WO2017164121A1 - 標的蛋白質の精製方法 - Google Patents

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WO2017164121A1
WO2017164121A1 PCT/JP2017/010931 JP2017010931W WO2017164121A1 WO 2017164121 A1 WO2017164121 A1 WO 2017164121A1 JP 2017010931 W JP2017010931 W JP 2017010931W WO 2017164121 A1 WO2017164121 A1 WO 2017164121A1
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target protein
ldh
vaccine
purifying
protein
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浩 宮武
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一般財団法人阪大微生物病研究会
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a target protein (target protein) from a solution containing various proteins using layered double hydroxide (hereinafter referred to as LDH), and further using the purification method.
  • LDH layered double hydroxide
  • the present invention relates to a method for producing a vaccine.
  • Proteins are high molecular compounds mainly composed of polypeptides composed of amino acids, and have a wide variety of types and functions. Proteins are not only important research objects in life science, but are also applied in various fields including the medical field.
  • Proteins are artificially mass-produced and used as medicines in living bodies.
  • protein drugs include insulin as a therapeutic agent for diabetes, erythropoietin as a therapeutic agent for anemia, and interferons as a therapeutic agent for viral hepatitis.
  • anticancer agents such as rituximab and trastuzumab are used for cancer treatment as antibody drugs utilizing human immune functions.
  • the protein functions as an antigen having an immune-inducing function in vivo, and thus is used as a vaccine.
  • Vaccination is the most important means for preventing infections caused by infection with pathogens such as bacteria and viruses. In the production of vaccines, it is necessary to produce antigens such as proteins stably and in large quantities.
  • Affinity purification is a method of purifying a target substance by binding to a carrier a protein that can be specifically adsorbed to the target substance such as an antibody.
  • affinity purification has a problem that it is difficult to apply to other than antibodies, and a carrier to which a protein is bound is very expensive.
  • LDH is a layered compound having an inorganic skeleton (metal hydroxide layer) having anion exchange ability. LDH is explained in detail on the website of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (https://unit.aist.go.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html). Has been. Although LDH is not naturally produced, it is relatively easy to synthesize. Therefore, many studies and studies have been conducted using synthetic products, and it is used in gastrointestinal drugs as an antacid, Used as a stabilizer.
  • Patent Document 1 discloses an LDH particle group and a production method thereof, an LDH dispersion, and an LDH-added resin.
  • Patent Document 2 discloses a method of adsorbing microorganisms in water to LDH, and removing and purifying microorganisms from water.
  • Non-Patent Document 1 discloses that chromate can be adsorbed by LDH.
  • Patent Document 3 discloses that a low-molecular-weight compound is adsorbed by a layered inorganic compound containing hydrotalcite.
  • Non-Patent Document 2 discloses that synthetic hydrotalcite can adsorb hemoglobin and human serum albumin, and that the adsorbed protein can be eluted with a pH 10 carbonate buffer.
  • the target protein can be selectively purified from a solution in which various proteins are mixed with LDH.
  • JP 2013-112560 A International Publication No. WO2002 / 075777 Japanese Patent No. 3446796
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying a target protein efficiently and simply.
  • the present inventor discovered that when the cation content ratio of LDH changes, there is a difference in protein adsorption capacity, and the protein is selectively adsorbed on LDH. As a result, it was found that the target protein can be used for purification, and the present invention was completed.
  • the present invention comprises the following. 1.
  • a method for purifying a target protein using LDH represented by the following general formula (I): Formula (I): [M 2+ 1-x M 3+ x (OH) 2 ] [A n- x / n ⁇ mH 2 O]
  • M 2+ and M 3+ are each divalent and trivalent metal
  • X is [M 3+] / ([M 2 + ] + [M 3+ ])
  • x is 0.1 to 0.9
  • n is 1 to 3
  • m is 0 to 100.
  • a method for purifying the target protein according to item 1, comprising the following steps: 1) A step of bringing a solution containing a target protein and impurities into contact with LDH; 2) A step of separating LDH and the solution. 3.
  • a n- is PO 4 3-, CO 3 2-, OH -, F -, Cl -, Br -, NO 3 - at and least one member selected from the group consisting of nucleic acids
  • at least M 2+ is selected from the group consisting of Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , Ca 2+ , Li 2+ , Ni 2+ , Co 2+ and Cu 2+.
  • M 3+ is any one or more selected from the group consisting of Al 3+ , Fe 3+ , Mn 3+ and Cr 3+ Of purifying the target protein. 6).
  • a n- is PO 4 3-, a method of purifying a target protein according to any one of items 1-5. 7). 7. The method for purifying a target protein according to any one of items 1 to 6, wherein the target protein contains an antigen or an antibody. 8).
  • the target protein comprises a component contained in at least one vaccine selected from pneumococcal vaccine, influenza vaccine, Japanese encephalitis vaccine, diphtheria vaccine, pertussis vaccine, tetanus vaccine, influenza b virus vaccine, and hepatitis B vaccine.
  • a method for purifying a target protein according to any one of items 1 to 8 including the following steps: 1) A step of bringing a solution containing a target protein and impurities into contact with LDH and adsorbing the protein to LDH; 2) separating LDH and solution; 3) A step of recovering the target protein. 10.
  • M 2+ and M 3+ are each divalent and trivalent metal
  • X is [M 3+] / ([M 2 + ] + [M 3+ ])
  • x is 0.1 to 0.9
  • n is 1 to 3
  • m is 0 to 100.
  • the target protein can be selectively separated from impurities.
  • the present invention relates to a method for purifying a target protein using LDH represented by the following general formula (I).
  • M 2+ and M 3+ are each divalent and trivalent metal
  • x is 0.1 to 0.9
  • n is 1 to 3.
  • m is 0 to 100, and preferably m is 1 to 100.
  • x represented by the general formula (I) is 0.1 to 0.9 as described above.
  • x is generally in the range of 0.2 to 0.33.
  • the present inventors have surprisingly found that when LDH is used for protein purification, x is preferably in the range of 0.1 to 0.9, which is wider than the general LDH x range.
  • [M 2+ ] represents the number of moles or molar concentration of M 2+
  • [M 3+ ] represents the number of moles or molar concentration of M 3+ .
  • the LDH represented by the general formula (I) is a double hydroxide in which a trivalent metal ion is dissolved in a divalent metal hydroxide
  • the metal hydroxide layer (host layer) is A compound having a stacked structure in which a negatively charged guest substance is sandwiched between the host layer and the host layer because it has a positive charge.
  • the first half of the general formula [M 2+ 1-x M 3+ x (OH) 2 ] is the host layer, and x is positively charged. Compensating for this positive charge, anions and water molecules, which are guest substances, exist between these layers.
  • LDH has a composition in which part of a trivalent metal is replaced with a tetravalent metal, or a combination of monovalent to trivalent [Li 1/3 Al 2/3 (OH) 2 ] [A n- 1 / ( 3 x n) ⁇ mH 2 O].
  • the metal in the host layer may be composed of three or more multi-component systems. Taking a guest substance such as an atom, molecule, or ion between layers while holding the host layer by “host-guest reaction” is called “intercalation”.
  • M ⁇ 2+> shown in general formula (I) consists of Mg ⁇ 2+> , Fe ⁇ 2+> , Zn ⁇ 2+> , Ca ⁇ 2+> , Li ⁇ 2+> , Ni ⁇ 2+> , Co ⁇ 2+> and Cu ⁇ 2+>.
  • Selected from the group preferably selected from the group consisting of Mg 2+ , Fe 2+ , Zn 2+ , and Ca 2+ , more preferably Mg 2+ or Ca 2+ , more preferably Mg 2+ .
