CN112638930A - 抗体或抗体样分子的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供能够从包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液中高效地去除杂质的方法。本发明的抗体或抗体样分子的纯化方法包括：用包含选自镁、钙及铝中的1种以上元素的水不溶性无机化合物对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理的工序。
Description
技术领域
本发明涉及从包含杂质的组合物中减少杂质并提高目标抗体或抗体样分子的纯度的方法。
背景技术
近年来，从生物体试样的提取或使用基因重组技术生产的抗体等有用蛋白质已经用于以医药品为代表的食品、工业用酶、吸附剂、传感器等很多的用途，其高效率的高纯度纯化成为了问题。杂质多数情况下对目标的有用蛋白质的功能造成影响、或者成为副作用的原因，为了确保有用蛋白质的有效性和安全性，需要将这些杂质除去，高度地进行纯化。例如，在以重组蛋白质、肽这样的有用蛋白质作为主要药物的生物医药品的领域中，在通过基因重组技术以动物细胞、植物细胞、细菌细胞作为宿主将目标的有用蛋白质进行重组表达后，进行高纯度纯化。培养重组动物细胞、植物细胞、细菌细胞而生产的有用蛋白质有分泌在培养上清中的蛋白质、在细胞内可溶性表达的蛋白质、在细胞内以包涵体的形式不溶性表达的蛋白质。培养上清中表达的有用蛋白质通过离心分离、膜处理而从宿主的动物细胞、植物细胞、细菌细胞、其片段、其它的不溶性成分中被分离，然后，通过色谱、膜分离工艺进行高纯度纯化。在细胞内可溶性表达的有用蛋白质通过将细胞溶解或破碎等方法进行提取，通过将不溶性成分离心分离、膜处理而去除后，通过色谱、膜分离工艺进行高纯度纯化。在细胞内不溶性表达的有用蛋白质通过将细胞溶解或破碎等方法进行提取后，从由通过将可溶性成分离心分离、膜处理而去除的残渣进行可溶化提取而得到的包含杂质的有用蛋白质溶液中，利用色谱、膜分离工艺进行高纯度纯化。
供于色谱、膜分离工艺的包含有用蛋白质的溶液包含来自于宿主的夹杂蛋白质、核酸、细胞、细胞器的膜片段及培养基成分等大量的杂质，因此对色谱、膜分离工艺的负担大，会导致色谱载体的吸附容量降低、分离能力降低、背压(back pressure)上升引起的处理速度降低、清洗、再生效率的降低引起的载体寿命降低。另外，在膜分离工艺中，也会导致每单位膜面积的处理容量降低、背压上升、处理速度降低、清洗、再生效率降低引起的载体寿命降低。大量杂质会对基于色谱、膜分离工艺的高纯度纯化造成很大的负担，因此，在这些处理前减少杂质对于后续工序的负担减小是非常重要的。
作为对包含杂质的有用蛋白质溶液进行处理而减少杂质的技术，已知有将多胺(非专利文献1)、壳聚糖(非专利文献2)、低pH下游离的2价阳离子(专利文献1)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDACMAC，非专利文献3)、核酸内切酶(非专利文献4)等水溶性的添加剂进行添加处理的方法、通过pH调整(非专利文献5)、热处理(专利文献2)将杂质沉淀去除的方法。
抗体等有用蛋白质的纯化通常在水体系中进行，因此，水溶性的添加剂在后续工序中的去除成为问题。此外，添加剂、其片段自身吸附于有用蛋白质等，其后续的去除工艺的构建困难，而且残留物的安全性、数值管理成为问题。例如，在有用蛋白质为医药品的情况下，从安全性的观点考虑，需要预先高度地进行纯化，美国食品药品监督管理局(Foodand Drug Administration)在Q3A指导原则中严格要求了残留杂质的管理。核酸内切酶可以在其它夹杂蛋白质等杂质去除时通过设定色谱的条件而容易地去除，因此是优异的。另一方面，核酸内切酶可以将DNA片段化而无效化，并且对于提高片段化的DNA的色谱、膜分离除去效率是有效的，但是，对于夹杂蛋白质等的除去没有效果，作为杂质去除方法是不足的。另外，对于pH处理、热处理而言，将目标的有用蛋白质的功能降低、变性、凝聚、分解的风险高，通过严密的工序参数的管理、处理而生成的目标产物来源的聚集体、片段及修饰体这样的杂质的去除成为新的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-508352号公报
专利文献2：日本特开昭63-275600号公报
非专利文献
非专利文献1：Peram T等、Biotechnol Prog,26(5):1322-1331
非专利文献2：Riske F等、J.Biotechnol,128(4):813-823
非专利文献3：McNerney T等、241st ACS National Meeting&Exposition,Anaheim,CA,BIOT-302
非专利文献4：D.W.Zabriskie等、Biotechnology and Bioengineering,Vol.32,100-104
非专利文献5：Hjelm等、FEBS.LETT.,1972,28:73-76
发明内容
发明要解决的问题
大多数上述现有技术为了纯化抗体等有用蛋白质而使用了水溶性高的添加剂，难以在后续工艺中从目标的有用蛋白质去除上述添加剂、其分解物，在残留物的管理等方面存在问题。另外，对于pH处理、热处理而言，有用蛋白质的功能降低、发生变性、凝聚、分解的风险高，产生了因严格的工序参数管理、处理而形成的目标产物来源的聚集体、片段及修饰体这样的杂质的去除的新问题，作为高纯度纯化前的粗纯化方法是有问题的。
因此，本发明的目的在于提供对于从抗体等有用蛋白质溶液中去除杂质有效且可减轻对随后的后续工艺的负担的添加剂、以及其利用方法。
解决问题的方法
本发明人等为了解决上述问题而进行了深入研究。其结果发现，通过在包含杂质的抗体或抗体样分子水溶液或悬浮液中添加特定的水不溶性无机化合物，不仅可以将目标的抗体或抗体样分子保持在水溶液侧而有效地减少杂质，而且水不溶性无机化合物可以通过自然沉降、离心、膜分离等而容易地从体系中分离，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种用于纯化抗体或抗体样分子的方法，该方法包括：
用包含选自镁、钙及铝中的1种以上元素的水不溶性无机化合物对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理的工序。
[2]根据上述[1]所述的方法，其中，所述水不溶性无机化合物为选自碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、磷酸镁、硫酸钙、以及氧化铝中的1种以上。
[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其进一步包括：
使所述水溶液或悬浮液与活性炭接触的工序。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述水溶液或悬浮液为包含抗体或抗体样分子的培养液。
[5]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述水溶液或悬浮液为将培养液进行离心处理或膜处理而得到的培养上清。
[6]根据上述[4]或[5]所述的方法，其中，所述培养液为产生抗体或抗体样分子的重组宿主细胞的培养液。
[7]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述水溶液或悬浮液为重组宿主细胞的破碎物或提取物。
[8]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述水溶液或悬浮液为将重组宿主细胞的破碎物或提取物进行离心或膜处理而得到的上清。
[9]根据上述[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，所述水溶液或悬浮液为生物体提取物。
