JPWO2018203541A1 - 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法 - Google Patents
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Abstract
Description
下記工程(1)〜(3)を含む免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法。
(1)免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
(2)下記(a)〜(e)のいずれか一つ以上を酸性で加熱処理する工程
(a)前記工程(1)にて得られた培養液
(b)前記(a)の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
(c)前記(a)の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
(d)前記(c)の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
(e)前記(d)の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
(3)沈殿を分離する工程
前記工程(3)の後に沈殿分離後の上清をクロマトグラフィーにより処理する工程を有することを特徴とする前記[1]に記載の精製方法。
前記ポリペプチドが、微生物由来である前記[1]または[2]に記載の精製方法。
前記ポリペプチドが免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドである前記[1]〜[3]のいずれかに記載の精製方法。
前記ポリペプチドが以下の(x)および(y)からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドを含有している前記[1]〜[4]のいずれかに記載の精製方法。
(x) 配列番号1〜19のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(y) 配列番号1〜19のいずれかで示されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
前記遺伝子組換え体が微生物である、前記[1]〜[5]のいずれかに記載の精製方法。
免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の製造方法であって、
前記[1]〜[6]のいずれかに記載の方法にて免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを製造する工程、
前記ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造する工程、
前記アフィニティー分離マトリックスと、免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
(2)下記(a)〜(e)のいずれか一つ以上を酸性条件で加熱処理する工程
(a)前記工程(1)にて得られた培養液
(b)前記(a)の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
(c)前記(a)の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
(d)前記(c)の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
(e)前記(d)の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
(3)沈殿を分離する工程
Nalgene Rapid−Flow PES 膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター 0.45μm(Thermo Scientific社)
Nalgene Rapid−Flow PES 膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター 0.2μm(Thermo Scientific社)
IWAKI ボトルトップフィルター500mL PES 0.22um 33口径(AGCテクノグラス・IWAKI社)
Bottle top vacuum filter 0.22μm(Corning社)
Bottle top vacuum filter 0.45μm(Corning社)
が挙げられるが、これらに限定されない。
Vivaspin 20−3K(GE Healthcare Life Sciences社)
Vivaspin 20−5K(GE Healthcare Life Sciences社)
Vivaspin 20−10K(GE Healthcare Life Sciences社)
Vivaspin 20−30K(GE Healthcare Life Sciences社)
Vivaspin 20−50K(GE Healthcare Life Sciences社)
Vivaspin 20−100K(GE Healthcare Life Sciences社)
Amicon Ultra−15 3kDa(MERK MILLIPORE社)
Amicon Ultra−15 10kDa(MERK MILLIPORE社)
Amicon Ultra−15 30kDa(MERK MILLIPORE社)
Amicon Ultra−15 50kDa(MERK MILLIPORE社)
Amicon Ultra−15 100kDa(MERK MILLIPORE社)
が挙げられるが、これらに限定されない。
PelliconXL 50 精密ろ過モジュール 0.65μm(MERK MILLIPORE社)
PelliconXL 50 精密ろ過モジュール 0.22μm(MERK MILLIPORE社)
PelliconXL 50 精密ろ過モジュール 0.45μm(MERK MILLIPORE社)
PelliconXL 50 精密ろ過モジュール 0.10μm(MERK MILLIPORE社)
Kvick Start 50 cm2, 5 KD, PES(GE Healthcare Life Sciences社)
Kvick Start 50 cm2, 10 KD, PES(GE Healthcare Life Sciences社)
Kvick Start 50 cm2, 30 KD, PES(GE Healthcare Life Sciences社)
Kvick Start 50 cm2, 50 KD, PES(GE Healthcare Life Sciences社)
Kvick Start 50 cm2, 100 KD, PES(GE Healthcare Life Sciences社)
Pellicon2 Cassette−Biomax(R) Hydrophilic Polyethersulfone Membrane ・ A Screen 5kDa(MERK MILLIPORE社)