  • M 2+ may be used alone or in combination of two or more selected from the above.
  • M 3+ represented by the general formula (I) can be selected from the group consisting of Al 3+ , Fe 3+ , Mn 3+ and Cr 3+ , preferably Al 3+ or Fe 3 + , More preferably Al 3+ .
  • M 3+ may be used alone or in combination of two or more selected from the above.
  • a n- is shown in formula (I), it is a guest substance incorporated in the interlayer. Between the layers, an anion or an organic molecule having no negative charge can be intercalated as a guest substance.
  • the guest material only needs to contain an anion, and the type of anion is not particularly limited.
  • An n- can be selected from the group consisting of PO 4 3 ⁇ , CO 3 2 ⁇ , OH ⁇ , F ⁇ , Cl ⁇ , Br ⁇ , NO 3 ⁇ and a nucleic acid, for example.
  • nucleic acids examples include DNA and RNA, and more specifically, poly I: C (TLR3 ligand), DNA unmethylated CpG oligonucleotide (CpG ODN), and the like.
  • a n- is shown in formula (I), preferably PO 4 3- is, CO 3 2-and OH - can be selected from the group consisting of, more preferably PO 4 3- or CO 3 2-, most PO 4 3- is preferred. Any one of A n- selected from the above may be used alone, or two or more may be used in combination. It may exist between the same layers, or may exist regularly between different layers.
  • Adsorption capacity of LDH shown in general formula (I) can be adjusted according to the type of the target protein, M 2+, M 3+, by changing A n- type and ratios as appropriate.
  • a n- is PO 4 3 -
  • x is from 0.1-0.9, preferably when 0.3-0.9, more preferably 0.5-0.7, can be purified target protein more selectively.
  • a n- is CO 3 2- is, x is from 0.1-0.9, preferably when 0.1-0.7, more preferably 0.1-0.3, can be purified target protein more selectively.
  • LDH When adsorbing impurities LDH also if A n- is PO 4 3-, x is 0.1-0.9, preferably be used LDH is 0.6 to 0.9 A n- is CO 3 2- in In this case, LDH in which x is 0.1 to 0.9, preferably 0.6 to 0.9, more preferably 0.6 to 0.7 can be used.
  • M 2+ in a is Mg 2+ or Ca 2+
  • M 3+ is the Al 3+
  • a n- is It is preferably PO 4 3 ⁇ or CO 3 2 ⁇
  • M 2+ is Mg 2+ or Ca 2+
  • M 3+ is Al 3+
  • An ⁇ is PO 4 3 ⁇ . It is more preferable.
  • the ratio of M 2+ and M 3+ can be appropriately changed according to the type of protein adsorbed on LDH.
  • the method for purifying a target protein in the present specification includes the following steps 1) and 2). 1) A step of bringing a solution containing a target protein and impurities into contact with LDH. 2) A step of separating LDH and the solution.
  • the target protein is a protein to be purified.
  • a protein is a polymer compound mainly composed of a polypeptide consisting of amino acids.
  • the protein in the present specification includes proteins bound with other substances such as nucleic acids, phosphates, lipids, sugars, metals, etc., in addition to proteins consisting only of amino acids.
  • the target protein in the present specification has a negative charge in the solution, and the molecular weight of the target protein is not particularly limited.
  • the target protein may be a naturally occurring protein or a recombinant protein produced by genetic recombination.
  • the target protein may have any function such as an antigen, an antibody, an enzyme, a dye, a membrane component, a transport protein, a structural protein, a motor protein, a binding protein, and a receptor.
  • the target protein in the present specification is preferably a component to be blended with a pharmaceutical, more preferably an antigen, an antibody or the like, and particularly preferably an antigen.
  • a solution containing the target protein and impurities is brought into contact with LDH.
  • An impurity means impurities other than the target protein.
  • Impurities include proteins other than the target protein.
  • a target protein can be selectively purified from a variety of proteins. Examples of proteins that are impurities include those derived from microorganisms, plants, or animals, those derived from host cells, and those dissolved in a solution. According to the purification method of the present invention, some or all of the impurities can be removed. Since the purification method of the present invention has selectivity, the target protein in the total protein can be purified to a purity of about 90 to 95%.
  • step 1) either the target protein or the impurity is adsorbed on LDH, and in step 2), LDH and the solution are separated.
  • the target protein can be separated from the impurities and purified by step 2).
  • the target protein may be eluted from LDH and recovered after step 2).
  • LDH is removed and the solution may be recovered.
  • the means for eluting the target protein from LDH is not particularly limited, and means known per se or means developed in the future can be used.
  • the target protein can be eluted by contacting a pH 6.0-8.0 buffer with LDH.
  • the pH 6.0 to 8.0 buffer include a citrate buffer, a high salt concentration solution, or a solution containing an organic substance having a polyvalent carboxylic acid.
  • the organic substance having a polyvalent carboxylic acid include EDTA.
  • the present invention is advantageous because the target protein can be eluted from LDH using a substance that does not adversely affect the living body.
  • step 1) and step 2) of the purification method of the present specification.
  • Other purification steps and processing steps other than step 1) and step 2) include filter filtration, ultrafiltration, ultraconcentration, centrifugation, density gradient centrifugation, column chromatography, membrane chromatography, affinity chromatography, or chemical addition. The separation by is exemplified.
  • a vaccine is produced by preparing a vaccine stock solution by purifying an antigen and formulating it.
  • An antigen can induce an immune response in a living body by being administered, and becomes an active ingredient of a vaccine.
  • the term “antigen” is sometimes used in the meaning of including a vaccine.
  • the purification method of the present specification is applied to an antigen purification process in the production of a general vaccine, thereby simplifying the purification process and allowing the antigen to be purified in a short time.
  • the antigen contained in the vaccine is any of proteins derived from bacteria, viruses, fungi, protozoa, parasites (eg, mycoplasma), or infectious agents (eg, prions). May be.
  • the antigen in the present specification may be either an active ingredient contained in a vaccine known per se or an active ingredient contained in a vaccine to be developed in the future, and is not particularly limited.
  • the active ingredient contained in any of a live vaccine, an inactivated vaccine, or a component vaccine may be sufficient.
  • the solution containing the target protein and impurities is, for example, a solution that is a raw material for preparing a vaccine stock solution.
  • an antigen is propagated by a hatched chicken egg culture method, an animal inoculation method, a cell culture method, a cell culture method, a method of expressing a target protein by genetic recombination, or the like.
  • the antigen is contained in the chorioallantoic fluid of the hatched chicken egg, and in the cell culture method, the antigen is contained in the cell culture solution or in the cell, and a cell disruption solution containing the antigen is prepared. .
  • the solution containing the target protein and impurities may be the urinary membrane fluid, the cell culture solution, the cell disruption solution of the cells or the cells, or may be purified by a purification process such as centrifugation or other chromatography. A crude antigen solution from which some of the impurities have been removed may be used.
  • the solution containing the target protein obtained by the purification method in the present specification may be further subjected to other purification steps such as chromatography.
  • a vaccine preparation from a vaccine stock solution can be produced by a method known per se or any method developed in the future.
  • a vaccine preparation can be formulated as an immune composition by including an adjuvant, a pharmacologically acceptable carrier, a diluent and / or an excipient in addition to an antigen.
  • the vaccine formulation of the present invention is suitable for oral, rectal, nasal, topical (including buccal and sublingual), transdermal, vaginal or parenteral (including intramuscular, subcutaneous and intravenous), or inhalation or
  • a form suitable for administration by gas injection may be included.
