WO2016121703A1 - 変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド - Google Patents

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WO2016121703A1
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chain variable
amino acid
immunoglobulin
acid sequence
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吉田　慎一
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株式会社カネカ
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    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Definitions

  • the present invention relates to an immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having improved acid dissociation properties for the immunoglobulin ⁇ chain variable region, an affinity separation matrix having the peptide as a ligand, and an immunoglobulin ⁇ chain variable using the affinity separation matrix.
  • the present invention relates to a method for producing a region-containing protein, DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and a transformant transformed with the vector.
  • Protein A affinity separation matrix used to purify (capture) antibody drugs from animal cell cultures at a high purity at a time.
  • Monoclonal antibodies are basically developed as antibody drugs and are produced in large quantities using recombinant cultured cell technology.
  • “Monoclonal antibody” refers to an antibody obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell.
  • Most antibody drugs currently on the market are immunoglobulin G (IgG) subclass in terms of molecular structure.
  • antibody drugs comprising antibody derivatives (fragment antibodies) having a molecular structure obtained by fragmenting immunoglobulin have been actively developed, and various fragment antibody drugs have been clinically developed (Non-patent Document 3).
  • SpA affinity separation matrix is used for the initial purification step in the antibody drug manufacturing process.
  • SpA is basically a protein that specifically binds to the Fc region of IgG. Therefore, a fragment antibody that does not contain an Fc region cannot be captured using the SpA affinity separation matrix. Therefore, from the viewpoint of developing a platform for antibody drug purification process, there is a great industrial need for an affinity separation matrix capable of capturing a fragment antibody that does not contain the Fc region of IgG.
  • Non-Patent Document 4 A plurality of peptides that bind to regions other than the Fc region of IgG are already known (Non-Patent Document 4). Among them, a peptide that can bind to a variable region (antigen-binding domain) is most preferable from the viewpoint of the variety of fragment antibody formats that can be bound and the ability to bind to IgM and IgA.
  • protein L is sometimes abbreviated as “PpL”).
  • PpL is a protein containing a plurality of ⁇ chain variable region binding domains (hereinafter, the ⁇ chain variable region may be abbreviated as “VL- ⁇ ”), and the amino acid sequences of individual VL- ⁇ binding domains are different.
  • the number of VL- ⁇ binding domains and individual amino acid sequences differ depending on the type of strain.
  • the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL of Peptostreptococcus magnus 312 strain is 5, and the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL of Peptostreptococcus magnus strain 3316 Is four (Non-patent Documents 5 to 7, Patent Documents 1 and 2).
  • these nine VL- ⁇ binding domains there are no domains having the same amino acid sequence.
  • affinity separation matrices for purifying immunoglobulins or fragments thereof have been developed.
  • a neutral solution and an affinity separation matrix are generally contacted to selectively adsorb the immunoglobulin or fragment thereof and wash to remove impurities.
  • the adsorbed immunoglobulin or fragment thereof is then eluted with an acidic eluate.
  • the target compound, immunoglobulin or a fragment thereof may be damaged.
  • an object of the present invention is to provide an immunoglobulin capable of releasing the ⁇ chain variable region peptide by an acidic eluate having a relatively high pH while exhibiting an excellent selective adsorption ability for the ⁇ chain variable region peptide of the immunoglobulin.
  • An object is to provide a kappa chain variable region-binding peptide.
  • the present invention also provides an affinity separation matrix having the peptide as a ligand, a method for producing an immunoglobulin ⁇ chain variable region-containing protein using the affinity separation matrix, a DNA encoding the peptide, a vector containing the DNA, and the vector Another object is to provide a transformant transformed by the above.
  • the chromatographic profile varies greatly depending on the type of fragment antibody, even though the light chain is a kappa chain.
  • PpL protein L
  • the present inventor has designed a mutant of a kappa chain variable region binding domain of PpL and transformed the mutant using a protein engineering technique and a genetic engineering technique.
  • a study was conducted to compare the physical properties of the obtained mutants obtained from the cells. As a result, it was found that the above problem can be solved by introducing a specific mutation into the kappa chain variable region binding domain of protein L derived from Peptostreptococcus magnus, and the present invention was completed.
  • the immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide of any one of (1) to (3) below (1) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, one or more amino acid residues selected from the 15th, 16th, 17th and 18th positions are substituted, and An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide whose acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before introduction of substitution; (2) In the amino acid sequence of (1) above, 1 to 20 amino acid residues in the region excluding the 15th, 16th, 17th and 18th positions are deleted, substituted and An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having an amino acid sequence added and / or having an acid dissociation pH shifted to a neutral side compared to that before mutagenesis; (3) It has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of (1) above, and the acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before the mutation introduction.
  • Immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide (provided that the amino acid residue at one or more positions selected from the 15th, 16th, 17th and 18th positions in the amino acid sequence defined in (1) above) The substitution of (3) shall not be further mutated).
  • position 15 is His
  • position 16 is Ala
  • position 17 is His
  • position 18 is Asp, Gln or His.
  • the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide according to any one of [1] to [3] above, which is substituted.
  • An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide comprising a plurality of domains in which two or more immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptides according to any one of [1] to [6] are linked. Multimers.
  • the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide according to any one of [1] to [6] above or the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide multimer according to [7] above is used as a ligand.
  • a method for producing a protein comprising an immunoglobulin ⁇ chain variable region Contacting the affinity separation matrix according to the above [8] with a liquid sample containing a protein containing an immunoglobulin ⁇ chain variable region; and Separating the protein comprising the immunoglobulin kappa chain variable region bound to the affinity separation matrix from the affinity separation matrix.
  • the affinity separation matrix obtained by immobilizing the ⁇ chain variable region-binding peptide obtained by the present invention on an insoluble carrier exhibits an excellent selective adsorption ability for immunoglobulin ⁇ chain variable region-containing proteins. On the other hand, they exhibit mutually contradictory properties such as excellent acid dissociation properties.
  • excellent acid dissociation property means that the protein containing the ⁇ chain variable region is dissociated under more acidic elution conditions and the protein containing the ⁇ chain variable region is eluted under acidic conditions. It refers to the characteristic that the elution peak profile is sharper. As the elution peak of chromatography becomes sharper, it is possible to recover a higher concentration of antibody-containing eluate with a smaller volume of eluate.
  • FIG. 1 is an alignment of amino acid sequences of PpL-derived VL- ⁇ binding domains.
  • FIG. 2 shows LB5t-Wild. It is a figure which shows the preparation methods of the expression plasmid of 1d.
  • FIG. 3 is a chart of affinity purification chromatography when various LB5t mutants having mutations introduced at position 16 are added to an aRSV-Fab-immobilized carrier and eluted with a pH gradient.
  • the present invention relates to the immunoglobulin ⁇ chain variable region binding peptide of any one of (1) to (3) below.
  • (1) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, one or more amino acid residues selected from the 15th, 16th, 17th and 18th positions are substituted, and An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide whose acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before introduction of substitution;
  • (2) In the amino acid sequence of (1) above, 1 to 20 amino acid residues in the region excluding the 15th, 16th, 17th and 18th positions are deleted, substituted and An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide having an amino acid sequence added and / or having an acid dissociation pH shifted to a neutral side compared to that before mutagenesis;
  • It It has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence of (1) above, and the acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before the mutation introduction.
  • Immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide (provided that the amino acid residue at one or more positions selected from the 15th, 16th, 17th and 18th positions in the amino acid sequence defined in (1) above) The substitution of (3) shall not be further mutated).
  • Immunoglobulin is a glycoprotein produced by B cells of lymphocytes and has a function of recognizing and binding molecules such as specific proteins.
  • the immunoglobulin has a function of specifically binding to this specific molecule (antigen) and a function of detoxifying and removing factors having the antigen in cooperation with other biomolecules and cells.
  • Immunoglobulin is generally called “antibody”, which is a name that focuses on such a function. All immunoglobulins basically have the same molecular structure, and have a basic structure of a “Y” -shaped four-chain structure (two polypeptide chains each consisting of a light chain and a heavy chain).
  • Immunoglobulin G is a monomeric immunoglobulin and is composed of two heavy chains ( ⁇ chains) and two light chains, and has two antigen-binding sites.
  • the place corresponding to the vertical bar of the lower half of the “Y” of immunoglobulin is called the Fc region, and the “V” of the upper half is called the Fab region.
  • the Fc region has an effector function that induces a reaction after the antibody binds to the antigen, and the Fab region has a function of binding to the antigen.
  • the heavy chain Fab region and the Fc region are connected by a hinge part, and the proteolytic enzyme papain contained in papaya decomposes this hinge part and cleaves it into two Fab regions and one Fc region.
  • the portion near the tip of the “Y” in the Fab region is called a variable region (V region) because various changes in the amino acid sequence are seen so that it can bind to various antigens.
  • the variable region of the light chain is called the VL region, and the variable region of the heavy chain is called the VH region.
  • the Fab region and the Fc region other than the V region are regions with relatively little change, and are called constant regions (C regions).
  • the constant region of the light chain is referred to as the CL region, and the constant region of the heavy chain is referred to as the CH region.
  • the CH region is further divided into three, CH1 to CH3.
  • the heavy chain Fab region consists of a VH region and CH1, and the heavy chain Fc region consists of CH2 and CH3.
  • the hinge part is located between CH1 and CH2.
  • Protein L binds to a variable region in which the light chain is a ⁇ chain (sometimes abbreviated as “VL- ⁇ ” in the present specification) (Non-Patent Documents 5 to 7).
  • the ⁇ chain variable region-binding peptide according to the present invention binds to the ⁇ chain variable region of an immunoglobulin.
  • the VL- ⁇ chain variable region-containing protein to which the peptide of the present invention is to be bound is not limited as long as it contains an immunoglobulin ⁇ chain variable region, and may be an IgG containing a Fab region and an Fc region without deficiency, It may be other Igs such as IgM, IgD, and IgA, or may be a derivative of an immunoglobulin molecule that has been modified by protein engineering.
  • the immunoglobulin molecule derivative to which the VL- ⁇ chain variable region-binding peptide according to the present invention binds is not particularly limited as long as it is a derivative having a VL- ⁇ chain variable region.
  • Fab fragments fragmented only in the Fab region of immunoglobulin G, scFv consisting only of the variable region of immunoglobulin G, and partial domains of human immunoglobulin G are replaced with immunoglobulin G domains of other species.
  • Examples include fused chimeric immunoglobulin G, immunoglobulin G obtained by molecular modification of the sugar chain of the Fc region, and scFv fragment covalently bound to a drug.
  • peptide includes all molecules having a polypeptide structure, and includes not only so-called proteins, but also fragments and those in which other peptides are linked by peptide bonds.
  • a “domain” is a unit of protein conformation, which is composed of a sequence of tens to hundreds of amino acid residues, and is a unit of a peptide sufficient to express some physicochemical or biochemical function.
  • a “variant” of a protein or peptide refers to a protein or peptide in which at least one substitution, addition or deletion is introduced at the amino acid level with respect to the sequence of a wild-type protein or peptide.
  • the amino acid of a wild type or a non-mutation type is attached
  • the mutated amino acid is attached
  • G29A a mutation that replaces Gly at position 29 with Ala.
  • Protein L is a protein derived from the cell wall of anaerobic gram-positive cocci belonging to the genus Peptostreptococcus.
  • PpL derived from Peptostreptococcus magnus is preferable, and two types of PpL derived from Peptostreptococcus magnus 312 and Peptostreptococcus magnus 3316 are preferable, but are not limited thereto.
  • PpL of the Peptostreptococcus magnus 312 strain may be abbreviated as “PpL312”
  • PpL derived from the Peptostreptococcus magnus 3316 strain may be abbreviated as “PpL3316”.
  • the amino acid sequence of PpL312 is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of PpL3316 is shown in SEQ ID NO: 2 (including the signal sequence).
  • PpL contains a plurality of VL- ⁇ binding domains consisting of 70 to 80 residues in a protein.
  • the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL312 is five, and the number of VL- ⁇ binding domains contained in PpL3316 is four.
  • the VL- ⁇ binding domains of PpL312 are, in order from the N terminus, B1 domain (SEQ ID NO: 3), B2 domain (SEQ ID NO: 4), B3 domain (SEQ ID NO: 5), B4 domain (SEQ ID NO: 6), B5 domain (
  • the VL- ⁇ binding domain of PpL3316 is C1 domain (SEQ ID NO: 8), C2 domain (SEQ ID NO: 9), C3 domain (SEQ ID NO: 10), C4 domain (sequence) No. 11) (Non-Patent Documents 5 to 6).
  • FIG. 1 The amino acid sequence alignment of these various VL- ⁇ binding domains is shown in FIG.
  • the residue numbers given according to Non-Patent Documents 7 to 8 and Patent Document 9 are shown in parentheses. Studies have shown that about 20 residues at the N-terminus do not adopt a specific secondary structure, and retain the three-dimensional structure as a VL- ⁇ binding domain even when the N-terminal region is deleted, It shows VL- ⁇ binding (Non-patent Document 7).
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 for the B1 domain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 for the B2 domain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 for the B3 domain, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 for the B4 domain, and the B5 domain
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 for the C2 domain the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 for the C3 domain
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 for the C4 domain.
  • the peptide represented by the amino acid sequence also functions as a VL- ⁇ binding domain.
  • the amino acid sequence of the B5 domain of PpL312 shown herein is also preferably the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 16.
  • the amino acid sequence applied to the present invention is preferably an amino acid sequence (SEQ ID NO: 21) that comprehensively includes amino acid residues common to various domains (SEQ ID NOs: 12 to 20).
  • SEQ ID NO: 21 an amino acid sequence
  • the N-terminus of SEQ ID NO: 21 is defined as the first position, and an amino acid residue number is given.
  • residue numbers according to this definition are also shown, and further, Val from position 1 to various positions (SEQ ID NOs: 12 to 20) to Ala at position 60 are shown in bold.
  • the present invention introduces a specific amino acid substitution mutation into any of the wild-type PpL VL- ⁇ binding domains (B1-B5, C1-C4), thereby This is a technique characterized in that the acid dissociation pH is shifted to the neutral side compared to before the introduction of mutation.
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptide (1) dissociates the ⁇ chain variable region peptide under acidic elution conditions at a higher pH, as confirmed in the Examples below, and the ⁇ chain variable region.
  • the elution peak when the peptide is eluted under acidic conditions is sharper.
  • the amino acid residue substitution site according to the present invention is one or more amino acid residues selected from the 15th, 16th, 17th and 18th positions in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • position 15 is Gln
  • position 16 is Thr
  • position 17 is Ala
  • position 18 is Glu.
  • position 15 is Gln
  • position 17 is Ala
  • the 16th position is Asn in the amino acid sequence of the C1 domain (SEQ ID NO: 17)
  • the 18th position is Thr in the amino acid sequence of the B5 domain (SEQ ID NO: 16).
  • one or more amino acid residues selected from the 15th, 16th, 17th and 18th positions are substituted. It has an amino acid sequence.
