WO2018203541A1 - 免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法 - Google Patents

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cells
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慶一 唐杉
正大 船木
正克 西八條
中野　喜之
和信 水口
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株式会社カネカ
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a method for recovering and purifying a polypeptide having immunoglobulin binding activity produced by culturing a gene recombinant.
  • antibody pharmaceuticals using functions of immunoglobulins.
  • antibody drugs work more specifically for target molecules, and are expected to reduce side effects and achieve high therapeutic effects. It contributes to the improvement.
  • Monoclonal antibodies are basically developed as antibody drugs and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are classified into the immunoglobulin G (hereinafter sometimes abbreviated as “IgG”) subclass in terms of molecular structure.
  • antibody drugs composed of antibody derivatives (fragment antibodies) having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively developed, and a plurality of antibody drugs composed of IgG Fab fragments have been marketed (Non-patent Document 1). .
  • polypeptides having immunoglobulin binding activity such as protein A (PA), protein G (PG), and protein L (PL) are insoluble in polysaccharides, synthetic polymers, silica and the like.
  • An affinity carrier bonded to a porous substrate is used.
  • An affinity carrier using a polypeptide having immunoglobulin binding activity as a ligand can purify a full-length antibody or a fragmented antibody with high purity from a culture solution by a single treatment.
  • a protein A affinity carrier (PA carrier) and a protein G affinity carrier (PG carrier) are used in the initial purification step in the production process of an antibody drug having IgG as a basic structure.
  • protein L affinity carriers are used for purification in the research and development stage of antibody drugs and diagnostic drugs based on fragmented antibodies.
  • affinity carriers are required to have high quality as materials for drug production, and protein ligands themselves are required to have the same level of quality as antibody drugs, which increases production costs and provides affinity carriers at low cost. It has become difficult. As a result, the ratio of the affinity carrier to the antibody drug production cost is large, which contributes to an increase in the antibody drug production cost. Therefore, a simpler, more effective and more standardized method than the conventional method has been desired as a method for preparing a large amount of these polypeptides having immunoglobulin binding activity at a low cost.
  • Non-patent Document 2 a method for recovering and purifying wild-type protein A produced by culturing Staphylococcus aureus
  • the culture solution of Staphylococcus aureus containing wild-type protein A is treated with Lysostaphin, the host-derived cell components are removed by centrifugation, and the pH of the resulting culture supernatant is 3.5.
  • the filtered solution was purified with Sepharose (R) 4B (Pharmacia) to which IgG was immobilized.
  • Non-patent Document 3 Escherichia coli culture solution containing wild type protein G is treated at 80 ° C. for 10 minutes to extract protein G in the culture supernatant, and this is cross-flow filtered to separate cell components. Furthermore, the obtained supernatant was purified with IgG Sepharose (R) 6 Fast Flow (Pharmacia).
  • Patent Document 1 Describe a method for recovering and purifying wild-type protein A produced by culturing transformed E. coli.
  • the E. coli culture solution containing wild-type protein A is crushed with a bead mill, and then the resulting supernatant after crushed cells is heated at 80 ° C. for 30 minutes to precipitate contaminating proteins derived from E. coli.
  • the pH of the culture supernatant after the heat treatment it is purified by anion exchange chromatography or cation exchange chromatography.
  • either the acidic treatment or the heat treatment is performed on the culture solution or culture supernatant containing the polypeptide having immunoglobulin binding activity before the treatment by chromatography.
  • the particle size of the precipitate formed from impurities such as host cell components, contaminating proteins, and nucleic acids is small, and the impurities cannot be removed sufficiently by only treatment by any of the above methods. Therefore, there has been a problem that productivity in the subsequent purification process is lowered.
  • the latter purification process affected by the productivity reduction includes a filtration step for removing the precipitate generated by the acidic treatment or heat treatment and a chromatography step for collecting and purifying the polypeptide having immunoglobulin binding activity. It is done.
  • the problems in the individual processes when only the acid treatment or the heat treatment is performed by the conventional method will be specifically described below.
  • the culture solution or culture supernatant containing the polypeptide is subjected to a combination of an acid treatment and a heat treatment before the chromatographic treatment, whereby the acid treatment or the heat treatment is performed alone.
  • a treatment method for precipitating the impurities more efficiently by precipitating more impurities and increasing the particle size of the precipitates can be considered, but for the following reasons, Since the combination of them presumably increases the risk of irreversibly changing the structure of the polypeptide and losing immunoglobulin binding activity, it has been avoided.
  • a protein may be inactivated by causing an irreversible change in the three-dimensional structure due to the influence of the pH, temperature, salt, heavy metal, and denaturing agent of the solution containing the protein.
  • the pH of the protein solution For example, by setting the pH of the protein solution to an acidic or alkaline condition, the ionization state of the side chain of the amino acid residue is changed or the modification reaction is promoted (Shinsei Chemistry Experiment Course 1 “Protein I Separation / Purification / Property "The Japanese Biochemical Society”).
  • the ionic attractive force and repulsive force that play an important role in maintaining the original three-dimensional structure of the protein is lost, and the three-dimensional structure of the protein is destabilized.
  • JP-A-63-275600 describes that E. coli-containing protease destroys protein A at low pH (pH 3.0 to pH 3.5). Treatment at low pH and heat treatment are described. It can be easily imagined that the combined action promotes the destruction of protein A.
  • purification Platform Technology For antibody drugs, pharmaceutical companies have built their own platforms. A polypeptide having immunoglobulin binding activity with high production cost is also industrially useful if a purification platform technology can be established.
  • the present inventors As a method for recovering and purifying a polypeptide having immunoglobulin binding activity from a gene recombinant, the present inventors have used a host-derived cell component, contaminating protein, nucleic acid, regardless of the host or amino acid sequence of the polypeptide.
  • the processing method which can improve the filterability and improve the productivity in a chromatography process by precipitating the impurity which consists of highly efficiently by a larger and larger particle size was investigated.
  • the culture broth obtained by surprisingly cultivating the gene recombinant, the culture supernatant thereof, the suspension of the bacterial cells in the culture broth, the liquid after disrupting the bacterial bodies, and the disruption of the bacterial bodies
  • heat-treating any one or more of the post-supernatant under acidic conditions while maintaining the activity of the polypeptide, more host-derived cells, contaminating proteins and DNA and more than the conventional method described above
  • the preparation method described above can be applied to a polypeptide having a plurality of immunoglobulin binding activities with different host and amino acid sequences, and has established a purification platform technology for the polypeptide. That is, the present invention relates to the following [1] to [7].
  • a method for purifying a polypeptide having immunoglobulin binding activity comprising the following steps (1) to (3).
  • (c) Removal of culture supernatant from the culture solution of (a) D) A solution after disrupting the cells obtained by crushing the cells of (c)
  • polypeptide is a polypeptide that binds to any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region of an immunoglobulin.
  • a method for producing a protein comprising any one or more of an Fc region, a CH region, a VH region, a CL region, and a VL region of an immunoglobulin A step of producing a polypeptide having immunoglobulin binding activity by the method according to any one of [1] to [6], A step of producing an affinity separation matrix by immobilizing the polypeptide as a ligand on a water-insoluble carrier; Contacting the affinity separation matrix with a liquid sample containing a protein comprising any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region of an immunoglobulin; and Separating the protein bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the present invention treats a genetic recombinant containing a polypeptide having immunoglobulin binding activity by the following steps, thereby maintaining the activity of the polypeptide while coexisting in a culture with a host cell component,
  • the present invention relates to a method for recovering and purifying the polypeptide from contaminating proteins and nucleic acids.
  • the process development period can be shortened when producing a plurality of types of the polypeptides. Costs can be reduced by refining materials and equipment.
  • the culture may be treated according to the steps (1) to (3).
  • a step of culturing a gene recombinant that produces a polypeptide having immunoglobulin binding activity (2) A step of heat-treating any one or more of the following (a) to (e) under acidic conditions (a) (B) culture supernatant obtained by removing cells from the culture solution of (a) (c) culture supernatant from the culture solution of (a) Suspension of cells obtained by removal (d) A solution after disrupting cells obtained by crushing the cells of (c) (e) Cells from the solution after disrupting cells of (d) (3) Step of separating the precipitate
  • the “immunoglobulin” in the present invention is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes, and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins. In addition to the function of specifically binding to such specific molecules (antigens), the immunoglobulin has a function of detoxifying and removing factors including antigens in cooperation with other biomolecules and cells. Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function. All immunoglobulins have basically the same molecular structure, and are based on a “Y” -shaped four-chain structure consisting of two light chain and two heavy chain polypeptide chains.
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the portion near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • variable region of the light chain is called the VL region
  • variable region of the heavy chain is called the VH region
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region
  • the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • the polypeptide to be purified by the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a polypeptide that binds to any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region of the immunoglobulin.
  • a polypeptide has, for example, the E, D, A, B, and C domains that are immunoglobulin binding domains of protein A having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 5, and the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 10.
  • “Mutant” refers to a polypeptide having at least one mutation introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type polypeptide.
  • the mutation refers to one or more mutations selected from substitution, addition, and deletion.
  • the number of amino acids to be mutated is preferably 10 or less, more preferably 5 or less, and even more preferably 4 or less, 3 or less, or 2 or less.
  • the “conjugate” is a polypeptide obtained by linking polypeptides having immunoglobulin binding activity or variants thereof in series. The same polypeptide may be linked, or different polypeptides may be linked. Examples of the number of polypeptides to be linked include 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, and the like.
  • the polypeptide to be purified by the method of the present invention is preferably a polypeptide essentially having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 19.
  • the polypeptide of the present invention preferably has 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% of the sequence identity with the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1 to 19. % Or more, more preferably 98% or more.
  • Protein A is one of the cell wall proteins produced by the Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus, and its immunoglobulin binding domains (E domain, D domain, A domain, B domain, C domain) are It can bind to a region other than the complementarity determining region (CDR) of an antibody. Both domains have the activity of binding to the Fc region, Fab region, and particularly the Fv region in the Fab region of the antibody.
  • the origin of protein A is not particularly limited, but protein A is preferably derived from staphylococcus, which is a microorganism.
  • Protein G is one of the cell wall proteins produced by Streptococcus, whose immunoglobulin binding domains (B1, B2 and C1-C3 domains) bind to the Fc region of most mammalian IgGs. It exhibits activity and has the activity of weakly binding to the Fab region of the antibody.
  • the origin of protein G is not particularly limited, but is preferably protein G derived from a microorganism, Streptococcus sp.
  • Protein L is one of the proteins produced by Peptostreptococcus magnus, and its immunoglobulin binding domain (B1-B5 domain and C1-C4 domain) is an immunoglobulin k light chain (k1, It exhibits binding activity to k3, k4) and binds to antibodies of various animal species. It can also bind to a single chain antibody (ScFv) or Fab.
  • the origin of protein L is not particularly limited, but protein L is preferably derived from the microorganism Peptostreptococcus magnus.
  • polypeptide includes all molecules having a polypeptide structure, and is not only a so-called “protein” but also a fragmented one or another peptide linked by a peptide bond. Are also included.
  • a “domain” is a unit in a higher-order structure of a protein, which is composed of a sequence of several tens to several hundreds of amino acid residues, and is sufficient for expressing any physicochemical or biochemical function. The unit.
  • the gene recombinant in the present invention refers to an expression vector comprising a base sequence encoding the amino acid sequence of a polypeptide having immunoglobulin binding activity, and a promoter operable in the host operably linked to the base sequence. Is a transformed cell introduced into the cell.
  • the host is particularly limited as long as it is a microorganism that can be transformed with an expression vector containing DNA encoding a polypeptide having immunoglobulin binding activity and express the introduced DNA to produce the polypeptide. is not.
  • Examples of usable microorganisms include, for example, the genus Escherichia, the genus Bacillus, the genus Pseudomonas, the genus Serratia, the genus Brevibacterium, the genus Corynebacterium, and the genus Corynebacterium.
  • CHO Choinese Hamster Overy
  • insects such as moths (Nature, 315, 592-594 (1985)
  • rapeseed A system for expressing a large amount of a heterologous protein in plants such as corn and potato has been developed and can be suitably used.
  • bacteria and yeasts are preferable from the viewpoint of introduction and expression efficiency, and Escherichia genus, Brevibacillus genus bacteria, or Pichia genus yeast are particularly preferable.
  • the expression vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can replicate autonomously in the host, and plasmid DNA or phage DNA can be used as the vector.
  • vectors for inserting genes include pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Japan ( Vector) and the like.
  • a bacterium belonging to the genus Brevibacillus is used as a host
  • pUB110 known as a Bacillus subtilis vector pHY500 (JP-A-2-31682), pNY700 (JP-A-4-278091), pNU211R2L5 (special) (Kaihei 7-170984), pHT210 (JP-A-6-133782), or pNCMO2 (JP-A 2002-238569), which is a shuttle vector between Escherichia coli and Brevibacillus bacteria, can be used.
  • pPICHOLI, pHIP, pHRP, pHARS and the like can be mentioned, but the invention is not particularly limited thereto.
  • Examples of methods for introducing a vector into a host cell include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, or a polyethylene glycol method. However, it is not limited to these.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the gene recombinant When the desired polypeptide is produced using the gene recombinant, the gene recombinant is cultured in a medium and cultured in a cultured cell (including the cell periplasm region) or in a culture solution (cells). And the desired polypeptide can be collected from the culture.