  • the dosage form include a liquid agent, a suspension agent, and a powder agent.
  • the liquid agent include those dissolved in purified water, buffer solution and the like.
  • suspending agent examples include those suspended in purified water, buffer solution and the like together with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin, casein and the like.
  • powder examples include those mixed with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and the like.
  • absorption promoters, surfactants, preservatives, stabilizers, moisture-proofing agents, moisturizing agents, solubilizing agents and the like that are usually used can be added as necessary.
  • the vaccine preparation prepared by the purification method of the present invention can be prepared by any method well known in the pharmaceutical art.
  • the dose of the vaccine preparation of the present invention is appropriately determined in consideration of the administration subject, administration site, administration method and administration interval, for example, when the subject is a human, the age, sex, body weight, and other factors known to physicians. it can.
  • the pharmaceutically effective amount when using the vaccine formulation of the present invention for the prevention and / or treatment of infectious diseases is determined by such considerations known in the medical field.
  • the administration target can be appropriately determined according to the type of antigen contained in the vaccine preparation. For example, it can be administered to mammals other than humans, birds, crustaceans and the like.
  • the present invention also extends to a target protein purification carrier carrying LDH represented by the general formula (I) on its surface.
  • a target protein purification carrier carrying LDH represented by the general formula (I) on its surface can be used for liquid chromatography.
  • the present invention also extends to a composition comprising a target protein purification carrier carrying LDH represented by the general formula (I) on its surface. Furthermore, the present invention extends to a method for purifying a target protein using a carrier for purifying a target protein or a composition containing the carrier.
  • Example 1 an LDH represented by the following general formula (I) was produced.
  • M 2+ and M 3+ are each divalent and trivalent metal, A n-denotes an interlayer anion.
  • X is [M 3+] / ([M 2 + ] + [M 3+ ])
  • LDH was produced according to the method disclosed in Patent Document 1, and the aluminum content was confirmed.
  • 0.1 mol / L MgCl 2 ⁇ 6H 2 O and 0.1 mol / L AlCl 3 ⁇ 6H 2 O are mixed at a ratio of 9: 1 to 1: 9, and the total amount of the resulting mixture is equal Of 0.1 mol / L Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O was mixed. Thereafter, the mixture was washed by centrifugation with 1/500 mol / L PBS to prepare a magnesium-aluminum-phosphate LDH (hereinafter referred to as MAP).
  • MAP magnesium-aluminum-phosphate LDH
  • Example 2 The adsorption ability of the target protein was confirmed for the LDH produced in Example 1.
  • a MAP hereinafter referred to as MAP46
  • PspA pneumococcal surface protein A
  • FIG. 1 A protein in which the two clades were fused (PspA fusion protein) was used (FIG. 1).
  • a target protein was expressed by genetic recombination in E. coli, and an E. coli disruption solution containing the target protein was prepared.
  • LDH produced in Example 1 (aluminum content about 10 mg / mL) and E. coli crushed liquid (total protein content about 1.5 mg / mL) were mixed in equal amounts and allowed to stand for 1 hour after stirring.
  • a sample treated with hydroxyapatite was used as a control instead of LDH. Hydroxyapatite treatment was carried out by changing the salt concentration (PBS concentration) and pH to confirm the adsorption ability. The salt concentration and pH are as shown in FIG. Hydroxyapatite is known to exhibit high adsorptivity with amino acids, proteins, lipids, and sugars.
  • hydroxyapatite is used in column chromatography packing materials used for separation of biomolecules and the like, and cosmetics intended to adsorb and remove excess lipids and waste products.
  • the centrifuged supernatant was collected as a sample.
  • the behavior of the target protein was confirmed by SDS-PAGE using ET / R1020L (10-20%) gel manufactured by ATTO. Samples were applied to each lane of the gel so that the total protein mass was equal.
  • the molecular weight band surrounded by a square corresponds to the target protein.
  • sample numbers 2 to 10 were applied with a supernatant after hydroxyapatite treatment, and sample number 11 was applied with a supernatant after LDH treatment.
  • Sample number 1 is obtained by applying a sample before each processing. At any salt concentration and pH, with hydroxyapatite, both the target protein band and the other protein bands were detected, indicating that the target protein could not be selectively adsorbed.
  • LDH treatment was carried out, almost no target protein band was confirmed, and other protein bands were detected, indicating that LDH has a selective adsorption ability for the target protein.
  • Example 3 With respect to the LDH produced in Example 1, the ability to adsorb the target protein when the metal composition was changed was confirmed.
  • MAP or CAP was used as LDH
  • PspA fusion protein was used as the target protein.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, an E. coli disruption solution containing the target protein was prepared, and LDH treatment was performed by mixing MAP or CAP and the E. coli disruption solution.
  • the content ratio (molar ratio) of magnesium and aluminum in MAP and the content ratio (molar ratio) of calcium and aluminum in CAP are as shown in FIG.
  • the molecular weight band indicated by the arrow corresponds to the target protein.
  • Each lane in FIG. 2 was subjected to LDH treatment and then centrifuged as a supernatant.
  • Sample number 1 was treated with Ca 3 (PO 4 ) 2 instead of LDH, and sample number 10 was treated with AlPO 4 instead of LDH.
  • CAP sample numbers 2 to 5
  • CAP sample numbers 2 to 5
  • MAP sample Nos. 6 to 9
  • Example 4 About LDH produced in Example 1, the adsorption ability of the target protein at the time of changing a metal composition was confirmed.
  • MAC or CAC was used as LDH
  • PspA fusion protein was used as the target protein.
  • Example 3 Experiments were performed in the same manner as in Example 3 except that MAC or CAC was used instead of MAP or CAP.
  • the content ratio of magnesium and aluminum in MAC and the content ratio (molar ratio) of calcium and aluminum in CAC are as shown in FIG.
  • the molecular weight band indicated by the arrow corresponds to the target protein.
  • Each lane in FIG. 3 was subjected to LDH treatment and then centrifuged as a supernatant.
  • the pre-purification solution of sample number 1 is a sample before performing LDH treatment.
  • Sample No. 2 is obtained by performing CaCO 3 treatment instead of LDH.
  • CAC sample numbers 3 to 7
  • MAC sample numbers 8 to 12
  • the target protein was selectively adsorbed when the content ratio of magnesium and aluminum was 9: 1. It was shown that the target protein PspA fusion protein can be purified using carbonated LDH whose anion is carbonate.
  • Example 5 The LDH produced in Example 1 was confirmed for target protein adsorption ability.
  • MAP was used as LDH
  • a protein (PspA single antigen) that was PspA clade 2 and was not fused with another clade was used as the target protein.
  • An E. coli disruption solution containing the target protein was prepared by the same method as in Example 2 except that the PspA single antigen was used as the target protein, and LDH treatment was performed by mixing MAP and the E. coli disruption solution.
  • the content ratio (molar ratio) of magnesium and aluminum in MAP is as shown in FIG.
  • Sample number 1 is a sample before the LDH process. It was found that LDH with a high aluminum content ratio adsorbs proteins other than the target protein. It was found that LDH with a content ratio of magnesium and aluminum of 7: 3 selectively adsorbs the target protein. It was shown that PspA single antigen can be purified using phosphate-based LDH.
  • Example 6 Similarly to Example 1, LDH was produced according to Table 1 below. LDH was produced according to the method disclosed in Patent Document 1, and the aluminum content was confirmed.
  • Example 7 Using the LDH prepared in Example 6, the ability to adsorb Japanese encephalitis virus antigen was confirmed.