  • the positions to be substituted are preferably 15th, 16th, 17th and 18th positions, more preferably 15th, 16th and 18th positions, still more preferably 16th and 18th positions, The 16th is most preferred.
  • the phrase “having a (specific) amino acid sequence” means that the peptide only needs to contain the specified amino acid sequence, and the function of the peptide is maintained. To do.
  • sequences other than the amino acid sequence specified in the peptide include a histidine tag, a linker sequence for immobilization, and a cross-linked structure such as an —SS— bond.
  • the type of amino acid to be mutated is not particularly limited, including substitution with non-protein constituent amino acids or non-natural amino acids, but natural amino acids can be suitably used from the viewpoint of genetic engineering production.
  • natural amino acids are classified into neutral amino acids; acidic amino acids of Asp and Glu; basic amino acids of Lys, Arg, and His.
  • Neutral amino acids are classified as aliphatic amino acids; Pro imino acids; Phe, Tyr, Trp aromatic amino acids.
  • Aliphatic amino acids are further classified into Gly; Ala; branched amino acids of Val, Leu and Ile; hydroxy amino acids of Ser and Thr; sulfur-containing amino acids of Cys and Met; and acid amide amino acids of Asn and Gln.
  • Tyr has a phenolic hydroxyl group, it may be classified not only as an aromatic amino acid but also as a hydroxy amino acid.
  • natural amino acids are Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Trp, Cys, Met, Pro, Phe highly non-polar amino acids; Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr Neutral polar amino acids; acidic polar amino acids such as Asp and Glu; basic polar amino acids such as Lys, Arg and His.
  • His, Asp, and Glu which are amino acids having a functional group that is protonated under acidic conditions in the side chain, can also be suitably used.
  • amino acid substituted at the 15th position Ala, Glu or His is preferable, and His is particularly preferable.
  • amino acid substituted at the 16th position Ala, Asp, Gly, Ile, Leu or His is preferred, and Ala, Asp or His is preferred.
  • Glu or His is preferable, and His is particularly preferable.
  • amino acid substituted at the 18th position Asp, Gln or His is preferable.
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region-binding peptide (2) is one or more in the region excluding the 15th, 16th, 17th and 18th positions in the amino acid sequence of (1) above.
  • the number of mutations in the above deletion, substitution and / or addition is preferably 15 or less or 10 or less, more preferably 7 or less, 5 or less or 3 or less, further preferably 1 or 2, and particularly preferably 1.
  • the position of deletion, substitution and / or addition of amino acid residues is the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptide.
  • amino acid residue deletion, substitution and / or addition positions include the N-terminus and / or C-terminus. These sites are particularly preferred as deletion and / or addition sites.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 12 to 21 are amino acid sequences in which 10 to 20 residues on the N-terminal side and 1-2 residues on the C-terminal side of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 11 are deleted. Accordingly, as one embodiment, the addition of amino acids to the N-terminal and / or C-terminal includes adding amino acid sequences derived from these amino acid sequences. In one embodiment, the amino acid sequence added to the N-terminus includes Glu-Glu or Glu-Gln. In one embodiment, the amino acid sequence added to the C-terminus includes Gly, Cys, or Gly-Cys.
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptide (3) has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence of (1) above, and the acid dissociation pH is mutated.
  • Immunoglobulin kappa chain variable region-binding peptide that is shifted to the neutral side as compared with that before introduction (provided that the amino acid sequence defined by (1) above, positions 15, 16, 17, and 18) Substitution of amino acid residues at one or more positions selected from the positions shall not be further mutated in (3)).
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptide (3) has an amino acid sequence having 80% or more sequence identity to the amino acid sequence defined in (1) above, and An immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide characterized in that the acid dissociation pH of an immunoglobulin ⁇ chain variable region-containing protein is shifted to the neutral side compared to that before mutation introduction (provided that (1) above)
  • the substitution of amino acid residues at one or more positions selected from positions 15, 16, 17, and 18 in the defined amino acid sequence shall not be further mutated in (3)).
  • sequence identity is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, 95% or more, 98% or more or 99% or more, and particularly preferably 99.5% or more.
  • sequence identity can be evaluated using Clustal (http://www.clustal.org/omega/), which is a program for multiple alignment of amino acid sequences.
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptides (1) to (3) according to the present invention have an acid dissociation pH with respect to an immunoglobulin ⁇ chain variable region (VL- ⁇ ) -containing protein as compared with that before the introduction of the mutation. It is characterized by shifting to the sex side. In general, under strong acid conditions or strong base conditions, bonds between peptides are lost due to changes in the molecular surface charge or steric structure changes due to denaturation. “Acid dissociation pH” is a pH at which the specific binding is lost and dissociated on the acidic side (pH having a value smaller than 7).
  • the acid dissociation pH can separate (elute) the VL- ⁇ -containing protein adsorbed on the affinity separation matrix having the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptides (1) to (3) according to the present invention as ligands. It can be said that it is the highest possible pH value. Therefore, in this specification, acid dissociation pH and acid elution pH are basically synonymous.
  • the acid dissociation pH is “shifted to the neutral side compared to before mutagenesis” because the pH value required for bond dissociation is smaller before mutagenesis and larger after mutagenesis. Means. That is, the bond is dissociated with a weaker acidic solution after mutagenesis.
  • the value of acid dissociation pH also varies depending on the type of VL- ⁇ -containing protein and the type and concentration of the buffer component in the acidic solution.
  • the type and structure of the water-insoluble carrier and the linker immobilization linker Since it varies depending on the type and structure, it is difficult to clearly indicate the numerical range.
  • the acid dissociation pH before introducing this mutation is about 2.0 or more and 3.5 or less, but by introducing the mutation according to the present invention, the pH is about 3.0 or more and 4.5 or less.
  • the present invention is not limited to this. Elution under these conditions causes little damage to the antibody (Ghose S. et al., Biotechnology amd bioengineering, 2005, Vol. 92, No. 6).
  • the acid dissociation pH is preferably shifted to 0.1 or more neutral side in terms of pH value, and may be shifted to 0.2 or more neutral side in terms of pH value. More preferably, the pH value is more preferably shifted to a neutral side of 0.3 or more, still more preferably the pH value is shifted to a neutral value of 0.4 or more, and the pH value is more preferably 0.5. It is even more preferable to shift to the neutral side.
  • the method for evaluating the acid dissociation pH before and after mutagenesis is not particularly limited as long as it is a technique capable of detecting an interaction between biomolecules.
  • a Biacore system GE Healthcare
  • a method for measuring the acid dissociation pH for example, one peptide to be bound is immobilized on a sensor chip, the other peptide solution adjusted to a desired pH is added to the flow path, the presence or absence of a binding signal is detected, and the binding signal is detected.
  • the present invention is not limited to this.
  • a buffer solution having a desired pH may be added, and the change in the binding signal remaining without being dissociated on the chip before and after the addition may be evaluated.
  • the temperature is a constant temperature of 20 to 40 ° C.
  • the pH when the binding state is observed is a neutral condition of pH 5 to 8.
  • the buffer component include phosphoric acid, tris, bistris and the like when neutral, and acetic acid, citric acid, glycine and the like when acidic, but are not limited thereto.
  • the NaCl concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is preferably about 0 to 0.15M, and particularly preferably 0M when viewing the dissociated state.
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptide may be immobilized on the chip (solid phase), or the flow channel addition side (liquid phase) Either can be evaluated.
  • the concentration at the time of adding the flow channel is adjusted so that the mutant VL- ⁇ chain variable region-binding peptide has the same concentration. Is preferably added to the flow path.
  • a method of evaluating a chromatographic profile using an affinity separation matrix is also preferable. For example, after binding one peptide to a chromatography column and connecting the column to a chromatography device, the other peptide solution is added to the column and adsorbed with a linear gradient that gradually decreases the pH. What is necessary is just to evaluate pH of the peak top which the peptide eluted, but it is not limited to this.
  • the temperature, buffer solution, and salt concentration during measurement preferably follow the above-mentioned conditions, but are not particularly limited thereto.
  • the components of the binding buffer (buffer A) and the dissociation buffer (buffer B) are preferably the same except for pH.
  • the mutant VL- ⁇ chain variable region-binding peptide may be immobilized on the column (solid phase), or added and eluted (liquid phase). Is possible.
  • the concentration at the time of addition to the column is adjusted, and the mutant VL- ⁇ chain variable region-binding peptide is aligned. It is preferable to add and compare the obtained chromatographic profiles.
  • VL- ⁇ chain variable region-binding peptides (1) to (3) according to the present invention can be retained on the column as an affinity ligand and exhibit excellent VL- ⁇ binding power.
  • the affinity for the VL- ⁇ chain variable region can be tested by, for example, a biosensor such as a Biacore system using the surface plasmon resonance principle, but is not limited thereto.
  • affinity constant K A
  • dissociation constant K D
  • the affinity constant between the VL- ⁇ chain variable region-binding peptide and the VL- ⁇ chain variable region-containing peptide according to the present invention is determined by immobilizing the VL- ⁇ chain variable region-containing peptide on the sensor chip using the Biacore system.
  • the VL- ⁇ chain variable region binding peptide according to the present invention can be determined in an experimental system in which a flow path is added under conditions of a temperature of 25 ° C. and a pH of 7.4.
  • the peptide having a sequence into which a mutation according to the present invention has been introduced preferably has an affinity constant (K A ) of 1 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 or more with a VL- ⁇ chain variable region-containing peptide, 5 ⁇ 10 6.
  • the affinity constant is not limited to this because it varies depending on the type of VL- ⁇ chain variable region-containing peptide and the number of domains of the VL- ⁇ binding peptide.
  • the VL- ⁇ chain variable region-binding peptide according to the present invention also includes, as one embodiment, two or more, preferably 3 VL- ⁇ chain variable region-binding peptides that are monomers or single domains. It may be a multimer of multiple domains linked by one or more, more preferably four or more, more preferably five or more.
  • the upper limit of the number of domains to be linked is, for example, 10 or less, preferably 8 or less, and more preferably 6 or less.
  • These multimers may be homopolymers such as homodimers and homotrimers that are linked to a single VL- ⁇ chain variable region binding peptide, the B1 to B4 domains of PpL312 and the C1 of PpL3316. As long as none of the .about.C4 domains is contained, it may be a heteropolymer such as a heterodimer or a heterotrimer which is a conjugate of a plurality of types of VL- ⁇ chain variable region binding peptides.
  • Examples of how the VL- ⁇ chain variable region binding peptide multimers according to the present invention are linked include a method of linking with one or a plurality of amino acid residues, and a method of directly linking without interposing amino acid residues. However, it is not limited to these methods.
  • the number of amino acid residues to be linked is not particularly limited, but is preferably 20 residues or less, more preferably 15 residues or less, still more preferably 10 residues or less, and even more preferably 5 residues. Or even more preferably 2 residues or less. These amino acid sequences are preferably those that do not destabilize the three-dimensional structure of the monomeric protein.
  • the VL- ⁇ chain variable region binding peptide or multimer thereof obtained by the present invention is fused with another peptide having a different function as one component.
  • a fusion peptide examples include, but are not limited to, peptides fused with albumin or glutathione S-transferase (GST).
  • GST glutathione S-transferase
  • a nucleic acid such as a DNA aptamer
  • a drug such as an antibiotic
  • PEG polyethylene glycol
  • the present invention includes the use of the peptide of the present invention as an affinity ligand characterized by having affinity for immunoglobulins and fragments thereof, particularly VL- ⁇ chain variable regions.
  • an affinity separation matrix characterized in that the ligand is immobilized on a water-insoluble carrier is also included as one embodiment.
  • the affinity separation matrix according to the present invention is the above-mentioned immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide or the immunoglobulin ⁇ chain variable region-binding peptide multimer according to the present invention immobilized on a water-insoluble carrier as a ligand. It is characterized by being.
  • the term “ligand” refers to a substance or a function that selectively collects or binds a target molecule from a set of molecules based on specific affinity between molecules represented by binding of an antigen and an antibody. It is a term indicating a group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to an immunoglobulin. In the present invention, the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • affinity ligand refers to a substance that selectively collects or binds a target molecule from a set of molecules based on the affinity between specific molecules represented by the binding of an antigen and an antibody.
  • the term refers to a functional group, and in the present invention, refers to a peptide that specifically binds to an immunoglobulin.
  • the expression “ligand” is also synonymous with “affinity ligand”.
  • water-insoluble carrier used in the present invention examples include inorganic carriers such as glass beads and silica gel; synthetic polymers such as crosslinked polyvinyl alcohol, crosslinked polyacrylate, crosslinked polyacrylamide, and crosslinked polystyrene; crystalline cellulose, crosslinked cellulose, crosslinked agarose, Examples thereof include organic carriers composed of polysaccharides such as cross-linked dextran; and organic-organic and organic-inorganic composite carriers obtained by a combination thereof.
  • GCL2000 a porous cellulose gel
  • Sephacryl S-1000 in which allyl dextran and methylene bisacrylamide are covalently crosslinked
  • Toyopearl an acrylate carrier
  • Sepharose CL4B an agarose crosslinking carrier
  • Cellufine which is a cellulosic crosslinking carrier.
  • the water-insoluble carrier in the present invention is not limited to these exemplified carriers.
  • the water-insoluble carrier used in the present invention desirably has a large surface area in view of the purpose and method of use of the affinity separation matrix, and is preferably a porous material having a large number of pores of an appropriate size.
  • the form of the carrier can be any of beads, monoliths, fibers, membranes (including hollow fibers), and any form can be selected.
  • the ligand is immobilized on the water-insoluble substrate directly or via a linker group by a covalent bond.
  • the affinity separation matrix according to the present invention can be produced by immobilizing the ligand on the water-insoluble carrier.
  • the method for immobilizing the ligand may be bound to the carrier by a conventional coupling method using an amino group, a carboxyl group or a thiol group present in the ligand.
  • the carrier is activated by reacting the carrier with cyanogen bromide, epichlorohydrin, diglycidyl ether, tosyl chloride, tresyl chloride, hydrazine or sodium periodate, or the surface of the carrier.
  • the immobilization method include addition of a reagent having a plurality of functional groups in the molecule such as glutaraldehyde, condensation, and crosslinking.
  • a spacer molecule composed of a plurality of atoms may be introduced between the ligand and the carrier, or the ligand may be directly immobilized on the carrier. Therefore, the VL- ⁇ chain variable region binding peptide according to the present invention may be chemically modified for immobilization, or an amino acid residue useful for immobilization may be added.
  • amino acids useful for immobilization include amino acids having functional groups useful for immobilization chemical reactions in the side chain, such as Lys containing an amino group in the side chain, and thiol groups in the side chain. Cys containing is mentioned.
  • VL- ⁇ chain variable region binding property imparted to a peptide in the present invention is similarly imparted to a matrix in which the peptide is immobilized as a ligand. Modifications and alterations are included in the scope of the present invention.