[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗体样分子为含Fc蛋白质。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗体样分子为低分子化抗体。
[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的方法，其进一步包括：
用絮凝剂对所述水溶液或悬浮液进行处理的工序。
[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的方法，其进一步包括：
用核酸内切酶对所述水溶液或悬浮液进行处理的工序。
[14]根据上述[1]～[13]中任一项所述的方法，其包括：
对纯化后的抗体或抗体样分子进一步进行柱处理或膜过滤处理的工序。
发明的效果
根据本发明，可以通过使用特定的水不溶性无机化合物而从包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液中有效地去除杂质。本方法不仅可以单独制备粗纯化物，而且在与其它高度的纯化工艺组合的情况下，也可以减少后续的纯化工艺的负担。
附图说明
图1是示出使用了本发明和现有方法时的杂质量的降低效果的图表。
图2是示出作为水不溶性无机化合物的碱式碳酸镁的添加量与IgG浓度及作为杂质的宿主细胞蛋白(HCP)的残留量的关系的图表。
图3是示出作为水不溶性无机化合物的碱式碳酸镁的添加量与IgG浓度及作为杂质的DNA的残留量的关系的图表。
图4是示出各种水不溶性无机化合物单独或和活性炭的组合、与IgG浓度及作为杂质的HCP的残留量的关系的图表。
图5是示出各种水不溶性无机化合物单独或和活性炭的组合、与IgG浓度及作为杂质的DNA的残留量的关系的图表。
图6是示出作为水不溶性无机化合物的碱式碳酸镁及和抗体纯化用载体的组合、与IgG回收率及作为杂质的HCP的残留量的关系的图表。
图7是示出作为水不溶性无机化合物的碱式碳酸镁及和抗体纯化用载体的组合、与IgG回收率及作为杂质的DNA的残留量的关系的图表。
图8是示出作为水不溶性无机化合物的碱式碳酸镁及和抗体纯化用载体的组合、与载体清洗液中的作为杂质的HCP及DNA的量的关系的图表。
图9是示出对填充有碱式碳酸镁的柱通液前后的培养上清中的HCP浓度和IgG浓度的图表。
图10是示出对填充有碱式碳酸镁的柱通液前后的培养上清中的DNA浓度和IgG浓度的图表。
具体实施方式
本发明涉及通过用特定的水不溶性无机化合物对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理而去除杂质的抗体或抗体样分子的纯化方法。以下，分开工序对本发明方法进行说明，但本发明并不限定于以下的具体例。
1.含抗体/抗体样分子液体的制备工序
在本工序中，制备包含作为纯化对象的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液。本工序的实施是任意的，在已经得到了所述水溶液或悬浮液的情况等下，不必要实施本工序。水溶液是指，抗体或抗体样分子溶解于作为溶剂的水中且不包含不溶性成分的溶液，悬浮液是指，抗体或抗体样分子溶解于作为溶剂的水中、而且还包含细胞、其破碎物、细胞来源成分的凝聚物、凝聚蛋白质等不溶性成分的溶液。需要说明的是，不溶性成分可以分散在溶液中，也可以沉降。
在本发明中，作为纯化对象的“抗体或抗体样分子”只要是工业利用上有用的抗体或抗体样分子即可，除了具有多肽结构的功能性蛋白质、且分子内包含α螺旋、β折叠结构等二级结构的蛋白质以外，还包括具有糖链的蛋白质、经过糖修饰的蛋白质、经过磷酸化或酪氨酸化等修饰的蛋白质、金属配位的蛋白质。另外，除了天然存在的蛋白质、肽以外，还包括通过基因重组技术生产的物质、对其功能进行了改良的物质、仅由功能性部位构成的结构体、以及不同的功能部位的连接体、同一功能部位的连接体。另外，除了通过分子内的半胱氨酸残基的二硫键进行了分子内交联的物质、通过分子间的半胱氨酸残基的二硫键进行了分子间交联的物质、非共价键地包含亚基结构的物质以外，还包括通过化学修饰而连接的蛋白质、通过蛋白质的化学修饰、功能性分子的添加而赋予了功能的物质。
作为本发明中的抗体或抗体样分子，没有特别限定，可以列举：多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源抗体、嵌合抗体、单链抗体、重链抗体、多价抗体、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、Fc融合蛋白、双特异性抗体、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、二硫键Fv(sdFv)、Diabody、抗体样分子靶标肽(微抗体)等。在本发明中，作为这些抗体或抗体样分子，可以是免疫球蛋白、具有Fc部的Fc融合蛋白等含Fc蛋白质，也可以是上述Fab、F(ab’)、F(ab’)2、Fc、重链(H链)、轻链(L链)、单链Fv(scFv)、sc(Fv)2、二硫键Fv(sdFv)、单链抗体、重链抗体、多价抗体、双特异性抗体、Diabody、抗体样分子靶标肽(微抗体)这样的低分子化抗体，均可以作为优选的对象。
在本发明中，作为用特定的水不溶性无机化合物进行处理的“包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液”，没有特别限定，只要是含有上述抗体或抗体样分子、且包含除此以外的夹杂物作为杂质的水溶液或悬浮液即可，没有特别限定，可以列举例如：培养液、培养上清、使作为培养物的细胞、其破碎物悬浮于水中的混合物、其提取物、生物体提取物等。另外，作为水溶液、悬浮液，不妨害共存的有机溶剂的存在。夹杂物只要是作为纯化对象的抗体或抗体样分子以外的化合物即可，没有特别限制，可以列举例如：宿主来源的蛋白质、核酸。
作为上述培养的细胞，可以是天然来源的细胞，优选为重组宿主细胞。这里，宿主只要是为了对抗体或抗体样分子进行重组生产而使用的动物、植物或细菌的细胞，且是被包含编码抗体或抗体样分子的DNA的表达载体、基因片段转化、并表达导入的DNA而可以生产有用蛋白质的动植物来源的细胞或微生物即可，没有特别限制。本发明中的基因重组体是指，导入了编码目标的抗体或抗体样分子的氨基酸序列的碱基序列、以及包含可发挥作用地连接于该碱基序列且能够在宿主中发挥功能的启动子的表达载体或基因片段、并进行了转化的宿主细胞。对于抗体或抗体样分子而言，无论是暂时性表达还是组成型表达，只要重组表达有用蛋白质即可，没有特别限制。
作为可利用的动物来源的细胞(动物细胞)，可以列举例如：HEK、HeLa等贴壁类的细胞；293-F、293-FT、Jurkat等悬浮类的细胞；CHO、MC等小鼠来源的细胞；Sf-9、Sf-21等由草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)建立的Sf株、蚕等昆虫细胞(Nature,315,592-594(1985))。其中，优选为CHO细胞或HEK细胞。
作为可利用的植物，开发了在油菜、玉米、马铃薯、香蕉等植物中大量表达异种蛋白质的体系，也可以适宜地利用这些植物的细胞。
作为可利用的微生物，可以列举例如：埃希氏菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷氏菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、短芽孢杆菌(Brevibacillus)属、链球菌(Streptococcus)属、以及乳酸杆菌(Lactobacillus)属等开发了宿主载体系统的细菌；红球菌(Rhodococcus)属及链霉菌(Streptomyces)属等开发了宿主载体系统的放线菌；酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、子囊菌酵母(Yarrowia)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、以及念珠菌(Candida)属等开发了宿主载体系统的酵母；链孢霉菌(Neurospora)属、曲霉菌(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、以及木霉(Trichoderma)属等开发了宿主载体系统的霉菌等。这些微生物可以是革兰氏阴性微生物，也可以是革兰氏阳性微生物，没有特别限定，作为革兰氏阴性菌，可以举出大肠杆菌为优选例子，作为革兰氏阳性菌，可以举出酵母或短芽孢杆菌族细菌为优选例子。