  • LDH (aluminum content 500 ⁇ g / mL) and target protein Japanese encephalitis virus-containing solution (protein content 101 ⁇ g / mL) are mixed in equal amounts, stirred and left for 3 hours, then the supernatant not adsorbed to LDH The amount of protein inside was measured by absorbance (wavelength 280 nm).
  • Example 8 LDH (MAP, CAP, MAC, CAC) was prepared in the same manner as in Example 1 except that 0.1 mol / L CaCl 2 ⁇ 2H 2 O was used instead of 0.1 mol / L CaCl 2 ⁇ 6H 2 O, The aluminum content was confirmed.
  • Example 9 About LDH produced in Example 8, the adsorption ability to the protein derived from Mycoplasma (Mycoplasma pneumoniae) was confirmed.
  • Mycoplasma pneumoniae Mycoplasma pneumoniae
  • MAP, CAP, MAC, or CAC was used as LDH
  • mycoplasma-derived P30 protein was used as the target protein.
  • a plasmid expressing mycoplasma P30 protein was introduced into Escherichia coli according to a conventional method to express the target protein.
  • the frozen E. coli was suspended in PBS and crushed by ultrasonic waves. After crushing, centrifugation was performed for 15 minutes at a maximum centrifugal acceleration of 14310 ( ⁇ g). To the supernatant after centrifugation, ammonium sulfate was added so as to be 10% saturated, and centrifuged at a maximum centrifugal acceleration of 14310 ( ⁇ g) for 15 minutes.
  • ammonium sulfate was added so as to be 30% saturated, and centrifuged at a maximum centrifugal acceleration of 14310 ( ⁇ g) for 15 minutes.
  • the precipitate after centrifugation was suspended in PBS and used as a raw material before purification for the following treatment with LDH.
  • Example 8 The LDH produced in Example 8 (aluminum content about 10 mg / mL) and the raw material before purification (total protein content about 1.5 mg / mL) were mixed in equal amounts and left for 1 hour after stirring. After the treatment with LDH, the centrifuged supernatant was collected as a sample. For the sample, the behavior of the target protein was confirmed by SDS-PAGE using AT-E / T / R1020L (10-20%) gel manufactured by ATTO. Samples were applied to each lane of the gel so that the total protein mass was equal.
  • the molecular weight band indicated by the arrow corresponds to the target protein.
  • the size marker was applied to the SM lane, and the raw material before purification that had not been treated with LDH was applied to the untreated lane. In the other lanes, the supernatant after the pre-purification raw material was treated with LDH having the metal composition shown in each lane was applied.
  • LDH When LDH was MAC, specific adsorption of protein was not observed with LDH having a content ratio of aluminum to magnesium of 1: 9 to 4: 6. In 5: 5 LDH, slight protein adsorption was observed. With 6: 4 to 9: 1 LDH, all proteins were adsorbed.
  • LDH When LDH was MAP, LDH with an aluminum to magnesium content ratio of 1: 9 to 5: 5 increased the aluminum content and adsorbed all proteins. In LDH of 6: 4 to 9: 1, the adsorption ability of the target protein was lowered, and specific adsorption of the impurity protein was observed.
  • LDH When LDH was CAC, impurity protein was adsorbed in LDH with a content ratio of aluminum to calcium of 1: 9 to 5: 5.
  • the target protein can be adsorbed specifically to LDH by changing the composition of LDH, but the target protein can also be purified by adsorbing the impurity protein specifically to LDH. It was done.
  • the target protein can be selectively separated from impurities by using LDH.
  • LDH is, M 2+, M 3+, by adjusting the A n- type and ratios, it is possible to impart various adsorption capability by combining a variety of LDH. Therefore, the protein purification method of the present invention can be applied to the purification of various target proteins.
  • the method for purifying a target protein of the present invention is useful because it reduces the number of purification steps and enables efficient and simple purification of the target protein.
  • the method for purifying a target protein of the present invention is excellent in safety because it uses a substance that is not harmful to the living body.

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Abstract

本発明は、以下の一般式（Ｉ）で示す層状複水酸化物を用いて、標的蛋白質を精製する方法に関する。　一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O] （上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1～0.9であり、ｎは1～3であり、ｍは0～100である。）

Description

標的蛋白質の精製方法
　本発明は、層状複水酸化物（Layered Double Hydroxide：以下LDH）を用いて多様な蛋白質が混在する溶液の中から目的の蛋白質（標的蛋白質）を精製する方法に関し、さらに当該精製方法を用いたワクチンの製造方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願２０１６－５６７８０号優先権を請求する。
　蛋白質は、アミノ酸から構成されるポリペプチドを主体とする高分子化合物であり、多種多様な種類・機能がある。蛋白質は生命科学における重要な研究対象となるだけでなく、医療分野を含む様々な分野において応用されている。
　蛋白質は人工的に大量生産され、医薬として生体に投与されて利用されている。蛋白質医薬としては例えば、糖尿病治療薬のインスリン、貧血治療薬のエリスロポエチン、ウイルス性肝炎の治療薬のインターフェロン類などが挙げられる。さらに、ヒトの免疫機能を利用した抗体医薬として、リツキシマブやトラスツズマブ等の抗癌剤が、がん治療に用いられている。また、蛋白質は生体内で免疫惹起機能を有する抗原としても機能することから、ワクチンとして利用される。ワクチン接種は、細菌やウイルス等の病原体の感染により引き起こされる感染症予防のための最も重要な手段である。ワクチンの製造においては、蛋白質などの抗原を安定的かつ大量に製造することが必要とされている。
　蛋白質を大量に生産した後、ワクチン等の医薬を製造するためには、標的蛋白質を精製して回収する必要がある。従来、蛋白質を精製するには、固定の電荷を持った粒子体、例えばDEAEなどの陰イオン交換カラム、リン酸アルミニウムもしくはリン酸カルシウム等が用いられていた。リン酸カルシウムの結晶の一つであるハイドロキシアパタイトを充填剤とする液体クロマトグラフィーも蛋白質の精製に用いられている。しかし標的蛋白質のみを精製するには、多数の精製工程が必要であり、複雑かつ煩雑であるという問題があった。
　標的蛋白質を選択的に精製する方法として、アフィニティー精製が知られている。アフィニティー精製とは、抗体等の目的物質に対して特異的に吸着し得る蛋白質を担体に結合させて、目的物質を精製する方法である。しかし、アフィニティー精製には、抗体以外への適用が困難であるという問題があり、また蛋白質を結合させた担体は非常に高価である。
　LDHは、陰イオン交換能を有する無機の骨格（金属水酸化物層）を持った層状化合物である。
　LDHは独立行政法人産業技術総合研究所ホームページ（https://unit.aist.go.jp/emtech-ri/ci/e-keyword/LDH/ldh.html）において、構造等も含め、詳細に説明されている。LDHは天然での産出は多くはないが、合成が比較的簡単なことから、合成物を用いて多くの研究・検討がなされており、制酸剤として胃腸薬に使用されたり、塩化ビニールの安定剤として使用されている。特許文献１には、LDH粒子群およびその製造方法、LDH分散液、並びにLDH添加樹脂が開示されている。特許文献２には、LDHに水中の微生物を吸着させ、水から微生物を除去して浄化する方法が開示されている。
　LDHは陰イオン交換能を有することから、陰イオン回収・除去を目的として検討がなされている。非特許文献１にはLDHによりクロム酸塩を吸着できることが開示されている。特許文献３には、低分子化合物である色素を、ハイドロタルサイトを含む層状無機化合物により吸着させることが開示されている。非特許文献２には、合成ハイドロタルサイトにより、ヘモグロビンやヒト血清アルブミンを吸着可能であること、pH10の炭酸バッファーにより吸着した蛋白質を溶出できることが開示されている。しかし、LDHが多様な蛋白質が混在する溶液の中から、標的蛋白質を選択的に精製できることは、知られていない。
Lazaridis NK, Matis KA, Webb M.,　Chemosphere. 2001 Feb;42(4):373-8. Ralla K, Sohling U, Suck K, Sander F, Kasper C, Ruf F, Scheper T.,　Colloids Surf B Biointerfaces. 2011 Oct 15;87(2):217-25. doi: 10.1016/j.colsurfb.2011.05.021. Epub 2011 May 19.