  • VL- ⁇ -containing proteins proteins containing immunoglobulin ⁇ chain variable regions by affinity column chromatography purification methods.
  • the purification method of these VL- ⁇ -containing proteins can be achieved by a procedure according to an immunoglobulin affinity column chromatography purification method, for example, a purification method using an SpA affinity separation matrix (Non-patent Document 1).
  • the solution is passed through an affinity column packed with the affinity separation matrix of the present invention to adsorb the VL- ⁇ -containing protein.
  • an appropriate amount of pure buffer is passed through the affinity column, and the inside of the column is washed.
  • the desired VL- ⁇ -containing protein is adsorbed to the affinity separation matrix according to the present invention in the column.
  • the affinity separation matrix in which the peptide obtained in the present invention is immobilized as a ligand is excellent in the ability to adsorb and retain the target VL- ⁇ -containing protein from the sample addition step to the matrix washing step.
  • an acidic buffer adjusted to an appropriate pH is passed through the column to elute the desired VL- ⁇ -containing protein, thereby achieving high-purity purification.
  • a substance that promotes dissociation from the matrix may be added to the acidic buffer used to elute the peptide.
  • an acidic buffer having a pH closer to the neutral side can be used as an eluent.
  • the acidic buffer to be used preferably has a pH value of 3.0 or more, more preferably 3.1 or more, even more preferably 3.2 or more, and 3.3 or more. Is more preferably, pH 3.4 or higher, even more preferably pH 3.5 or higher, even more preferably pH 3.6 or higher, and further preferably pH 3.7 or higher. More preferably, the pH is 3.8 or more.
  • the upper limit of the acidic buffer to be used is not particularly limited, but the acidic buffer to be used is used in the case of washing at about pH 5.0 by intermediate washing in affinity chromatography, or in the case of incubation at about pH 3.8 for virus removal after purification. Is preferably pH 4.5 or less, more preferably pH 4.0 or less.
  • the affinity separation matrix of the present invention can be reused by washing by passing it through a pure buffer having a suitable strong acidity or strong alkali that does not completely impair the function of the ligand compound or the carrier substrate. Is possible.
  • An appropriate denaturing agent or an organic solvent may be added to the regeneration buffer.
  • the present invention also relates to a DNA encoding the above-mentioned mutant VL- ⁇ chain variable region binding peptide.
  • the DNA encoding the peptide of the present invention may be any one as long as the amino acid sequence obtained by translating the base sequence constitutes the peptide.
  • Such a base sequence can be obtained by using a commonly used known method, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) method. It can also be synthesized by a known chemical synthesis method, and can also be obtained from a DNA library.
  • the base sequence may not be the same as the original base sequence as long as the codon may be substituted with a degenerate codon and it encodes the same amino acid when translated.
  • a genetically modified organism into which the DNA has been introduced, or a cell-free protein synthesis system using the DNA as a template DNA for transcription can be obtained.
  • the VL- ⁇ chain variable region-binding peptide according to the present invention can be obtained as a fusion peptide with a known protein having an advantage of assisting protein expression or facilitating purification. That is, a microorganism or cell containing at least one recombinant DNA encoding a fusion peptide containing the VL- ⁇ chain variable region binding peptide according to the present invention can be obtained.
  • the protein include maltose binding protein (MBP) and glutathione-S-transferase (GST), but are not limited to these proteins.
  • site-specific mutations for modifying the DNA encoding the peptide of the present invention can be carried out using recombinant DNA techniques, PCR methods and the like as follows.
  • the introduction of mutations by recombinant DNA technology is performed, for example, when there are appropriate restriction enzyme recognition sequences on both sides of the target site where mutations are desired in the gene encoding the peptide of the present invention.
  • the recognition sequence can be cleaved with the restriction enzyme, and after removing the region containing the site desired to be mutated, the cassette mutation method can be used in which a DNA fragment mutated only at the desired site is inserted by chemical synthesis or the like. .
  • site-specific mutation by PCR for example, using a double-stranded plasmid encoding the peptide of the present invention as a template and two synthetic oligo primers containing mutations complementary to the + strand and the ⁇ strand.
  • the double primer method can be used.
  • a DNA encoding a multimeric peptide can also be prepared by linking a desired number of DNAs encoding the monomer peptide (one domain) in series.
  • an appropriate restriction enzyme site is introduced into the DNA sequence, and double-stranded DNA fragmented with the restriction enzyme can be ligated with DNA ligase.
  • the DNA encoding a multimeric peptide if the base sequences encoding each monomer peptide are the same, homologous recombination may be induced in the host.
  • sequence identity between the base sequences of DNA encoding the peptide is, for example, 90% or less, preferably 85% or less, more preferably 80% or less, and even more preferably 75% or less.
  • identity of the base sequence can be determined by a conventional method as in the case of the amino acid sequence.
  • the “expression vector” of the present invention includes a base sequence encoding the aforementioned peptide of the present invention or a partial amino acid sequence thereof, and a promoter operable in a host operably linked to the base sequence.
  • the gene encoding the peptide of the present invention can be obtained by linking or inserting into a suitable vector, and the vector for inserting the gene is not particularly limited as long as it can autonomously replicate in the host.
  • plasmid DNA or phage DNA can be used as a vector.
  • vectors such as pQE vectors (Qiagen), pET vectors (Merck), and pGEX vectors (GE Healthcare Bioscience) may be mentioned.
  • the transformed cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a host cell.
  • methods for introducing recombinant DNA into a host include a method using calcium ions, an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, an Agrobacterium infection method, a particle gun method, and a polyethylene glycol method.
  • examples of a method for expressing the function of the obtained gene in a host include a method for incorporating the gene obtained in the present invention into a genome (chromosome).
  • the host cell is not particularly limited, but for mass production at low cost, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Brevibacillus genus, Staphylococcus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus (Streptomyces), Coryne Bacteria (eubacteria) such as Corynebacterium can be preferably used.
  • the VL- ⁇ chain variable region-binding peptide according to the present invention is obtained by culturing the above-described transformed cells in a medium, and in the cultured cells (including the cell periplasm region) or in the culture solution (external to the cells). And the peptide according to the present invention is produced and accumulated, and the desired peptide is collected from the culture.
  • the peptide of the present invention comprises the peptide of the present invention in the cultured cells (including the periplasm region) or in the culture solution (outside the cells) by culturing the above-described transformed cells in a medium. It can be produced by producing and accumulating a fusion peptide, collecting the fusion peptide from the culture, cleaving the fusion peptide with an appropriate protease, and collecting the desired peptide.
  • the method of culturing the transformed cell of the present invention in a medium is performed according to a usual method used for host culture.
  • the medium used for culturing the obtained transformant is not particularly limited as long as it can produce the peptide of the present invention with high efficiency and high yield.
  • carbon sources and nitrogen sources such as glucose, sucrose, glycerol, polypeptone, meat extract, yeast extract, and casamino acid can be used.
  • inorganic salts such as potassium salt, sodium salt, phosphate, magnesium salt, manganese salt, zinc salt, iron salt and the like are added as necessary.
  • an auxotrophic host cell a nutrient substance required for growth may be added. If necessary, antibiotics such as penicillin, erythromycin, chloramphenicol, neomycin may be added.
  • protease inhibitors ie, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), benzamideline, 4- (2-aminoethyl) -benzonesulfonyl. Fluoride (AEBSF), Antipain, Chymostatin, Leupeptin, Pepstatin A, Phosphoramidon, Aprotinin, Ethylenediaminetic acid acid (EDTA) and / or other commercially available protease inhibitors may be used.
  • molecular chaperones such as GroEL / ES, Hsp70 / DnaK, Hsp90, Hsp104 / ClpB may be used (for example, Co-expression or co-expression with the peptide of the present invention by a technique such as fusion protein).
  • there are techniques such as adding an additive that promotes correct folding to the medium and culturing at a low temperature, but it is not limited thereto. Absent.
  • LB medium tryptone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 1%) or 2 ⁇ YT medium (tryptone 1.6%, yeast extract) 1.0%, NaCl 0.5%) and the like.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 42 ° C., preferably 20 to 37 ° C.
  • the peptide of the present invention is cultured aerobically under aeration and stirring conditions for several hours to several days. Or accumulated in a culture solution (extracellular) and collected. In some cases, the culture may be performed anaerobically by blocking aeration.
  • the assembly produced by separating the cultured cell and the supernatant containing the secreted peptide by a general separation method such as centrifugation or filtration after the completion of the culture. The replacement peptide can be recovered.
  • the cells when accumulated in cultured cells (including in the periplasm region), for example, the cells are collected from the culture solution by a method such as centrifugation or filtration, and then the cells are sonicated.
  • the peptide accumulated and produced in the cells can be recovered by crushing by a French press method and / or solubilizing by adding a surfactant or the like.
  • the peptide according to the present invention can be purified by affinity chromatography, cation or anion exchange chromatography, gel filtration chromatography or the like alone or in appropriate combination. Confirmation that the obtained purified substance is the target peptide can be carried out by usual methods such as SDS polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequence analysis, Western blotting and the like.
  • the mutant peptide obtained in the following examples is expressed in the form of “peptide name—introduced mutation”, and the wild-type peptide that does not introduce displacement is expressed in the form of “peptide name—Wild”.
  • the B5 domain of wild-type PpL312 shown in SEQ ID NO: 7 is indicated by “LB5-Wild”.
  • the B5 domain of PpL312 represented by SEQ ID NO: 16 is mainly used in experiments, and this is expressed as “LB5t-Wild” in order to distinguish it from SEQ ID NO: 7.
  • the B5 domain mutant of PpL312 into which mutation T16H has been introduced is referred to as “LB5t-T16H”.
  • mutant introduced with the same type of mutation is indicated with a slash.
  • a Bp domain variant of PpL312 introduced with mutations T16H and T18D is denoted as “LB5t-T16H / T18D”.
  • d is added to the number concatenated after the period. In the case of a mutant consisting of a single domain, it is expressed as “LB5t-T16H.1d”.
  • Example 1 Preparation of various modified PpL VL- ⁇ -binding peptides
  • Expression plasmid preparation LB5t-Wild Back translation was performed from the amino acid sequence of 1d (SEQ ID NO: 16), and a base sequence (SEQ ID NO: 22) encoding the peptide was designed.
  • the base sequence was designed to encode an amino acid sequence in which Glu-Gln was added to the N-terminus and Gly was added to the C-terminus.
  • These additional sequences of 1-2 residues are derived from the B5 domain of wild type PpL312.
  • FIG. LB5t-Wild Next, a method for preparing an expression plasmid is shown in FIG. LB5t-Wild.
  • a DNA encoding 1d was prepared by linking two types of double-stranded DNAs (f1 and f2) having the same restriction enzyme site, and incorporated into the multicloning site of the expression vector.
  • coding DNA preparation and vector integration were simultaneously performed by three-fragment ligation in which a total of three types of double-stranded DNA, ie, two types of double-stranded DNA and an expression vector, were ligated.
  • the method for preparing two types of double-stranded DNA includes two types of single-stranded oligo DNAs (f1-1 / f1-2 or f2-1 / f2-2) containing complementary regions of about 30 bases each other,
  • the target double-stranded DNA was prepared by extension by overlap PCR.
  • the specific experimental operation is as follows. Single-stranded oligo DNA f1-1 (SEQ ID NO: 23) / f1-2 (SEQ ID NO: 24) was synthesized by outsourcing (Sigma Genosys), and Pyrobest (Takara Bio Inc.) was used as a polymerase to perform an overlap PCR reaction. It was. The double-stranded DNA extracted by subjecting the PCR reaction product to agarose electrophoresis and cutting out the target band was cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII (both were Takara Bio Inc.).
  • single-stranded oligo DNA f2-1 (SEQ ID NO: 25) / f2-2 (SEQ ID NO: 26) was synthesized by outsourcing, and the double-stranded DNA synthesized and extracted through the overlap PCR reaction was subjected to restriction enzyme HindIII. And EcoRI (both were Takara Bio).
  • HindIII HindIII
  • EcoRI both were Takara Bio
  • the above two double-stranded DNAs were subcloned into the BamHI / EcoRI site in the multicloning site of the plasmid vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare Bioscience).
  • the ligation reaction in subcloning was performed using Ligation high (TOYOBO) according to the protocol attached to the product.
  • GST glutathione-S-transferase fused with LB5t-Wild. 1d can be produced.
  • plasmid DNA was amplified and extracted using a plasmid purification kit ("Wizard Plus SV SV Minipreps DNA Purification System” manufactured by Promega) according to the standard protocol attached to the kit.
  • the base sequence of the coding DNA of the expression plasmid was confirmed using a DNA sequencer (“3130xl3Genetic Analyzer” manufactured by Applied Biosystems). Using gene analysis kit (Applied Biosystems “BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit) and plasmid vector pGEX-6P-1 sequencing DNA primer (GE Healthcare Bioscience) according to the attached protocol A sequencing PCR reaction was performed, and the sequencing product was purified according to the attached protocol using a plasmid purification kit “Applied Biosystems” “BigDye® XTerminator Purification® Kit” and used for base sequence analysis.
  • the produced LB5t-Wild A PCR reaction using the 1d expression plasmid as a template and the 5 ′ sequencing DNA primer of the plasmid vector pGEX-6P-1 and the respective DNA primers (3 ′ side) of SEQ ID NOs: 27 to 34, as shown in FIG. A double-stranded DNA corresponding to f1 was synthesized.
  • the DNA primer PCR reaction was performed using Blend Taq-Plus- (TOYOBO) according to the attached protocol. This double-stranded DNA was cleaved with restriction enzymes BamHI and HindIII, and LB5t-Wild.
  • the expression plasmid of 1d was also cleaved with the same restriction enzyme and ligated to prepare both expression plasmids for various LB5t mutants.
  • Table 1 shows the base sequence of the oligo DNA used for making each mutant, the base sequence of the cDNA encoding the mutant, and the amino acid sequence of the mutant.
  • the cells were collected by centrifugation and resuspended in 5 mL of PBS buffer. The cells were disrupted by ultrasonic disruption, centrifuged, and fractionated into a supernatant fraction (cell-free extract) and an insoluble fraction.
  • cell-free extract When the gene of interest is introduced into the multiple cloning site of the pGEX-6P-1 vector, GST is expressed as a fusion peptide attached to the N-terminus.
  • each fraction was analyzed by SDS electrophoresis, all of the various cell-free extracts prepared from the respective transformed cell cultures were found to have peptides that were thought to have been induced by IPTG at a molecular weight of about 25,000 or more. I confirmed the band.
  • the GST fusion peptide was roughly purified from each cell-free extract containing the GST fusion peptide by affinity chromatography using a GSTrap FF column (GE Healthcare Bioscience) having affinity for GST. Each cell-free extract is added to the GSTRap FF column, and the column is washed with a standard buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, pH 7.4), followed by an elution buffer ( The target GST fusion peptide was eluted with 50 mM Tris-HCl, 20 mM glutathione, pH 8.0).
  • the amino acid sequence capable of cleaving GST with the sequence-specific protease PreScission Protease is between GST and the target protein.