  • the method of culturing the gene recombinant in the above step (1) in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as the target polypeptide can be produced with high efficiency and high yield.
  • a medium containing a carbon source or nitrogen source such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, casamino acid and the like can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2 -Aminoethyl) -benzonesulfonyl fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenedietate May be.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, and Hsp104 / ClpB may be used for correctly folding the target polypeptide of the present invention.
  • it can coexist with the target polypeptide of the present invention by a technique such as co-expression or fusion proteinization.
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but are not limited thereto. It is not something.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%
  • 2 ⁇ YT medium tryptone 1.6%) Yeast extract 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • TM medium 1% peptone, 0.5% meat extract, 0.2% yeast extract, 1% glucose, pH 7.0.
  • 2SL medium peptone 4%, yeast extract 0.5%, glucose 2%, pH 7.2.
  • YPD medium 1% yeast extract bacto (manufactured by Difco), 2% tryptone bacto (manufactured by Difco), 2% glucose), etc. Is mentioned.
  • the target polypeptide of the present invention is cultured in a cultured cell (periplasm) by culturing at a temperature of 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C. under aerobic stirring for several hours to several days. Collected in the culture solution (extracellular). In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the culture medium obtained in the above step (1) may be used as it is, an enzyme such as lysostaphin, lysozyme or lithicase, nonionic, Anionic, cationic and amphoteric surfactants may be added, but are not limited to this method.
  • an enzyme such as lysostaphin, lysozyme or lithicase, nonionic, Anionic, cationic and amphoteric surfactants may be added, but are not limited to this method.
  • the “culture supernatant” in the above steps (2) to (b) is used when the target polypeptide is accumulated in the culture solution (extracellular).
  • the “bacterial cell suspension” in the steps (2) to (c) is used when the target polypeptide is accumulated in cultured cells (including in the periplasmic region).
  • the method for separating and removing cells or culture supernatant from the culture solution obtained in the step (1) is as follows. Although it is not limited, it can be separated from the bacterial cells by collecting the culture supernatant after standing or centrifuging the culture after completion of the culture. Moreover, it can also isolate
  • the treatment by the dead end filtration, the cross flow filtration and the acoustic wave separation may be performed after the culture solution is centrifuged, or the culture solution may be used as it is.
  • the dead end filtration is a filtration method in which the feed solution moves perpendicularly to the membrane, and the filtrate passes through the membrane.
  • Examples of the method for separating the bacterial cells and the culture supernatant by dead-end filtration include microfiltration or ultrafiltration of the culture solution using a bottle top filter or a centrifugal filter unit, but are not limited to this method. It is not something.
  • the cross flow filtration is a filtration method in which the feed solution moves parallel to the membrane surface, and the filtrate passes through the membrane.
  • Examples of the method for separating the bacterial cells and the culture supernatant by cross-flow filtration include microfiltration or ultrafiltration of the culture solution using a cassette membrane or a hollow core. However, the method is not limited to this method. Absent.
  • the treatment by acoustic wave separation means that the insoluble matter and the supernatant in the feed solution are collected by irradiating the feed solution with standing waves to collect and settle insoluble matter at the position of the standing wave nodes. It is a method of separation. Examples of the method for separating the bacterial cells and the culture supernatant by acoustic wave separation include a method for treating the culture solution with an acoustic wave separator, but are not limited to this method.
  • Nalgene Rapid-Flow PES Sterile Disposable Bottle Top Filter with Membrane 0.45 ⁇ m Nalgene Rapid-Flow PES Membrane-sterilized disposable bottle top filter 0.2 ⁇ m (Thermo Scientific) IWAKI bottle top filter 500mL PES 0.22um 33 caliber (AGC Techno Glass, IWAKI) Bottle top vacuum filter 0.22 ⁇ m (Corning) Bottle top vacuum filter 0.45 ⁇ m (Corning)
  • IWAKI bottle top filter 500mL PES 0.22um 33 caliber (AGC Techno Glass, IWAKI) Bottle top vacuum filter 0.22 ⁇ m (Corning) Bottle top vacuum filter 0.45 ⁇ m (Corning)
  • Vivaspin 20-3K GE Healthcare Life Sciences
  • Vivaspin 20-5K GE Healthcare Life Sciences
  • Vivaspin 20-10K GE Healthcare Life Sciences
  • Vivaspin 20-30K GE Healthcare Life Sciences
  • Vivaspin 20-50K Vivaspin 20-100K
  • Amicon Ultra-15 3kDa (MERK MILLIPORE)
  • Amicon Ultra-15 10 kDa (MERK MILLIPORE)
  • Amicon Ultra-15 30 kDa (MERK MILLIPORE)
  • Amicon Ultra-15 50 kDa (MERK MILLIPORE)
  • Amicon Ultra-15 100 kDa (MERK MILLIPORE)
  • MidGee Cartridge As a holofiber when performing the cross flow filtration, MidGee Cartridge, 0.1 micron (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 0.2 micron (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 0.45 micron (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 0.65 micron (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 1 kD (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 3 kD (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 10 kD (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 30 kD (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 50 kD (GE Healthcare Life Sciences) MidGee Cartridge, 100 kD (GE Healthcare Life Sciences)
  • Cadence Acoustic Separator As the acoustic wave separator, Cadence Acoustic Separator (PALL) However, it is not limited to this.
  • the culture supernatant in the above steps (2) to (b) is a solution containing a polypeptide having an immunoglobulin binding activity secreted and produced from the host.
  • the culture supernatant obtained by removing the cells from the culture solution obtained in the step (1) may be used as it is, or the pH may be adjusted to neutral with acid, alkali, etc., or diluted with a neutral buffer. You may do it.
  • the acid used at this time include formic acid, acetic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, and the like.
  • the alkali include sodium hydroxide, ammonia, and sodium acetate. It is not limited to these as long as the pH can be adjusted without losing it.
  • the neutral buffer is not particularly limited as long as the polypeptide does not lose the immunoglobulin binding activity.
  • an acetate-Na acetate buffer, a phosphate Na buffer, a phosphate K buffer, Tris-HCl buffer, HEPES buffer, MES buffer, MOPS buffer, etc. may be used.
  • the suspension of bacterial cells in the steps (2) to (c) is a suspension containing a polypeptide having immunoglobulin binding activity accumulated in cultured cells (including in the periplasmic region),
  • the cells obtained by removing the culture supernatant from the culture solution obtained in step (1) may be suspended in a neutral buffer, diluted with water, and adjusted to neutral pH with acid or alkali. May be.
  • acid or alkali include formic acid, acetic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, nitric acid, sulfuric acid, and the like.
  • the alkali include sodium hydroxide, ammonia, and sodium acetate. It is not limited to these as long as the pH can be adjusted without losing it.
  • the neutral buffer is not particularly limited as long as the polypeptide does not lose the immunoglobulin binding activity.
  • an acetate-Na acetate buffer, a phosphate Na buffer, a phosphate K buffer, A Tris buffer, HEPES buffer, MES buffer, MOPS buffer, or the like may be used.
  • the solution after disrupting the cells in the steps (2) to (d) is a suspension obtained by crushing the cells in the suspension of the cells in the steps (2) to (c). That is.
  • the cells need not be completely crushed.
  • the suspension obtained by partially rupturing the outer membrane is include.
  • the method for disrupting the bacterial cells is not particularly limited as long as the bacterial cells in the suspension are sufficiently disrupted.
  • the osmotic shock method, the freeze-thaw method, and the disruption method using a surfactant are examples of the osmotic shock method, the freeze-thaw method, and the disruption method using a surfactant.
  • Enzyme digestion method ultrasonic treatment method, French press method, mortar grinding method, homogenizer crushing method, glass bead crushing method, sample crushing kit crushing method, etc., more preferably ultrasonic treatment method, homogenizer If it is the crushing method by this, the microbial cell in suspension can fully be crushed.
  • the supernatant after disrupting cells in the steps (2)-(e) is a supernatant obtained by removing insoluble precipitates from the solution after disrupting cells in the steps (2)-(d).
  • a method for removing the insoluble precipitate a method similar to the method for separating the culture supernatant or the bacterial cells from the culture solution obtained in the step (1) can be used, but the method is not limited thereto.
  • the acidic conditions in the step (2) may be within the range where the bacterial components of the host microorganism and contaminating proteins and nucleic acids derived from the host produced in the cytoplasm or periplasm or extracellularly are specifically precipitated, preferably pH 3.0 to 6.0, more preferably pH 3.2 to 5.9, more preferably pH 3.4 to 5.8, more preferably pH 3.6 to 5.7, more preferably pH 3.8 to 5. 6 is sufficient.
  • a culture solution containing the polypeptide having the immunoglobulin binding activity obtained in the step (1), a culture supernatant thereof, a suspension of cells in the culture solution, and disruption of the cells The acid or alkali for adjusting the pH of any one of the post-solution and the supernatant after disrupting the cells is limited to these as long as the pH can be adjusted without losing the immunobinding activity of the polypeptide.
  • the acid includes, but is not limited to, formic acid, acetic acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, nitric acid, and sulfuric acid
  • the alkali includes sodium hydroxide, ammonia, and sodium acetate.
  • the culture solution, the culture supernatant, the suspension of the bacterial cells, the liquid after disrupting the bacterial cells or the supernatant after disrupting the bacterial cells is uniformly stirred in a plastic bottle.
  • a method of monitoring pH with a pH meter or a pH test paper and dropping an acetic acid solution diluted to 5 M with water using a pipette is included, but is not limited thereto.
  • the pH adjustment is preferably performed before temperature adjustment from the viewpoint of safety, but can also be performed during temperature adjustment or after temperature adjustment.
  • the temperature in the step (2) may be within a range where the contaminating protein derived from the host produced in the cytoplasm or periplasm of the host microorganism or outside the cell is specifically precipitated, and the temperature is preferably 50 ° C. to 70 ° C. More preferably 51 ° C. to 69 ° C., more preferably 52 ° C. to 68 ° C., more preferably 53 ° C. to 67 ° C., more preferably 54 ° C. to 66 ° C., and even more preferably 55 ° C. to 65 ° C. good.
  • the temperature control method is not limited to the following method, but a culture solution containing a polypeptide having immunoglobulin binding activity after pH adjustment in a water bath kept within the temperature range by a temperature control device or Put a culture supernatant, a suspension of bacterial cells or a solution after disrupting the cells or a plastic bottle containing the supernatant after disrupting the cells, and the temperature in the solution is within the above temperature range with a thermometer while stirring uniformly.
  • the temperature adjustment is preferably performed after pH adjustment from the viewpoint of safety, but can also be performed before pH adjustment or during pH adjustment.
  • the acid heat treatment includes a culture solution containing a polypeptide having immunoglobulin binding activity after the pH and temperature adjustment by a water bath kept within the temperature range by a temperature adjusting device, and its culture Treating any one or more of the supernatant, the suspension of the cells in the culture, the solution after disrupting the cells, and the supernatant after disrupting the cells for 30 minutes to 1 hour with uniform stirring,
  • a culture solution containing a polypeptide having immunoglobulin binding activity after the pH and temperature adjustment by a water bath kept within the temperature range by a temperature adjusting device, and its culture Treating any one or more of the supernatant, the suspension of the cells in the culture, the solution after disrupting the cells, and the supernatant after disrupting the cells for 30 minutes to 1 hour with uniform stirring
  • the method of lowering the temperature of this solution to 25 degreeC by making the temperature of a water bath into 25 degreeC is mentioned, it is not limited to this.
  • the step of separating the precipitate in the step (3) is a step of separating precipitates such as contaminating proteins generated by the acidic heat treatment in the step (2), and is composed of host-derived cell components, contaminating proteins and nucleic acids.
  • the method is not particularly limited as long as it can separate a supernatant containing a precipitate and a polypeptide having immunoglobulin binding activity, and a method for separating a culture supernatant or cells from the culture solution obtained in the step (1). Separation can be performed in a similar manner.
  • the target polypeptide may be purified from the supernatant containing the target polypeptide by chromatography.
  • the chromatography carrier to be used is not particularly limited as long as it is a method capable of recovering and purifying a polypeptide having immunoglobulin binding activity from the supernatant after the steps (1) to (3), but anion exchange chromatography, Chromatographic carriers such as cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, hydroxyapatite chromatography, mixed mode chromatography, and affinity chromatography may be used, and these may be used alone or in combination.
  • the anion exchange resin used for the anion exchange chromatography is not limited as long as it exhibits an anion exchange action.
  • anion exchange resin Capt Q (GE Healthcare Life Sciences) Cap DEAE (GE Healthcare Life Sciences) Capt Q ImpRes (GE Healthcare Life Sciences) Q Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences) RESOURCE Q (GE Healthcare Life Sciences) SOURCE 30Q (GE Healthcare Life Sciences) YMC BioPro Q (YMC) YMC BioPro DA (YMC) TOYOPARL SuperQ-650 (TOSOH) TOYOPEARL GigaCapQ-650 (TOSOH) TOYOPEARL DEAE-650 (TOSOH) TOYOPEARL GigaCap DEAE-650 (TOSOH) Cellufine MAX Qr (JNC) Cellufine MAX Qh (JNC) Cellufine MAX DEAE (JNC) However, it is not limited to these.
  • the cation exchange resin used in the cation exchange chromatography is not limited as long as it exhibits a cation exchange action.