特開２０１３－１１２５６０号公報 国際公報ＷＯ２００２／０７６５７７号 特許第３４４６７９６号公報
　本発明は、効率良くかつ簡便に標的蛋白質を精製する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、LDHの持つ陽イオンの含量比率が変化すると蛋白質吸着能に差が出ることを発見し、LDHに蛋白質を選択的に吸着させることで、標的蛋白質の精製に利用できることを見出し、本発明を完成した。
　本発明は、すなわち以下よりなる。
１．以下の一般式（Ｉ）で示すLDHを用いて、標的蛋白質を精製する方法：
一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1～0.9であり、ｎは1～3であり、ｍは0～100である。）
２．以下の工程を含む、前項１に記載の標的蛋白質を精製する方法：
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と、LDHとを接触させる工程；
２）LDHと溶液とを分離する工程。
３．一般式（Ｉ）において、An-がPO4 3-, CO3 2-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3 -及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種以上である、前項１又は２に記載の標的蛋白質を精製する方法。
４．一般式（Ｉ）において、M2+がMg2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, Li2+, Ni2+, Co2+及び Cu2+からなる群より選択される少なくとも１種以上である、前項１～３のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
５．一般式（Ｉ）において、M3+がAl3+, Fe3+, Mn3+及びCr3+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、前項１～４のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
６．一般式（Ｉ）において、An-がPO4 3-である、前項１～５のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
７．標的蛋白質が、抗原又は抗体を含む、前項１～６のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
８．標的蛋白質が、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、及びＢ型肝炎ワクチンから選択される少なくとも１種以上のワクチンに含まれる成分を含む、前項１～７のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
９．以下の工程を含む、前項１～８のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法：
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液とLDHとを接触させ、LDHに蛋白質を吸着させる工程；
２）LDHと溶液とを分離する工程；
３）標的蛋白質を回収する工程。
１０．前項１～９のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法を用いて、ワクチンを製造する方法。
１１．以下の一般式（Ｉ）で示すLDHを表面に担持した、標的蛋白質精製用担体：
一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]））で示され、ｘは0.1～0.9であり、ｎは1～3であり、ｍは0～100である。）
　本発明の標的蛋白質の精製方法によれば、標的蛋白質を不純物から選択的に分離することができる。
LDH（MAP46）によるPspA融合蛋白質の選択的吸着能を確認した結果を示す写真である。（実施例２） LDH（MAP又はCAP）の陽イオンの含量比率によるPspA融合蛋白質の選択的吸着能への影響を確認した結果を示す写真である。（実施例３） LDH（MAC又はCAC）の陽イオンの含量比率によるPspA融合蛋白質の選択的吸着能への影響を確認した結果を示す写真である。（実施例４） LDH（MAP）によるPspA単抗原の選択的吸着能を確認した結果を示す写真である。（実施例５） LDH（MAP、CAP、MAC、又はCAC）によるマイコプラズマ由来P30蛋白質の選択的吸着能を確認した結果を示す写真である。（実施例８）
　本発明は、下記一般式（Ｉ）に示すLDHを用いた標的蛋白質の精製方法に関する。
一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1～0.9であり、ｎは1～3である。ｍは0～100であり、好ましくはｍは1～100である。）
　本明細書において一般式（Ｉ）で示すｘは、上述の如く0.1～0.9である。LDHは一般的に、ｘが0.2～0.33の範囲とされている。しかし本発明者は、驚くべきことに、LDHを蛋白質の精製に使用する場合には、一般的なLDHのｘの範囲より広範な、ｘが0.1～0.9の範囲が好ましいことを見出した。なお、[M2+]はM2+のモル数又はモル濃度、[M3+]はM3+のモル数又はモル濃度を表す。
　本明細書において一般式（Ｉ）で示されるLDHとは、２価の金属水酸化物に３価の金属イオンが固溶した複水酸化物であり、金属水酸化物層（ホスト層）が正電荷を持つため、ホスト層とホスト層の間（層間）に負に帯電するゲスト物質を挟んだ積層構造の化合物をいう。一般式前半部 [M2+ 1-xM3+ x(OH)2]がホスト層で、ｘは正に帯電している。この正電荷を補償して、これら層間にゲスト物質である陰イオンと水分子が存在している。LDHには、３価金属の一部を４価金属で置き換えた組成や、１価～３価の組み合わせである [Li1/3Al2/3(OH)2][An- 1/(3 × n)・mH2O] などもある。ホスト層中の金属は３種以上の多元系の構成も可能である。「ホスト－ゲスト反応」により、ホスト層を保持したまま、層間に原子・分子・イオン等のゲスト物質を取り込むことを「インターカレーション」という。
　本明細書において、一般式（Ｉ）に示すM2+は、Mg2+，Fe2+，Zn2+，Ca2+，Li2+，Ni2+，Co2+及び Cu2+からなる群より選択することができ、好ましくはMg2+，Fe2+，Zn2+，及びCa2+からなる群より選択することができ、さらに好ましくはMg2+又はCa2+、より好ましくはMg2+である。M2+は、上記より選択されるいずれか１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　本明細書において、一般式（Ｉ）に示すM3+は、Al3+，Fe3+，Mn3+及びCr3+からなる群より選択することができ、好ましくはAl3+又はFe3+、より好ましくはAl3+である。M3+は、上記より選択されるいずれか１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　本明細書において、一般式（Ｉ）に示すAn-は、層間に取り込まれたゲスト物質である。層間にはゲスト物質として陰イオンや負電荷を持たない有機分子等をインターカレーションすることができる。ゲスト物質としては陰イオンが含まれていればよく、陰イオンの種類は特に限定されない。An-は、例えばPO4 3-, CO3 2-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3 - 及び核酸からなる群より選択することができる。核酸の例としてはDNAやRNAを挙げることができ、より具体的にはpoly I:C（TLR3リガンド）、DNAの非メチル化CpGのオリゴヌクレオチド（CpG ODN）などが挙げられる。一般式（Ｉ）に示すAn-は、好ましくはPO4 3-，CO3 2-及びOH-からなる群より選択することができ、より好ましくはPO4 3-又はCO3 2-、最も好ましくはPO4 3-である。An-は上記より選択されるいずれか１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。同じ層間に存在することもあれば、規則的に別の層間に存在する場合もある。