  • GST cleavage reaction was performed using PreScience Protease according to the attached protocol.
  • the target peptide was purified by gel filtration chromatography using Superdex 75 10/300 GL column (GE Healthcare Biosciences) from the sample used for the assay in the form of cleaved GST.
  • 1d is a peptide having an amino acid sequence in which Gly-Pro-Leu-Gly-Ser-Glu-Gln is added to the N-terminal side and Gly is added to the C-terminal side of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46.
  • Example 2 Evaluation of affinity of various LB5t mutants to aRSV-Fab (1) Preparation of IgG-derived Fab fragment Using humanized monoclonal IgG preparation as a raw material, this was fragmented into Fab fragment and Fc fragment with papain, and Fab It was prepared by separating and purifying only the fragment. Specifically, an anti-RSV monoclonal IgG (generic name “Palivizumab”, product name “Synagis”, Abvi Inc.) whose light chain is a ⁇ chain is prepared from a papain digestion buffer (0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA).
  • a papain digestion buffer 0.1 M AcOH-AcONa, 2 mM EDTA
  • Papain Agarose from papalate latex papain-immobilized agarose SIGMA was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for about 8 hours while mixing with a rotator.
  • IgG-Fab IgG-Fab in the flow-through fraction from the reaction solution separated from papain-immobilized agarose (mixed with Fab fragment and Fc fragment) by affinity chromatography using MabSelect SuRe column (GE Healthcare Bioscience) Separated and purified.
  • the sorted IgG-Fab solution was purified by gel filtration chromatography using a Superdex 75 10/300 GL column (standard buffer was used for equilibration and separation), and the IgG-Fab solution (aRSV-Fab) was purified. Obtained.
  • protein purification by chromatography was performed using the AKTAprime plus system.
  • Example 2 (2) Analysis of affinity of various LB5t mutants for IgG-Fab Various LB5t mutations obtained in Example 1 (2) using a biosensor Biacore 3000 (GE Healthcare Bioscience) utilizing surface plasmon resonance The affinity of the body for IgG-Fab was analyzed.
  • the IgG-Fab obtained in Example 2 (1) was immobilized on a sensor chip, and various peptides were run on the chip to detect the interaction between them.
  • Immobilization of IgG-Fab on sensor chip CM5 is performed by an amine coupling method using N-hydroxysuccinimide (NHS) and N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC).
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • the sensor chip and the immobilization reagent were all manufactured by GE Healthcare Bioscience.
  • the IgG-Fab solution was diluted about 10 times using an immobilization buffer (10 mM CH 3 COOH—CH 3 COONa, pH 4.5), and fixed to the sensor chip according to the protocol attached to the Biacore 3000.
  • a reference cell serving as a negative control was prepared by immobilizing human serum albumin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) after activation with EDC / NHS for another flow cell on the chip. .
  • Various LB5t mutants can be 0.01, 0.1, 1 or using running buffer (20 mM NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 , 150 mM NaCl, 0.005% P-20, pH 7.4).
  • the protein solution whose concentration was adjusted to 10 ⁇ M was added to the sensor chip at a flow rate of 40 ⁇ L / min for 1 minute.
  • a binding reaction curve at the time of addition (binding phase, 1 minute) and after the end of the addition (dissociation phase, 1 minute) was observed sequentially. After each observation, washing was performed by adding about 20 mM NaOH.
  • the wild type LB5t-Wild The analysis results are shown in Table 2 together with various binding parameters of 1d.
  • the affinity constant K A of the mutant to aRSV-Fab is greater when the mutations of T16A, T16D, T16H, T18H and T18Q are introduced compared to the wild type (before mutation).
  • the affinity constant K A decreased, but the value is 1 ⁇ 10 6 (1 / M) or more.
  • the VL- ⁇ binding force only needs to be able to hold the partner molecule as a ligand in the column. If the binding force is too strong, it may be disadvantageous for elution, so if it is 1 ⁇ 10 6 (1 / M) or more, It seems to function well.
  • Example 3 Evaluation of acid dissociation pH of aRSV-Fab of various LB5t mutants (1) Preparation of Fab fragment immobilization carrier Utilizing a commercially available coupling column for immobilizing a ligand having a functional group as an amino group. Thus, an affinity separation matrix in which the aRSV-Fab obtained in Example 2 was immobilized was prepared.
  • a water-insoluble substrate 1 mL of a commercially available prepacked column (“Hitrap ⁇ NHS activated HP” manufactured by GE Healthcare Bioscience) was used. Since this column is based on cross-linked agarose and has already been introduced with an active group for immobilizing a protein ligand having a functional group for coupling as an amino group, the ligand was immobilized according to the product manual. The operation of flowing 2 mL of 1 mM HCl cooled in an ice bath at a flow rate of 1 mL / min was performed three times to remove isopropanol in the column.
  • Example 2 Chromatographic experiment using Fab fragment-immobilized carrier
  • Various LB5t mutants prepared in Example 1 (2) were subjected to affinity purification chromatography using the aRSV-Fab immobilized column prepared in Example 3 (1).
  • the pH (acid dissociation pH) at the top of the elution peak of the LB5t mutant was analyzed.
  • a chromatographic system about 0.1 mg / mL is applied to a column equilibrated with ion exchange buffer A (50 mM citrate-Na citrate, pH 5.5) using the AKTAprime plus system.
  • ion exchange buffer A 50 mM citrate-Na citrate, pH 5.5
  • AKTAprime plus system 0.1 mL of protein solutions of various LB5t mutants adjusted to 1 were added and eluted with a linear pH gradient from pH 5.5 to pH 2.5.
  • an ion exchange buffer A and an ion exchange buffer B (50 mM CH 3 COOH-CH 3 COONa, 1M NaCl, pH 2.5) are used, and the buffer for 20 column volumes is used in the column.
  • the acid dissociation pH was evaluated from the elution position in the step of linearly increasing the concentration of buffer B from 0% to 100%.
  • FIG. 3 shows a chromatographic chart in which the mutants introduced with mutations at the 16th position of various LB5t's were overlaid in such a manner that they could be compared with the wild type LB5t of Comparative Example 3.
  • Comparative Example 1 Preparation of PpL wild-type B5 domain (LB5t-Wild.1d) LB5t-Wild.1 prepared in Example 1 Using the 1d expression plasmid, transformed cells were prepared in the same manner as in Example 1, and after culturing and purification, a protein solution was prepared.
  • Comparative Example 2 LB5t-Wild. Evaluation of affinity of 1d to aRSV-Fab LB5t-Wild. Regarding 1d, the affinity with RSV-Fab prepared in Example 2 (1) was analyzed by the same method as in Example 2 (2). The analysis results are also shown in Table 2 above.
  • Comparative Example 3 LB5t-Wild. Acid Dissociation pH Evaluation of 1d aRSV-Fab LB5t-Wild. Regarding 1d, the acid dissociation pH was analyzed in the same manner as in Example 3 (2) using the RSV-Fab immobilized carrier prepared in Example 3 (1). The analysis results are also shown in Table 3 above.
  • Example 4 Preparation of a 4-domain type (LB5t-T16H.4d) of a B5 domain variant of PpL312 Utilizing the amino acid sequence between the VL- ⁇ binding domains contained in PpL312 shown in SEQ ID NO: 1, The amino acid sequence of SEQ ID NO: 51 (“LB5t-T16H.4d”) was designed by linking four amino acid sequences of the B5 domain mutant shown. Back translation was performed from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, and a base sequence (SEQ ID NO: 52) encoding the peptide was designed.
  • An artificially synthesized gene of DNA having a PstI recognition site at the 5 ′ end and an XbaI recognition site at the 3 ′ end (SEQ ID NO: 53) of the DNA of SEQ ID NO: 52 was totally synthesized by outsourcing to Eurofin Genomics.
  • the expression plasmid after this subcloning was digested with restriction enzymes PstI and XbaI (Takara Bio Inc.), and the obtained DNA fragment was ligated to the Brevibacillus expression vector pNCMO2 (Takara Bio Inc.) digested with the same restriction enzyme, and LB5t -T36H.
  • An expression plasmid was prepared in which DNA encoding the 4d amino acid sequence was inserted into the Brevibacillus expression vector pNCMO2.
  • the ligation reaction was performed using Ligation high (TOYOBO) according to the protocol attached to the product, and Escherichia coli JM109 strain (Takara Bio) was used for plasmid preparation.
  • Each expression plasmid DNA base sequence was confirmed using a DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems). BigDye Terminator v.
  • each plasmid DNA was subjected to a sequencing PCR reaction, and the sequencing product was converted into a plasmid purification kit (Applied Biosystems, “BigDye XT Terminator Kit”). )) According to the attached protocol and used for sequence analysis.
  • Brevibacillus choshinensis SP3 strain (Takara Bio Inc.) was transformed with the obtained plasmid, and LB5t-T16H.
  • a gene recombinant that secreted 4d was bred.
  • the cells were subjected to shaking culture at 30 ° C. for 3 days in manganese 0.001% and zinc chloride 0.0001%. After cultivation, the cells were separated by centrifuging the culture solution at 15,000 rpm and 25 ° C. for 5 minutes.
  • LB5t-T16H.P was analyzed by cation exchange chromatography using UnoSphere S (BioRad). 4d was purified. UnoSphere S was used by filling Tricorn 10/200 (GE Healthcare Bioscience).
  • cation exchange buffer A 50 mM CH 3 COOH—CH 3 COONa, pH 4 0.0
  • UnoSphere S column washed with cation exchange buffer A, cation exchange buffer A and cation exchange buffer B (50 mM CH 3 COOH-CH 3 COONa , 1M NaCl, pH 4.0), and LB5t-T16H. 4d was collected.
  • an anion exchange chromatography using a Nuvia Q column (Bio-Rad) was used, and LB5t-T16H. 4d was purified.
  • Nuvia Q was used by filling Tricorn 10/200 (GE Healthcare Bioscience). Specifically, the collected LB5t-T16H. The 4d solution was dialyzed against anion exchange buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8.0), added to Nuvia Q column equilibrated with anion exchange buffer A, and anion exchange buffer. After washing with A, LB5t eluted in the middle with a salt concentration gradient using anion exchange buffer A and anion exchange buffer B (50 mM Tris-HCl, 1.0 M NaCl, pH 8.0). -T36H. 4d was collected. The collected LB5t-T16H. 4d was dialyzed again against ultrapure water, and LB5t-T16H. An aqueous solution containing only 4d was used as the final purified sample. In addition, protein purification by chromatography using the above-described column was performed using the AKTA york 25 system (GE Healthcare Bioscience).
  • Example 5 Preparation of 4-domain-type immobilization support of PpL312 B5 domain mutant LB5t-T16H. 4d was immobilized on a water-insoluble cellulose carrier.
  • a water-insoluble cellulose carrier crystalline highly crosslinked cellulose (manufactured by JNC, gel obtained by the method described in JP2009-242770A or US20090062118A) was used. At this time, an epoxy method was used as an immobilization method.
  • LB5t-T16H An operation to immobilize 4d was performed. 1.5 mL of the epoxidized carrier was transferred to a centrifuge tube, and LB5t-T16H. The 4d solution was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, sodium sulfate powder was added so that the final concentration was 0.6M. After adding sodium sulfate, the mixture was reacted at 37 ° C. for 2 hours. After the reaction, the support was transferred to a glass filter, washed with 5 mL of an immobilization buffer (150 mM Na 2 HPO 4 , 1 mM EDTA, pH 8.5) three times, and unreacted LB5t-T16H.
  • an immobilization buffer 150 mM Na 2 HPO 4 , 1 mM EDTA, pH 8.5
  • the carrier was washed 3 times with 5 mL of ultrapure water, and then washed 3 times with 5 mL of a thioglycerol-containing inactivation buffer (200 mM NaHCO 3 , 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).
  • a thioglycerol-containing inactivation buffer 200 mM NaHCO 3 , 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
  • the carrier was suspended in thioglycerol-containing inactivation buffer and collected, then transferred to a centrifuge tube and reacted overnight at 25 ° C.
  • the carrier was transferred to a glass filter, washed 3 times with 5 mL of ultrapure water and a washing buffer (100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0), then moved to a centrifuge tube and stirred at 25 ° C. for 20 minutes.
  • the carrier was transferred to a glass filter and washed 3 times with 5 mL of ultrapure water. Further, the carrier was washed with 10 mL of ultrapure water and 10 mL of 20% ethanol, and then suspended and recovered in a 20% ethanol carrier to recover LB5t-T16H. A 4d-immobilized support was obtained.
  • Example 6 Chromatography experiment using a 4-domain type immobilization support of the B5 domain variant of PpL312 Tricorn 5/50 column (GE Healthcare Bioscience) packed with 1 mL-gel of support prepared in Example 5 was used.
  • the sample was connected to a chromatographic system AKTA van 25, and the pH (acid dissociation pH) at the top of the elution peak of aRSV-Fab prepared in (1) of Example 2 was analyzed.
  • 1.0 mL of an aRSV-Fab solution adjusted to 1.0 mg / mL was added to a column equilibrated with ion exchange buffer A (50 mM citrate-Na citrate, pH 5.0). And a linear pH gradient from pH 5.0 to pH 2.4.
  • ion exchange buffer A 50 mM citrate-Na citrate, pH 5.0
  • ion exchange buffer A and ion exchange buffer B (50 mM citrate-Na citrate, pH 2.4) are used, and 20 column volumes of buffer solution are passed through the column.
  • the acid dissociation pH was evaluated from the elution position in the step of increasing the concentration of the buffer B linearly from 0% to 100%. The results are shown in Table 5.
  • the affinity separation matrix on which the peptide linked to the B5 domain mutant of the present invention was immobilized was able to dissociate the monoclonal Fab at a pH close to neutrality.
  • Example 7 Additional preparation of various VL- ⁇ chain binding domain variants and evaluation of acid dissociation pH for Fabs containing the VL- ⁇ chain variable region (1) Expression plasmid preparation and protein expression and purification LB5t- Wild. 1d (SEQ ID NO: 16), LB1t-Wild. 1d (SEQ ID NO: 12), or LC4t-Wild. An additional expression plasmid of the 1d (SEQ ID NO: 20) mutant was prepared. LB1t-Wild. 1d and LC4t-Wild.
  • An expression plasmid for mutagenesis having 1d coding DNA was prepared in the same manner as described in Example 1 (1) using single-stranded oligo DNAs of SEQ ID NOs: 54 to 61 shown in Table 6.
  • LB1t-Wild. 1d is the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 62, LC4t-Wild. 1d was confirmed by base sequence analysis in the same manner as described in Example 1 (1) to be the base sequence of SEQ ID NO: 63.
  • DNA primers for 5′-side sequencing of plasmid vector pGEX-6P-1 and SEQ ID NO: Double-stranded DNA corresponding to f1 in FIG. 2 was synthesized by a PCR reaction using each 3′-side DNA primer of 64 to 69, and prepared in the same manner as described in Example 1 (1).