在本发明中，可以优选将上述这样的重组宿主细胞的培养液、重组宿主细胞的破碎物或提取物、将它们离心或膜处理而得到的培养上清用作“包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液”。这些重组宿主细胞的培养液、重组宿主细胞的破碎物或提取物、将它们离心或膜处理而得到的培养上清、其它的来自生物体试样的提取物中除了包含作为目标的抗体或抗体样分子以外，大多还包含不必要的杂质。作为这样的杂质，可以列举例如：细胞、细胞碎片、细胞器的膜片段、夹杂蛋白质及其片段、聚集体、蛋白质的聚集体、脂质(例如细胞壁物质)、核酸(例如染色体DNA或染色体外DNA)、核糖核酸(t-RNA或mRNA)、培养基成分、或者它们的组合等。例如，在抗体或抗体样分子为重组蛋白质的情况下，根据宿主的种类，重组蛋白质表达的部位是不同的，例如，有分泌表达至细胞外的宿主，也有在细胞内表达并积累的宿主。革兰氏阴性菌大多可以在细胞内膜与外膜之间的细胞周质成分积累目标抗体或抗体样分子。在细胞周质成分或细胞内表达抗体或抗体样分子的宿主的情况下，需要通过将宿主细胞的膜成分溶解或破碎，从而提取目标抗体或抗体样分子。在抗体或抗体样分子以包涵体等不溶性成分的形式在宿主内表达的情况下，需要在通过将宿主细胞离心或膜分离而回收后，将宿主细胞溶解或破碎，并对可溶性成分进行离心或膜分离，从而从去除的残渣中提取抗体或抗体样分子。
作为上述水溶液及悬浮液的溶剂，除了水以外，还可以使用缓冲液等水溶液。作为缓冲液，可以列举例如：包含磷酸、柠檬酸、2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid(MES)(2-(N-吗啉基)乙磺酸)、Bis-Tris、N-(2-Acetamido)iminodiacetic acid(ADA)(N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二乙酸)、Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid)(PIPES)(哌嗪-1,4-二乙磺酸)、N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid(ACES)(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid(MOPSO)(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)、N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid(BES)(N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸)、3-(N-morpholino)propanesulfonic acid(MOPS)(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸)、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonicacid(TES)(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid(HEPES)(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基乙磺酸)、Triethanolamine(三乙醇胺)、3-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]propanesulfonicacid(EPPS)(3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸)、Tricine(三(羟甲基)甲基甘氨酸)、Tris、Glycylglycine(双甘氨肽)、Bicine(N,N-二羟乙基甘氨酸)、N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic acid(TAPS)(N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸)的缓冲液、以及杜氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲生理盐水。用水不溶性无机化合物对包含杂质的抗体或抗体样分子水溶液或悬浮液进行处理时的pH优选为4以上、且12以下，更优选为5以上、且10以下。
2.基于水不溶性无机化合物的处理工序
在本工序中，利用包含选自镁、钙及铝中的1种以上元素的水不溶性无机化合物对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理，由此，使作为纯化对象的抗体或抗体样分子以外的杂质选择性地吸附于水不溶性无机化合物，将抗体或抗体样分子纯化。需要说明的是，“纯化”是指，相对于与水不溶性无机化合物接触前的水溶液或悬浮液中的抗体或抗体样分子，杂质的比例减少。另外，“处理”是指，使包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液与水不溶性无机化合物接触。以下，有时将包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液简称为“含抗体液体”。
在本公开中，水不溶性是指，将无机化合物的粉末加入纯化水中，在20±5℃下每5分钟强烈振荡30秒钟进行混合，此时在30分钟以内溶解的程度，具体而言，是指溶解无机化合物1g所需要的纯化水的量为100mL以上。
水不溶性无机化合物是包含选自镁、钙及铝中的1种以上元素的化合物，可以列举它们的不溶性碳酸盐、不溶性硫酸盐、不溶性磷酸盐、氧化物等，优选为选自碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、硫酸钙、磷酸镁、以及氧化铝中的1种以上，更优选为水不溶性镁盐。例如，也可以适宜地使用作为氢氧化镁与碳酸镁的混合物的碱式碳酸镁。其中，磷酸钙等除磷酸镁以外的磷酸盐的水溶性较高、存在吸附目标的抗体或抗体样分子的隐患，因此不优选。
特别是碳酸镁作为用于胃/十二指肠溃疡、胃炎(包括急/慢性胃炎、药物性胃炎)、上部消化道功能障碍(包括神经性厌食症、所谓的胃下垂症、胃酸过多症)、便秘症的医疗用医药品，进行1天数g的给药，已确认了安全性，此外，可以容易地通过静置沉淀、离心、膜分离而去除，另外，微量的泄漏物也可以通过膜分离、色谱处理而容易地从目标抗体或抗体样分子中分离去除，从这一点考虑也是优异的。
水不溶性无机化合物的大小可以适当调整，例如，可以使平均粒径为0.1μm以上、且1000μm以下。该平均粒径为1000μm以下时，水不溶性无机化合物的比表面积足够大，可以更高效地吸附杂质，另外，为0.1μm以上时，不需要用于粉碎的过多的能量。另外，从填充于柱中时等的操作性的观点考虑，作为上述平均粒径，优选为1μm以上。需要说明的是，在本公开中，平均粒径是通过激光衍射粒度分布测定装置测定的，作为平均粒径的基准，有体积基准、重量基准、数量基准等，优选为体积基准。
水不溶性无机化合物的用量可以根据含抗体液体的浓度等而调整，例如，相对于含抗体液体100mL，可以使用0.1g以上、且20g以下的水不溶性无机化合物。作为该比例，优选为15g/100mL以下。另外，相对于含抗体液体，可以使用0.1质量％以上、且20质量％以下的水不溶性无机化合物，作为该比例，优选为1质量％以上、且15质量％以下。