　一般式（Ｉ）に示すLDHの吸着能は、標的蛋白質の種類に応じて、M2+、M3+、An-の種類や比率を適宜変更することにより調節できる。例えばAn-がPO4 3-の場合は、ｘが0.1～0.9、好ましくは0.3～0.9、より好ましくは0.5～0.7であるときに、標的蛋白質をより選択的に精製することができる。An-がCO3 2-の場合には、ｘが0.1～0.9、好ましくは0.1～0.7、より好ましくは0.1～0.3であるときに、標的蛋白質をより選択的に精製することができる。また不純物をLDHに吸着させる場合は、An-がPO4 3-の場合、ｘが0.1～0.9、好ましくは0.6～0.9であるLDHを用いることができ、An-がCO3 2-の場合、ｘが0.1～0.9、好ましくは0.6～0.9、より好ましくは0.6～0.7であるLDHを用いることができる。
　本明細書におけるLDHは、標的蛋白質の種類に応じて、一般式（Ｉ）においてM2+がMg2+又はCa2+であり、M3+がAl3+であり、かつAn-がPO4 3-又はCO3 2-であることが好ましく、さらにM2+がMg2+又はCa2+であり、M3+がAl3+であり、An-がPO4 3-であることがより好ましい。M2+とM3+の比率は、LDHに吸着させる蛋白質の種類に応じて適宜変更することができる。
　本明細書における標的蛋白質を精製する方法は、以下の工程１）及び工程２）を含むものである。
１）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と、LDHとを接触させる工程。
２）LDHと溶液とを分離する工程。
　標的蛋白質とは、精製の対象となる蛋白質である。蛋白質とは、アミノ酸からなるポリペプチドを主体とする高分子化合物である。本明細書における蛋白質には、アミノ酸のみからなる蛋白質に加えて、他の物質、例えば、核酸、リン酸、脂質、糖、金属等を結合した蛋白質も含まれる。本明細書における標的蛋白質は、溶液中においてマイナス電荷を有するものであり、標的蛋白質の分子量は特に限定されない。標的蛋白質は、天然に存在するものであっても、遺伝子組み換えにより作製された組換え蛋白質であってもよい。標的蛋白質は抗原、抗体、酵素、色素、膜構成成分、輸送蛋白、構造蛋白、運動蛋白、結合蛋白、受容体など、いかなる機能を持つものであってもよい。本明細書における標的蛋白質は、医薬に配合する成分であることが好ましく、抗原、抗体等がより好ましく、抗原であることが特に好ましい。
　工程１）では、標的蛋白質と不純物とを含む溶液を、LDHと接触させる。不純物とは、標的蛋白質以外の夾雑物を意味する。不純物には、標的蛋白質以外の蛋白質が含まれる。本発明の精製方法によれば、多種の蛋白質の中から標的蛋白質を選択的に精製することができる。不純物である蛋白質としては、微生物、植物、もしくは動物由来のもの、宿主細胞由来のもの、又は溶液に溶存しているものが挙げられる。本発明の精製方法によれば、不純物の一部又は全部を除去することができる。本発明の精製方法は選択性を有することから、全蛋白質中の標的蛋白質を90～95%程度の純度にまで精製することができる。
　工程１）では、標的蛋白質か不純物のいずれかをLDHに吸着させ、工程２）においてLDHと溶液とを分離する。工程２）により標的蛋白質を不純物から分離し精製することができる。標的蛋白質をLDHに吸着させた場合は、工程２）の後に、LDHから標的蛋白質を溶出して回収すればよい。あるいは、不純物をLDHに吸着させた場合は、LDHを除去して、溶液を回収すればよい。
　LDHから標的蛋白質を溶出する手段は、特に限定されず、自体公知の手段又は今後開発される手段を用いることができる。例えば、pH6.0～8.0の緩衝液をLDHに接触させることにより、標的蛋白質を溶出させることができる。pH6.0～8.0の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、高塩濃度溶液、又は多価カルボン酸を有する有機物を含む溶液が例示される。多価カルボン酸を有する有機物としては、EDTAが例示される。本発明においては、生体に悪影響を及ぼさない物質を用いてLDHから標的蛋白質を溶出することができるため、有利である。
　標的蛋白質の精製では、本明細書の精製方法の工程１）及び工程２）の前後に、他の精製工程や処理工程が含まれていてもよい。工程１）及び工程２）以外の他の精製工程や処理工程としては、フィルターろ過、限外ろ過、限外濃縮、遠心分離、密度勾配遠心分離、カラムクロマトグラフィ、メンブレンクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、又は薬品添加による分離等が例示される。
　ワクチンは、抗原を精製することでワクチン原液を作製し、これを製剤化することにより製造される。抗原は、投与されることにより生体に免疫応答を誘導し得るものであり、ワクチンの有効成分となるものである。なお本明細書において、一般的に抗原という場合は、ワクチンも包含される意味で使用される場合がある。本明細書の精製方法は、一般的なワクチンの製造における抗原精製過程に適用することにより、精製工程を簡略化し、短時間での抗原の精製を可能とする。
　ワクチンに含まれる抗原は、例えば細菌由来、ウイルス由来、真菌由来、原生動物由来、寄生虫由来（例えば、マイコプラズマ由来等）、又は感染性因子由来（例えば、プリオン由来等）の蛋白質のいずれであってもよい。本明細書における抗原は、自体公知のワクチンに含まれる有効成分又は今後開発されるワクチンに含まれる有効成分のいずれであってもよく、特に限定されない。例えば、生ワクチン、不活化ワクチン又は成分ワクチンのいずれに含まれる有効成分であってもよい。ワクチンとしては、例えば日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン及びＢ型肝炎ワクチンから選択されるいずれか１種のワクチン、あるいは２種以上のワクチンの組み合わせからなるワクチンであってもよい。
　標的蛋白質と不純物とを含む溶液とは、例えばワクチン原液を作製するための原料となる溶液である。ワクチンの製造では、ふ化鶏卵培養法や、動物接種法、細胞培養法、菌体培養法、又は遺伝子組み換えにより標的蛋白質を発現させる方法等により、抗原を増殖させる。ふ化鶏卵培養法では、ふ化鶏卵のしょう尿膜腔液に抗原が含まれ、細胞培養法では、細胞の培養溶液や細胞内に抗原が含まれており、抗原を含む細胞破砕液が調製される。このように、抗原を増殖させる過程ではいずれも、抗原以外に不純物を含むことから、抗原を不純物から分離してワクチン原液を調製する必要がある。標的蛋白質と不純物とを含む溶液は、しょう尿膜腔液や細胞培養溶液、細胞や菌体の細胞破砕液そのままであってもよいし、遠心分離や他のクロマトグラフィー等を用いた精製工程により、不純物の一部が除去された粗抗原溶液であってもよい。本明細書における精製方法により得られた標的蛋白質を含む溶液は、さらに他のクロマトグラフィー等の精製工程に供されてもよい。
　ワクチン原液からのワクチン製剤の製造は、自体公知の方法又は今後開発されるあらゆる方法により製造できる。ワクチン製剤は、抗原のほか、アジュバントや、薬理学的に許容しうる担体、希釈液及び／又は賦形剤等を含めることで、免疫組成物として製剤化することができる。本発明のワクチン製剤は、経口、直腸、鼻、局所（頬および舌下を含む）、経皮、膣または非経口（筋肉内、皮下および静脈内を含む）の投与に適するもの、あるいは吸入またはガス注入による投与に適する形態のものを含むことができる。剤形としては、例えば液剤、懸濁剤、粉末剤などとすることができる。液剤としては、精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともに混合したものなどが挙げられる。これらのワクチン製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。本発明の精製方法で調製されたワクチン製剤は、薬学の技術分野でよく知られている任意の方法により調製することができる。
　本発明のワクチン製剤の投与量は、投与対象、投与部位、投与方法及び投与間隔、例えば対象がヒトの場合は、年齢、性別、体重、ならびに医師に公知の他の因子を考慮して適宜設定できる。本発明のワクチン製剤を感染症の予防及び／又は治療のために使用するときの薬学的に有効な量は、医療分野において公知であるこのような考慮すべき事柄によって決定される。投与対象は、ワクチン製剤に含まれる抗原の種類に応じて適宜決定することができる。例えばヒトのほか、ヒト以外の哺乳類、鳥類、甲殻類などに投与することができる。
　また、本発明は一般式（Ｉ）で示すLDHを表面に担持した、標的蛋白質精製用担体にも及ぶ。かかる担体は、液体クラマトグラフィに用いることができる。本発明は、一般式（Ｉ）で示すLDHを表面に担持した標的蛋白質精製用担体を含む組成物にも及ぶ。さらに本発明は、標的蛋白質精製用担体又は当該担体を含む組成物を用いた標的蛋白質を精製する方法にも及ぶ。
　本発明の理解を助けるために、以下に実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は本実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