  • Table 7 shows the base sequence of the oligo DNA used in preparing each mutant, the base sequence of the cDNA encoding the mutant, and the sequence number of the amino acid sequence of the mutant.
  • transformed cells were prepared in the same manner as in Example 1, and after culturing and purification, a protein solution was prepared.
  • the added LB5t mutants (LB5t-T16I.1d and LB5t-T16L.1d) are similarly modified with LB5t-Wild.
  • the elution was confirmed at a pH closer to the neutral side than 1d.
  • This result shows that the same effect can be obtained even if the type of mutated amino acid is a hydrophobic amino acid.
  • the essence of the present invention is data suggesting that an amino acid substitution mutation is introduced at positions 15 to 18 of SEQ ID NO: 21.
  • the mutant LB1t-E18D. 1d, LB1t-Wild As for the LB1t mutant, the mutant LB1t-E18D. 1d, LB1t-Wild. The elution was confirmed at a pH closer to the neutral side than 1d.
  • the peptide of the present invention elutes at a pH close to the neutral side compared to a peptide having no mutation, even for different types of VL- ⁇ chain variable region-containing proteins. It was confirmed. Such a result is considered to be data suggesting that the effect of the mutation of the present invention is not limited to the VL- ⁇ chain variable region-containing protein having a specific sequence. Moreover, the same tendency was observed in the mutants based on the C4 domain.
  • the mutation of the present invention is not limited to protein L of a specific strain, but is recognized as general protein L or an analog thereof. It is considered that the data suggests that the present invention can also be applied to other proteins.
  • Comparative Example 4 Preparation of PpL wild-type B1 domain (LB1t-Wild.1d) and C4 domain (LC4t-Wild.1d) LB1t-Wild.1 prepared in Example 7 (1) 1d and LC4t-Wild. Using the 1d expression plasmid, transformed cells were prepared in the same manner as in Example 7, and after culturing and purification, a protein solution was prepared.
  • Comparative Example 5 LB1t-Wild. Acid dissociation pH evaluation of 1d aRSV-Fab and LC4t-Wild. Acid Dissociation pH Evaluation of 1d aIgE-Fab LB1t-Wild. Regarding 1d, the acid dissociation pH was analyzed in the same manner as in Example 7 (2) using the aRSV-Fab immobilized carrier prepared in Example 3 (1). In addition, LC4t-Wild. Regarding 1d, the acid dissociation pH was analyzed in the same chromatographic experiment as in Example 7 (2) using the aIgE-Fab immobilized carrier prepared in Example 7 (2). The analysis results are shown in Table 8 and Table 9 above.

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Abstract

　本発明は、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、および当該アフィニティ分離マトリックスを用いたκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。ペプトストレプトコッカス・マグヌス株由来プロテインＬのκ鎖可変領域結合ドメインに対して、適切な部位に変異を導入したペプチドをアフィニティ・リガンドとして利用することで、上記課題を解決する。

Description

変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド
　本発明は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に対する酸解離特性が改良された免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
　タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。この機能を有用物質の分離精製に利用する技術開発も盛んになされている。実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度で精製（キャプチャリング）するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献１，２）。
　抗体医薬として開発されているのは基本的にモノクローナル抗体であり、組換え培養細胞技術等を用いて大量に生産されている。「モノクローナル抗体」とは、単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体を指す。現在上市されている抗体医薬のほとんどは、分子構造的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラスである。また、免疫グロブリンを断片化した分子構造を有する抗体誘導体（断片抗体）からなる抗体医薬も盛んに臨床開発されており、様々な断片抗体医薬の臨床開発が進んでいる（非特許文献３）。
　抗体医薬製造工程における初期精製工程には、先述のＳｐＡアフィニティ分離マトリックスが利用されている。しかし、ＳｐＡは基本的にＩｇＧのＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質である。よって、Ｆｃ領域を含まない断片抗体は、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用したキャプチャリングができない。従って、抗体医薬精製プロセスのプラットフォーム開発の観点から、ＩｇＧのＦｃ領域を含まない断片抗体をキャプチャリング可能なアフィニティ分離マトリックスに対する産業的なニーズは高い。
　ＩｇＧのＦｃ領域以外に結合するペプチドはすでに複数知られている（非特許文献４）。それらの中でも、結合できる断片抗体フォーマットの種類の多さ、および、ＩｇＭやＩｇＡなどにも結合可能という観点からは、可変領域（抗原結合ドメイン）に結合できるペプチドが最も好ましく、例えば、プロテインＬ（以下、プロテインＬを「ＰｐＬ」と略記する場合がある）がよく知られている。ＰｐＬは、複数のκ鎖可変領域結合ドメイン（以下、κ鎖可変領域を「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）を含むタンパク質であり、個々のＶＬ－κ結合ドメインのアミノ酸配列は異なる。また、菌株の種類によっても、ＶＬ－κ結合ドメインの数、および個々のアミノ酸配列は異なる。例えば、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）３１２株のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合ドメインの数は５個であり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス株３３１６のＰｐＬに含まれるＶＬ－κ結合ドメインの数は４個である（非特許文献５～７，特許文献１～２）。そして、それら計９個のＶＬ－κ結合ドメインの中に、互いに同じアミノ酸配列であるドメインは無い。
　ＰｐＬをリガンドとするアフィニティ分離マトリックスもすでに複数市販されている。しかし、ＳｐＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１、特許文献３～８）、ＰｐＬの場合にも、学術的に結合力や結合様式を解析することを目的とした変異導入の報告は複数存在し（非特許文献７～９）、アフィニティリガンドとしての機能改変を意図した研究の報告も存在する（特許文献９）。しかし、ＳｐＡの場合に比較するとＰｐＬの変異導入報告例は限られており、特にアフィニティ分離マトリックスに吸着した抗体類の酸溶出ｐＨに関して、ＳｐＡの場合にはｐＨ３．５～４．０で溶出できるという報告が複数あるが（非特許文献１，特許文献７～８）、ＰｐＬの場合には改良の余地が残っている。
特表平７－５０６５７３号公報 特表平７－５０７６８２号公報 米国特許第５１４３８４４号公報 特開２００６－３０４６３３号公報 欧州特許第１１２３３８９号公報 国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット 米国公開第２００６／０１９４９５０号公報 国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット 国際公開第００／１５８０３号パンフレット
Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Nelson A．N．ら，Nat．Biotechnol．，2009，27巻，331-337頁 Bouvet P．J．，Int．J．Immunopharmac．，1994，16巻，419-424頁 Kastern W．ら，J．Biol．Chem．，1992，267巻，12820-12825頁 Murphy J．P．ら，Mol．Microbiol．, 1994，12巻，911-920頁 Housden N．G．ら，Biochemical Society Transactions，2003，31巻，716-718頁 Housden N．G．ら，J．Biol．Chem．，2004，279巻，9370-9378頁 Tadeo X．ら，Biophys．J．，2009，97巻，2595-2603頁
　上述したように、免疫グロブリンまたはその断片を精製するためのアフィニティ分離マトリックスは種々開発されている。アフィニティ分離マトリックスにより免疫グロブリンまたはその断片を精製するには、一般的に、中性の溶液とアフィニティ分離マトリックスとを接触させて免疫グロブリンまたはその断片を選択的に吸着させ、洗浄して不純物を除去し、次いで酸性の溶出液により吸着された免疫グロブリンまたはその断片を溶出する。この際、純度の高い目的化合物を得るには、選択的吸着力の高いアフィニティ分離マトリックスを用い、洗浄を十分に行う必要がある。そして、目的化合物を高い回収率で得るために、選択的吸着を確実に解離できる酸性ｐＨで溶出する必要がある。しかし、強い酸性条件下では、目的化合物である免疫グロブリンまたはその断片がダメージを受けるおそれがあった。
　そこで本発明の目的は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域ペプチドに対して優れた選択的吸着能を示す一方で、比較的高いｐＨの酸性溶出液により当該κ鎖可変領域ペプチドを放出可能な免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
　本発明者は、プロテインＬ（ＰｐＬ）をリガンドとするアフィニティ分離マトリックスを予備的に評価した際に、軽鎖がκ鎖であるにもかかわらず、断片抗体の種類によってクロマトグラフィ・プロファイルが大きく異なることを発見した。具体的には、結合容量が高く、中間洗浄での漏出も見られない断片抗体に対しては、酸溶出時により強い酸が必要とされる傾向がある。本発明者は、上記課題を解決するために、ＰｐＬのκ鎖可変領域結合性ドメインの変異体を分子設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて、該変異体を、形質転換細胞から取得し、取得した該変異体の物性を比較検討する検討を行った。その結果、ペプトストレプトコッカス・マグヌス由来のプロテインＬのκ鎖可変領域結合性ドメインに特定の変異を導入することにより上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　（１）　配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（２）　上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（３）　上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　［２］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列が配列番号１２～２０のいずれかのアミノ酸配列である上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［３］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１６位または第１８位のいずれかの位置のアミノ酸残基が置換されている上記［１］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［４］　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１５位がＨｉｓに、第１６位がＡｌａ、ＡｓｐまたはＨｉｓに、第１７位がＨｉｓに、第１８位がＡｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓに置換されている上記［１］～［３］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［５］　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である上記［１］～［４］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［６］　上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である上記［１］～［５］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
　［７］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
　［８］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または上記［７］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
　［９］　免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
　上記［８］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
　［１０］　上記［１］～［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記［７］に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
　［１１］　上記［１０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
　［１２］　上記［１１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
　本発明によって得られたκ鎖可変領域結合性ペプチドを不溶性担体に固定化したアフィニティ分離マトリックスは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域含有タンパク質に対して優れた選択的吸着能を示す。その一方で、優れた酸解離特性という互いに相反する特性を示す。ここでの「優れた酸解離特性」とは、より中性側の酸性溶出条件でκ鎖可変領域含有タンパク質が解離され、且つ、κ鎖可変領域含有タンパク質を酸性条件下で溶出させたときの溶出ピーク・プロファイルがよりシャープであるといった特性を指す。クロマトグラフィの溶出ピークがよりシャープになることで、より少ない容量の溶出液でより高濃度の抗体含有溶出液を回収可能とすることができる。
図１は、ＰｐＬ由来ＶＬ－κ結合ドメインのアミノ酸配列のアラインメントである。 図２は、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドの作製方法を示す図である。 図３は、第１６位に変異を導入した各種ＬＢ５ｔ変異体をａＲＳＶ－Ｆａｂ固定化担体に添加し、ｐＨ勾配にて溶出した際のアフィニティ精製クロマトグラフィのチャートである。
　本発明は、下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドに関する。
　（１）　配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（２）　上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
　（３）　上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　「免疫グロブリン（ＩｇＧ）」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、この特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能と、他の生体分子や細胞と協同して抗原を有する因子を無毒化・除去する機能を有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造からなり、“Ｙ”字型の４本鎖構造（軽鎖・重鎖の２本のポリペプチド鎖が２本ずつ）を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）には、λ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
　免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１～ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。プロテインＬは、軽鎖がκ鎖である可変領域（本明細書では「ＶＬ－κ」と略記する場合がある）に結合する（非特許文献５～７）。
　本発明に係るκ鎖可変領域結合性ペプチドは、免疫グロブリンのκ鎖可変領域に結合する。本発明ペプチドが結合すべきＶＬ－κ鎖可変領域含有タンパク質は、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むものであればよく、Ｆａｂ領域とＦｃ領域を不足なく含有するＩｇＧであってもよいし、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡなどの他のＩｇ類であってもよいし、それらをタンパク質工学的に改変した免疫グロブリン分子の誘導体であってもよい。本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドが結合する免疫グロブリン分子誘導体は、ＶＬ－κ鎖可変領域を有する誘導体であれば特に制限されない。例えば、免疫グロブリンＧのＦａｂ領域のみに断片化されたＦａｂフラグメント、免疫グロブリンＧの可変領域のみからなるｓｃＦｖ、ヒト免疫グロブリンＧの一部のドメインを他生物種の免疫グロブリンＧのドメインに置き換えて融合させたキメラ型免疫グロブリンＧ、Ｆｃ領域の糖鎖に分子改変を加えた免疫グロブリンＧ、薬剤を共有結合したｓｃＦｖ断片などを挙げることができる。
　本発明において「ペプチド」とは、ポリペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものであって、いわゆるタンパク質のみならず、断片化されたものや、ペプチド結合によって他のペプチドが連結されたものも包含されるものとする。「ドメイン」とは、タンパク質の高次構造上の単位であり、数十から数百のアミノ酸残基配列から構成され、なんらかの物理化学的または生物化学的な機能を発現するに十分なペプチドの単位をいう。タンパク質やペプチドの「変異体」は、野生型のタンパク質やペプチドの配列に対し、アミノ酸レベルで、少なくとも１つ以上の置換、付加または欠失が導入されたタンパク質またはペプチドをいう。アミノ酸を置換する変異の表記について、置換位置の番号の前に、野生型または非変異型のアミノ酸を付し、置換位置の番号の後に、変異したアミノ酸を付して表記する。例えば、２９位のＧｌｙをＡｌａに置換する変異は、Ｇ２９Ａと記載する。
　「プロテインＬ（ＰｐＬ）」は、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）に属する嫌気性グラム陽性球菌の細胞壁に由来するタンパク質である。好ましくは、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｇｎｕｓ）に由来するＰｐＬであり、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株、および、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株に由来する２種類のＰｐＬが好ましいが、これらに限定されない（非特許文献４～６）。なお、本明細書では、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３１２株のＰｐＬを「ＰｐＬ３１２」、ペプトストレプトコッカス・マグヌス３３１６株由来のＰｐＬを「ＰｐＬ３３１６」と略記することがある。ＰｐＬ３１２のアミノ酸配列を配列番号１に、ＰｐＬ３３１６のアミノ酸配列を配列番号２に示す（シグナル配列も含む）。
　ＰｐＬは、タンパク質中に７０～８０残基からなる複数のＶＬ－κ結合性ドメインを含有する。ＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は５個であり、ＰｐＬ３３１６に含まれるＶＬ－κ結合性ドメインの数は４個である。ＰｐＬ３１２のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｂ１ドメイン（配列番号３）、Ｂ２ドメイン（配列番号４）、Ｂ３ドメイン（配列番号５）、Ｂ４ドメイン（配列番号６）、Ｂ５ドメイン（配列番号７）と呼び、ＰｐＬ３３１６のＶＬ－κ結合性ドメインは、Ｎ末端から順に、Ｃ１ドメイン（配列番号８）、Ｃ２ドメイン（配列番号９）、Ｃ３ドメイン（配列番号１０）、Ｃ４ドメイン（配列番号１１）と呼ぶ（非特許文献５～６）。
