於鋁與鈣之含量比率為1：9~5：5之LDH中，觀察到雜質蛋白質之吸附。於6：4及7：3之LDH中，觀察到雜質蛋白質之特異性吸附。於8：2及9：1中未觀察到吸附，認為其原因在於LDH量較少，吸附不充分。
於LDH為CAP之情形時，於鋁與鈣之含量比率為1：9~3：7之LDH中，觀察到少許雜質蛋白質之吸附。於4：6及5：5之LDH中，觀察到全部蛋白質之吸附。於6：4~9：1之LDH中，除了標的蛋白質之吸附以外，亦觀察到雜質蛋白質之較強之吸附。
因此確認，藉由使LDH之組成發生變動，可使LDH特異性地吸附標的蛋白質，相反地亦可使LDH特異性地吸附雜質蛋白質，而將標的蛋白質純化。
根據本發明之蛋白質之純化方法，藉由使用LDH，可將標的蛋白質自雜質中選擇性地分離。LDH藉由調節M2+、M3+、An-之種類或比率，可合成各種LDH，賦予多種吸附能力。因此，本發明之蛋白質之純化方法可應用於各種標的蛋白質之純化。於習知之蛋白質之純化方法中，難以將標的蛋白質選擇性地分離，故而必須進行多次純化。於本發明之標的蛋白質之純化方法中，純化步驟減少，可效率良好且簡便地將標的蛋白質純化，從而有用。又，本發明之標的蛋白質之純化方法由於使用對活體無害之物質，故而安全性優異。
Claims (11)
- 一種將標的蛋白質純化之方法，其係使用以下之通式(I)所表示之層狀雙氫氧化物(Layered Double Hydroxide)，將標的蛋白質純化：通式(I)：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n．mH2O](於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子；x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示，x為0.1~0.9，n為1~3，m為0~100)。
- 如申請專利範圍第1項之將標的蛋白質純化之方法，其包括以下步驟：1)使含有標的蛋白質與雜質之溶液與層狀雙氫氧化物接觸；2)將層狀雙氫氧化物與溶液分離。
- 如申請專利範圍第1或2項之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，An-係選自由PO4 3-、CO3 2-、OH-、F-、Cl-、Br-、NO3 -及核酸所組成之群中之至少1種以上。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，M2+係選自由Mg2+、Fe2+、Zn2+、Ca2+、Li2+、Ni2+、Co2+及Cu2+所組成之群中之至少1種以上。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，M3+係選自由Al3+、Fe3+、Mn3+及Cr3+所組成之群中之任意1種以上。
- 如申請專利範圍第1至5項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，其中，於通式(I)中，An-為PO4 3-。
- 如申請專利範圍第1至6項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，其 中，標的蛋白質包含抗原或抗體。
- 如申請專利範圍第1至7項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，其中，標的蛋白質含有選自肺炎球菌疫苗、流行性感冒疫苗、日本腦炎疫苗、白喉疫苗、百日咳疫苗、破傷風疫苗、b型流行性感冒桿菌疫苗、及B型肝炎疫苗中之至少1種以上之疫苗所含之成分。
- 如申請專利範圍第1至8項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，其包括以下步驟：1)使含有標的蛋白質與雜質之溶液與層狀雙氫氧化物接觸，而使層狀雙氫氧化物吸附蛋白質；2)將層狀雙氫氧化物與溶液分離；3)將標的蛋白質回收。
- 一種製造疫苗之方法，其係使用申請專利範圍第1至9項中任一項之將標的蛋白質純化之方法，製造疫苗。
- 一種標的蛋白質純化用載體，其於表面載持有以下之通式(I)所表示之層狀雙氫氧化物：通式(I)：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n．mH2O](於上述通式(I)中，M2+與M3+分別為二價與三價之金屬，An-為層間陰離子；x係以[M3+]/([M2+]+[M3+])表示，x為0.1~0.9，n為1~3，m為0~100)。
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