　本実施例では、下記一般式（Ｉ）に示すLDHを作製した。
一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O]
（上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示される。）
　LDHは、特許文献１に開示される方法に従って作製し、アルミニウム含量を確認した。具体的には、0.1mol/L　MgCl2・6H2Oと0.1mol/L　AlCl3・6H2Oを９：１～１：９の割合で混合し、得られた混合液の総量と等量の0.1mol/L　Na2HPO4・12H2Oを混合した。その後、1/500mol/L　PBSにより遠心して洗浄し、マグネシウム－アルミニウム－リン酸系のLDH（以下MAP）を作製した。0.1mol/L　MgCl2・6H2Oを0.1mol/L　CaCl2・6H2Oに変更した以外は上記と同様の手法により、カルシウム－アルミニウム－リン酸系のLDH（以下CAP）を作製した。また、0.1mol/L　Na2HPO4・12H2Oを0.1mol/L　Na2CO3に変更した以外は同様の手法により、マグネシウム－アルミニウム－炭酸系のLDH（以下MAC）又はカルシウム－アルミニウム－炭酸系のLDH（以下CAC）を作製した。
（実施例２）
　実施例１で作製したLDHについて標的蛋白質の吸着能を確認した。本実施例では、LDHとしてマグネシウムとアルミニウムのモル比が4:6であるMAP（以下MAP46）を用い、標的蛋白質として国際公開公報WO2014/045621号に記載されている肺炎球菌表面蛋白質Ａ（PspA）の２つのクレードが融合した蛋白質（PspA融合蛋白質）を用いた（図１）。
　常法に従って、大腸菌にて遺伝子組み換えにより標的蛋白質を発現させ、標的蛋白質を含む大腸菌破砕液を作製した。実施例１で作製したLDH（アルミニウム含量約10mg/mL）と、大腸菌破砕液（全蛋白質含量約1.5mg/mL）とを等量混合し、撹拌後１時間放置した。LDHの代わりに、ハイドロキシアパタイト処理をしたサンプルをコントロールとした。ハイドロキシアパタイト処理は、塩濃度（PBS濃度）及びpHを変えて実験を行い、吸着能の確認を行った。塩濃度及びpHは図１に示す通りである。ハイドロキシアパタイトは、アミノ酸、タンパク質、脂質、糖と高い吸着性を示すことが知られている。このような特性を利用し、ハイドロキシアパタイトは、生体分子等の分離に用いるカラムクロマトグラフィの充填剤や余分な脂質や老廃物を吸着し除去することを目的とした化粧品等に利用されている。
　LDHによる処理又はハイドロキシアパタイト処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとして回収した。サンプルについてATTO社製のE-T/R1020L（10～20%）ゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、標的蛋白質の挙動を確認した。ゲルの各レーンには、全蛋白質の質量が等しくなるようにサンプルをアプライした。
　図１において、四角で囲った分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図１のサンプル番号２～１０はハイドロキシアパタイト処理を行った後の上清、サンプル番号１１はLDH処理を行った後の上清をアプライした。またサンプル番号１は、各処理を行う前のサンプルをアプライしたものである。いかなる塩濃度、pHであっても、ハイドロキシアパタイトでは、標的蛋白質のバンドとそれ以外の蛋白質のバンドの両方が検出され、標的蛋白質を選択的に吸着することができないことがわかった。一方、LDH処理した場合には、標的蛋白質のバンドがほとんど確認できず、それ以外の蛋白質のバンドが検出されたことから、LDHが標的蛋白質に対する選択的な吸着能を持つことがわかった。
（実施例３）
　実施例１で作製したLDHについて、金属の組成を変化させた場合の標的蛋白質の吸着能を確認した。本実施例ではLDHとしてMAP又はCAPを用い、標的蛋白質としてPspA融合蛋白質を用いた。
　実施例２と同様の手法により、標的蛋白質を含む大腸菌破砕液を調製し、MAP又はCAPと大腸菌破砕液を混合することによりLDH処理を行った。MAPのマグネシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）、CAPのカルシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）は、図２に示す通りである。
　図２において、矢印で示す分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図２の各レーンには、LDH処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとしてアプライした。なお、サンプル番号１は、LDHの代わりにCa3(PO4)2により処理を行ったものであり、サンプル番号１０は、LDHの代わりにAlPO4により処理を行ったものである。
　CAP（サンプル番号２～５）では、アルミニウム含量比率が上昇するにつれて、不純物のバンドが検出されるようになり、標的蛋白質と不純物とを分離可能となることがわかった。MAP（サンプル番号６～９）では、アルミニウム含量比率が上昇するにつれて標的蛋白質が吸着すること、不純物である低分子蛋白質は吸着しないことがわかった。MAPの場合は、マグネシウムとアルミニウムの含量比率が５：５～３：７の場合に、標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。陰イオンがリン酸であるリン酸系のLDHを用いてPspA融合蛋白質を精製できることが示された。
（実施例４）
　実施例１で作製したLDHについて、金属の組成を変化させた場合の標的蛋白質の吸着能について確認した。本実施例ではLDHとしてMAC又はCACを用い、標的蛋白質としてPspA融合蛋白質を用いた。
　MAP又はCAPの代わりに、MAC又はCACを用いた以外は、実施例３と同様の手法により実験を行った。MACのマグネシウムとアルミニウムの含量比率、CACのカルシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）は、図３に示す通りである。
　図３において、矢印で示す分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図３の各レーンには、LDH処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとしてアプライした。なお、サンプル番号１の精製前液とは、LDH処理を行う前のサンプルである。サンプル番号２は、LDHの代わりにCaCO3処理を行ったものである。
　CAC（サンプル番号３～７）の場合は、カルシウムとアルミニウムの含量比率が７：３の場合に標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。MAC（サンプル番号８～１２）の場合は、マグネシウムとアルミニウムの含量比率が９：１の場合に、標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。陰イオンが炭酸である炭酸系のLDHを用いて標的蛋白質であるPspA融合蛋白質を精製できることが示された。
（実施例５）
　実施例１で作製したLDHについて、標的蛋白質の吸着能を確認した。本実施例では、LDHとしてMAPを用い、標的蛋白質として、PspAクレード２であって他のクレードと融合していない蛋白質（PspA単抗原）を用いた。
　標的蛋白質としてPspA単抗原を用いた以外は、実施例２と同様の手法により、標的蛋白質を含む大腸菌破砕液を調製し、MAPと大腸菌破砕液を混合することによりLDH処理を行った。MAPのマグネシウムとアルミニウムの含量比率（モル比）は、図４に示す通りである。
　図４の各レーンには、LDH処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとしてアプライした。なお、サンプル番号１は、LDH処理を行う前のサンプルである。
　アルミニウム含量比率が大きいLDHは、標的蛋白質以外の蛋白質も吸着されてしまうことがわかった。マグネシウムとアルミニウムの含量比率が７：３のLDHは、標的蛋白質を選択的に吸着することがわかった。リン酸系のLDHを用いてPspA単抗原を精製できることが示された。
（実施例６）
 　実施例１と同様に、以下の表１に従ってLDHを作製した。LDHは、特許文献１に開示される方法に従って作製し、アルミニウム含量を確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例７）