Pellicon2 Cassette−Biomax(R) Hydrophilic Polyethersulfone Membrane ・ A Screen 8kDa(MERK MILLIPORE社)
Pellicon2 Cassette−Biomax(R) Hydrophilic Polyethersulfone Membrane ・ A Screen 10kDa(MERK MILLIPORE社)
Pellicon2 Cassette−Biomax(R) Hydrophilic Polyethersulfone Membrane ・ A Screen 30kDa(MERK MILLIPORE社)
Pellicon2 Cassette−Biomax(R) Hydrophilic Polyethersulfone Membrane ・ A Screen 50kDa(MERK MILLIPORE社)
Pellicon2 Cassette−Biomax(R) Hydrophilic Polyethersulfone Membrane ・ A Screen 100kDa(MERK MILLIPORE社)
が挙げられるが、これらに限定されない。
MidGee Cartridge, 0.1 micron(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 0.2 micron(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 0.45 micron(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 0.65 micron(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 1 kD(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 3 kD(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 10 kD(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 30 kD(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 50 kD(GE Healthcare Life Sciences社)
MidGee Cartridge, 100 kD(GE Healthcare Life Sciences社)
が挙げられるが、これらに限定されない。
ケイデンス Acoustic Separator(PALL社)
が挙げられるが、これに限定されない。
Capt Q (GE Healthcare Life Sciences社)
Capt DEAE (GE Healthcare Life Sciences社)Capt Q ImpRes (GE Healthcare Life Sciences社)
Q Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences社)
RESOURCE Q (GE Healthcare Life Sciences社)
SOURCE 30Q (GE Healthcare Life Sciences社)
YMC BioPro Q (YMC社)
YMC BioPro DA (YMC社)
TOYOPEARL SuperQ−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL GigaCapQ−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL DEAE−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL GigaCap DEAE−650 (TOSOH社)
Cellufine MAX Q−r (JNC社)
Cellufine MAX Q−h (JNC社)
Cellufine MAX DEAE (JNC社)
などが挙げられるが、これらに限定されない。
Capt S (GE Healthcare Life Sciences社)
Capt SP ImpRes (GE Healthcare Life Sciences社)
SP Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences社)
RESOURCE S (GE Healthcare Life Sciences社)
SOURCE 30S (GE Healthcare Life Sciences社)
YMC BioPro S (YMC社)
YMC BioPro CM (YMC社)
TOYOPEARL SP−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL GigaCap S−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL CM−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL GigaCap CM−650 (TOSOH社)
Cellufine MAX S−r (JNC社)
Cellufine MAX S−h (JNC社)
Cellufine MAX CM (JNC社)
などが挙げられるが、これらに限定されない。
Phenyl Sepharose High Performance(GE Healthcare Life Sciences社)
Buthyl Sepharose High Performance(GE Healthcare Life Sciences社)
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences社)
Buthyl Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences社)
Octyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences社)
Buthyl Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences社)
Macro−Prep HIC (Bio−Rad Laboratories 社)
TOYOPEARL Ethyl−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL PPG−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL Phenyl−650 (TOSOH社)
TOYOPEARL Buthyl−650 (TOSOH社)
Cellufine MAX Phenyl (JNC社)
Cellufine MAX Buthyl (JNC社)