　これらの各種ＶＬ－κ結合性ドメインのアミノ酸配列アラインメントを図１に示す。図１中、非特許文献７～８および特許文献９に倣って付与した残基番号を（）内に示した。Ｎ末端の約２０残基は特定の二次構造を取らないことが研究によって分かっており、Ｎ末端領域を欠失させた場合にも、ＶＬ－κ結合性ドメインとして三次元構造を保持し、ＶＬ－κ結合性を示す（非特許文献７）。したがって、例えば、Ｂ１ドメインに関しては配列番号１２のアミノ酸配列、Ｂ２ドメインに関しては配列番号１３のアミノ酸配列、Ｂ３ドメインに関しては配列番号１４のアミノ酸配列、Ｂ４ドメインに関しては配列番号１５のアミノ酸配列、Ｂ５ドメインに関しては配列番号１６のアミノ酸配列、Ｃ１ドメインに関しては配列番号１７のアミノ酸配列、Ｃ２ドメインに関しては配列番号１８のアミノ酸配列、Ｃ３ドメインに関しては配列番号１９のアミノ酸配列、Ｃ４ドメインに関しては配列番号２０のアミノ酸配列で示されるペプチドも、ＶＬ－κ結合性ドメインとして機能する。本明細書で示される、ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列であることも好ましい。また、本発明に適用するアミノ酸配列として、各種ドメイン（配列番号１２～２０）に共通するアミノ酸残基を網羅的に含んだアミノ酸配列（配列番号２１）であることも好ましい。本明細書においては、配列番号２１のＮ末端を第１位と定義して、アミノ酸残基番号を付与する。図１には、この定義に従った残基番号も示し、さらに、各種ドメイン（配列番号１２～２０）の第１位に位置するＶａｌから第６０位に位置するＡｌａまでを太字で示した。
　本発明は、野生型のＰｐＬのＶＬ－κ結合ドメイン（Ｂ１～Ｂ５、Ｃ１～Ｃ４）のいずれかに対し、特定のアミノ酸置換変異を導入することによって、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質の酸解離ｐＨを、変異導入前に比べて中性側にシフトさせることを特徴とする技術である。
　変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）は、後記の実施例において確かめられている通り、より高ｐＨの酸性溶出条件でκ鎖可変領域ペプチドを解離し、且つ、κ鎖可変領域ペプチドを酸性条件下で溶出させたときの溶出ピークがよりシャープである。
　本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は、配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基である。例えば、配列番号１２の第１５位はＧｌｎ、第１６位はＴｈｒ、第１７位はＡｌａ、第１８位はＧｌｕである。配列番号１２～２０のアミノ酸配列において、第１５位はＧｌｎであり、第１７位はＡｌａである。また、第１６位はＣ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号１７）においてはＡｓｎであり、第１８位はＢ５ドメインのアミノ酸配列（配列番号１６）においてはＴｈｒである。変異導入前のアミノ酸配列のアミノ酸数が異なる場合においても、配列同一性が８０％以上である場合に、配列番号２１の第１５～１８位に相当する位置を同定することは、当業者であれば容易に可能である。具体的には、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）、または、遺伝情報処理ソフトウエアであるＧＥＮＥＴＹＸ（https://www.genetyx.co.jp/）で、アラインメントをとって確かめることが可能である。なお、非特許文献７～８および特許文献９に記載の残基番号に従えば、本発明に係るアミノ酸残基の置換部位は第３５位～第３８位に相当する。
　本発明に係る変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）は、上述の第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有する。置換される位置は、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位が好ましく、第１５位、第１６位および第１８位がより好ましく、第１６位および第１８位がさらに好ましく、第１６位が最も好ましい。
　本発明においてペプチドが「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、そのペプチドのアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、そのペプチドの機能が維持されていることを意味する。ペプチドにおいて特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、－Ｓ－Ｓ－結合などの架橋構造などが挙げられる。
　変異するアミノ酸の種類は、非タンパク質構成アミノ酸や非天然アミノ酸への置換を含め、特に限定されるものではないが、遺伝子工学的生産の観点から、天然型アミノ酸を好適に用いることができる。さらに、天然型アミノ酸は、中性アミノ酸；ＡｓｐとＧｌｕの酸性アミノ酸；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性アミノ酸に分類される。中性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸；Ｐｒｏのイミノ酸；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐの芳香族アミノ酸に分類される。脂肪族アミノ酸は、さらに、Ｇｌｙ；Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅの分枝アミノ酸；Ｓｅｒ、Ｔｈｒのヒドロキシアミノ酸；Ｃｙｓ、Ｍｅｔの含硫アミノ酸；Ａｓｎ、Ｇｌｎの酸アミドアミノ酸に分類される。また、Ｔｙｒはフェノール性水酸基を有することから、芳香族アミノ酸のみでなくヒドロキシアミノ酸に分類してもよい。さらに、別の観点からは、天然アミノ酸を、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅの疎水性の高い非極性アミノ酸類；Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒの中性の極性アミノ酸類；Ａｓｐ、Ｇｌｕの酸性の極性アミノ酸類；Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの塩基性の極性アミノ酸類に分類することもできる。また、酸性条件でプロトネーションする官能基を側鎖に有するアミノ酸であるＨｉｓ、Ａｓｐ、および、Ｇｌｕを好適に用いることもできる。
　第１５位で置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、ＧｌｕまたはＨｉｓが好ましく、Ｈｉｓが特に好ましい。第１６位で置換するアミノ酸としては、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ，Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓが好ましく、Ａｌａ、ＡｓｐまたはＨｉｓが好ましい。第１７位で置換されるアミノ酸の種類としては、ＧｌｕまたはＨｉｓが好ましく、Ｈｉｓが特に好ましい。第１８位で置換されるアミノ酸の種類としては、Ａｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓが好ましい。
　変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（２）は、上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである。
　上記の欠失、置換および／または付加の変異の数としては、１５以下または１０以下が好ましく、７以下、５以下または３以下がより好ましく、１または２がさらに好ましく、１が特に好ましい。本発明に係る変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（２）のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置は、変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）で規定された第１５位、第１６位、第１７位および第１８位以外であれば、特に制限されない。アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加の位置としては、例えば、Ｎ末端および／またはＣ末端を挙げることができる。これら部位は、特に欠失および／または付加の部位として好ましい。
　配列番号１２～２１のアミノ酸配列は、配列番号３～１１のアミノ酸配列のＮ末端側の１０～２０残基およびＣ末端側の１～２残基を欠失させたアミノ酸配列である。したがって、実施形態の一つとして、Ｎ末端および／またはＣ末端へのアミノ酸の付加としては、これらのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を付加することが挙げられる。実施形態の一つとして、Ｎ末端に付加するアミノ酸配列としては、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、または、Ｇｌｕ－Ｇｌｎが挙げられる。実施形態の一つとして、Ｃ末端に付加するアミノ酸配列としては、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＧｌｙ－Ｃｙｓが挙げられる。
　変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（３）は、上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　本発明に係る変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（３）は、上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、免疫グロブリンκ鎖可変領域含有タンパク質の酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドである（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
　上記配列同一性としては、８５％以上が好ましく、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上がさらに好ましく、９９．５％以上が特に好ましい。上記配列同一性は、上述の通り、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って評価することができる。
　本発明に係る変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）～（３）は、免疫グロブリンκ鎖可変領域（ＶＬ－κ）含有タンパク質に対する酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトすることを特徴とする。一般的に、強酸条件下や強塩基条件下では、分子表面電荷の変化や変性による立体構造の変化が要因となって、ペプチド間の結合は失われてしまう。「酸解離ｐＨ」とは、酸性側（値が７より小さいｐＨ）でその特異的結合が失われ解離するｐＨのことである。酸解離ｐＨは、本発明に係る変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）～（３）をリガンドとするアフィニティ分離マトリックスに吸着したＶＬ－κ含有タンパク質を分離（溶出）することが可能な、最も高いｐＨ値ということができる。よって、本明細書においては、酸解離ｐＨと酸溶出ｐＨは、基本的には同義である。酸解離ｐＨが「変異導入前に比べて中性側にシフトする」というのは、結合の解離に必要なｐＨの数値が、変異導入前の方が小さく、変異導入後の方が大きいということを意味する。即ち、変異導入後の方がより弱い酸性溶液で結合が解離するということを意味する。
　酸解離ｐＨの数値は、ＶＬ－κ含有タンパク質の種類、酸性溶液のバッファー成分の種類・濃度によっても変わり、アフィニティ分離マトリックスの場合には、水不溶性担体の種類・構造やリガンド固定化用リンカーの種類・構造によっても変わるので、一義的に数値の範囲で示すのは難しい。一般的には、本変異を導入する前の酸解離ｐＨは２．０以上３．５以下程度であるのが、本発明に係る変異を導入することによって、ｐＨ３．０以上４．５以下程度にシフトするが、これには限定されない。この条件下で溶出すると、抗体へのダメージが小さい（Ghose S. 他、Biotechnology amd bioengineering、2005年、92巻、6号）。本発明に係る変異を導入することによって、酸解離ｐＨは、ｐＨ値にして０．１以上中性側にシフトすることが好ましく、ｐＨ値にして０．２以上中性側にシフトすることがより好ましく、ｐＨ値にして０．３以上中性側にシフトすることがさらにより好ましく、ｐＨ値にして０．４以上中性側にシフトすることがさらにより好ましく、ｐＨ値にして０．５以上中性側にシフトすることがさらにより好ましい。
　変異導入前後の酸解離ｐＨを評価する方法は、生体分子間相互作用を検出できる手法であれば特に限定はされないが、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）などのバイオセンサーによって試験することができる。酸解離ｐＨの測定方法としては、例えば、結合する一方のペプチドをセンサーチップに固定化し、所望のｐＨに調整したもう一方のペプチド溶液を流路添加し、結合シグナルの有無を検出し、結合シグナルが検出できなくなるｐＨを評価すれば良いが、これに限定されない。別の方法としては、ペプチド溶液を添加した後に、所望のｐＨの緩衝液を添加し、添加した前後でのチップ上で解離せずに残った結合シグナルの変化を評価してもよい。測定条件としては、温度は２０～４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨはｐＨ５～８の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられ、酸性の場合には、酢酸、クエン酸、グリシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液のＮａＣｌ濃度は、特に限定はされないが、０～０．１５Ｍ程度が好ましく、特に解離状態を見るときは０Ｍが好ましい。この評価においては、変異導入前後の違いを比較するために、変異以外の条件を全て揃えることが重要である。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた評価では、変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを、チップに固定化する側（固相）としても良いし、流路添加する側（液相）としても、どちらでも評価は可能である。例えば、変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドをチップに固定化する量を揃えるのが難しい場合には、流路添加する際の濃度を揃えて変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを流路添加する方が好ましい。
　酸解離ｐＨを評価する方法として、アフィニティ分離マトリックスを用いて、クロマトグラフィ・プロファイルを評価する方法も好ましい。例えば、結合する一方のペプチドをクロマトグラフィ用カラムに固定化し、そのカラムをクロマトグラフィ装置に接続した後で、もう一方のペプチド溶液をそのカラムに添加し、ｐＨを徐々に下げる直線勾配をかけて吸着したペプチドが溶出したピークトップのｐＨを評価すればよいが、これに限定されない。測定時の温度、緩衝液、塩濃度は上述の条件に従うのが好ましいが、特にこれには限定されない。例えば、きれいなｐＨ直線勾配を得る為に、結合用緩衝液（緩衝液Ａ）と解離用緩衝液（緩衝液Ｂ）の成分はｐＨ以外は同一とするのが好ましい。この評価においても、変異導入前後の違いを比較するために、変異以外の条件を全て揃えることが重要である。この評価系においても、変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを、カラムに固定化する側（固相）としても良いし、添加して溶出する側（液相）としても、どちらでも評価は可能である。例えば、変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドをカラムに固定化する量を揃えるのが難しい場合には、カラムに添加する際の濃度を揃えて変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを添加し、得られたクロマトグラフィ・プロファイルを重ねて比較する方が好ましい。
　本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド（１）～（３）は、アフィニティ・リガンドとしてカラムに保持可能であり、優れたＶＬ－κ結合力を示す。ＶＬ－κ鎖可変領域に対する親和性は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステムなどのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
　結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。親和定数は、結合速度定数（ｋon）を解離速度定数（ｋoff）で割った値である（ＫA＝ｋon／ｋoff）。
　本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドとＶＬ－κ鎖可変領域含有ペプチドとの親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＶＬ－κ鎖可変領域含有ペプチドを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係る変異を導入した配列を有するペプチドについて、ＶＬ－κ鎖可変領域含有ペプチドとの親和定数（ＫA）が、１×１０6Ｍ-1以上であることが好ましく、５×１０6Ｍ-1以上であることがより好ましく、１×１０7Ｍ-1以上であることがさらにより好ましい。しかし、親和定数は、ＶＬ－κ鎖可変領域含有ペプチドの種類や、ＶＬ－κ結合ペプチドのドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
　ＰｐＬは、ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ドメインが４個または５個タンデムに並んだ形で含んだタンパク質である。したがって、本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドも、実施形態の１つとして、単量体または単ドメインである当該ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、より好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、例えば１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは６個以下である。これらの多量体は、単一のＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、ＰｐＬ３１２のＢ１～Ｂ４ドメイン、および、ＰｐＬ３３１６のＣ１～Ｃ４ドメインのいずれも含まなければ、複数種類のＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
　本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチド多量体の連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結するアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。これらのアミノ酸配列は、単量体タンパク質の３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
　その他、実施形態の１つとして、本発明により得られるＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドまたはその多量体が、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
　本発明は、本発明ペプチドを、免疫グロブリンやその断片、特にＶＬ－κ鎖可変領域に親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。
　本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、本発明に係る上記免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは上記免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とする。
　本発明において「リガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
　本発明において「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に捕集または結合する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンに対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
　本発明に用いる水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体；架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や；結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体；さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機－有機、有機－無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅなどを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
　また、本発明に用いる水不溶性担体は、本アフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて、表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
　上記リガンドは、直接またはリンカー基を介して、共有結合により上記水不溶性基材に固定化されている。当該リンカー基としては、例えば、Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基（－ＮＨ－）、エーテル基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、エステル基（－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（＝Ｏ）－）、アミド基（－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ－または－ＮＨＣ（＝Ｏ）－）、ウレア基（－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ－）；Ｃ1-6アルキレン基、アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される２以上１０以下の基が連結された基；アミノ基、エーテル基、カルボニル基、エステル基、アミド基およびウレア基からなる群より選択される基を一端または両端に有するＣ1-6アルキレン基を挙げることができる。上記の連結数としては、８以下または６以下が好ましく、５以下がより好ましく、４以下がさらに好ましい。また、上記Ｃ1-6アルキレン基は、水酸基などの置換基などにより置換されていてもよい。
　本発明に係るアフィニティ分離マトリックスは、上記リガンドを上記水不溶性担体に固定化することにより製造することができる。
　リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシル基またはチオール基を利用した、従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
　また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＶＬ－κ鎖可変領域結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンのκ鎖可変領域を含むタンパク質（ＶＬ－κ含有タンパク質）をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらのＶＬ－κ含有タンパク質の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。
　即ち、ＶＬ－κ含有タンパク質の溶液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、ＶＬ－κ含有タンパク質を吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望のＶＬ－κ含有タンパク質はカラム内の本発明に係るアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とするＶＬ－κ含有タンパク質を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望のＶＬ－κ含有タンパク質を溶出することにより、高純度な精製が達成される。ペプチドを溶出するために用いられる上記酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