  • a cation exchange resin Capt S (GE Healthcare Life Sciences) Cap SP ImpRes (GE Healthcare Life Sciences) SP Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences) RESOURCE S (GE Healthcare Life Sciences) SOURCE 30S (GE Healthcare Life Sciences) YMC BioPro S (YMC) YMC BioPro CM (YMC) TOYOPEARL SP-650 (TOSOH) TOYOPEARL GigaCap S-650 (TOSOH) TOYOPEARL CM-650 (TOSOH) TOYOPEARL GigaCap CM-650 (TOSOH) Cellufine MAX Sr (JNC) Cellufine MAX SH (JNC) Cellufine MAX CM (JNC) However, it is not limited to these.
  • the hydrophobic chromatography resin used for the hydrophobic chromatography is not limited as long as it exhibits a hydrophobic interaction.
  • a hydrophobic chromatography resin Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences) Butyl Sepharose High Performance (GE Healthcare Life Sciences) Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) Butyl Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) Octyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) Butyl Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) Macro-Prep HIC (Bio-Rad Laboratories) TOYOPEARL Ethyl-650 (TOSOH) TOYOPEARL PPG-650 (TOSOH) TOYOPEARL Phenyl-650 (TOSOH) TOYOPEARL Butyl-650 (TOSOH) Cellufine MAX Phenyl (JNC) Cellufine MAX Butyl (JNC) Cellufine MAX Phenyl LS (J
  • Capt MMC GE Healthcare Life Sciences
  • Capt Adhere GE Healthcare Life Sciences
  • Eshumuno HCX Merck Millipore
  • affinity chromatography resin IgG Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences)
  • IgG Sepharose 6 Fast Flow GE Healthcare Life Sciences
  • the polypeptide having immunoglobulin binding activity purified by the purification method of the present invention has binding affinity for any one or more of Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of immunoglobulin. It can be used as an affinity ligand. That is, immunoglobulins can be separated and purified by affinity column chromatography purification using an affinity separation matrix in which the polypeptide is immobilized on a water-insoluble carrier as a ligand.
  • the affinity separation matrix can be produced by immobilizing the polypeptide as an affinity ligand on a carrier comprising a water-insoluble substrate.
  • affinity ligand is a substance that selectively collects (binds) a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding of an antigen and an antibody. It is a term indicating (functional group), and in the present invention, it refers to a protein that specifically binds to immunoglobulin.
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • Examples of the carrier composed of a water-insoluble substrate used in the present invention include inorganic carriers such as glass beads and silica gel, crosslinked polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene, crystalline cellulose, crosslinked Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cellulose, crosslinked agarose and crosslinked dextran, and organic-organic, organic-inorganic and other composite carriers obtained by a combination thereof.
  • GCL2000 which is a porous cellulose gel
  • Sephacryl® S-1000 in which allyldextran and methylenebisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl which is a methacrylate-based carrier
  • Sepharose® CL4B which is an agarose-based crosslinked carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size, in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxyl group, or a thiol group present in the ligand.
  • the support is activated by reacting the support with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine, sodium periodate, or the like (or on the support surface).
  • introducing a reactive functional group a method of immobilizing by performing a coupling reaction with a compound to be immobilized as a ligand, a condensation reagent such as carbodiimide in a system in which a compound to be immobilized as a carrier and a ligand exists, or
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, for immobilization, the polypeptide having the immunoglobulin binding activity purified by the purification method of the present invention may be chemically modified, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • the affinity separation matrix is obtained by immobilizing a polypeptide having immunoglobulin binding activity purified by the purification method of the present invention, based on the activity of the polypeptide itself, the Fc region, CH region, VH region of immunoglobulin , And can be bonded to any one or more of the CL region and the VL region. Therefore, using the polypeptide purified by the purification method of the present invention and the affinity separation matrix, a protein containing any one or more of immunoglobulin Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region is affinity column. -Separation and purification can be achieved by chromatographic purification methods.
  • Protein containing any one or more of immunoglobulin Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region refers to a protein to which the polypeptide binds. However, as long as the polypeptide can be bound, the polypeptide does not have to include the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region completely.
  • immunoglobulin G examples include, but are not limited to, immunoglobulin G or immunoglobulin G derivatives. is not.
  • immunoglobulin G derivative means, for example, a chimeric immunoglobulin G in which a part of the domain of human immunoglobulin G is replaced with a domain of immunoglobulin G of another species and a CDR of human immunoglobulin G The (Complementarity Determinig Regions) part is replaced with the CDR part of an antibody of another species, and the humanized immunoglobulin G is fused, the immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, the Fv region of the human immunoglobulin G, and It is a generic name for modified artificial proteins to which a polypeptide having immunoglobulin binding activity purified by the purification method of the present invention, such as artificial immunoglobulin G fused with Fc region, can bind.
  • the binding region is widely defined as Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region
  • the immunoglobulin binding purified by the purification method of the present invention retains the three-dimensional structure of the region to which the polypeptide binds by protein engineering, and then the Fc region, CH region, VH region, CL region, and The VL region may be further modified (such as fragmentation).
  • the protein can be recovered and purified with high purity by the step of adsorbing the protein to the affinity separation matrix (adsorption step) and the step of separating the protein bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix (elution step).
  • an affinity separation matrix comprising a ligand immobilized on a carrier. Adsorption by contacting with. Specifically, after the liquid sample containing the protein is adjusted to be neutral, the liquid sample is passed through an affinity column packed with an affinity separation matrix to adsorb the protein. As the solvent for the liquid sample, a buffer solution is preferable.
  • buffer examples include citric acid, 2- (N-morpholino) ethansulfonic acid (MES), Bis-Tris, N- (2-Acetamido) iminodiacetic acid (ADA), Piperazine-1,4-bis (2- etheresulfonic acid) (PIPES), N- (2-Acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3- (N-Morpholino) -2-hydroxypropionic acid (MOPSO), N, N-Brys-hixy 2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3- (N-morpholino) pro anesulonic acid (MOPS), N-Tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethanesulfide acid (TES), 4- (2-hydroxyethylethyl) -1-piperazine etheric acid (HEPES) -1-piperazinyl] Propanesulphonic acid (EPPS), Tricine, Tris, Glyc
  • the pH at which the protein is adsorbed on the affinity separation matrix is preferably pH 6.5 to 8.5, more preferably pH 7 to 8.
  • the temperature at which the protein is adsorbed on the affinity separation matrix is preferably 1 to 40 ° C., more preferably 4 to 25 ° C.
  • an appropriate amount of pure buffer may be passed through the affinity column to wash the inside of the column.
  • the protein containing any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region of the immunoglobulin is adsorbed to the affinity separation matrix in the column.
  • the buffer used for washing the same buffer as that used in the adsorption step can be used.
  • the eluate having a pH of 2.7 or more is contacted with an affinity separation matrix, Elute the protein.
  • affinity separation matrix Elute the protein.
  • the eluate include citrate buffer, acetate buffer, phosphate buffer, glycine buffer, formate buffer, propionate buffer, ⁇ -aminobutyric acid buffer, and lactic acid buffer.
  • pH of the eluate It is possible to recover the antibody if the pH of the eluate is 2.7 or higher, but it is preferable to use an eluate having a higher pH because aggregation of the antibody and a decrease in activity can be avoided.
  • pH 3.0 or more is more preferable
  • pH 3.5, pH 3.75, pH 3.8, pH 3.9 or more is more preferable
  • pH 4.0 or more is most preferable.
  • the upper limit of the pH of the eluate is preferably pH 6.0.
  • a surfactant for example, Tween 20 or Triton-X100
  • a chaotropic agent for example, urea or guanidine
  • an amino acid for example, arginine
  • the pH in the affinity column packed with the affinity separation matrix is pH2. It is preferably 7 or more, more preferably pH 3.0 or more, more preferably pH 3.6, pH 3.75, pH 3.8, pH 3.9 or more, and pH 4.0 or more. Most preferred. Elution at pH 3.0 or higher can reduce the damage to the protein (Biotechnology and bioengineering., 2005, 92 (6): 665-673).
  • the upper limit of the pH in the affinity column packed with the affinity separation matrix when eluting the protein is preferably pH 6.0.
  • the temperature for eluting the protein containing any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of immunoglobulin is preferably 1 to 40 ° C, and preferably 4 to 25 ° C. It is more preferable.
  • the recovery rate of the protein containing any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of the immunoglobulin recovered by the purification method of the present invention is preferably 90% or more, 95 % Or more is more preferable.
  • the recovery rate is calculated by the following formula, for example.
  • Recovery rate (%) [ ⁇ (concentration of protein containing at least one of Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of eluted immunoglobulin (mg / mL)) ⁇ (eluted solution Amount (mL)) ⁇ / ⁇ (concentration of protein containing at least one of Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of loaded immunoglobulin (mg / mL)) ⁇ (loaded solution Amount (mL)) ⁇ ] ⁇ 100
  • contamination of a protein derived from a host for expressing a protein containing any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region of an immunoglobulin can be reduced. Contamination of these proteins may increase the load of the purification process in antibody production (increase in man-hours and decrease in yield) and impurity proteins may cause serious side effects as pharmaceuticals. The problem can be avoided.
  • the affinity separation matrix of the present invention is effective for separating a host-derived protein from a protein containing any one or more of the Fc region, CH region, VH region, CL region, and VL region of immunoglobulin.
  • the host cell from which the host cell protein is derived is a cell capable of expressing the protein, and examples thereof include CHO cells and Escherichia coli for which genetic recombination techniques have been established.
  • These host-derived proteins can be quantified by a commercially available immunoassay kit. For example, if a CHO HCP ELISA kit (Cygnus) is used, proteins derived from CHO cells can be quantified.
  • the affinity separation matrix of the present invention contains an appropriate strong acid or strong alkaline pure buffer (appropriate denaturing agent or organic solvent) that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. It may be reused by passing it through and washing it.
  • Affinity of polypeptide having affinity for immunoglobulin and affinity separation matrix purified by the purification method of the present invention to a protein containing any one or more of Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of immunoglobulin The property can be tested by a biosensor such as a Biacore system (manufactured by GE Healthcare Japan Co., Ltd.) using the surface plasmon resonance principle.
  • the affinity of the protein of the present invention for the immunoglobulin is such that the binding constant (K A ) is 10 6 (M ⁇ 1 ) or more when the affinity for the human immunoglobulin G preparation is measured by the Biacore system described later. Preferably, it is 10 7 (M ⁇ 1 ) or more.
  • the polypeptide having the immunoglobulin binding activity purified by the purification method of the present invention binds to any of the Fc region, CH region, VH region, CL region and VL region of immunoglobulin. It is sufficient if the binding signal can be detected at this time, and it can be easily evaluated by measuring at a temperature of 20 to 40 ° C. (constant temperature) and at a pH of 6 to 8.
  • binding immunoglobulin molecule examples include a polyclonal antibody, gamma globulin Nichiyaku (human immunoglobulin G) (Nippon Pharmaceutical) and a commercially available monoclonal antibody.
  • the difference in affinity is obtained by obtaining the binding reaction curve for the same immunoglobulin molecule under the same measurement conditions, and the protein before introducing the mutation and the protein after introducing the mutation using the binding parameters obtained when analyzed. Can be easily verified by those skilled in the art.
  • a binding constant for example, a binding constant (K A ) or a dissociation constant (K D ) can be used (Nagata et al., “Real-time analysis experiment method of biological substance interaction”, Springer Fairlark Tokyo, 1998, 41).
  • the binding constant between the polypeptide obtained in the present invention and the Fab is obtained by immobilizing an immunoglobulin Fab fragment belonging to the VH3 subfamily on the sensor chip using the Biacore system, at a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.4.
  • the binding constant is sometimes referred to as an affinity constant, but the definition of both is basically the same.
  • Reference Example 1 Preparation of cell disruption supernatant containing protein G Streptococcus sp.
  • the artificially synthesized gene (SEQ ID NO: 21) was totally synthesized by outsourcing (Eurofin Genomics).
  • the subcloned expression plasmid was digested with restriction enzymes NdeI and XbaI (Takara Bio Inc.), and the obtained DNA fragment was ligated to the vector pUCSNT (International Patent Publication WO94 / 03613) digested with the same restriction enzyme, and SPG •
  • An expression plasmid was prepared in which the DNA encoding the 2d amino acid sequence was inserted into the vector pUCSNT.
  • Escherichia coli HB101 strain (Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and a gene recombinant producing SPG ⁇ 2d was bred. The gene recombinant was shake-cultured at 37 ° C.
  • 2YT medium polypeptone 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin.
  • 2YT medium polypeptone 1.6%, yeast extract 1.0%, sodium chloride 0.5%) containing 100 ⁇ g / mL ampicillin.
  • the culture supernatant is removed from the culture solution by centrifugation (15,000 rpm, 25 ° C., 5 minutes), and the cells are suspended in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0). The cells were crushed. The precipitate was removed by centrifugation to obtain a cell disruption supernatant of SPG ⁇ 2d.
  • Reference Example 2 Preparation of culture supernatant containing protein A Polypeptide SPA containing the immunoglobulin binding region (EDDABBC domain) of wild type protein A produced by Staphylococcus aureus Cowan I strain (ATCC 12598) An artificially synthesized gene of DNA (SEQ ID NO: 23) having an NcoI recognition site at the 5 ′ end and a BamHI recognition site at the 3 ′ end of DNA encoding 5d (SEQ ID NO: 22) was totally synthesized by outsourcing (Eurofin Genomics) Company).