Cellufine MAX Phenyl LS (JNC社)
などが挙げられるが、これらに限定されない。
Ceramic Hydroxyapatite (Bio−Rad Laboratories 社)
Ceramic Fluoloapatite (Bio−Rad Laboratories 社)
MPC Ceramic HydroxyFluoloapatite (Bio−Rad Laboratories 社)
HA Ultrogel (PALL社)
などが挙げられるが、これらに限定されない。
Capt MMC (GE Healthcare Life Sciences社)
Capt Adhere (GE Healthcare Life Sciences社)
Eshumuno HCX (Merck Millipore社)
などが挙げられるが、これらに限定されない。
IgG Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences社)
などが挙げられるが、これに限定されない。
回収率(%)=[{(溶出した免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の濃度(mg/mL))×(溶出した液量(mL))}/{(負荷した免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の濃度(mg/mL))×(負荷した液量(mL))}]×100
本実施では、組換えDNAの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。
・ T.Maniatis,E.F.Fritsch,J.Sambrook著、「モレキュラー・クローニング/ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning/A Laboratory Manual)」、第2版(1989)、Cold Spring Harbor Laboratory刊(米国)
・ 村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第3版(1996)、丸善株式会社刊。
また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。
Streptococcus sp. GX7809株が生産する野生型プロテインGの免疫グロブリン結合領域を含むポリペプチドSPG・2d(配列番号20)をコードするDNAの5’末端にNdeI認識サイト、3’末端にXbaI認識サイトを付与したDNA(配列番号21)の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した(ユーロフィンジェノミクス社)。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素NdeIおよびXbaI(タカラバイオ社)で消化し、取得したDNA断片を、同じ制限酵素で消化したベクターpUCSNT(国際特許公報WO94/03613)へライゲーションし、SPG・2dのアミノ酸配列をコードするDNAがベクターpUCSNTに挿入された発現プラスミドを調製した。
Escherichia coliHB101株(タカラバイオ社)を得られたプラスミドで形質転換し、SPG・2dを生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を100μg/mLのアンピシリンを含む50mLの2YT培地(ポリペプトン 1.6%、酵母エキス 1.0%、塩化ナトリウム 0.5%)にて、37℃で24時間、振盪培養した。培養後、培養液から遠心分離(15,000rpm、25℃、5分間)により培養上清を除去し、菌体を10mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に懸濁し、超音波破砕機により菌体破砕した。遠心分離により、沈殿を除去し、SPG・2dの菌体破砕上清を得た。
Staphylococcus aureus CowanI株(ATCC12598)が生産する野生型プロテインAの免疫グロブリン結合領域(E・D・A・B・Cドメイン)を含むポリペプチドSPA・5d(配列番号22)をコードするDNAの5’末端にNcoI認識サイト、3’末端にBamHI認識サイトを付与したDNA(配列番号23)の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した(ユーロフィンジェノミクス社)。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素NcoIおよびBamHI(タカラバイオ社)で消化し、取得したDNA断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターpNCMO2(タカラバイオ社)へライゲーションし、SPA・5dのアミノ酸配列をコードするDNAがブレビバチルス発現用ベクターpNCMO2に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはEscherichia・coli JM109株を用いた。
Brevibacillus choshinensis SP3株(タカラバイオ社)を得られたプラスミドで形質転換し、SPA・5dを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を60μg/mLのネオマイシンを含む30mLのA培地(ポリペプトン 3.0%、酵母エキス 0.5%、グルコース 3%、硫酸マグネシウム 0.01%、硫酸鉄 0.001%、塩化マンガン 0.001%、塩化亜鉛 0.0001%)にて、30℃で3日間の振盪培養を行った。培養後、培養液から遠心分離(15,000rpm、25℃、5分間)により菌体を除去し、SPA・5dの培養上清を得た。
Peptostreptococcus・magnus312株由来株が生産する野生型プロテインLの免疫グロブリン結合領域を含むポリペプチドPPL・5d(配列番号24)をコードするDNAの5’末端にPstI認識サイト、3’末端にXbaI認識サイトを付与したDNA(配列番号25)の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した(ユーロフィンジェノミクス社)。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素PstIおよびXbaI(タカラバイオ社)で消化し、取得したDNA断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターpNCMO2(タカラバイオ社)へライゲーションし、PPL・5dのアミノ酸配列をコードするDNAがブレビバチルス発現用ベクターpNCMO2に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはEscherichia coli JM109株を用いた。