　実施例６で作製したLDHを用いて日本脳炎ウイルス抗原の吸着能を確認した。LDH（アルミニウム含量500μg/mL）と、標的蛋白質である日本脳炎ウイルス含有液（蛋白質含量101μg/mL）とを等量混合し、撹拌して３時間放置した後、LDHに吸着されなかった上清中の蛋白質量を吸光度（波長280nm）で測定した。
　その結果を表２に示す。LDHは、日本脳炎ウイルス抗原に対する吸着能が高いことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例８）
　0.1mol/L　CaCl2・6H2Oの代わりに0.1mol/L　CaCl2・2H2Oを用いた以外は、実施例１と同様にしてLDH（MAP、CAP、MAC、CAC）を作製し、アルミニウム含量を確認した。
（実施例９）
　実施例８で作製したLDHについて、マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）由来の蛋白質への吸着能について確認した。本実施例ではLDHとしてMAP、CAP、MAC、又はCACを用い、標的蛋白質としてマイコプラズマ由来のP30蛋白質を用いた。
　マイコプラズマP30蛋白質を発現するプラスミドを常法に沿って大腸菌に導入し、標的蛋白質を発現させた。凍結させた大腸菌をPBS中に浮遊させて超音波により破砕した。破砕後、最大遠心加速度14310（×g）で15分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清に、硫酸アンモニウムを10%飽和となるように添加して、最大遠心加速度14310（×g）で15分間遠心分離を行った。遠心分離後の上清に、硫酸アンモニウムを30%飽和となるように添加して、最大遠心加速度14310（×g）で15分間遠心分離を行った。遠心分離後の沈殿物をPBSにて懸濁し、以下のLDHによる処理の精製前原料とした。
　実施例８で作製したLDH（アルミニウム含量約10mg/mL）と、精製前原料（全蛋白質含量約1.5mg/mL）とを等量混合し、撹拌後１時間放置した。LDHによる処理を行った後、遠心分離した上清をサンプルとして回収した。サンプルについてATTO社製のE-T/R1020L（10～20%）ゲルを用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、標的蛋白質の挙動を確認した。ゲルの各レーンには、全蛋白質量が等量となるようにサンプルをアプライした。
　結果を図５に示す。図５において、矢印で示す分子量のバンドが標的蛋白質に該当する。図５中、SMのレーンにはサイズマーカーを、未処理のレーンにはLDHによる処理を行っていない、精製前原料をアプライした。それ以外のレーンには、各レーンに示す金属組成のLDHで精製前原料を処理した後の上清をアプライした。
　LDHがMACの場合、アルミニウムとマグネシウムの含量比率が１：９～４：６のLDHでは、蛋白質の特異的な吸着は認められなかった。５：５のLDHでは僅かに不純物蛋白質の吸着が認められた。６：４～９：１のLDHでは、全ての蛋白質の吸着が認められた。
　LDHがMAPの場合、アルミニウムとマグネシウムの含量比率が１：９～５：５のLDHでは、アルミニウム含量が増加するとともに全ての蛋白質の吸着が認められた。６：４～９：１のLDHでは、標的蛋白質の吸着能が低くなり、不純物蛋白質の特異的な吸着が認められた。
　LDHがCACの場合、アルミニウムとカルシウムの含量比率が１：９～５：５のLDHでは、不純物蛋白質の吸着が認められた。６：４及び７：３のLDHでは、不純物蛋白質の特異的な吸着が認められた。８：２及び９：１で吸着が認められなかったのは、LDH量が少なく吸着が不十分であったためと考えられる。
　LDHがCAPの場合、アルミニウムとカルシウムの含量比率が１：９～３：７のLDHでは、不純物蛋白質の吸着能が僅かに認められた。４：６及び５：５のLDHでは、全ての蛋白質の吸着が認められた。６：４～９：１のLDHでは、標的蛋白質の吸着とともに、不純物蛋白質の強い吸着能が認められた。
　従って、LDHの組成を変動させることにより、標的蛋白質をLDHに特異的に吸着させることもできるが、逆に不純物蛋白質をLDHに特異的に吸着させて、標的蛋白質を精製することもできることが確認された。
　本発明の蛋白質の精製方法によれば、LDHを用いることにより、標的蛋白質を不純物から選択的に分離することができる。LDHは、M2+、M3+、An-の種類や比率を調節することにより、様々なLDHを合成して多様な吸着能を付与することが可能となる。したがって、本発明の蛋白質の精製方法は、様々な標的蛋白質の精製に応用できる。従来の蛋白質の精製方法では、標的蛋白質を選択的に分離することが困難であったため、複数回精製する必要があった。本発明の標的蛋白質の精製方法では、精製工程が減少し、効率良くかつ簡便に標的蛋白質の精製が可能となり、有用である。また、本発明の標的蛋白質の精製方法は、生体に害のない物質を用いることから、安全性に優れている。

Claims (11)

  1. 以下の一般式（Ｉ）で示す層状複水酸化物を用いて、標的蛋白質を精製する方法：
    一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O]
    （上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]）で示され、ｘは0.1～0.9であり、ｎは1～3であり、ｍは0～100である。）
  2. 以下の工程を含む、請求項１に記載の標的蛋白質を精製する方法：
    １）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と、層状複水酸化物とを接触させる工程；
    ２）層状複水酸化物と溶液とを分離する工程。
  3. 一般式（Ｉ）において、An-がPO4 3-, CO3 2-, OH-, F-, Cl-, Br-, NO3 -及び核酸からなる群より選択される少なくとも１種以上である、請求項１又は２に記載の標的蛋白質を精製する方法。
  4. 一般式（Ｉ）において、M2+がMg2+, Fe2+, Zn2+, Ca2+, Li2+, Ni2+, Co2+及び Cu2+からなる群より選択される少なくとも１種以上である、請求項１～３のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
  5. 一般式（Ｉ）において、M3+がAl3+, Fe3+, Mn3+及びCr3+からなる群より選択されるいずれか１種以上である、請求項１～４のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
  6. 一般式（Ｉ）において、An-がPO4 3-である、請求項１～５のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
  7. 標的蛋白質が、抗原又は抗体を含む、請求項１～６のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
  8. 標的蛋白質が、肺炎球菌ワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ジフテリアワクチン、百日咳ワクチン、破傷風ワクチン、ｂ型インフルエンザ菌ワクチン、及びＢ型肝炎ワクチンから選択される少なくとも１種以上のワクチンに含まれる成分を含む、請求項１～７のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法。
  9. 以下の工程を含む、請求項１～８のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法：
    １）標的蛋白質と不純物とを含む溶液と層状複水酸化物とを接触させ、層状複水酸化物に蛋白質を吸着させる工程；
    ２）層状複水酸化物と溶液とを分離する工程；
    ３）標的蛋白質を回収する工程。
  10. 請求項１～９のいずれかに記載の標的蛋白質を精製する方法を用いて、ワクチンを製造する方法。
  11. 以下の一般式（Ｉ）で示す層状複水酸化物を表面に担持した、標的蛋白質精製用担体：
    一般式（Ｉ）：[M2+ 1-xM3+ x(OH)2][An- x/n・mH2O]
    （上記一般式（Ｉ）において、M2+とM3+は各々２価と３価の金属であり、An-は層間陰イオンである。 ｘは[M3+]/（[M2+]＋[M3+]））で示され、ｘは0.1～0.9であり、ｎは1～3であり、ｍは0～100である。）
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