  • the subcloned expression plasmid was digested with restriction enzymes NcoI and BamHI (Takara Bio Inc.), and the obtained DNA fragment was ligated to the Brevibacillus expression vector pNCMO2 (Takara Bio Inc.) digested with the same restriction enzyme.
  • An expression plasmid was prepared in which DNA encoding the 5d amino acid sequence was inserted into the Brevibacillus expression vector pNCMO2.
  • Escherichia coli JM109 strain was used for the preparation of the plasmid.
  • Brevibacillus choshinensis SP3 strain (Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and a gene recombinant that secreted and produced SPA-5d was bred.
  • Manganese (0.001% manganese, 0.0001% zinc chloride) was subjected to shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After the culture, the cells were removed from the culture solution by centrifugation (15,000 rpm, 25 ° C., 5 minutes) to obtain a SPA ⁇ 5d culture supernatant.
  • Reference Example 3 Preparation of culture supernatant containing protein L 5 ′ of DNA encoding polypeptide PPL ⁇ 5d (SEQ ID NO: 24) containing immunoglobulin binding region of wild type protein L produced by a strain derived from Peptostreptoccus magnus 312 strain
  • An artificially synthesized gene of DNA (SEQ ID NO: 25) having a PstI recognition site at the end and an XbaI recognition site at the 3 ′ end was totally synthesized by outsourcing (Eurofin Genomics).
  • the expression plasmid after this subcloning was digested with restriction enzymes PstI and XbaI (Takara Bio Inc.), and the obtained DNA fragment was ligated to the Brevibacillus expression vector pNCMO2 (Takara Bio Inc.) digested with the same restriction enzyme, and PPL An expression plasmid was prepared in which DNA encoding the 5d amino acid sequence was inserted into the Brevibacillus expression vector pNCMO2.
  • Escherichia coli JM109 strain was used for the preparation of the plasmid.
  • Brevibacillus choshinensis SP3 strain (Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and a gene recombinant that secreted and produced PPL ⁇ 5d was bred. This gene recombinant was cultured and separated in the same manner as in Reference Example 3 to obtain a culture supernatant of PPL ⁇ 5d.
  • Reference Example 4 Preparation of solution after disruption of cells containing protein L 5 ′ end of DNA encoding polypeptide PPL ⁇ 4d (SEQ ID NO: 26) containing antibody binding region of wild type protein L produced by Peptostreptoccus magnus 3316 strain
  • An artificially synthesized gene of DNA (SEQ ID NO: 27) having a NdeI recognition site and a PstI recognition site at the 3 ′ end was totally synthesized by outsourcing (Eurofin Genomics).
  • the expression plasmid after this subcloning is digested with restriction enzymes NdeI and PstI (Takara Bio), and the obtained DNA fragment is ligated to a vector pUCSTN (International Patent Publication WO94 / 03613) digested with the same restriction enzyme.
  • An expression plasmid in which a DNA encoding the amino acid sequence of 4d was inserted into the vector pUCSNT was prepared.
  • Escherichia coli HB101 strain (Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and a gene recombinant producing PPL 4d was bred.
  • This genetically modified product was cultured, separated from cells, and disrupted in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a solution after disruption of PPL-4d cells.
  • Example 1 SPG ⁇ 2d cell disruption supernatant / acidic heat treatment derived from Escherichia coli After water disruption of E. coli cells, water is added to the supernatant 20 mL, diluted 5-fold, and filtered (Thermo Scientific 500 mL Rapid-Flow Bottom Top Filter, 0 The culture supernatant was obtained by 2 ⁇ m aPES membrane, 75 mm dia, 45 mm neck). 1 M Na acetate was added to this culture supernatant to 10 mM, and 2.5 mL was dispensed into five 15 mL centrifuge tubes, and the pH was adjusted to 5.2, 5.6, and 7.0 with acetic acid, respectively.
  • each buffer is as follows: ⁇ Running buffer (25 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane, 192 mM glycine, 0.1% sodium dodecyl sulfate) ⁇ 2-fold concentrated sample buffer (1M Tris-HCl (pH 6.8) 12.48 mL, bromophenol blue 0.02 g, sodium dodecyl sulfate 4 g, glycerol 28 g, ultrapure water 30 mL)
  • Example 2 (1) SPA / 5d culture supernatant / acidic heat treatment derived from Brevibacillus 100 mL of Brevibacillus cell culture solution is centrifuged (7500 rpm, 15 minutes), and filtered (Thermo Scientific 500 mL Rapid-Flow Bottom Top Filter, 0) The culture supernatant was obtained by 2 ⁇ m aPES membrane, 75 mm dia, 45 mm neck). 1 M Na acetate was added to this culture supernatant to 10 mM, and 2.5 mL was dispensed into five 15 mL tubes, and the pH was adjusted to 4.6, 5.0, and 7.0 with acetic acid, respectively.
  • Example 3 (1) PPL ⁇ 5d culture supernatant / acidic heat treatment derived from Brevibacillus Experiments were conducted by the method described in Example 2 except that the pH of the culture supernatant was 4.5 and 7.0.
  • FIG. 5 shows the purity of PPL ⁇ 5d in each condition determined by densitometry.
  • Example 4 PPL • 4d cell disruption supernatant / acidic heat treatment derived from Escherichia coli
  • the temperature during the treatment is 25 ° C., 55 ° C., 65 ° C.
  • the pH is 4.8, 7.0
  • the treatment amount under each condition is 1 mL
  • FIG. 6 shows the purity of PPL ⁇ 4d in each condition determined by densitometry.
  • Example 5 (1) SPA ⁇ 5d culture supernatant / filter filtration after acid heat treatment derived from Brevibacillus Examples except that the temperature during the treatment was 25 ° C, 60 ° C, 65 ° C, and the treatment amount in each condition was 1 mL
  • the acidic heat treatment was performed by the method described in 2.
  • the filtrate was received in a 1.5 mL tube, and the filtrate amount was calculated from the tube weight before and after filtration. The results are shown in FIG.
  • Example 6 (1) Confirmation of activity of polypeptide having antibody binding activity after acidic heat treatment
  • Four kinds of acidic heat treatment liquids obtained in Example 5 60 ° C pH 4.6, 60 ° C pH 5.0, 65 ° C) (pH 4.6, 65 ° C., pH 5.0) was collected in a 15 mL centrifuge tube, and separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation (12000 rpm, 5 minutes). 1M Tris-HCl pH 8.8 was added to the resulting supernatant to adjust the pH to 8.0.
  • the obtained solution was loaded with 1 mL of IgG Sepharose 6 FF (chromatography system: Akta Louis 25 GE Healthcare Life Sciences, column: omnifit ISIS, inner diameter 6.6 mm ⁇ height 6.2 cm) equilibrated with PBS. . Thereafter, the plate was washed with PBS, and intermediate washed with 5 mM ammonium acetate-acetic acid buffer (pH 5.0). Elution was performed with 50 mM citric acid (pH 3.0), and washing was performed with PBS 2M urea. In each of the sample loading, intermediate washing, elution, and washing steps, 0.5 mL of the eluate was fractionated. The obtained eluate was analyzed by SDS-PAGE as in Example 1. The obtained chromatogram and the results of SDS-PAGE of the eluate are shown in FIG. 8 and FIG.

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Abstract

本発明は、遺伝子組換え体より免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製する方法として、ポリペプチドの宿主やアミノ酸配列の違いによらず、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク、核酸からなる不純物を、より大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、ろ過性を向上させ、クロマトグラフィー工程における生産性を向上させうる処理法を提供することを特徴とする。本発明に係る免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法は、（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程、（２）前記工程（１）にて得られた培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、前記菌体懸濁液を菌体破砕することで得られる菌体破砕後液および前記破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清のいずれか一つ以上を酸性加熱処理する工程、（３）沈殿を分離する工程を有することを特徴とする。

Description

免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法
　本発明は、遺伝子組み換え体を培養することによって生産された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの回収精製法に関するものである。
　近年、遺伝子工学、タンパク質工学、および、細胞工学の発展に伴い、抗体医薬と呼ばれる、免疫グロブリンの有する機能を利用した医薬品の開発が盛んに行われている。抗体医薬は、従来の医薬と比べて、標的分子に対してより特異的に働くために、副作用をより軽減させ、かつ、高い治療効果が得られることが期待されており、実際に様々な病態の改善に寄与している。
　抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略記する場合がある）サブクラスに分類される。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、ＩｇＧのＦａｂ断片からなる抗体医薬が複数上市された（非特許文献１）。
　これら抗体医薬品の調製における初期精製工程ではプロテインＡ（ＰＡ）、プロテインＧ（ＰＧ）、プロテインＬ（ＰＬ）といった免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを、多糖類、合成ポリマー、シリカ等からなる不溶性の多孔質基材に結合させたアフィニティー担体が用いられる。
　これら免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドをリガンドとしたアフィニティー担体は、培養液から完全長抗体や断片化抗体を１回の処理で高純度に精製することができる。これを利用し、例えばプロテインＡアフィニティー担体（ＰＡ担体）やプロテインＧアフィニティー担体（ＰＧ担体）はＩｇＧを基本構造とした抗体医薬品の製造プロセスにおける初期精製工程に用いられている。
　また、プロテインＬアフィニティー担体（ＰＬ担体）は、断片化抗体を基本構造とした抗体医薬品や診断薬の研究開発段階における精製に用いられている。
　一方、これらアフィニティー担体は、医薬品製造用資材として高い品質が求められ、タンパク質からなるリガンド自体も抗体医薬品と同レベルの品質を要求されるため、生産コストが高くなり、アフィニティー担体を安価に提供することが難しくなっている。これにより、抗体医薬品製造コストのうち、アフィニティー担体が占める割合は大きく、抗体医薬品製造コスト増加の一因となっている。そのため、これら免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを安価に大量調製する方法として、従来法よりも簡便で、効果的で、定型化された手法が望まれていた。
　免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを調製する方法としてこれまでに種々の方法が検討されている。例えばＨｊｅｌｍらは、スタフィロコッカス・アウレウスの培養により生産された野生型のプロテインＡを回収精製する方法について報告している（非特許文献２）。当該文献では、野生型のプロテインＡを含むスタフィロコッカス・アウレウスの培養液をＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎにより処理し、遠心分離により宿主由来の細胞成分を除去後、得られた培養上清のｐＨを３．５とすることにより夾雑タンパク質を沈殿させており、さらにこの上清を回収し、中和後にフィルターろ過したものをＩｇＧを固定化したｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R)　４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にて精製している。
　またＬｅｅらは、形質転換された大腸菌を培養することにより生産された野生型プロテインＧの免疫グロブリン結合ドメインの回収精製方法について報告している（非特許文献３）。当該文献では、野生型プロテインＧを含む大腸菌培養液を８０℃で１０分間処理することにより培養上清中にプロテインＧを抽出し、これをクロスフローろ過することで、細胞成分を分離しており、さらに、得られた上清をＩｇＧ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ(R)　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にて精製している。
　また、Ｒｉｃｈａｒｄらは、形質転換された大腸菌を培養することにより生産された野生型プロテインＡの回収精製法について記載している（特許文献１）。当該文献では、野生型プロテインＡを含む大腸菌培養液をビーズミルにて菌体破砕したのち、得られた菌体破砕後上清を８０℃で３０分加熱し、大腸菌由来の夾雑タンパク質を沈殿させて取り除いており、さらに、加熱処理後の培養上清のｐＨを調整した後に陰イオン交換クロマトグラフィーあるいは陽イオン交換クロマトグラフィーにて精製している。
特開昭６３－２７５６００
Ｎｅｌｓｏｎら、Ｎａｔ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　２００９　　，　２７：３３１－３３７ Ｈｊｅｌｍら、ＦＥＢＳ．　ＬＥＴＴ．，　１９７２，　２８：７　　３－７６ Ｌｅｅら、Ｊ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　１９９２，　２６：　　２１３－２２９