通常，作为将包含抗体或抗体样分子的培养液等和培养中使用的宿主细胞或宿主细胞的碎片进行分离的方法，通过将生物体试样、培养液或提取物静置或利用离心分离、死端过滤、错流过滤、声波分离(acoustic wave separation)进行处理后，回收澄清液体，由此可以与宿主细胞或宿主细胞的碎片进行分离(澄清化工序)。本发明的纯化方法可以与上述清澄化工序的处理组合使用，或者适当地单独使用。需要说明的是，这些基于死端过滤、错流过滤、声波分离的处理及本发明的纯化可以在对该培养液或提取物进行离心分离后进行，也可以直接对该培养液或提取物进行处理。
上述死端过滤是指进料溶液相对于膜垂直地移动的过滤方式，滤液通过膜。根据死端过滤，作为将包含抗体或抗体样分子的溶液回收的方法，可以列举：使用了瓶顶过滤器(bottle top filter)、离心式过滤器单元的精密过滤或超滤，但并不限定于该方法。
上述错流过滤是指进料溶液与膜表面平行地移动的过滤方式，滤液通过膜。根据错流过滤，作为将包含抗体或抗体样分子的溶液回收的方法，可以列举使用了盒式膜或中空元件的精密过滤或超滤，但并不限定于该方法。
上述基于声波分离的处理是指，通过对进料溶液照射驻波，使不溶物集中于驻波的波节的位置，使其沉降，从而将进料溶液中的不溶物与上清分离的方法。根据声波分离，作为将包含抗体或抗体样分子的溶液回收的方法，可以举出通过声波分离器对包含抗体或抗体样分子的溶液进行处理的方法，但并不限定于该方法。
作为进行上述死端过滤时的瓶顶过滤器，可以列举：带有Nalgene Rapid-FlowPES膜的灭菌一次性瓶顶过滤器0.45μm(Thermo Scientific公司)、带有Nalgene Rapid-Flow PES膜的灭菌一次性瓶顶过滤器0.2μm(Thermo Scientific公司)、IWAKI瓶顶过滤器500mL PES 0.22μm 33口径(AGC TECHNO GLASS/IWAKI公司)、Bottle top vacuum filter0.22μm(Corning公司)、Bottle top vacuum filter 0.45μm(Corning公司)等，但并不限定于此。
作为进行上述死端过滤时的离心式过滤器单元，可以列举：Vivaspin 20-3K(GEHealthcare Life Sciences公司)、Vivaspin 20-5K(GE Healthcare Life Sciences公司)、Vivaspin 20-10K(GE Healthcare Life Sciences公司)、Vivaspin 20-30K(GEHealthcare Life Sciences公司)、Vivaspin 20-50K(GE Healthcare Life Sciences公司)、Vivaspin 20-100K(GE Healthcare Life Sciences公司)、Amicon Ultra-15 3kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Amicon Ultra-15 10kDa(MERCK MILLIPORE公司)、AmiconUltra-15 30kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Amicon Ultra-15 50kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Amicon Ultra-15 100kDa(MERCK MILLIPORE公司)等，但并不限定于此。
作为进行上述错流过滤时的盒式膜，可以列举：PelliconXL 50精密过滤组件0.65μm(MERCK MILLIPORE公司)、PelliconXL 50精密过滤组件0.22μm(MERCK MILLIPORE公司)、PelliconXL 50精密过滤组件0.45μm(MERCK MILLIPORE公司)、PelliconXL 50精密过滤组件0.10μm(MERCK MILLIPORE公司)、Kvick Start 50cm2,5KD,PES(GE Healthcare LifeSciences公司)、Kvick Start 50cm2,10KD,PES(GE Healthcare Life Sciences公司)、Kvick Start 50cm2,30KD,PES(GE Healthcare Life Sciences公司)、Kvick Start50cm2,50KD,PES(GE Healthcare Life Sciences公司)、Kvick Start 50cm2,100KD,PES(GE Healthcare Life Sciences公司)、Pellicon2 Cassette-Biomax(R)HydrophilicPolyethersulfone Membrane·A Screen5kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Pellicon2Cassette-Biomax(R)Hydrophilic Polyethersulfone Membrane·A Screen 8kDa(MERCKMILLIPORE公司)、Pellicon2 Cassette-Biomax(R)Hydrophilic PolyethersulfoneMembrane·A Screen10kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Pellicon2 Cassette-Biomax(R)Hydrophilic Polyethersulfone Membrane·A Screen 30kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Pellicon2 Cassette-Biomax(R)Hydrophilic Polyethersulfone Membrane·AScreen50kDa(MERCK MILLIPORE公司)、Pellicon2 Cassette-Biomax(R)HydrophilicPolyethersulfone Membrane·A Screen 100kDa(MERCK MILLIPORE公司)等，但并不限定于此。
作为进行上述错流过滤时的中空纤维，可以列举：MidGee Cartridge，0.1micron(GE Healthcare Life Sciences公司)、MidGee Cartridge,0.2micron(GE HealthcareLife Sciences公司)、MidGee Cartridge,0.45micron(GE Healthcare Life Sciences公司)、MidGee Cartridge,0.65micron(GE Healthcare Life Sciences公司)、MidGeeCartridge,1kD(GE Healthcare Life Sciences公司)、MidGee Cartridge,3kD(GEHealthcare Life Sciences公司)、MidGee Cartridge,10kD(GE Healthcare LifeSciences公司)、MidGee Cartridge,30kD(GE Healthcare Life Sciences公司)、MidGeeCartridge,50kD(GE Healthcare Life Sciences公司)、MidGee Cartridge,100kD(GEHealthcare Life Sciences公司)等，但并不限定于此。
作为上述声波分离器，可以举出Cadence Acoustic Separator(PALL公司)等，但并不限定于此。