Brevibacillus choshinensis SP3株(タカラバイオ社)を得られたプラスミドで形質転換し、PPL・5dを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を参考例3と同様に培養、菌体分離し、PPL・5dの培養上清を得た。
Peptostreptococcus magnus 3316株が生産する野生型プロテインLの抗体結合領域を含むポリペプチドPPL・4d(配列番号26)をコードするDNAの5’末端にNdeI認識サイト、3’末端にPstI認識サイトを付与したDNA(配列番号27)の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した(ユーロフィンジェノミクス社)。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素NdeIおよびPstI(タカラバイオ社)で消化し、取得したDNA断片を、同じ制限酵素で消化したベクターpUCSNT(国際特許公報WO94/03613)へライゲーションし、PPL・4dのアミノ酸配列をコードするDNAがベクターpUCSNTに挿入された発現プラスミドを調製した。
Escherichia coli HB101株(タカラバイオ社)を得られたプラスミドで形質転換し、PPL・4dを生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を参考例1と同様に培養、菌体分離、菌体破砕し、PPL・4dの菌体破砕後液を得た。
(1)SPG・2d菌体破砕上清/大腸菌由来の酸性加熱処理
大腸菌の菌体破砕後上清20mLに水を加え5倍希釈後、フィルターろ過(Thermo Scientific 500mL Rapid−Flow Bottle Top Filter,0.2μm aPES membrane,75mm dia,45mm neck)することで培養上清を得た。この培養上清に10mMとなるよう1M酢酸Naを加え、2.5mLずつ5本の15mL遠沈管に分注し、pHを酢酸によりそれぞれ5.2、5.6、7.0に調整した。これらの溶液を各pHにつき0.5mLずつ4本の1.5mLチューブに分注し、各pHの溶液を25℃、55℃、60℃、65℃の各温度に設定したブロックヒーターにて60分間、加熱処理した。さらに処理後の各サンプルを遠心分離(12000rpm,5分間)した後に上清を回収した。回収した上清を150mMリン酸Na、pH7.0で3倍希釈し、SDSPAGEにて分析した。また、得られた上清中に含まれるSPG・2dの純度をデンシトメトリー法にて求めた。結果を図1および図2に示す。
各希釈液20μLを2倍濃縮のサンプル緩衝液(下記参照)にて希釈し、それぞれ40μLのサンプル溶液とした。これをe−パジェルE−R15L(アトー製)15%均一ゲルの各ウェルに10μLずつアプライし、電気泳動を行なった(40mA、90分)。その後、ゲルをBio−Safe CBB G−250ステイン(バイオラッド)にて染色した。
・泳動緩衝液 (25mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、192mM グリシン、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム)
・2倍濃縮サンプル緩衝液 (1M Tris−HCl(pH 6.8)12.48mL、ブロモフェノールブルー 0.02g、ドデシル硫酸ナトリウム 4g、グリセロール 28g、超純水 30mL)
前記操作にて得られたゲルを画像データとし、ImageJ(Broken Symmetry Software、Version 1.4.3.67)にて解析を行なった。ゲルの各レーンにおけるタンパク質由来バンドの全面積に対する目的物バンドの面積の割合を算出することで、各条件における目的物の純度を算出した。
図1および図2より、pH7.0にて加熱処理のみを行なった場合、65℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、SPG・2dの純度は47%までしか向上しなかった。また、25℃にて酸性処理のみを行なった場合、pHを5.2まで低下させてもSPG・2dの純度は36%までしか向上しなかった。一方、pHを5.6以下で且つ温度を55℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、SPG・2dの純度は86%以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、SPG・2dをより高純度に精製できることが分かる。
(1)SPA・5d培養上清/ブレビバチルス由来の酸性加熱処理
ブレビバチルスの菌体培養液100mLを遠心分離(7500rpm,15分間)し、フィルターろ過(Thermo Scientific 500mL Rapid−Flow Bottle Top Filter,0.2μm aPES membrane,75mm dia,45mm neck)することで培養上清を得た。この培養上清に10mMとなるよう1M酢酸Naを加え、2.5mLずつ5本の15mLチューブに分注し、pHを酢酸によりそれぞれ4.6、5.0、7.0に調整した。これらの溶液を各pHにつき0.5mLずつ4本の1.5mLチューブに分注し、各pHの溶液を25℃、55℃、60℃、65℃の温度に設定したブロックヒーターにて60分間、加熱処理した。さらに処理後の各サンプルを遠心分離(12000rpm,5分間)した後に上清を回収した。回収した上清を150mMリン酸Na、pH7.0で2倍希釈し、SDS−PAGEにて分析した。また、得られた上清中に含まれるSPA・5dの純度をデンシトメトリー法にて求めた。結果を図3および図4に示す。
図3および図4より、pH7.0にて加熱処理のみを行なった場合、65℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、SPA・5dの純度は64%までしか向上しなかった。また、25℃にて酸性処理のみを行なった場合、pHを4.6まで低下させてもSPA・5dの純度は64%までしか向上しなかった。一方、pHを5.0以下、温度を55℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、SPA・5dの純度は85%以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、SPA・5dをより高純度に精製できることが分かる。
(1)PPL・5d培養上清/ブレビバチルス由来の酸性加熱処理
培養上清の調製pHを4.5、7.0とした以外は実施例2に記載の方法にて実験を行なった。デンシトメトリーによって求めた各条件におけるPPL・5dの純度を図5に示す。