　前記のいずれの精製法も、クロマトグラフィーによる処理の前に、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液または培養上清に対し、酸性処理または加熱処理のいずれかの処理を行なっているが、前記のいずれかの方法による処理のみでは以下に述べるように宿主由来の菌体成分、夾雑タンパク、核酸といった不純物から形成される沈殿の粒子サイズが小さいことや、前記不純物を十分に除去できないことから、後段の精製プロセスにおける生産性が低下するといった課題があった。
　前記の生産性低下の影響を受ける後段の精製プロセスとは、前記酸性処理または加熱処理によって生じた沈殿を除去するろ過工程と免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収、精製するクロマトグラフィー工程が挙げられる。以下に前記の従来法にて酸性処理または加熱処理のみを行なう場合の個々のプロセスにおける問題点を具体的に述べる。
　前記の酸性処理または加熱処理のいずれかの方法による処理のみの場合、宿主由来の菌体成分、夾雑タンパク、核酸といった不純物からなる沈殿の粒子サイズが小さいために、精密ろ過フィルターや限外ろ過フィルターによるろ過速度が低下し、ろ過工程における生産性が低下するといった課題があった。さらに、前記のいずれかの方法による処理のみでは前記不純物を十分に除去できず、後段のクロマトグラフィー精製における一回当たりの処理量が低下するといった課題があった。
　これらを解決する方法として、例えば該ポリペプチドを含む該培養液または培養上清に対し、クロマトグラフィーによる処理の前に、酸性処理および加熱処理を組み合わせて行なうことによって、酸性処理または加熱処理を単独で実施する場合に比べ、より多くの不純物を沈殿化するとともに沈殿の粒子サイズを大きくすることでより高効率に前記不純物を沈殿化する処理法が考えられうるが、以下のような理由から、それらを組み合わせることは該ポリペプチドの構造を不可逆的に変化させ、免疫グロブリン結合活性を失わせるリスクが高まることが推察されるため、実施は避けられていた。
　一般にタンパク質は、それが含まれる溶液のｐＨ、温度、塩、重金属、変性剤の影響により立体構造の不可逆的変化を起こし失活してしまう場合がある。例えば、タンパク質溶液のｐＨを酸性あるいはアルカリ性条件とすることにより、アミノ酸残基の側鎖のイオン化状態が変化したり、修飾反応が促進される（新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ分離・精製・性質」日本生化学会編）。これにより、タンパク質本来の立体構造を安定に保つ上で重要な役割を担っているイオン性の引力や反発力が失われ、タンパク質の立体構造を不安定化する。さらに、タンパク質溶液の温度を高温とすることにより、タンパク質の立体構造を安定化している非共有結合が壊され、折りたたみ構造をほどけやすくする。また、これら酸性やアルカリ性条件と高温条件を組み合わせると、タンパク質の立体構造の不安定化はそれらを単独で行なう場合よりもさらに促進されうる。さらに、特開昭６３－２７５６００には、大腸菌含有プロテアーゼが低ｐＨ（ｐＨ　３．０～ｐＨ　３．５）でプロテインＡを破壊することが記載されており、低ｐＨでの処理と加熱処理を組み合わせて行なうことは、プロテインＡの破壊を促進することは容易に想像できる。つまり、前記免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む該溶液に対し、酸性処理および加熱処理を組み合わせて行なうことは、これらを単独で実施する場合に比べて、該ポリペプチドの立体構造を不可逆的に不安定化させたり、ポリペプチドを破壊させてしまうリスクが高まる（新生化学実験講座１「タンパク質Ｉ分離・精製・性質」日本生化学会編）。また、免疫グロブリン結合活性は、ポリペプチドの立体構造やそのアミノ酸配列が少し変化しただけでも劇的に変化しうるため、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを精製する際に、酸性処理および加熱処理を組み合わせて行なうことは、免疫グロブリン結合活性の低下という問題が発生すると考えられ、これまで避けられてきた。
　また、複数種類のタンパク質を工業的に精製する際、それらの精製プロセスを共通化できると、プロセス開発期間の短縮や精製資材や設備の共通化によるコスト削減が可能となる。このような精製プロセスの共通化は「精製プラットフォーム技術」と呼ばれ、抗体医薬品では、製薬会社各社が独自のプラットフォームを構築している。製造コストの高い免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに関しても、精製プラットフォーム技術を確立できれば、産業上有用である。
　上記の理由から、遺伝子組換え体より免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製する方法として、前記ポリペプチドの宿主やアミノ酸配列の違いによらず、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク、核酸からなる不純物をより多く且つより大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することにより、ろ過性を向上させ、クロマトグラフィー工程における生産性を向上させうる処理法が求められていた。
　本発明者らは、遺伝子組換え体より免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製する方法として、前記ポリペプチドの宿主やアミノ酸配列の違いによらず、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク、核酸からなる不純物を、より多く且つより大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、ろ過性を向上させ、クロマトグラフィー工程における生産性を向上させうる処理法について鋭意検討を行なった。その結果、驚くべきことに遺伝子組換え体を培養することによって得られた培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか一つ以上を酸性条件で加熱処理することにより、該ポリペプチドの活性を保ちつつ、前記の従来法に比べて宿主由来の菌体、夾雑タンパク質やＤＮＡを、より多く且つより大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、凝集沈殿画分のろ過性が向上するだけでなく、後段のクロマトグラフィー工程における生産性を向上させられるということを発見した。さらに、前記記載の調製法は由来となる宿主やアミノ酸配列の異なる複数の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに適用可能なことを発見し、該ポリペプチドの精製プラットフォーム技術の確立に至った。すなわち本発明は、下記の［１］～［７］に関する。
　［１］　
下記工程（１）～（３）を含む免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法。
（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
（２）下記（ａ）～（ｅ）のいずれか一つ以上を酸性で加熱処理する工程
　（ａ）前記工程（１）にて得られた培養液
　（ｂ）前記（ａ）の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
　（ｃ）前記（ａ）の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
　（ｄ）前記（ｃ）の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
　（ｅ）前記（ｄ）の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
（３）沈殿を分離する工程
　［２］
　前記工程（３）の後に沈殿分離後の上清をクロマトグラフィーにより処理する工程を有することを特徴とする前記［１］に記載の精製方法。
　［３］
　前記ポリペプチドが、微生物由来である前記［１］または［２］に記載の精製方法。
　［４］
　前記ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドである前記［１］～［３］のいずれかに記載の精製方法。
　［５］
　前記ポリペプチドが以下の（ｘ）および（ｙ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドを含有している前記［１］～［４］のいずれかに記載の精製方法。
　（ｘ）　配列番号１～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（ｙ）　配列番号１～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　［６］
　前記遺伝子組換え体が微生物である、前記［１］～［５］のいずれかに記載の精製方法。
　［７］
　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の製造方法であって、
　前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法にて免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを製造する工程、
　前記ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造する工程、
　前記アフィニティー分離マトリックスと、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
　アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養することによって得られた培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか１つ以上を酸性条件で加熱処理することにより、従来法に比べてより多くの宿主由来の菌体、夾雑タンパク質やＤＮＡを、より大きな粒子サイズで高効率に沈殿化することで、凝集沈殿画分のろ過性が向上するだけでなく、後段のクロマトグラフィー工程における生産性を向上させられる。
本発明の実施例１に係る、大腸菌由来のＳＰＧ・２ｄ菌体破砕後上清の酸性加熱処理後の各サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 本発明の実施例１に係る、大腸菌由来のＳＰＧ・２ｄ菌体破砕後上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＳＰＧ・２ｄの純度である。 本発明の実施例２に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。 本発明の実施例２に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＳＰＡ・５ｄの純度である。 本発明の実施例３に係る、ブレビバチルス由来のＰＰＬ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＰＰＬ・５ｄの純度である。 本発明の実施例４に係る、大腸菌由来のＰＰＬ・４ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルにおけるＰＰＬ・４ｄの純度である。 本発明の実施例５に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後の各サンプルの同一条件下でのろ過量である。 本発明の実施例６に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後液をクロマトグラフィーにて精製した場合のクロマトグラムである。 本発明の実施例６に係る、ブレビバチルス由来のＳＰＡ・５ｄ培養上清の酸性加熱処理後のサンプルのクロマトグラフィーによる溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。
　本発明は免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含有する遺伝子組換え体を、下記工程により処理することで、該ポリペプチドの活性を保ちつつ、培養物中に共存する宿主由来の菌体成分、夾雑タンパク質および核酸等から該ポリペプチドを回収精製する方法に関するものである。
　さらに、前記記載の方法は由来となる宿主やアミノ酸配列の異なる複数の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに適用可能であるため、複数種類の該ポリペプチドを製造する場合、プロセス開発期間の短縮や精製資材や設備の共通化によるコスト削減が可能となる。
　すなわち本発明を実施するには、該培養物について、（１）～（３）の工程にしたがって処理すれば良い。
　（１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
　（２）下記（ａ）～（ｅ）のいずれか一つ以上を酸性条件で加熱処理する工程
　　（ａ）前記工程（１）にて得られた培養液
　　（ｂ）前記（ａ）の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
　　（ｃ）前記（ａ）の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
　　（ｄ）前記（ｃ）の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
　　（ｅ）前記（ｄ）の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
　（３）沈殿を分離する工程
　本発明における「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるようアミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
　本発明方法で精製すべきポリペプチドとは、前記免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域、ＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドであれば特に限定はされない。このようなポリペプチドとして、例えば配列番号１～５のアミノ酸配列を有する、プロテインＡの免疫グロブリン結合ドメインであるＥ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣドメイン、配列番号６～１０のアミノ酸配列を有する、プロテインＧの免疫グロブリン結合ドメインであるＢ１、Ｂ２ドメインおよびＣ１－Ｃ３ドメイン、配列番号１１～１９のアミノ酸配列を有する、プロテインＬの免疫グロブリン結合ドメインであるＢ１－Ｂ５ドメインおよびＣ１－Ｃ４ドメイン、ならびにそれらの変異体や連結体が挙げられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．,ＵＳＡ，１９８３，８０：６９７－７０１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，２８：１３３８８－１３３９１；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７：１２８２０－１２８２５；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，１２（６）：９１１－９２０）。「変異体」とは、野生型のポリペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の変異が導入されたポリペプチドを言う。変異は、置換、付加、欠失から選択される１以上の変異をいう。変異するアミノ酸の数としては、１０以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下、３以下または２以下がより更に好ましい。また、「連結体」とは、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドあるいはその変異体を直列に連結して得られるポリペプチドである。同じポリペプチドを連結しても良く、異なるポリペプチドを連結しても良い。連結されるポリペプチドの数としては、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個が挙げられる。
　本発明方法で精製すべきポリペプチドは配列番号１～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列を必須的に有するポリペプチドが好ましい。
　本発明のポリペプチドとは配列番号１～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列との配列同一性が好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であればよい。
　プロテインＡはグラム陽性細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ・Ａｕｒｅｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、その免疫グロブリン結合ドメイン（Ｅドメイン、Ｄドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン）は抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域に結合することができる。いずれのドメインも、抗体のＦｃ領域、Ｆａｂ領域、および、Ｆａｂ領域中の特にＦｖ領域に結合する活性を有する。なお、本発明においてプロテインＡの由来は特に限定されないが、微生物であるスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に由来するプロテインＡであることが好ましい。
　プロテインＧは、ストレプトコッカス属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）によって生産される細胞壁タンパク質の１種であり、その免疫グロブリン結合ドメイン（Ｂ１、Ｂ２ドメインおよびＣ１－Ｃ３ドメイン）はほとんどの哺乳動物のＩｇＧのＦｃ領域と結合活性を示し、抗体のＦａｂ領域にも弱く結合する活性を有する。なお、本発明においてプロテインＧの由来は特に限定されないが、微生物であるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．）に由来するプロテインＧであることが好ましい。
　プロテインＬはペプトストレプトコッカス・マグニウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）によって生産されるタンパク質の１種であり、その免疫グロブリン結合ドメイン（Ｂ１－Ｂ５ドメインおよびＣ１－Ｃ４ドメイン）は、免疫グロブリンのｋ軽鎖（ｋ１、ｋ３、ｋ４）との結合活性を示し、種々の動物種の抗体に結合する。また、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ）やＦａｂとも結合することができる。なお本発明においてプロテインＬの由来は特に限定されないが、微生物であるペプトストレプトコッカス・マグニウス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ・ｍａｇｎｕｓ）に由来するプロテインＬであることが好ましい。
　本発明において「ポリペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆる「タンパク質」のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。また、「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なタンパク質の単位をいう。
　本発明における遺伝子組換え体とは、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む発現ベクターを宿主となる細胞へ導入した形質転換細胞である。
　前記宿主とは免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換され、導入されたＤＮＡを発現してポリペプチドを生産することができる微生物であれば、特に制限するものではない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属及びストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クライベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、及びキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属など宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属など宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特にＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞、蚕などの昆虫（Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２－５９４（１９８５））、菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌および酵母が好ましく、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属またはブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌またはピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属酵母が特に好ましい。
　遺伝子を挿入するための発現ベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。遺伝子を挿入するためのベクターは、例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社製）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社製）、および、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）のベクターなどが挙げられる。ブレビバチルス属細菌を宿主として用いる場合には、例えば、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、または、ｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、または、大腸菌とブレビバチルス属細菌とのシャトルベクターであるｐＮＣＭＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）などを使用することができる。ピキア属酵母を宿主として用いる場合にはｐＰＩＣＨＯＬＩ、ｐＨＩＰ、ｐＨＲＰ、ｐＨＡＲＳなどが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