含抗体液体与水不溶性无机化合物的接触方法可以适当选择。例如，可以在含抗体液体中加入水不溶性无机化合物，进行振荡、搅拌。此时的温度可以为常温，具体而言，可以设为0℃以上、且40℃以下。作为该温度，优选为1℃以上，更优选为10℃以上或15℃以上，而且优选为30℃以下，更优选为25℃以下。另外，作为接触时间，可以设为1秒钟以上、且10小时以下。
可以在接触后，通过离心分离、过滤等将水不溶性无机化合物从含抗体液体中分离。此时，抗体或抗体样分子主要分散在液体成分中，除此以外的杂质全部或一部分主要被吸附于水不溶性无机化合物。另外，虽然有时抗体或抗体样分子的一部分被吸附于水不溶性无机化合物，而除此以外的杂质的一部分溶解在液体成分中，但至少可以减少液体成分中的杂质的总量，将液分中的抗体或抗体样分子浓缩。
通过本工序被吸附于水不溶性无机化合物的杂质只要是抗体或抗体样分子以外的化合物即可，没有特别限制，可以列举例如：聚集的抗体或聚集的抗体样分子、宿主细胞夹杂物、以及细胞培养夹杂物。作为宿主细胞夹杂物，可以列举：来自宿主细胞的核酸、质粒、来自宿主细胞的蛋白质。作为细胞培养夹杂物，可以列举：培养基成分、血清白蛋白、以及其它血清蛋白质、转染用的质粒DNA。
另外，可以将水不溶性无机化合物填充于柱中，并使含抗体液体流过，从而使抗体或抗体样分子以外的杂质吸附于水不溶性无机化合物。在该情况下，可以同时进行杂质的吸附、和水不溶性无机化合物与液体成分的分离。柱中的水不溶性无机化合物的填充量、含抗体液体的流速优选在杂质被充分吸附于水不溶性无机化合物的范围进行调整。
3.与活性炭的接触工序
在本工序中，使包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液与活性炭接触。本工序可以在上述的处理工序之前实施，也可以在之后实施，或者还可以将水不溶性无机化合物和活性炭组合使用并同时实施。其中，本工序的实施是任意的。
活性炭是指将木炭、椰壳等烧成而使微孔发达形成多孔的物质，吸附性能优异。活性炭的通常的比表面积为800m2/g以上、且2500m2/g以下左右。
作为活性炭，可以举出矿物类活性炭及植物类活性炭。作为矿物类活性炭，可以举出例如，煤类活性炭、石油类活性炭。作为植物类活性炭，可以列举例如，木质类活性炭、椰壳活性炭，优选可举出木质类活性炭。
活性炭的原料只要是碳质的物质即可，没有特别限制，可以列举例如：锯屑、木炭、素灰(素灰)、草炭、泥炭或木材片等木质；椰壳；褐煤、褐炭、无烟炭等煤炭；石油沥青；油碳(oil carbon)；人造丝、丙烯腈、酚醛树脂等有机化合物。
活性炭的制造方法没有特别限制，可以列举例如：在高温下向原料中添加氯化锌或磷酸等并在高温下进行碳化反应的药液赋活法、在高温下使碳化后的原料及水蒸气、二氧化碳、空气或燃烧气体等气体发生反应的气体赋活法。优选可以列举：氯化锌赋活化法、使用了磷酸的酸赋活化法、以及水蒸气赋活化法等。
活性炭的形状没有特别限制，可以列举例如：粉碎炭、颗粒炭、球状炭、以及粒状炭等粒状活性炭；纤维、布等纤维状活性炭；片状、成形体、以及蜂窝状等特殊成形活性炭；以及粉末活性炭。
赋予了正电荷或负电荷的活性炭、以及用聚甲基丙烯酸羟基乙酯(PHEMA)、肝素(ヘパリン)、纤维素、或聚氨酯等表面修饰剂进行了修饰的活性炭也包含于本发明的纯化方法所使用的活性炭。另外，通过溶胶-凝胶法制作的碳凝胶也包含于本发明的纯化方法所使用的活性炭。作为溶胶-凝胶法所使用的原料，可以列举例如：苯酚、三聚氰胺、间苯二酚、或甲醛等。
活性炭的平均微孔径没有特别限定，通常为0.1nm以上、且20nm以下，优选为0.5nm以上、且5.0nm以下，更优选为2.0nm以上、且5.0nm以下，更进一步优选为3.0nm以上、且5.0nm以下。活性炭的平均微孔径可以通过氮吸附等温吸附曲线使用BJH法计算。
作为本发明的使用活性炭的纯化方法的方式，没有特别限定，可以列举例如：分批法、膜处理法或柱色谱法等，可以根据各种方式而选择适当的活性炭的形状。根据需要，也可以以将活性炭封入多孔性聚合物或凝胶而成的粒子等的形态、使用聚丙烯或纤维素等支撑剂或纤维等而将活性炭吸附、固定或成型而成的膜或盒等形态来使用。
作为包含活性炭的膜或盒，具体可以列举例如：CUNO活性炭过滤器盒、Zeta Plus活性炭过滤器盒(Sumitomo 3M公司制造、CUNO及Zeta Plus为注册商标)；Millistak+活性炭过滤器(Merck Millipore公司制造、Millistak为注册商标)；SUPRA AKS1过滤器、AKS1过滤器、Stax(商标)AKS1(以上为PALL公司制造)；ADALL(UNITIKA公司制造)；K Filter(注册商标)、活性炭片(以上为东洋纺株式会社制造)；Hemax(可乐丽株式会社制造)；Hemosova(注册商标)(Asahi Kasei Medical公司制造)；Hemocolumn(TERUMO公司制造)；或者Heselus(帝人株式会社制造)等，但并不限定于此。其中，作为包含木质类的活性炭的膜或盒，可以列举例如：Zeta Plus活性炭过滤器盒(Sumitomo 3M公司制造、Zeta Plus为注册商标)；SUPRA AKS1过滤器、AKS1过滤器、或者Stax(商标)AKS1(以上为PALL公司制造)等。
使用的活性炭的填充密度、粒度、硬度、干燥减重、灼烧残渣、比表面积或微孔容积等也可以适当选择。
活性炭的用量可以根据含抗体液体的浓度等而调整，例如，相对于含抗体液体100mL，可以使用0.5g以上、且5g以下的活性炭。
与水不溶性无机化合物的情况相同，含抗体液体与活性炭的接触方法可以在含抗体液体中加入活性炭进行振荡或搅拌，也可以将活性炭填充于柱中。在同时进行本工序和上述处理工序的情况下，可以将水不溶性无机化合物和活性炭混合而使用。
4.基于絮凝剂的处理工序
在本工序中，用絮凝剂对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理。本工序可以在基于水不溶性无机化合物的处理工序和/或与活性炭的接触工序之前实施，也可以在之后实施，或者还可以将水不溶性无机化合物和/或活性炭和絮凝剂组合使用并同时实施。其中，本工序的实施是任意的。
作为上述絮凝剂(flocculants)，可以列举：辛酸、多胺、2价的阳离子、聚醚亚胺、壳聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、pDACMAC等。作为2价的阳离子，例如为Ca2 +、Mg2+、Cu2+、Co2+、Mn2+、Ni2+、Be2+、Sr2+、Ba2+、Ra2+、Zn2+、Cd2+、Ag2+、Pd2+、Rh2+，这些2价阳离子可以以游离状态使用，或者以盐酸盐、硫酸盐、柠檬酸盐等的形式使用。
絮凝剂的用量可以通过含抗体液体的浓度等进行调整，例如，在絮凝剂为多胺或或聚醚亚胺的情况下，可以使用0.01w/v％以上、且10w/v％以下的絮凝剂，更优选可以使用0.1w/v％以上、且1w/v％以下的絮凝剂。在絮凝剂为辛酸、壳聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇或聚乙烯基吡咯烷酮的情况下，可以使用0.01w/v％以上、且10w/v％以下的絮凝剂，更优选可以使用1w/v％以上、且5w/v％以下的絮凝剂。在絮凝剂为pDACMAC的情况下，可以使用0.01w/v％以上、且0.1w/v％以下的絮凝剂，更优选可以使用0.1w/v％以上、且0.5w/v％以下的絮凝剂。在絮凝剂为2价的阳离子的情况下，可以添加使2价的阳离子浓度为1mM以上、且100mM以下的量，更优选可以添加使2价的阳离子浓度为2mM以上、且50mM以下的量。
与水不溶性无机化合物的情况相同，含抗体液体与絮凝剂的接触方法可以在含抗体液体中加入絮凝剂进行振荡或搅拌，也可以将絮凝剂填充于柱中。在同时进行本工序和基于水不溶性无机化合物的处理工序和/或与活性炭的接触工序的情况下，可以将絮凝剂与水不溶性无机化合物和/或活性炭混合而使用。
5.基于核酸内切酶的处理工序
在本工序中，用核酸内切酶对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理。本工序可以在上述各工序之前实施，也可以在之后实施，或者还可以将选自水不溶性无机化合物、活性炭、絮凝剂及絮凝剂中的1种以上与核酸内切酶组合使用并同时实施。其中，本工序的实施是任意的。