　特に、本発明のアフィニティ分離マトリックスでは、より中性側に近いｐＨの酸性緩衝液を溶出液として用いることが可能である。用いる酸性緩衝液としては、ｐＨ値がｐＨ３．０以上であることが好ましく、ｐＨ３．１以上であることがより好ましく、ｐＨ３．２以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．３以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．４以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．５以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．６以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．７以上であることがさらにより好ましく、ｐＨ３．８以上であることがさらにより好ましい。用いる酸性緩衝液の上限は特に無いが、アフィニティ・クロマトグラフィにおける中間洗浄でｐＨ５．０程度で洗浄する場合や、精製後にウイルス除去のためにｐＨ３．８程度でインキュベーションする場合においては、用いる酸性緩衝液はｐＨ４．５以下であることが好ましく、ｐＨ４．０以下であることがより好ましい。
　本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性、または、強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。上記の再生用緩衝液には、適当な変性剤や有機溶剤を配合してもよい。
　本発明は、上記変異型ＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換微生物／細胞、または、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
　また、本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物、または、細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
　本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
　即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
　また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および－鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
　また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が例えば９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
　本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
　本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
　本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明に係るペプチドを生成蓄積させ、該培養物から所望のペプチドを採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
　本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することができる。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
　さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ　ｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ　Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
　さらに、本発明に係るＶＬ－κ鎖可変領域結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい（例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる）。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
　大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２×ＹＴ培地（トリプトン　１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
　また、培養温度は、例えば１５～４２℃、好ましくは２０～３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間～数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
　本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
　本願は、２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５－１２６６４号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１５年１月２６日に出願された日本国特許出願第２０１５－１２６６４号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
　以下の実施例で取得した変異ペプチドは「ペプチド名－導入した変異」の形で表記し、変位を導入しない野生型ペプチドは「ペプチド名－Ｗｉｌｄ」の形で表記する。例えば、配列番号７で示される野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインは「ＬＢ５－Ｗｉｌｄ」で示す。また、本実施例においては、配列番号１６で示されるＰｐＬ３１２のＢ５ドメインを実験でメインに利用しており、これを配列番号７と区別するため、「ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ」と表記する。変異Ｔ１６Ｈを導入したＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体は「ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ」と表記する。種類の変異を同時に導入した変異体の表記については、スラッシュを用いて併記する。例えば、変異Ｔ１６ＨおよびＴ１８Ｄを導入したＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体は、「ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ／Ｔ１８Ｄ」と表記する。また、ドメイン数に関しては、ピリオドに続けて連結した数に「ｄ」をつけて併記する。単ドメインからなる変異体の場合には、「ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．１ｄ」と表記する。
　実施例１：　各種改変型ＰｐＬのＶＬ－κ結合ペプチドの調製
　（１）　発現プラスミド調製
　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号２２）を設計した。なお、実験上の都合から、塩基配列は、Ｎ末端にＧｌｕ－Ｇｌｎが、および、Ｃ末端にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列をコードするように設計した。これらの１～２残基の付加配列は、野生型ＰｐＬ３１２のＢ５ドメインに由来する。次に、発現プラスミドの作製方法を図２に示す。ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄをコードするＤＮＡは、同じ制限酵素サイトを有する２種の二本鎖ＤＮＡ（ｆ１とｆ２）を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。実際には、２種の二本鎖ＤＮＡと発現ベクターの計３種の二本鎖ＤＮＡを連結する３断片ライゲーションによって、コードＤＮＡ調製とベクター組込みを同時に実施した。２種の二本鎖ＤＮＡの調製方法は、互いに３０塩基程度の相補領域を含む２種の一本鎖オリゴＤＮＡ（ｆ１－１／ｆ１－２、または、ｆ２－１／ｆ２－２）を、オーバーラップＰＣＲによって伸長し、目的の二本鎖ＤＮＡを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴＤＮＡｆ１－１（配列番号２３）／ｆ１－２（配列番号２４）を外注によって合成し（シグマジェノシス社）、ポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社）を用い、オーバーラップＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。同様に、一本鎖オリゴＤＮＡｆ２－１（配列番号２５）／ｆ２－２（配列番号２６）を外注によって合成し、オーバーラップＰＣＲ反応を経て、合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）のマルチクローニングサイト中のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに上記２種の二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
　上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いて、コンピテント細胞（タカラバイオ社，「大腸菌ＨＢ１０１」）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。上記プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１を用いれば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」と略記する）が融合したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄを産生することができる。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems社製「3130xl Genetic Analyzer」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Applied Biosystems社製「BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit）と、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１のシークエンシング用ＤＮＡプライマー（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットApplied Biosystems社製「BigDye XTerminator Purification Kit」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。
　各種ＬＢ５ｔ変異体をコードするＤＮＡに関しては、作製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを鋳型として、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１の５’側シークエンシング用ＤＮＡプライマーと配列番号２７～３４の各々のＤＮＡプライマー（３’側）を用いたＰＣＲ反応によって、図２のｆ１に該当する二本鎖ＤＮＡを合成した。ＤＮＡプライマーＰＣＲ反応は、Ｂｌｅｎｄ　Ｔａｑ　－Ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、添付のプロトコルに従い行った。この二本鎖ＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドも同じ制限酵素で切断し、両者をライゲーション反応することで、各種ＬＢ５ｔ変異体の発現プラスミドを調製した。各々の変異体を作るときに使用したオリゴＤＮＡの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および、変異体のアミノ酸配列の配列番号を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２）　タンパク質の発現と精製
　上記（１）で得られた各種ＬＢ５ｔ変異体遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有２×ＹＴ培地にて、３７℃で終夜培養した。これらの培養液を、１００倍量程度のアンピシリン含有２×ＹＴ培地に接種し、３７℃で約２時間培養した後で、終濃度０．１ｍＭになるようイソプロピル１－チオ－β－Ｄ－ガラクシド（以下、「ＩＰＴＧ」と略記する）を添加し、さらに２５℃にて１８時間培養した。
　培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液５ｍＬに再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。それぞれの画分をＳＤＳ電気泳動により分析したところ、各々の形質転換細胞培養液から調製した各種無細胞抽出液のすべてについて、分子量約２５，０００以上の位置にＩＰＴＧにより誘導されたと考えられるペプチドのバンドを確認した。
　ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ　ＦＦカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
　ｐＧＥＸ－６Ｐ－１ベクターのマルチクローニングサイトに遺伝子を導入すると、配列特異的プロテアーゼＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）でＧＳＴを切断することが可能なアミノ酸配列が、ＧＳＴと目的タンパク質の間に導入される。ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅを用いて、添付プロトコルに従いＧＳＴ切断反応を行った。このようにＧＳＴを切断した形でアッセイに利用したサンプルから、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドの精製を行った。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のタンパク質を、切断したＧＳＴやＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。また、本実施例で得られるＧＳＴ切断後の各々のタンパク質のＮ末端側には、ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１由来のＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒが付加された。したがって、例えば、ＬＢ５ｔ－Ｔ３６Ｈ．１ｄは、配列番号４６のアミノ酸配列に対し、Ｎ末端側にＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎが、Ｃ末端側にＧｌｙが付加されたアミノ酸配列のペプチドである。
　実施例２：　各種ＬＢ５ｔ変異体のａＲＳＶ－Ｆａｂへの親和性評価
　（１）　ＩｇＧ由来Ｆａｂフラグメントの調製
　ヒト化モノクローナルＩｇＧ製剤を原料として、これをパパインによって、ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントに断片化し、Ｆａｂフラグメントのみを分離精製することで調製した。具体的には、軽鎖がκ鎖からなる抗ＲＳＶモノクローナルＩｇＧ（一般名「パリビズマブ」，製品名「シナジス」，アッヴィ社）製剤を、パパイン消化用緩衝液（０．１Ｍ　ＡｃＯＨ－ＡｃＯＮａ，２ｍＭ　ＥＤＴＡ，１ｍＭシステイン，ｐＨ５．５）に溶解し、Ｐａｐａｉｎ　Ａｇａｒｏｓｅ　ｆｒｏｍ　ｐａｐａｙａ　ｌａｔｅｘパパイン固定化アガロース（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ローテーターで混和させながら、３７℃で約８時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液（ＦａｂフラグメントとＦｃフラグメントが混在）から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用したアフィニティクロマトグラフィにより、素通り画分でＩｇＧ－Ｆａｂを回収することで分離精製した。分取したＩｇＧ－Ｆａｂ溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　７５　１０／３００　ＧＬカラム（平衡化および分離には標準緩衝液を使用）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて精製し、ＩｇＧ－Ｆａｂ溶液（ａＲＳＶ－Ｆａｂ）を得た。なお、実施例１と同様に、クロマトグラフィによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用して実施した。
　（２）　各種ＬＢ５ｔ変異体のＩｇＧ－Ｆａｂに対する親和性の解析
　表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いて、実施例１（２）で取得した各種ＬＢ５ｔ変異体のＩｇＧ－Ｆａｂとの親和性を解析した。本実施例では、実施例２（１）で取得したＩｇＧ－Ｆａｂをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。ＩｇＧ－ＦａｂのセンサーチップＣＭ５への固定化は、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた（センサーチップや固定化用試薬は、全てＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）。ＩｇＧ－Ｆａｂ溶液は、固定化用緩衝液（１０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．５）を用いて１０倍程度に希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ　３０００付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、ＥＤＣ／ＮＨＳにより活性化した後にヒト血清アルブミン（和光純薬社製）を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種ＬＢ５ｔ変異体は、ランニング緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，０．００５％　Ｐ－２０，ｐＨ７．４）を用いて、０．０１、０．１、１または１０μＭに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速４０μＬ／ｍｉｎで１分間センサーチップに添加した。測定温度２５℃にて、添加時（結合相，１分間）および添加終了後（解離相，１分間）の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約２０ｍＭ　ＮａＯＨを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線（リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線）に対して、システム付属ソフトＢＩＡ　ｅｖａｌｕａｔｉｏｎを用いた１：１の結合モデルによるフィッティング解析を行い、ａＲＳＶ－Ｆａｂに対する親和定数（ＫA＝ｋon／ｋoff）を算出した。比較例２で測定した、野生型のＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの各種結合パラメータと共に、解析結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示す結果のとおり、例えば変異体のａＲＳＶ－Ｆａｂへの親和定数ＫAは、野生型（変異前）に比較して、Ｔ１６Ａ、Ｔ１６Ｄ、Ｔ１６Ｈ、Ｔ１８ＨおよびＴ１８Ｑの変異を導入した場合には、ほぼ同等から約２倍となっており、ＶＬ－κ結合性が維持されていることを示す結果となった。Ｑ１５Ｈ、Ａ１７Ｈ、Ｔ１８Ｄの変異に関しては、親和定数ＫAは低下したが、その数値は１×１０6（１／Ｍ）以上である。ＶＬ－κ結合力は、リガンドとして相手分子をカラムに保持できれば良く、結合力が強過ぎると溶出には不利に働く可能性もあるので、１×１０6（１／Ｍ）以上であれば、十分機能すると考えられる。
　実施例３：　各種ＬＢ５ｔ変異体のａＲＳＶ－Ｆａｂの酸解離ｐＨの評価
　（１）　Ｆａｂフラグメント固定化担体の調製
　カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例２で得られたａＲＳＶ－Ｆａｂを固定化したアフィニティ分離マトリックスを作製した。
　水不溶性基材として、市販のプレパックカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製「Hitrap NHS activated HP」）１ｍＬを使用した。このカラムは、架橋アガロースをベースとし、カップリング目的官能基をアミノ基とするタンパク性リガンド固定化用の活性基が導入済みなので、製品マニュアルに従ってリガンドを固定化した。氷浴で冷やした１ｍＭ　ＨＣｌを、流速１ｍＬ／ｍｉｎで２ｍＬ分流す操作を３回行い、カラム中のイソプロパノールを除去した。
　その後すぐに、カップリング緩衝液（０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ3，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）でａＲＳＶ－Ｆａｂを１ｍｇ／ｍＬに希釈した溶液を同じ流速で１ｍＬ添加し、カラムの上下に栓をして２５℃で３０分間静置することで、取得したリガンドをカラムに固定化した。
　その後開栓し、カップリング緩衝液を同じ流速で３ｍＬ流して、未反応ａＲＳＶ－Ｆａｂを回収した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．５Ｍエタノールアミン，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）を２ｍＬ流す操作を３回実施し、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ酢酸，０．５Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を２ｍＬ流す操作を３回実施した。
　ブロッキング用緩衝液と洗浄用緩衝液を流す一連の操作は交互に３回ずつ行った。最後に標準緩衝液（２０ｍＭ　ＮａＨ2ＰＯ4－Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．４）を２ｍＬ流してアフィニティ分離カラムの作製を完了した。
　（２）　Ｆａｂフラグメント固定化担体を用いたクロマトグラフィ実験
　実施例１（２）で調製した各種ＬＢ５ｔ変異体を、実施例３（１）で調製したａＲＳＶ－Ｆａｂ固定化カラムを利用したアフィニティ精製クロマトグラフィにより、ＬＢ５ｔ変異体の溶出ピークトップにおけるｐＨ（酸解離ｐＨ）を解析した。具体的には、クロマトシステムとしては、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓシステムを利用し、イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　クエン酸－クエン酸Ｎａ，ｐＨ５．５）にて平衡化したカラムに、約０．１ｍｇ／ｍＬに調整した各種ＬＢ５ｔ変異体のタンパク質溶液を０．１ｍＬ添加し、ｐＨ５．５からｐＨ２．５へのｐＨ直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換用緩衝液Ａとイオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ２．５）を利用しており、カラムに２０カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Ｂの濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離ｐＨを評価した。実際のデータの一例として、各種ＬＢ５ｔの第１６位に変異を導入した変異体に関し、比較例３の野生型ＬＢ５ｔとの比較も出来る形で重ね合わせたクロマトグラフィのチャートを図３に示した。この実験において、本発明で得られた各種ＬＢ５ｔ変異体（ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ａ．１ｄ、ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｄ．１ｄ、ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．１ｄ）が、変異を導入していないＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄよりも早く溶出した。これは、より中性側に近いｐＨで各種ＬＢ５ｔ変異体が溶出されることを示している。即ち、本発明のペプチドは、ＶＬ－κ鎖可変領域含有タンパク質と解離するｐＨがより中性側に改変されたことを示すデータであるといえる。この実験系における、各々の溶出位置（ピークトップ）におけるｐＨ値を、比較例３の結果も併せて表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示す結果のとおり、各々の変異体に関して、ＶＬ－κ鎖可変領域含有ペプチドと解離するｐＨがより中性側に改変された。