図5より、pH7.0にて加熱処理のみを行なった場合、65℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、PPL・5dの純度は49%までしか向上しなかった。また、25℃にて酸性処理のみを行なった場合、pHを4.5としてもPPL・5dの純度は53%までしか向上しなかった。一方、pHを4.5、温度を55℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、PPL・5dの純度は89%以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、PPL・5dをより高純度に精製できることが分かる。
(1)PPL・4d菌体破砕上清/大腸菌由来の酸性加熱処理
処理時の温度を25℃、55℃、65℃、pHを4.8、7.0とし、各条件における処理量を1mLとした以外は、実施例1に記載の方法にて実験を行った。デンシトメトリーによって求めた各条件におけるPPL・4dの純度を図6に示す。
図6より、pH7.0にて加熱処理のみを行なった場合、65℃まで加熱してもPPL・4dの純度は88%までしか向上しなかった。また、25℃にて酸性処理のみを行なった場合、pHを4.8としてもPPL・4dの純度は76%までしか向上しなかった。一方、pHを4.8、温度を55℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、PPL・4dの純度は最高で99%となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、PPL・4dをより高純度に精製できることが分かる。
(1)SPA・5d培養上清/ブレビバチルス由来の酸性加熱処理後のフィルターろ過
処理時の温度を25℃、60℃、65℃とし、各条件における処理量を1mLとした以外は、実施例2に記載の方法にて酸性加熱処理を行った。得られた酸性加熱処理液のうち0.8mLを、0.2μmフィルター(0.22μm pore size,4mm diameter,Millex−GV Durapore(R)(PVDF)membrane,hydrophilic)を装着した1mLシリンジに投入後、シリンジの押子が止まるまでろ過した。ろ液を1.5mLチューブに受け、ろ過前後のチューブ重量からろ液量を算出した。結果を図7に示す。
図7より、加熱処理(pH7.0 60℃、pH7.0 65℃)あるいは酸性処理(25℃ pH4.6、25℃ pH5.0)の場合、ろ過量は0.05gから0.24gであった。それに対して、加熱処理と酸性処理を組み合わせるとろ過量は増大し、65℃ pH 4.6、60℃ pH 4.6の処理ではそれぞれ0.37g、0.4gとなった。
以上の結果から、酸性処理と加熱処理を組み合わせることによって酸性処理のみの場合に比べ約2倍、加熱処理のみに比べて約8倍も、ろ過量が向上することが分かった。
(1)酸性加熱処理後の抗体結合活性を持ったポリペプチドの活性確認
実施例5にて得られた4種の酸性加熱処理液(60℃ pH 4.6、60℃ pH5.0、65℃ pH 4.6、65℃ pH5.0)を15mL遠沈管に集め、遠心分離により上清と沈殿に分離した(12000rpm,5分間)。得られた上清に1Mトリス塩酸pH8.8を加えてpHを8.0とした。
得られた溶液を、PBSにて平衡化したIgG Sepharose 6 FF(クロマトシステム:Akta avant25 GE Healthcare Life Sciences社、カラム:omnifit 株式会社アイシス、内径6.6mm×高さ6.2cm)に1mL負荷した。その後PBSにて洗浄を行い、5mM酢酸アンモニウムー酢酸バッファー(pH 5.0)により中間洗浄を行った。50mMクエン酸(pH 3.0)により溶出を行い、PBS 2M尿素により洗浄を行った。サンプル負荷、中間洗浄、溶出、洗浄工程のそれぞれにおいて、0.5mLずつ溶出液を分取した。得られた溶出液を実施例1と同様にSDS−PAGEにて分析した。得られたクロマトグラムと溶出液のSDS−PAGEの結果を図8および図9に示す。
図8および図9よりSPA・5dはフロースルー画分および押し出し画分には漏出せずにほぼ全て溶出画分に回収できたことが分かった。以上の結果より、SPA・5dは酸性加熱処理後も抗体結合活性を保っていることが分かった。
Claims (7)
- 下記工程(1)〜(3)を含む免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法。
(1)免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
(2)下記(a)〜(e)のいずれか一つ以上を酸性で加熱処理する工程
(a)前記工程(1)にて得られた培養液
(b)前記(a)の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
(c)前記(a)の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
(d)前記(c)の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
(e)前記(d)の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
(3)沈殿を分離する工程 - 前記工程(3)の後に沈殿分離後の上清をクロマトグラフィーにより処理する工程を有することを特徴とする請求項1に記載の精製方法。
- 前記ポリペプチドが、微生物由来である請求項1または2に記載の精製方法。
- 前記ポリペプチドが免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドである請求項1〜3のいずれかに記載の精製方法。
- 前記ポリペプチドが以下の(x)および(y)からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドを含有している請求項1〜4のいずれかに記載の精製方法。
(x) 配列番号1〜19のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(y) 配列番号1〜19のいずれかで示されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 前記遺伝子組換え体が微生物である、請求項1〜5のいずれかに記載の精製方法。
- 免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の製造方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の方法にて免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを製造する工程、
前記ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造する工程、
前記アフィニティー分離マトリックスと、免疫グロブリンのFc領域、CH領域、VH領域、CL領域およびVL領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
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