核酸内切酶是DNA的分解酶之一，在碱基序列的中心部也具有分解的功能，例如，作为市售品，可以列举：Benzonase(MILLIPORE公司制造)、Kaneka endonuclease(株式会社钟化制造)。
核酸内切酶的用量可以通过含抗体液体的浓度等进行调整，例如，相对于含抗体液体，优选为10U/mL以上，更优选为100U/mL以上。另一方面，上限没有特别限制，优选为10,000U/mL以下。
6.其它纯化工序
以上的工序可以适宜地使用，而不限于以下所示的膜、柱处理这样的通常的抗体或抗体样分子的纯化工序的前段或后段，在膜、柱处理的前段进行以上工序的情况下，可以期待可抑制色谱载体的吸附容量降低、分离性能降低、背压上升所导致的处理速度降低、清洗、再生效率的降低所导致的载体寿命降低，另外，在膜过滤工艺中，也可以可期待抑制每单位膜面积的处理容量降低、背压上升、处理速度减少、清洗、再生效率的降低所导致的载体寿命降低。即，将通过以上工序纯化的抗体或抗体样分子进一步进行柱处理或膜过滤处理也是本发明的一个优选方式，换言之，也可以使用本发明的纯化方法作为柱处理、膜过滤处理的前处理。
对于以上的工序、特别是上述处理工序而言，特别是作为用于膜处理、柱处理的前处理法，可以可期待抑制色谱载体的吸附容量降低、分离性能降低、背压上升所导致的处理速度的降低、清洗、再生效率的降低所导致的载体寿命降低，另外，在膜分离工艺中，也可以可期待抑制每单位膜面积的处理容量降低、背压上升、处理速度降低、清洗、再生效率降低所导致的载体寿命降低，在这一点上是优异的。另外，本发明中使用的水不溶性无机化合物是水不溶性的添加剂，可以通过自然沉降、离心或膜分离而容易地去除，此外，微量泄漏的成分也可以通过膜分离工艺、色谱工艺而容易地去除，而且也没有泄漏物的副作用等隐患，在工业上是非常优异的。
含抗体液体可以通过色谱等柱处理进行纯化。作为使用的色谱法，只要是能够将目标的抗体或抗体样分子进行回收纯化的方法即可，没有特别限定，可以列举：阴离子交换色谱法、阳离子交换色谱法、疏水色谱法、羟基磷灰石色谱法、混合模式色谱法、亲和色谱法这样的色谱法，这些色谱法可以单独使用，也可以组合使用。以上的工序、特别是上述处理工序可以在上述色谱工序的前段或后段适宜地使用。
上述阴离子交换色谱法所使用的阴离子交换树脂只要显示出阴离子交换作用即可，没有限定。作为阴离子交换树脂，可以列举：Capto Q(GE Healthcare Life Sciences公司)、Capto DEAE(GE Healthcare Life Sciences公司)、Capto Q ImpRes(GE HealthcareLife Sciences公司)、Capto Q Sepharose High Performance(GE Healthcare LifeSciences公司)、RESOURCE Q(GE Healthcare Life Sciences公司)、SOURCE 30Q(GEHealthcare Life Sciences公司)、YMC BioPro Q(YMC公司)、YMC BioPro DA(YMC公司)、TOYOPEARL SuperQ-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL GigaCapQ-650(TOSOH公司)、TOYOPEARLDEAE-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL GigaCap DEAE-650(TOSOH公司)、Cellufine MAX Q-r(JNC公司)、Cellufine MAX Q-h(JNC公司)、Cellufine MAX DEAE(JNC公司)等，但并不限定于此。
上述阳离子交换色谱所使用的阳离子交换树脂只要显示出阳离子交换作用即可，没有限定。作为阳离子交换树脂，可以列举：Capto S(GE Healthcare Life Sciences公司)、Capto SP ImpRes(GE Healthcare Life Sciences公司)、SP Sepharose HighPerformance(GE Healthcare Life Sciences公司)、RESOURCE S(GE Healthcare LifeSciences公司)、SOURCE 30S(GE Healthcare Life Sciences公司)、YMC BioPro S(YMC公司)、YMC BioPro CM(YMC公司)、TOYOPEARL SP-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL GigaCap S-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL CM-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL GigaCap CM-650(TOSOH公司)、Cellufine MAX S-r(JNC公司)、Cellufine MAX S-h(JNC公司)、Cellufine MAX CM(JNC公司)等，但并不限定于此。
上述疏水色谱所使用的疏水色谱树脂只要显示出疏水性相互作用即可，没有限定。作为疏水色谱树脂，可以列举：Phenyl Sepharose High Performance(GE HealthcareLife Sciences公司)、Buthyl Sepharose High Performance(GE Healthcare LifeSciences公司)、Phenyl Sepharose 6Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司)、Buthyl Sepharose 6Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司)、Octyl Sepharose4Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司)、Buthyl Sepharose 4Fast Flow(GEHealthcare Life Sciences公司)、Macro-Prep HIC(Bio-Rad Laboratories公司)、TOYOPEARL Ethyl-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL PPG-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL Phenyl-650(TOSOH公司)、TOYOPEARL Buthyl-650(TOSOH公司)、Cellufine MAX Phenyl(JNC公司)、Cellufine MAX Buthyl(JNC公司)、Cellufine MAX Phenyl LS(JNC公司)等，但并不限定于此。
另外，作为羟基磷灰石色谱所使用的羟基磷灰石树脂，可以列举：CeramicHydroxyapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、Ceramic Fluoloapatite(Bio-RadLaboratories公司)、MPC Ceramic HydroxyFluoloapatite(Bio-Rad Laboratories公司)、HA Ultrogel(PALL公司)等，但并不限定于此。
另外，混合模式色谱所使用的树脂只要是显示出2种以上不同的相互作用的混合物即可，没有特别限定。作为混合模式色谱用树脂，可以列举：Capto MMC(GE HealthcareLife Sciences公司)、Capto Adhere(GE Healthcare Life Sciences公司)、Eshumuno HCX(MERCK MILLIPORE公司)等，但并不限定于此。