　比較例１：　ＰｐＬの野生型Ｂ５ドメイン（ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ）の調製
　実施例１にて調製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例１と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。
　比較例２：　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのａＲＳＶ－Ｆａｂへの親和性評価
　比較例１で調製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例２（１）で調製したＲＳＶ－Ｆａｂとの親和性を、実施例２（２）と同様の手法にて解析した。その解析結果を、上記の表２に併せて示した。
　比較例３：　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのａＲＳＶ－Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価
　比較例１で調製したＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例３（１）で調製したＲＳＶ－Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例３（２）と同様の手法にて酸解離ｐＨを解析した。その解析結果を、上記の表３に併せて示した。
　実施例４：　ＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体の４ドメイン型（ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄ）の調製
　配列番号１に示されるＰｐＬ３１２に含まれるＶＬ－κ結合ドメイン間のアミノ酸配列を利用し、配列番号４６で示されるＢ５ドメイン変異体のアミノ酸配列を４個連結した配列番号５１のアミノ酸配列（「ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄ」）を設計した。配列番号５１のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列（配列番号５２）を設計した。配列番号５２のＤＮＡの５’末端にＰｓｔＩ認識サイト、３’末端にＸｂａＩ認識サイトを付与したＤＮＡ（配列番号５３）の人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＸｂａＩ（タカラバイオ社）で消化し、取得したＤＮＡ断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２（タカラバイオ社）へライゲーションし、ＬＢ５ｔ－Ｔ３６Ｈ．４ｄのアミノ酸配列をコードするＤＮＡがブレビバチルス発現用ベクターｐＮＣＭＯ２に挿入された発現プラスミドを調製した。なおライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施し、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリＪＭ１０９株（タカラバイオ社）を用いた。各々の発現プラスミドＤＮＡ塩基配列の確認は、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて行った。ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ．１．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドＤＮＡのシークエンシングＰＣＲ反応を行い、そのシークエンシング産物をプラスミド精製キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，「ＢｉｇＤｙｅ　ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ」）を用いて添付のプロトコルに従い精製し、配列解析に用いた。
　ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（タカラバイオ社）を得られたプラスミドで形質転換し、ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを分泌生産する遺伝子組換え体を育種した。この遺伝子組換え体を６０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含む３０ｍＬのＡ培地（ポリペプトン　３．０％，酵母エキス　０．５％，グルコース　３％，硫酸マグネシウム　０．０１％，硫酸鉄　０．００１％，塩化マンガン　０．００１％，塩化亜鉛　０．０００１％）にて、３０℃で３日間の振盪培養を行った。培養後、培養液を１５，０００ｒｐｍ、２５℃でから５分間遠心分離するにより菌体を分離した。
　得られた培養上清から、ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ Ｓ（バイオラッド社）を利用した陽イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを精製した。ＵｎｏＳｐｈｅｒｅ　ＳはＴｒｉｃｏｒｎ　１０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、酢酸ナトリウムを終濃度５０ｍＭになるように添加し、さらに酢酸でｐＨ４．０に調整した培養上清を、陽イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，ｐＨ４．０）にて平衡化したＵｎｏＳｐｈｅｒｅ　Ｓカラムに添加し、陽イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陽イオン交換用緩衝液Ａと陽イオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＣＨ3ＣＯＯＨ－ＣＨ3ＣＯＯＮａ，１Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ４．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを分取した。次に、Ｎｕｖｉａ　Ｑカラム（バイオラッド社）を利用した陰イオン交換クロマトグラフィーにて、ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを精製した。Ｎｕｖｉａ　ＱはＴｒｉｃｏｒｎ　１０／２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）に充填して使用した。具体的には、分取したＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄ溶液を、陰イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０）に透析し、陰イオン交換用緩衝液Ａにて平衡化したＮｕｖｉａ　Ｑカラムに添加し、陰イオン交換用緩衝液Ａで洗浄後、陰イオン交換用緩衝液Ａと陰イオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１．０Ｍ　ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）を利用した塩濃度勾配にて、途中に溶出されるＬＢ５ｔ－Ｔ３６Ｈ．４ｄを分取した。分取したＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを再び超純水に透析し、ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄのみを含む水溶液を最終精製サンプルとした。なお、上記のカラムを用いたクロマトグラフィーによるタンパク質精製は、ＡＫＴＡａｖａｎｔ　２５システム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を利用して実施した。
　実施例５：　ＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体の４ドメイン型固定化担体の作製
　実施例４で調製したＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを、水不溶性セルロース担体へ固定化した。水不溶性セルロース担体としては、結晶性高架橋セルロース（ＪＮＣ社製，特開２００９－２４２７７０号公報またはＵＳ２００９００６２１１８Ａに記載に方法により得られるゲル）を使用した。この際、エポキシ法を固定化方法として利用した。
　具体的には、担体２ｍＬ－ｇｅｌをガラスフィルターにうつし、１０ｍＬ超純水で３回洗浄した。その後、担体を遠沈管にうつし、所定量の１，４－ビス（２，３－エポキシプロポキシ）ブタンを加え、３７℃で３０分攪拌した。３０分後、最終濃度が１Ｍとなるように９．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を加え、３７℃で２時間攪拌し、担体をガラスフィルターにうつした。減圧により反応溶液を取り除き、ガラスフィルター上の担体を３０ｍＬの超純水で洗浄し、エポキシ化した担体を得た。
　次に、エポキシ化した担体にＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを固定化する操作を行った。エポキシ化した担体１．５ｍＬを遠沈管に移し、さらにＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄ溶液を加えて３７℃で３０分間反応させた。反応後、終濃度が０．６Ｍになるように硫酸ナトリウム粉末を添加した。硫酸ナトリウム添加後、３７℃で２時間反応させた。反応後、担体をガラスフィルターにうつし、固定化緩衝液（１５０ｍＭ　Ｎａ2ＨＰＯ4，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．５）５ｍＬで３回洗浄し、未反応ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄを回収した。次に、担体を５ｍＬの超純水で３回洗浄した後、チオグリセロール含有不活性化緩衝液（２００ｍＭ　ＮａＨＣＯ3，１００ｍＭ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）５ｍＬで３回洗浄した。担体をチオグリセロール含有不活性化緩衝液に懸濁させ回収した後、遠沈管にうつし２５℃で一晩反応させた。その後、担体をガラスフィルターにうつし、超純水および洗浄緩衝液（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ８．０）５ｍＬで３回洗浄後、遠沈管にうつし、２５℃で２０分間攪拌した。担体をガラスフィルターにうつし、超純水５ｍＬで３回洗浄した。さらに担体を超純水１０ｍＬ、２０％エタノール１０ｍＬで洗浄した後、２０％エタノール担体に懸濁し回収してＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄ固定化担体を得た。
　回収した未反応ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄの２８０ｎｍの吸光度を分光計で測定し、アミノ酸配列から算出した吸光係数から未反応ＬＢ５ｔ－Ｔ３６Ｈ．４ｄの量を算出した。ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄの仕込み量と定量した未反応ＬＢ５ｔ－Ｔ３６Ｈ．４ｄの量の差からＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｈ．４ｄの固定化量を算出し、さらに担体の体積からリガンド密度を算出した。表４に作製した担体のリガンド密度を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例６：　ＰｐＬ３１２のＢ５ドメイン変異体の４ドメイン型固定化担体を用いたクロマトグラフィー実験
　実施例５で作製した担体１ｍＬ－ｇｅｌを充填したＴｒｉｃｏｒｎ　５／５０　ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）をクロマトシステムＡＫＴＡａｖａｎｔ　２５に接続し、実施例２の（１）で調製したａＲＳＶ－Ｆａｂの溶出ピークトップにおけるｐＨ（酸解離ｐＨ）を解析した。具体的には、イオン交換用緩衝液Ａ（５０ｍＭ　クエン酸－クエン酸Ｎａ，ｐＨ５.０）にて平衡化したカラムに、１．０ｍｇ／ｍＬに調整したａＲＳＶ－Ｆａｂ溶液を１．０ｍＬ添加し、ｐＨ５．０からｐＨ２．４へのｐＨ直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換用緩衝液Ａとイオン交換用緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　クエン酸－クエン酸Ｎａ，ｐＨ２．４）を利用しており、カラムに２０カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Ｂの濃度を０％から１００％に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離ｐＨを評価した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示す結果のとおり、本発明のＢ５ドメイン変異体を連結したペプチドを固定化したアフィニティー分離マトリックスは、比較的中性に近いｐＨでモノクローナルＦａｂを解離することができた。
　実施例７：　各種ＶＬ－κ鎖結合ドメイン変異体の追加調製、および、ＶＬ－κ鎖可変領域を含むＦａｂに対する酸解離ｐＨの評価
　（１）　発現プラスミド調製、および、タンパク質の発現と精製
　ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）、またはＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号２０）の変異体の発現プラスミドを追加で調製した。ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄおよびＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのコードＤＮＡを有する変異導入用発現プラスミドは、表６に示す配列番号５４～６１の一本鎖オリゴＤＮＡを用いて、実施例１（１）の記載と同様の手法にて調製した。調製した発現プラスミドにおいて目的のペプチドをコードするＤＮＡについて、ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄは配列番号６２の塩基配列、ＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄは配列番号６３の塩基配列であることを、実施例１（１）の記載と同様の手法にて、塩基配列解析で確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　各種単ドメイン型ＶＬ－κ鎖結合ドメイン変異体の発現プラスミドに関しては、各々の対応する野生型の発現プラスミドを鋳型として、プラスミドベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１の５’側シークエンシング用ＤＮＡプライマーと配列番号６４～６９の各々の３’側ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、図２のｆ１に該当する二本鎖ＤＮＡを合成し、実施例１（１）の記載と同様の手法にて調製した。各々の変異体を作製する際に使用したオリゴＤＮＡの塩基配列、変異体をコードするｃＤＮＡの塩基配列、および変異体のアミノ酸配列の配列番号を表７に示す。各種変異体に関し、実施例１と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（２）　各種ＶＬ－κ鎖結合ドメイン変異体のＦａｂに対する酸解離ｐＨの評価
　ａＲＳＶ－Ｆａｂ固定化担体、またはａＩｇＥ－Ｆａｂ固定化担体を用いて、（１）にて調製した各種ＶＬ－κ鎖結合ドメイン変異体のＦａｂに対する酸解離ｐＨの評価を行った。ａＩｇＥ－Ｆａｂは、抗ＩｇＥモノクローナルＩｇＧ製剤（一般名「オマリズマブ」，製品名「ゾレア」，ノバルティスファーマ社）より、実施例２（１）に記載の手法にて調製し、ａＲＳＶ－Ｆａｂ固定化担体は実施例３（１）に記載の手法にて、市販のプレパックカラムに固定化することで調製した。各種ＶＬ－κ鎖結合ドメイン変異体のａＲＳＶ－ＦａｂまたはａＩｇＥ－Ｆａｂに対する酸解離ｐＨは、実施例３（２）記載と同様のクロマトグラフィ実験にて評価した。
　最初に、ａＲＳＶ－Ｆａｂ固定化担体を用いた評価結果、即ち、各々の溶出位置を示すピークトップにおけるｐＨ値を、比較例３および５の結果も併せて表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　追加したＬＢ５ｔ変異体（ＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｉ．１ｄとＬＢ５ｔ－Ｔ１６Ｌ．１ｄ）も同様に、変異を導入していないＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄよりも中性側に近いｐＨで溶出することを確認した。この結果は、変異アミノ酸の種類が疎水性アミノ酸であっても同様の効果が得られることを示している。実施例３の結果と併せて、本発明の本質が、アミノ酸置換変異を配列番号２１の第１５位～第１８位に導入することにあることを示唆するデータであると言える。また、ＬＢ１ｔ変異体に関しても、本発明の変異を導入した変異体ＬＢ１ｔ－Ｅ１８Ｄ．１ｄが、変異を導入していないＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄよりも中性側に近いｐＨで溶出することを確認した。ＬＢ５ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１６）とＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ（配列番号１２）の配列同一性は、６２．３％である。このように変異導入前の配列同一性が６０％程度であっても、ＶＬ－κ鎖結合ドメインとして機能するペプチドには、本発明が適用できることを示唆するデータと言える。
　次に、ａＩｇＥ－Ｆａｂ固定化担体を用いた評価結果を、比較例３および５の結果も併せて表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記実験結果と同様に、種類の異なるＶＬ－κ鎖可変領域含有タンパク質に対しても、本発明のペプチドは、変異を導入していないペプチドと比較して、中性側に近いｐＨで溶出することを確認した。かかる結果は、本発明の変異の効果が、特定配列のＶＬ－κ鎖可変領域含有タンパク質に限定されていないことを示唆するデータと考えられる。また、Ｃ４ドメインをベースとした変異体でも同様の傾向が見られたことは、本発明の変異が、特定菌株のプロテインＬに限定されず、一般的なプロテインＬ、またはその類縁体と認知されるタンパク質にも、本発明が適用できることを示唆するデータと考えられる。
　比較例４：　ＰｐＬの野生型Ｂ１ドメイン（ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ）およびＣ４ドメイン（ＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄ）の調製
　実施例７（１）にて調製したＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄおよびＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄの発現プラスミドを用いて、実施例７と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。
　比較例５：　ＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのａＲＳＶ－Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価、および、ＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄのａＩｇＥ－Ｆａｂの酸解離ｐＨ評価
　比較例４で調製したＬＢ１ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例３（１）で調製したａＲＳＶ－Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例７（２）と同様の手法にて酸解離ｐＨを解析した。また、比較例４で調製したＬＣ４ｔ－Ｗｉｌｄ．１ｄに関し、実施例７（２）で調製したａＩｇＥ－Ｆａｂ固定化担体を用いて、実施例７（２）と同様のクロマトグラフィ実験にて酸解離ｐＨを解析した。その解析結果を、上記の表８および表９に併せて示した。

Claims (12)

  1. 　下記（１）～（３）のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
    　（１）　配列番号２１のアミノ酸配列において、第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
    　（２）　上記（１）のアミノ酸配列において、上記第１５位、第１６位、第１７位および第１８位を除く領域中で、１個以上２０個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド；
    　（３）　上記（１）のアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離ｐＨが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド（但し、上記（１）に規定されるアミノ酸配列における第１５位、第１６位、第１７位および第１８位から選択される１以上の位置のアミノ酸残基の置換は、（３）においてさらに変異しないものとする）。
  2. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列が配列番号１２～２０のいずれかのアミノ酸配列である請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  3. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１６位または第１８位のいずれかの位置のアミノ酸残基が置換されている請求項１に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  4. 　上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第１５位がＨｉｓに、第１６位がＡｌａ、ＡｓｐまたはＨｉｓに、第１７位がＨｉｓに、第１８位がＡｓｐ、ＧｌｎまたはＨｉｓに置換されている請求項１～３のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  5. 　上記（２）に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および／または付加されたアミノ酸残基の位置がＮ末端および／またはＣ末端である請求項１～４のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  6. 　上記（３）に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が９５％以上である請求項１～５のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを２個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または請求項７に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
  9. 　免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
    　請求項８に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    　アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  10. 　請求項１～６のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項７に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  11. 　請求項１０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  12. 　請求項１１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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