　宿主細胞へのベクターの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法、または、ポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。
　前記遺伝子組換え体を用いて目的のポリペプチドを製造する場合、遺伝子組換え体を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に目的のポリペプチドを生成蓄積させることにより製造することができ、該培養物から所望のポリペプチドを採取することができる。
　遺伝子組換え体を用いてポリペプチドを製造する場合には、遺伝子組換え体の細胞内および／またはペリプラズム領域内にポリペプチドを蓄積することも可能である。この場合、細胞内に蓄積すると、ポリペプチドの酸化を防ぐことができ、培地成分との副反応もない点で有利であり、ペリプラズム領域内に蓄積すると、細胞内プロテアーゼによる分解を抑えることができる点で有利である。一方、ポリペプチドを製造する場合に、形質転換体の細胞外にポリペプチドを分泌することも可能である。この場合、菌体破砕や抽出の工程が不要となるため、製造コストが抑えられる点で有利である。
　前記工程（１）の遺伝子組換え体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、目的のポリペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を含む培地を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ポリペプチドの分解、低分子化を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ　ｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）、および／または、その他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明の目的ポリペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。この場合、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明の目的ポリペプチドと共存させることができる。なお、本発明の目的ポリペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、例えば、ＬＢ培地（トリプトン　１％、酵母エキス　０．５％、ＮａＣｌ　１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、ＮａＣｌ　０．５％）等が挙げられる。
　ブレビバチルス属細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＴＭ培地（ペプトン　１％、肉エキス　０．５％、酵母エキス　０．２％、グルコース　１％、ｐＨ７．０）、または、２ＳＬ培地（ペプトン　４％、酵母エキス　０．５％、グルコース　２％、ｐＨ７．２）等が挙げられる。
　ピキア属酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えば、ＹＰＤ培地（１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％　ｔｒｙｐｔｏｎｅ　ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製），２％　ｇｌｕｃｏｓｅ）等が挙げられる。
　また、培養温度は、１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明の目的ポリペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。
　前記工程（２）－（ａ）における「培養液」とは、前記工程（１）にて得られた培養液をそのまま用いても良いし、リゾスタフィンまたはリゾチームあるいはリチケースといった酵素や、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、両イオン性の界面活性剤を添加しても良いが、この方法に限定されるものではない。
　前記工程（２）－（ｂ）における「培養上清」は、目的ポリペプチドが培養溶液（細胞外）に蓄積している場合に用いる。前記工程（２）－（ｃ）における「菌体の懸濁液」は、目的ポリペプチドが培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積している場合に用いる。前記工程（２）－（ｂ）または（２）－（ｃ）において、前記工程（１）にて得られた培養液から菌体または培養上清を分離除去する方法としては、以下の方法に限られるものではないが、培養終了後に、培養液を静置または遠心分離したのちに培養上清を回収することで菌体と分離することができる。また、該培養液をデッドエンドろ過またはクロスフローろ過のいずれかのろ過方式にて処理することによっても分離することができる。また、該培養液をアコースティックウェーブセパレーションによって処理することで、分離することもできる。さらに、前記デッドエンドろ過、クロスフローろ過、アコースティックウェーブセパレーションによる処理は該培養液を遠心分離した後に行なっても良いし、該培養液をそのまま用いても良い。
　前記デッドエンドろ過とはフィード溶液がメンブレンに対して垂直に移動するろ過方式であり、ろ液はメンブレンを通過する。デッドエンドろ過により、前記菌体と培養上清を分離する方法としては、ボトルトップフィルターや遠心式フィルターユニットを用いた該培養液の精密ろ過または限外ろ過が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
　前記クロスフローろ過とは、フィード溶液が膜表面に平行に移動するろ過方式であり、ろ液はメンブレンを通過する。クロスフローろ過により、前記菌体と培養上清を分離する方法としては、カセットメンブレンあるいは中空子を用いた該培養液の精密ろ過または限外ろ過が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
　前記、アコースティックウェーブセパレーションによる処理とは、フィード溶液に定在波を照射することにより、定在波の節の位置に不溶物を集め、沈降させることで、フィード溶液中の不溶物と上清を分離する方法である。アコースティックウェーブセパレーションにより、前記菌体と培養上清を分離する方法としては、アコースティックウェーブセパレーターによって該培養液を処理する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。
　前記デッドエンドろ過を行なう場合のボトルトップフィルターとしては、
Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　ＰＥＳ　膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター　０．４５μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　ＰＥＳ　膜付き滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター　０．２μｍ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）
ＩＷＡＫＩ　ボトルトップフィルター５００ｍＬ　ＰＥＳ　０．２２ｕｍ　３３口径（ＡＧＣテクノグラス・ＩＷＡＫＩ社）
Ｂｏｔｔｌｅ　ｔｏｐ　ｖａｃｕｕｍ　ｆｉｌｔｅｒ　０．２２μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）
Ｂｏｔｔｌｅ　ｔｏｐ　ｖａｃｕｕｍ　ｆｉｌｔｅｒ　０．４５μｍ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記デッドエンドろ過を行なう場合の遠心式フィルターユニットとしては、
Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－３Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－５Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－１０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－３０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－５０Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－１００Ｋ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　３ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　１０ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　３０ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　５０ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５　１００ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記クロスフローろ過を行なう場合のカセットメンブレンとしては、
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．６５μｍ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．２２μｍ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．４５μｍ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
ＰｅｌｌｉｃｏｎＸＬ　５０　精密ろ過モジュール　０．１０μｍ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０　ｃｍ2，　５　ＫＤ，　ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０　ｃｍ2，　１０　ＫＤ，　ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０　ｃｍ2，　３０　ＫＤ，　ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０　ｃｍ2，　５０　ＫＤ，　ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｋｖｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　５０　ｃｍ2，　１００　ＫＤ，　ＰＥＳ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　　５ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　　８ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　　１０ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　　３０ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　　５０ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
Ｐｅｌｌｉｃｏｎ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ－Ｂｉｏｍａｘ(R)　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ ・ Ａ　Ｓｃｒｅｅｎ　　１００ｋＤａ（ＭＥＲＫ　ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記クロスフローろ過を行なう場合のホロファイバーとしては、
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　０．１　ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　０．２　ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　０．４５　ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　０．６５　ｍｉｃｒｏｎ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　１　ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　３　ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　１０　ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　３０　ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　５０　ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＭｉｄＧｅｅ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，　１００　ｋＤ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記、アコースティックウェーブセパレーターとしては、
ケイデンス　Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（ＰＡＬＬ社）
が挙げられるが、これに限定されない。
　前記工程（２）－（ｂ）における培養上清とは、宿主より分泌生産された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む溶液である。前記工程（１）にて得られた培養液から菌体を取り除いた培養上清をそのまま用いても良いし、酸、アルカリ等で中性にｐＨ調整しても良いし、中性バッファーで希釈しても良い。この時に用いる酸としては、ギ酸、酢酸、リン酸、塩酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニア、酢酸Ｎａ等が挙げられるが、該ポリペプチドの免疫結合活性を失わせることなくｐＨ調整できるものであればこれらに限定されるものではない。また、中性バッファーとしては該ポリペプチドが免疫グロブリン結合活性を失うことの無い緩衝液であれば特に限定されないが、例えば酢酸－酢酸Ｎａ緩衝液やリン酸Ｎａ緩衝液、リン酸Ｋ緩衝液、トリス－塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等を用いればよい。
　前記工程（２）－（ｃ）における菌体の懸濁液は、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む懸濁液であり、前記工程（１）にて得られた培養液から培養上清を取り除いた菌体を中性バッファーで懸濁したものであっても良いし水で希釈後、酸やアルカリで中性にｐＨ調整しても良い。この時に用いる酸としては、ギ酸、酢酸、リン酸、塩酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニア、酢酸Ｎａ等が挙げられるが、該ポリペプチドの免疫結合活性を失わせることなくｐＨ調整できるものであればこれらに限定されるものではない。また、中性バッファーとしては該ポリペプチドが免疫グロブリン結合活性を失うことの無い緩衝液であれば特に限定されないが、例えば酢酸－酢酸Ｎａ緩衝液やリン酸Ｎａ緩衝液、リン酸Ｋ緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液等を用いればよい。
　前記工程（２）－（ｄ）における菌体破砕後液とは、前記工程（２）－（ｃ）の菌体の懸濁液中の菌体を破砕することで得られた懸濁液のことである。菌体は完全に破砕されている必要はなく、例えば、ペリプラズム領域に該ポリペプチドが蓄積している場合は、外膜を部分的に破壊して得られた懸濁液も菌体破砕後液に含まれる。ここで、菌体破砕の方法としては特に限定されないが、懸濁液中の菌体が十分に破砕されるものであれば良く、例えば浸透圧ショック法、凍結融解法、界面活性剤による破砕法、酵素消化法、超音波処理法、フレンチプレス法、乳鉢による粉砕法、ホモジナイザーによる破砕法、ガラスビーズによる破砕法、サンプル破砕キットによる破砕法等が挙げられ、より好ましくは超音波処理法、ホモジナイザーによる破砕法であれば懸濁液中の菌体を十分に破砕できる。
　前記工程（２）－（ｅ）における菌体破砕後上清とは、前記工程（２）－（ｄ）の菌体破砕後液から不溶性沈殿物を除去した上清のことである。不溶性沈殿の除去方法としては前記工程（１）にて得られた培養液から培養上清あるいは菌体を分離する方法と同様の方法を用いることができるが、これに限定されない。
　前記工程（２）における酸性条件は宿主となる微生物の菌体成分および細胞質内またはペリプラズムまたは細胞外に生産された宿主由来の夾雑タンパク質および核酸が特異的に沈殿する範囲であればよく、好ましくはｐＨ３．０～６．０、より好ましくはｐＨ３．２～５．９、より好ましくはｐＨ３．４～５．８、より好ましくはｐＨ３．６～５．７、より好ましくはｐＨ３．８～５．６であれば良い。
　前記工程（２）において前記工程（１）にて得られた免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか一つ以上のｐＨを調整するための酸やアルカリとしては該ポリペプチドの免疫結合活性を失わせることなくｐＨ調整できるものであればこれらに限定されるものではないが、酸としては、ギ酸、酢酸、リン酸、塩酸、硝酸、硫酸などが挙げられ、アルカリとしては、水酸化ナトリウム、アンモニア、酢酸Ｎａ等が挙げられる。また、ｐＨ調整する方法としては、前記培養液、前記培養上清、前記菌体の懸濁液、前記菌体破砕後液または前記菌体破砕後上清をプラスチックボトル中で均一に攪拌しながらｐＨメーターやｐＨ試験紙でｐＨをモニタリングし、水で５Ｍに希釈した酢酸溶液をピペットを用いて滴下する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また前記ｐＨ調整は安全上の観点から温度調節を行う前に行なうことが好ましいが、温度調節中または温度調節後に行うこともできる。
　前記工程（２）における温度は宿主となる微生物の細胞質内またはペリプラズムまたは細胞外に生産された宿主由来の夾雑タンパク質が特異的に沈殿する範囲であればよく、温度は好ましくは５０℃～７０℃、より好ましくは５１℃～６９℃、より好ましくは５２℃～６８℃、より好ましくは５３℃～６７℃、より好ましくは５４℃～６６℃、さらに好ましくは５５℃～６５℃の範囲であれば良い。また、温度調節の方法としては以下の方法に限られるものではないが、温度調節機器によって前記温度範囲内に保った水浴に前記ｐＨ調整後の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液または培養上清、菌体の懸濁液またはその菌体破砕後液もしくはその菌体破砕後上清を含んだプラスチックボトルを入れ、均一に攪拌しながら温度計で該溶液内の温度が前記温度範囲内に達するまでモニタリングする方法が挙げられる。また温度調節は安全上の観点からｐＨ調整後に行なうことが好ましいが、ｐＨ調整前またはｐＨ調整中に行なうこともできる。
　前記工程（２）において酸性で加熱処理する方法としては、温度調節機器によって前記温度範囲内に保った水浴により前記ｐＨおよび温度調整後の免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを含む培養液、その培養上清、前記培養液中の菌体の懸濁液、その菌体破砕後液およびその菌体破砕後上清のいずれか一つ以上を均一に攪拌しながら３０分から１時間処理し、その後、水浴の温度を２５℃とすることで、該溶液の温度を２５℃まで低下させる方法が挙げられるが、これに限定されない。
　前記工程（３）における沈殿を分離する工程とは、前記工程（２）の酸性加熱処理により生じた夾雑タンパク質などの沈殿を分離する工程であり、宿主由来の細胞成分、夾雑タンパク質および核酸からなる沈殿と免疫グロブリン結合活性を有するポリプチドを含む上清を分離できる方法であれば、特に限定されないが、前記工程（１）にて得られた培養液から培養上清あるいは菌体を分離する方法と同様の方法にて分離することができる。
　前記工程（３）の後に、クロマトグラフィーにより、目的ポリペプチドを含む上清から目的ポリペプチドを精製しても良い。使用するクロマトグラフィー担体としては、前記（１）～（３）の工程後の上清から免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを回収精製できる方法であれば特に限定されないが、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーといったクロマトグラフィー担体が挙げられ、これらを単独で使用しても良いし、組み合わせて使用しても良い。また、酸性加熱処理後の該ポリペプチドを含む溶液をｐＨ調整等することなくそのまま負荷できるという利点から、特に陽イオン交換クロマトグラフィー、ミックスモードクロマトグラフィーが好ましく、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いるとさらに良い。
　前記陰イオン交換クロマトグラフィーに用いられる陰イオン交換樹脂は、陰イオン交換作用を示すものであれば限定されない。陰イオン交換樹脂としては、
Ｃａｐｔ　Ｑ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｃａｐｔ　ＤＥＡＥ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）Ｃａｐｔ　Ｑ　ＩｍｐＲｅｓ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＲＥＳＯＵＲＣＥ　Ｑ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＳＯＵＲＣＥ　３０Ｑ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　Ｑ　（ＹＭＣ社）
ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　ＤＡ　（ＹＭＣ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＳｕｐｅｒＱ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐＱ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＤＥＡＥ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　ＤＥＡＥ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｑ－ｒ　（ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｑ－ｈ　（ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　ＤＥＡＥ　（ＪＮＣ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記陽イオン交換クロマトグラフィーに用いられる陽イオン交換樹脂は、陽イオン交換作用を示すものであれば限定されない。陽イオン交換樹脂としては、
Ｃａｐｔ　Ｓ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｃａｐｔ　ＳＰ　ＩｍｐＲｅｓ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＲＥＳＯＵＲＣＥ　Ｓ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＳＯＵＲＣＥ　３０Ｓ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　Ｓ　（ＹＭＣ社）
ＹＭＣ　ＢｉｏＰｒｏ　ＣＭ　（ＹＭＣ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＳＰ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　Ｓ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＣＭ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＧｉｇａＣａｐ　ＣＭ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｓ－ｒ　（ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｓ－ｈ　（ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　ＣＭ　（ＪＮＣ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記疎水クロマトグラフィーに用いられる疎水クロマトグラフィー樹脂は、疎水相互作用を示すものであれば限定されない。疎水クロマトグラフィー樹脂としては、
Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｂｕｔｈｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｂｕｔｈｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｏｃｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｂｕｔｈｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ　ＨＩＣ　（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｅｔｈｙｌ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＰＰＧ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｐｈｅｎｙｌ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　Ｂｕｔｈｙｌ－６５０　（ＴＯＳＯＨ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｐｈｅｎｙｌ　（ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｂｕｔｈｙｌ　（ＪＮＣ社）
Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＬＳ　（ＪＮＣ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー樹脂としては、
Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社）
Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｆｌｕｏｌｏａｐａｔｉｔｅ　（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社）
ＭＰＣ　Ｃｅｒａｍｉｃ　ＨｙｄｒｏｘｙＦｌｕｏｌｏａｐａｔｉｔｅ　（Ｂｉｏ－Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　社）
ＨＡ　Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　（ＰＡＬＬ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、ミックスモードクロマトグラフィー樹脂としては、
Ｃａｐｔ　ＭＭＣ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｃａｐｔ　Ａｄｈｅｒｅ　（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
Ｅｓｈｕｍｕｎｏ　ＨＣＸ　（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
などが挙げられるが、これらに限定されない。
　また、アフィニティークロマトグラフィー樹脂としては、
ＩｇＧ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）
などが挙げられるが、これに限定されない。
　本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合親和性を有することを特徴とするアフィニティーリガンドとして利用することができる。即ち、当該ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化したアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンをアフィニティーカラムクロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。
　前記ポリペプチドを、水不溶性の基材からなる担体にアフィニティーリガンドとして固定化して、アフィニティー分離マトリックスを製造することができる。ここで、「アフィニティーリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集（結合）する物質（官能基）を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。本明細書においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティーリガンド」と同意である。
　本発明に用いる水不溶性の基材からなる担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－１０００、メタクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。ただし、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティー分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基、または、チオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、担体を臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジン、および、過ヨウ素酸ナトリウムなどと反応させて担体を活性化し（あるいは担体表面に反応性官能基を導入し）、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。したがって、固定化のために、本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドに対して、化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。
　アフィニティー分離マトリックスは、本発明の精製方法により精製した、免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを固定化して得られるので、前記ポリペプチド自体の活性に基づき、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合することができる。よって、本発明の精製方法により精製したポリペプチドおよびアフィニティー分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質をアフィニティーカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。「免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質」とは、前記ポリペプチドが結合するタンパク質のことである。ただし、前記ポリペプチドが結合できれば、Ｆｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域を完全に含むポリペプチドである必要はない。
　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質としては、免疫グロブリンＧ、または、免疫グロブリンＧ誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　前記「免疫グロブリンＧ誘導体」とは、例えば、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧや、ヒト免疫グロブリンＧのＣＤＲ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｇ Ｒｅｇｉｏｎｓ）部分を他生物種抗体のＣＤＲ部分に置き換えて融合させたヒト型化免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、ヒト免疫グロブリンＧのＦｖ領域とＦｃ領域とを融合させた人工免疫グロブリンＧなどの、本発明の精製方法にて精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドが結合し得る改変型人工タンパク質を総称する名称である。
　また、結合する領域をＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域というように広く定義したが、抗体の立体構造はすでに既知であるので、本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドおよびアフィニティー分離マトリックスが結合する対象となるタンパク質は、タンパク質工学的に該ポリペプチドが結合する領域の立体構造を保持した上で、Ｆｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域にさらなる改変（断片化など）が施されたものであってもよい。
　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させ、前記タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる工程（吸着工程）、および、アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程（溶出工程）により、前記タンパク質を高純度に回収精製できる。
　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の精製方法の吸着工程では、前記タンパク質を、担体に固定化されたリガンドを含むアフィニティー分離マトリックスと接触させることにより吸着させる。具体的には、前記タンパク質を含有する液体試料を中性となるように調整した後、該液体試料をアフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラムに通過させ、前記タンパク質を吸着させる。液体試料の溶媒としては、緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、クエン酸、２－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＥＳ）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＤＡ）、Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，４－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ－（２－Ａｃｅｔａｍｉｄｏ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＡＣＥＳ）、３－（Ｎ－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－Ｂｉｓ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＢＥＳ）、３－（Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）、Ｎ－Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＥＳ）、４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）、Ｔｒｉｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ、３－［４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｔｒｉｓ、Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ、もしくはＢｉｃｉｎｅ、ＮＴｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ－３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＡＰＳ）を含む緩衝液、およびダルベッコリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液が挙げられる。前記タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる際のｐＨは、ｐＨ６．５～８．５であることが好ましく、ｐＨ７～８であることがより好ましい。前記タンパク質をアフィニティー分離マトリックスに吸着させる際の温度は、１～４０℃であることが好ましく、４～２５℃であることがより好ましい。
　吸着工程に次いで、アフィニティーカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄してもよい。この時点では免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質はカラム内のアフィニティー分離マトリックスに吸着されている。洗浄のために使用する緩衝液は、吸着工程で使用する緩衝液と同じものを使用できる。
　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の精製方法の溶出工程では、ｐＨ２．７以上の溶出液をアフィニティー分離マトリックスと接触させ、前記タンパク質を溶出させる。溶出液としては、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、ギ酸緩衝液、プロピオン酸緩衝液、γ－アミノ酪酸緩衝液、乳酸緩衝液が挙げられる。
　溶出液のｐＨは、ｐＨ２．７以上であれば抗体を回収することが可能であるが、より高いｐＨの溶出液を用いれば抗体の凝集や活性低下を回避できるため好適である。具体的には、ｐＨ３．０以上がより好ましく、ｐＨ３．５、ｐＨ３．７５、ｐＨ３．８、ｐＨ３．９以上がさらに好ましく、ｐＨ４.０以上が最も好ましい。溶出液のｐＨの上限はｐＨ６．０であることが好ましい。
　アフィニティー分離マトリックスからの免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の溶出には複数のｐＨの溶出液を用いて段階的に溶出することも可能である。また、ｐＨの異なる２種類以上の溶出液（例えばｐＨ６とｐＨ３）を用いたグラジエント溶出でｐＨに勾配をつけて溶出すれば、より高度に精製できるため、好適である。吸着時、洗浄時、溶出時の緩衝液には界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０やＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）やカオトロープ剤（例えば、尿素やグアニジン）、アミノ酸（例えば、アルギニン）を添加することも可能である。
　同様に、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を溶出させる際の、アフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラム内のｐＨは、ｐＨ２．７以上であることが好ましく、ｐＨ３．０以上であることがより好ましく、ｐＨ３．６、ｐＨ３．７５、ｐＨ３．８、ｐＨ３．９以上であることがさらに好ましく、ｐＨ４．０以上であることが最も好ましい。ｐＨ３．０以上の条件で溶出すると、前記タンパク質へのダメージを低減できる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ., ２００５, ９２(６)：６６５－６７３）。また、前記タンパク質を溶出させる際の、アフィニティー分離マトリックスを充填したアフィニティーカラム内のｐＨの上限はｐＨ６．０であることが好ましい。
　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を溶出する際の温度は、１～４０℃であることが好ましく、４～２５℃であることがより好ましい。
　本発明の精製方法により回収される免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の回収率は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。回収率は、例えば、下記式により算出される。
　　回収率（％）＝［｛（溶出した免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ））×（溶出した液量（ｍＬ））｝／｛（負荷した免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の濃度（ｍｇ／ｍＬ））×（負荷した液量（ｍＬ））｝］×１００
　本発明の精製方法では、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を発現させるための宿主に由来するタンパク質の混入を低減できる。これらのタンパク質の混入により、抗体の製造における精製工程の負荷増大（工数の増加や収率の低減）や不純物タンパク質が医薬品として重大な副作用をもたらす可能性があるが、本発明の精製方法ではこれらの問題を回避できる。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスは免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質と宿主由来タンパク質を分離するのに効果的である。宿主細胞タンパク質の由来となる宿主細胞は前記タンパク質を発現できる細胞であり、特に遺伝子組換え技術が確立されているＣＨＯ細胞や大腸菌が例として挙げられる。これらの宿主由来タンパク質は、市販のイムノアッセイキットによって定量することが可能である。例えば、ＣＨＯ　ＨＣＰ　ＥＬＩＳＡキット（Ｃｙｇｎｕｓ社）を用いれば、ＣＨＯ細胞由来のタンパク質を定量できる。
　本発明のアフィニティー分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液（適当な変性剤、または、有機溶剤を含む溶液の場合もある）を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。
　本発明の精製方法により精製した免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドおよびアフィニティー分離マトリックスの、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・ジャパン（株）製）などのバイオセンサーによって試験することができる。本発明のタンパク質が有する免疫グロブリンに対する親和性は、ヒト免疫グロブリンＧ製剤に対する親和性を後述のＢｉａｃｏｒｅシステムにより測定した時に、結合定数（ＫA）が１０6（Ｍ-1）以上であることが好ましく、１０7（Ｍ-1）以上であることがより好ましい。
　上記親和性の測定条件としては、本発明の精製法にて精製された免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれかに結合した時の結合シグナルが検出できる条件であればよく、温度２０～４０℃（一定温度）にて、ｐＨ６～８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
　結合相手の免疫グロブリン分子としては、例えば、ポリクローナル抗体であるガンマグロブリン・ニチヤク（ヒト免疫グロブリンＧ）（日本製薬）や市販医薬品のモノクローナル抗体が挙げられる。
　親和性の違いは、同じ測定条件にて、同じ免疫グロブリン分子に対する結合反応曲線を得て、解析した時に得られる結合パラメータにて、変異を導入する前のタンパク質と変異を導入した後のタンパク質とを比較することで当業者が容易に検証することができる。