另外，亲和色谱所使用的树脂只要对吸附对象物质显示出亲和性即可，没有特别限定。作为亲和色谱用树脂，可以列举：KANEKA KanCapA(株式会社钟化)、KANEKA KanCapA3G(株式会社钟化)、KANEKA KanCapG(株式会社钟化)、KANEKA KanCapL(株式会社钟化)、MabSelect(GE Healthcare Life Sciences公司)、MabSelect Xtra(GE Healthcare LifeSciences公司)、MabSelect SuRe(GE Healthcare Life Sciences公司)、MabSelect SuReLX(GE Healthcare Life Sciences公司)、MabSelect SuRe pcc(GE Healthcare LifeSciences公司)、MabSelect PrismA(GE Healthcare Life Sciences公司)、Protein GSepharose 4Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司)、KappaSelect(GEHealthcare Life Sciences公司)、LamdaFabSelect(GE Healthcare Life Sciences公司)、Capto L(GE Healthcare Life Sciences公司)、Glutathione Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences公司)、GSTrap 4B(GE Healthcare Life Sciences公司)、Glutathione Sepharose 4B(GE Healthcare Life Sciences公司)、IgG Sepharose 6FastFlow(GE Healthcare Life Sciences公司)、TOYOPEARL AF-rProteinA-650F(TOSOH公司)、TOYOPEARL AF-rProteinA-HC650F(TOSOH公司)、TOYOPEARL AF-rProteinL-650F(TOSOH公司)、TOYOPEARL AF-Red-650M(TOSOH公司)、TOYOPEARL AF-Chelate-650M(TOSOH公司)、Amsphere A3(JSR LIFE SCIENCES公司)等，但并不限定于此。
抗体或抗体样分子被纯化后，可以减少溶剂量而将抗体或抗体样分子浓缩、或交换溶剂等。
杂质可以在任意阶段使用吸光度分析法、电泳法、HPLC法等进行定量，此外也可以利用市售的检测试剂盒进行定量。例如，可以使用CHO HCP ELISA试剂盒(Cygnus公司制造)对来自CHO细胞的宿主来源蛋白质进行定量。在市售的检测试剂盒中没有期望的夹杂蛋白质的检测试剂盒的情况下，可以通过对鸡等动物免疫夹杂蛋白质来制备期望的检测体系。另外，DNA等杂质可以通过qPCR等方法进行定量。
本申请基于2018年8月31日提出申请的日本专利申请第2018-163228号要求优先权的利益。2018年8月31日提出申请的日本专利申请第2018-163228号的说明书的全部内容作为参考引入本申请。
实施例
以下，列举实施例对本发明更具体地进行说明，但本发明并不受下述实施例的限制，当然也可以在能够符合本发明主旨的范围适当进行变更而实施，这些均包含于本发明的技术范围。另外，对于本实施例所使用的试剂，在没有特别说明的情况下，使用了市售品。
实施例1：使用了碱式碳酸镁的来自动物细胞的培养液的处理
在包含0.025mol/mL磷酸钠的缓冲液(pH7.0)中添加10wt％的碱式碳酸镁，使其分散，制作了碱式碳酸镁分散液。向该碱式碳酸镁分散液加入相同量的包含单克隆抗体(IgG)的来自动物细胞的培养液，充分搅拌后，在25℃的培养箱中静置1小时。然后，以15,000rpm、15℃、10分钟的条件对处理后的溶液进行离心分离，回收了上清。
比较例1：使用了聚二烯丙基二甲基氯化铵的来自CHO的培养液的处理
加入了作为公知絮凝剂的0.01％的聚二烯丙基二甲基氯化铵(pDACMAC)来代替碱式碳酸镁，除此以外，与实施例1同样地进行了操作。
试验例1：抗体浓度、DNA及宿主细胞蛋白(HCP)含量的测定
通过以下所示的方法对处理前的培养上清、以及实施例1及比较例1的溶液中的IgG的浓度及作为杂质的DNA和宿主细胞蛋白(HCP)含量进行定量。
IgG浓度通过proteinA色谱进行了评价。在GE HEALTHCARE公司制造的色谱系统AKTA explorer 10S中安装作为proteinA亲和柱的TOSOH公司制造的TSKgel SuperSW mAb，使用包含0.02mol/mL磷酸钠及0.01mol/mL硫酸钠的缓冲液(pH6.7)，在室温下以流速0.7ml/min流过柱，向其中添加评价样品50μL，将作为清洗液的包含0.02mol/mL磷酸钠及0.01mol/mL硫酸钠的缓冲液(pH6.7)输送5个柱体积(Column Volume，CV)，然后，输送作为洗脱液的包含0.02mol/mL磷酸钠的缓冲液(pH2.5)10CV。利用系统所附带的UV分光光度计测定洗脱峰在280nm的UV吸光度。
HCP含量使用Cygnus公司制造的CHO Host Cell Protein ELISA Kit,3rdGeneration，按照附带的操作方案进行测定。
DNA含量使用Cygnus公司制造的CHO DNA Amplification Kit in Tubes，按照附带的操作方案进行测定。
将处理前及处理后的HCP量示于图1和表1。
表1
如表1和图1所示的结果，可知通过添加碱式碳酸镁，可以将作为目标的IgG残留在溶液中，有效地减少作为杂质的HCP。由此可以证明，通过用碱式碳酸镁对包含杂质的抗体或抗体样分子水溶液或悬浮液进行处理，可以减少杂质。
实施例2：碱式碳酸镁添加量对杂质蛋白质去除率的影响评价
在包含单克隆抗体的来自动物细胞的培养上清中添加1w/v％、5w/v％、或10w/v％的碱式碳酸镁，在室温下使用搅拌转子(mix rotor)搅拌了18小时。然后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，回收上清，得到了处理液。对IgG、HCP及DNA浓度进行了定量。将结果示于表2、图2及图3。
表2
评价的结果是，在碱式碳酸镁1～10w/v％的范围内，添加量越多，HCP浓度越低。可知DNA浓度没有差别，添加1w/v％就具有足够的杂质去除能力。
实施例3：水不溶性无机化合物的杂质去除效果与活性炭的组合效果
向包含单克隆抗体的来自动物细胞的培养上清分别添加1wt％水不溶性无机化合物及0.67wt％活性炭，在室温下使用搅拌转子搅拌18小时，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，回收上清，得到了处理液。作为水不溶性无机化合物，使用了碱式碳酸镁、氧化镁、氢氧化镁、硫酸钙、或氧化铝。对IgG浓度和HCP及DNA含量进行了定量。将结果示于表3、图4及图5。
表3
评价的结果是，不仅碱式碳酸镁，而且氧化镁、氢氧化镁、硫酸钙、氧化铝这样的水不溶性无机化合物也具有杂质蛋白质去除效果。它们均是医药品、医疗用途所使用的无机化合物，适合于生物医药品的制造中使用。另外可知，在组合活性炭时，虽然IgG回收率降低10％左右，但杂质去除效果进一步提高。
实施例4：碱式碳酸镁的添加处理所带来的蛋白A捕获工序的改善
在包含单克隆抗体的来自动物细胞的培养上清中添加1wt％的碱式碳酸镁，在室温下使用搅拌转子搅拌了18小时。然后，以15,000rpm、5分钟对处理后的溶液进行离心分离后，用过滤器进行过滤，回收上清，上样至填充有单克隆抗体医药制造用rProtein A载体“(Mabselect SuRe LX”GE Healthcare Life Sciences公司制造)(1mL)的柱、或高功能蛋白A色谱用载体(“KANEKA KanCapA 3G prepack column”株式会社钟化制造)(1mL)，用50mM柠檬酸缓冲液进行洗脱，用0.1M NaOH进行清洗。对得到的上样液、洗脱液及清洗液中的IgG，HCP及DNA进行测定。将结果示于表4、图6、图7及图8。
表4
根据评价的结果可知，通过用碱式碳酸镁进行处理，可以抑制杂质在蛋白A载体的积蓄，提高抗体洗脱液的品质。
实施例5：基于碱式碳酸镁填充柱的杂质去除
将碱式碳酸镁填充于1mL色谱柱，流过包含单克隆抗体的来自动物细胞的培养上清，对IgG、HCP及DNA含量进行了定量。将结果示于表5、图9及图10。
表5
根据评价的结果可知，即使填充于柱中，碱式碳酸镁也可以减少HCP、DNA这样的杂质。
实施例6：利用碱式碳酸镁从含有VHH的来自毕赤酵母(Pichia)的培养上清中去除杂质
在包含重链抗体(VHH)的毕赤酵母培养上清中加入0.67wt％的活性炭和/或1wt％的碱式碳酸镁，用搅拌转子搅拌2小时后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，回收上清，得到了处理液。用SDS-PAGE对处理前的培养液和处理液进行了分析。根据得到的SDS-PAGE，读取作为目标物质的VHH的15kDa附近的条带、作为杂质的18、25kDa附近的条带的强度，求出了VHH回收率和杂质残留率。将得到的结果示于表6。
表6
根据评价的结果可知，对于含有VHH的毕赤酵母培养上清，碱式碳酸镁也具有杂质去除效果，通过与活性炭组合，具有很高的杂质去除效果。
实施例7：利用碱式碳酸镁从含有scFV的来自毕赤酵母的培养上清中去除杂质
在包含单链抗体(scFV)的毕赤酵母培养上清中加入0.67wt％的活性炭和/或1wt％或10wt％的碱式碳酸镁，用搅拌转子搅拌2小时后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，回收上清，得到了处理液。用SDS-PAGE对处理前的培养液和处理液进行了分析。根据得到的SDS-PAGE，读取作为目标物质的scFV的30kDa附近的条带、作为杂质的除此以外的条带的强度，求出了VHH回收率和杂质残留率。将得到的结果示于表7。
表7
根据评价的结果可知，对于含有scFV的毕赤酵母培养上清，碱式碳酸镁也具有杂质去除效果，通过与活性炭组合，虽然收率稍有降低，但具有很高的杂质去除效果。
实施例8：利用碱式碳酸镁从含有VHH的来自大肠杆菌的培养上清中去除杂质
在含有VHH的大肠杆菌培养上清中加入1wt％或10wt％的碱式碳酸镁，用搅拌转子搅拌2小时后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，回收上清，得到了处理液。用SDS-PAGE对处理前的培养液和处理液进行了分析。根据得到的SDS-PAGE，读取作为目标物质的scFV的30kDa附近的条带、作为杂质的除此以外的条带的强度，求出了VHH回收率和杂质残留率。将得到的结果示于表8。
表8
根据评价的结果可知，对于含有scFV的毕赤酵母培养上清，碱式碳酸镁也具有杂质去除果。
实施例9：利用碱式碳酸镁从含有Fab的培养液中去除杂质
在含有Fab的CHO培养上清中加入0wt％、1wt％或10wt％的碱式碳酸镁，用搅拌转子搅拌2小时后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，制成经处理的液体，回收了上清。测定了经处理的液体中的Fab、HCP及DNA的浓度。需要说明的是，Fab浓度通过蛋白G色谱进行测定。
表9
根据评价的结果可知，对于含有Fab的CHO培养上清，碱式碳酸镁也具有杂质去除效果。
实施例10：利用碱式碳酸镁从含有抗体的培养液中去除聚集体
在含有单克隆抗体的CHO培养上清中加入0wt％或1wt％的碱式碳酸镁，用搅拌转子搅拌18小时后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，制成经处理的液体，回收了上清。测定了经处理的液体中的IgG浓度及聚集体含量。需要说明的是，聚集体含量通过凝胶过滤色谱进行测定。
表10
根据评价的结果可知，碱式碳酸镁具有聚集体去除效果。
实施例11：基于碱式碳酸镁与核酸内切酶的组合的杂质去除
在含有单克隆抗体的CHO培养上清中加入1wt％的碱式碳酸镁和/或100U/mL的kaneka endonucreaze，用搅拌转子搅拌18小时后，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，制成经处理的液体，回收了上清。测定了经处理的液体中的IgG浓度、HCP浓度及DNA浓度。
表11
根据评价的结果可知，通过将碱式碳酸镁与核酸内切酶组合，可以进一步提高杂质去除能力。
实施例12：基于磷酸三镁的杂质去除
在包含单克隆抗体的来自动物细胞的培养上清中分别加入1wt％或/及10wt％的磷酸三镁及0.67wt％的活性炭，在室温下使用搅拌转子搅拌18小时，以15,000rpm、5分钟进行离心分离，制成经处理的液体，回收了上清。对经处理的液体中的IgG浓度和HCP及DNA含量进行了定量。将结果示于表12。
表12
根据评价的结果可知，磷酸三镁也具有杂质去除能力，通过添加活性炭，可以进一步提高杂质去除能力。
Claims (14)
1.一种用于纯化抗体或抗体样分子的方法，该方法包括：
用包含选自镁、钙及铝中的1种以上元素的水不溶性无机化合物对包含杂质的抗体或抗体样分子的水溶液或悬浮液进行处理的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述水不溶性无机化合物为选自碳酸镁、氢氧化镁、氧化镁、磷酸镁、硫酸钙、以及氧化铝中的1种以上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括：
使所述水溶液或悬浮液与活性炭接触的工序。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述水溶液或悬浮液为包含抗体或抗体样分子的培养液。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述水溶液或悬浮液为将培养液进行离心处理或膜处理而得到的培养上清。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，
所述培养液为产生抗体或抗体样分子的重组宿主细胞的培养液。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述水溶液或悬浮液为重组宿主细胞的破碎物或提取物。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述水溶液或悬浮液为将重组宿主细胞的破碎物或提取物进行离心或膜处理而得到的上清。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述水溶液或悬浮液为生物体提取物。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，
所述抗体或抗体样分子为含Fc蛋白质。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，
所述抗体或抗体样分子为低分子化抗体。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其进一步包括：
用絮凝剂对所述水溶液或悬浮液进行处理的工序。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其进一步包括：
用核酸内切酶对所述水溶液或悬浮液进行处理的工序。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的方法，其包括：
对纯化后的抗体或抗体样分子进一步进行柱处理或膜过滤处理的工序。
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