　結合パラメータとしては、例えば、結合定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明で得られたポリペプチドとＦａｂの結合定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＶＨ３サブファミリーに属する免疫グロブリンのＦａｂフラグメントを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、ポリペプチドを流路添加する実験系で求めることができる。なお、文献によっては結合定数は親和定数と表記されることもあるが、基本的に両者の定義は同じである。
　本願は、２０１７年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１７－９１６０７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１７年５月２日に出願された日本国特許出願第２０１７－９１６０７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　本実施では、組換えＤＮＡの作製や操作などは特に断わらない限り下記の実験書に従って実施した。
　・　Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ著、「モレキュラー・クローニング／ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ／Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ刊（米国）
　・　村松正實編著「ラボマニュアル遺伝子工学」、第３版（１９９６）、丸善株式会社刊。
　また、本実施例で用いる試薬、制限酵素等については特に明記しない限り、市販品を用いた。
　参考例１：　プロテインＧを含む菌体破砕上清の調製
　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＧＸ７８０９株が生産する野生型プロテインＧの免疫グロブリン結合領域を含むポリペプチドＳＰＧ・２ｄ（配列番号２０）をコードするＤＮＡの５’末端にＮｄｅＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２１）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したベクターｐＵＣＳＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）へライゲーションし、ＳＰＧ・２ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがベクターｐＵＣＳＮＴに挿入された発現プラスミドを調製した。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉＨＢ１０１株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＳＰＧ・２ｄを生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬの２ＹＴ培地（ポリペプトン　１．６％、酵母エキス　１．０％、塩化ナトリウム　０．５％）にて、３７℃で２４時間、振盪培養した。培養後、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により培養上清を除去し、菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、超音波破砕機により菌体破砕した。遠心分離により、沈殿を除去し、ＳＰＧ・２ｄの菌体破砕上清を得た。
　参考例２：　プロテインＡを含む培養上清の調製
　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＣｏｗａｎＩ株（ＡＴＣＣ１２５９８）が生産する野生型プロテインＡの免疫グロブリン結合領域（Ｅ・Ｄ・Ａ・Ｂ・Ｃドメイン）を含むポリペプチドＳＰＡ・５ｄ（配列番号２２）をコードするＤＮＡの５’末端にＮｃｏＩ認識サイト、３’末端にＢａｍＨＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２３）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＳＰＡ・５ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ・ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を用いた。
　Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ　ＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＳＰＡ・５ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン　３．０％、酵母エキス　０．５％、グルコース　３％、硫酸マグネシウム　０．０１％、硫酸鉄　０．００１％、塩化マンガン　０．００１％、塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液から遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２５℃、５分間）により菌体を除去し、ＳＰＡ・５ｄの培養上清を得た。
　参考例３：　プロテインＬを含む培養上清の調製
　Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｍａｇｎｕｓ３１２株由来株が生産する野生型プロテインＬの免疫グロブリン結合領域を含むポリペプチドＰＰＬ・５ｄ（配列番号２４）をコードするＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２５）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＰＰＬ・５ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なお、プラスミドの調製にはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を用いた。
　Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ　ＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＰＰＬ・５ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を参考例３と同様に培養、菌体分離し、ＰＰＬ・５ｄの培養上清を得た。
　参考例４：　プロテインＬを含む菌体破砕後液の調製
　Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ　３３１６株が生産する野生型プロテインＬの抗体結合領域を含むポリペプチドＰＰＬ・４ｄ（配列番号２６）をコードするＤＮＡの５’末端にＮｄｅＩ認識サイト、３’末端にＰｓｔＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号２７）の人工合成遺伝子を、外注によって全合成した（ユーロフィンジェノミクス社）。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＰｓｔＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したベクターｐＵＣＳＮＴ（国際特許公報ＷＯ９４／０３６１３）へライゲーションし、ＰＰＬ・４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがベクターｐＵＣＳＮＴに挿入された発現プラスミドを調製した。
　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＨＢ１０１株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＰＰＬ・４ｄを生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を参考例１と同様に培養、菌体分離、菌体破砕し、ＰＰＬ・４ｄの菌体破砕後液を得た。
　実施例１
　（１）ＳＰＧ・２ｄ菌体破砕上清／大腸菌由来の酸性加熱処理
　大腸菌の菌体破砕後上清２０ｍＬに水を加え５倍希釈後、フィルターろ過（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５００ｍＬ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　Ｂｏｔｔｌｅ　Ｔｏｐ　Ｆｉｌｔｅｒ，０．２μｍ　ａＰＥＳ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，７５ｍｍ　ｄｉａ，４５ｍｍ　ｎｅｃｋ）することで培養上清を得た。この培養上清に１０ｍＭとなるよう１Ｍ酢酸Ｎａを加え、２．５ｍＬずつ５本の１５ｍＬ遠沈管に分注し、ｐＨを酢酸によりそれぞれ５．２、５．６、７．０に調整した。これらの溶液を各ｐＨにつき０．５ｍＬずつ４本の１．５ｍＬチューブに分注し、各ｐＨの溶液を２５℃、５５℃、６０℃、６５℃の各温度に設定したブロックヒーターにて６０分間、加熱処理した。さらに処理後の各サンプルを遠心分離（１２０００ｒｐｍ，５分間）した後に上清を回収した。回収した上清を１５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０で３倍希釈し、ＳＤＳＰＡＧＥにて分析した。また、得られた上清中に含まれるＳＰＧ・２ｄの純度をデンシトメトリー法にて求めた。結果を図１および図２に示す。
　（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
　各希釈液２０μＬを２倍濃縮のサンプル緩衝液（下記参照）にて希釈し、それぞれ４０μＬのサンプル溶液とした。これをｅ－パジェルＥ－Ｒ１５Ｌ（アトー製）１５％均一ゲルの各ウェルに１０μＬずつアプライし、電気泳動を行なった（４０ｍＡ、９０分）。その後、ゲルをＢｉｏ－Ｓａｆｅ　ＣＢＢ　Ｇ－２５０ステイン（バイオラッド）にて染色した。
　各緩衝液の組成は以下の通り
　・泳動緩衝液　（２５ｍＭ　トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１９２ｍＭ　グリシン、０．１％　ドデシル硫酸ナトリウム）
　・２倍濃縮サンプル緩衝液　（１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ　６．８）１２．４８ｍＬ、ブロモフェノールブルー　０．０２ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム　４ｇ、グリセロール　２８ｇ、超純水　３０ｍＬ）
　（３）デンシトメトリーによる純度の算出
　前記操作にて得られたゲルを画像データとし、ＩｍａｇｅＪ（Ｂｒｏｋｅｎ　Ｓｙｍｍｅｔｒｙ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ　１．４．３．６７）にて解析を行なった。ゲルの各レーンにおけるタンパク質由来バンドの全面積に対する目的物バンドの面積の割合を算出することで、各条件における目的物の純度を算出した。
　（４）結果
　図１および図２より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、ＳＰＧ・２ｄの純度は４７％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを５．２まで低下させてもＳＰＧ・２ｄの純度は３６％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを５．６以下で且つ温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＳＰＧ・２ｄの純度は８６％以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＳＰＧ・２ｄをより高純度に精製できることが分かる。
　実施例２
　（１）ＳＰＡ・５ｄ培養上清／ブレビバチルス由来の酸性加熱処理
　ブレビバチルスの菌体培養液１００ｍＬを遠心分離（７５００ｒｐｍ，１５分間）し、フィルターろ過（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５００ｍＬ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　Ｂｏｔｔｌｅ　Ｔｏｐ　Ｆｉｌｔｅｒ，０．２μｍ　ａＰＥＳ　ｍｅｍｂｒａｎｅ，７５ｍｍ　ｄｉａ，４５ｍｍ　ｎｅｃｋ）することで培養上清を得た。この培養上清に１０ｍＭとなるよう１Ｍ酢酸Ｎａを加え、２．５ｍＬずつ５本の１５ｍＬチューブに分注し、ｐＨを酢酸によりそれぞれ４．６、５．０、７．０に調整した。これらの溶液を各ｐＨにつき０．５ｍＬずつ４本の１．５ｍＬチューブに分注し、各ｐＨの溶液を２５℃、５５℃、６０℃、６５℃の温度に設定したブロックヒーターにて６０分間、加熱処理した。さらに処理後の各サンプルを遠心分離（１２０００ｒｐｍ，５分間）した後に上清を回収した。回収した上清を１５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．０で２倍希釈し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した。また、得られた上清中に含まれるＳＰＡ・５ｄの純度をデンシトメトリー法にて求めた。結果を図３および図４に示す。
　（２）結果
　図３および図４より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、ＳＰＡ・５ｄの純度は６４％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを４．６まで低下させてもＳＰＡ・５ｄの純度は６４％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを５．０以下、温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＳＰＡ・５ｄの純度は８５％以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＳＰＡ・５ｄをより高純度に精製できることが分かる。
　実施例３
　（１）ＰＰＬ・５ｄ培養上清／ブレビバチルス由来の酸性加熱処理
　培養上清の調製ｐＨを４．５、７．０とした以外は実施例２に記載の方法にて実験を行なった。デンシトメトリーによって求めた各条件におけるＰＰＬ・５ｄの純度を図５に示す。
　（２）結果
　図５より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱しても夾雑タンパク質の量に大きな変化は無く、ＰＰＬ・５ｄの純度は４９％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを４．５としてもＰＰＬ・５ｄの純度は５３％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを４．５、温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＰＰＬ・５ｄの純度は８９％以上となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＰＰＬ・５ｄをより高純度に精製できることが分かる。
　実施例４
　（１）ＰＰＬ・４ｄ菌体破砕上清／大腸菌由来の酸性加熱処理
　処理時の温度を２５℃、５５℃、６５℃、ｐＨを４．８、７．０とし、各条件における処理量を１ｍＬとした以外は、実施例１に記載の方法にて実験を行った。デンシトメトリーによって求めた各条件におけるＰＰＬ・４ｄの純度を図６に示す。
　（２）結果
　図６より、ｐＨ７．０にて加熱処理のみを行なった場合、６５℃まで加熱してもＰＰＬ・４ｄの純度は８８％までしか向上しなかった。また、２５℃にて酸性処理のみを行なった場合、ｐＨを４．８としてもＰＰＬ・４ｄの純度は７６％までしか向上しなかった。一方、ｐＨを４．８、温度を５５℃以上として酸性加熱処理を行なったところ、夾雑タンパク質の大部分が特異的に凝集沈殿し、ＰＰＬ・４ｄの純度は最高で９９％となり、高純度に精製できることが分かった。以上の結果より、酸性および加熱処理を組み合わせた場合、酸性処理または加熱処理のみを行なう場合に比べ、ＰＰＬ・４ｄをより高純度に精製できることが分かる。
　実施例５
　（１）ＳＰＡ・５ｄ培養上清／ブレビバチルス由来の酸性加熱処理後のフィルターろ過
　処理時の温度を２５℃、６０℃、６５℃とし、各条件における処理量を１ｍＬとした以外は、実施例２に記載の方法にて酸性加熱処理を行った。得られた酸性加熱処理液のうち０．８ｍＬを、０．２μｍフィルター（０．２２μｍ　ｐｏｒｅ　ｓｉｚｅ，４ｍｍ ｄｉａｍｅｔｅｒ，Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ　Ｄｕｒａｐｏｒｅ(R)（ＰＶＤＦ）ｍｅｍｂｒａｎｅ，ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）を装着した１ｍＬシリンジに投入後、シリンジの押子が止まるまでろ過した。ろ液を１．５ｍＬチューブに受け、ろ過前後のチューブ重量からろ液量を算出した。結果を図７に示す。
　（２）結果
　図７より、加熱処理（ｐＨ７．０　６０℃、ｐＨ７．０　６５℃）あるいは酸性処理（２５℃　ｐＨ４．６、２５℃　ｐＨ５．０）の場合、ろ過量は０．０５ｇから０．２４ｇであった。それに対して、加熱処理と酸性処理を組み合わせるとろ過量は増大し、６５℃　ｐＨ　４．６、６０℃　ｐＨ　４．６の処理ではそれぞれ０．３７ｇ、０．４ｇとなった。
　以上の結果から、酸性処理と加熱処理を組み合わせることによって酸性処理のみの場合に比べ約２倍、加熱処理のみに比べて約８倍も、ろ過量が向上することが分かった。
　実施例６
　（１）酸性加熱処理後の抗体結合活性を持ったポリペプチドの活性確認
　実施例５にて得られた４種の酸性加熱処理液（６０℃　ｐＨ　４．６、６０℃　ｐＨ５．０、６５℃　ｐＨ　４．６、６５℃　ｐＨ５．０）を１５ｍＬ遠沈管に集め、遠心分離により上清と沈殿に分離した（１２０００ｒｐｍ，５分間）。得られた上清に１Ｍトリス塩酸ｐＨ８．８を加えてｐＨを８．０とした。
　得られた溶液を、ＰＢＳにて平衡化したＩｇＧ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　ＦＦ（クロマトシステム：Ａｋｔａ　ａｖａｎｔ２５　ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カラム：ｏｍｎｉｆｉｔ　株式会社アイシス、内径６．６ｍｍ×高さ６．２ｃｍ）に１ｍＬ負荷した。その後ＰＢＳにて洗浄を行い、５ｍＭ酢酸アンモニウムー酢酸バッファー（ｐＨ　５．０）により中間洗浄を行った。５０ｍＭクエン酸（ｐＨ　３．０）により溶出を行い、ＰＢＳ　２Ｍ尿素により洗浄を行った。サンプル負荷、中間洗浄、溶出、洗浄工程のそれぞれにおいて、０．５ｍＬずつ溶出液を分取した。得られた溶出液を実施例１と同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分析した。得られたクロマトグラムと溶出液のＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図８および図９に示す。
　（２）結果
　図８および図９よりＳＰＡ・５ｄはフロースルー画分および押し出し画分には漏出せずにほぼ全て溶出画分に回収できたことが分かった。以上の結果より、ＳＰＡ・５ｄは酸性加熱処理後も抗体結合活性を保っていることが分かった。

Claims (7)

  1. 　下記工程（１）～（３）を含む免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドの精製方法。
    （１）免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを生産する遺伝子組換え体を培養する工程
    （２）下記（ａ）～（ｅ）のいずれか一つ以上を酸性で加熱処理する工程
    　（ａ）前記工程（１）にて得られた培養液
    　（ｂ）前記（ａ）の培養液から菌体を除去して得られた培養上清
    　（ｃ）前記（ａ）の培養液から培養上清を除去して得られた菌体の懸濁液
    　（ｄ）前記（ｃ）の菌体を破砕することで得られる菌体破砕後液
    　（ｅ）前記（ｄ）の菌体破砕後液から菌体を除去した菌体破砕後上清
    （３）沈殿を分離する工程
  2. 　前記工程（３）の後に沈殿分離後の上清をクロマトグラフィーにより処理する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の精製方法。
  3. 　前記ポリペプチドが、微生物由来である請求項１または２に記載の精製方法。
  4. 　前記ポリペプチドが免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上に結合するポリペプチドである請求項１～３のいずれかに記載の精製方法。
  5. 　前記ポリペプチドが以下の（ｘ）および（ｙ）からなる群より選択されるいずれかのポリペプチドを含有している請求項１～４のいずれかに記載の精製方法。
    　（ｘ）　配列番号１～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（ｙ）　配列番号１～１９のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  6. 　前記遺伝子組換え体が微生物である、請求項１～５のいずれかに記載の精製方法。
  7. 　免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質の製造方法であって、
    　請求項１～６のいずれかに記載の方法にて免疫グロブリン結合活性を有するポリペプチドを製造する工程、
    　前記ポリペプチドをリガンドとして水不溶性担体に固定化してアフィニティー分離マトリックスを製造する工程、
    　前記アフィニティー分離マトリックスと、免疫グロブリンのＦｃ領域、ＣＨ領域、ＶＨ領域、ＣＬ領域およびＶＬ領域のいずれか一つ以上を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    　アフィニティー分離マトリックスに結合した前記タンパク質を、アフィニティー分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
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