JPWO2019059400A1 - イムノグロブリン結合タンパク質、及びそれを用いたアフィニティー担体 - Google Patents
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Abstract
Description
イムノグロブリン結合タンパク質であって、
イムノグロブリン結合ドメインの変異体を少なくとも1つ含み、
該イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であって且つ以下の(a)〜(n):
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリンκ鎖結合活性を有する、
イムノグロブリン結合タンパク質。
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
本発明はまた、前記ベクターを含む形質転換体を提供する。
本発明はまた、固相担体と、該固相担体に結合した前記イムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体を提供する。
本発明はまた、前記アフィニティー担体を用いる、抗体又はその断片の単離方法を提供する。
本発明はまた、前記イムノグロブリン結合タンパク質を、前記形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法を提供する。
イムノグロブリン結合ドメインの変異体の製造方法であって、
配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれらと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリンκ鎖結合活性を有するポリペプチドに対して、以下の(a)〜(n):
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を加えることを含む、方法。
〔1〕イムノグロブリン結合タンパク質であって、
イムノグロブリン結合ドメインの変異体を少なくとも1つ含み、
該イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であって且つ以下の(a)〜(n):
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリンκ鎖結合活性を有する、
イムノグロブリン結合タンパク質。
〔2〕前記(a)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(b)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(c)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(d)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(e)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(f)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(g)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(h)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(i)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(j)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(k)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(l)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(m)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(n)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換である、
〔1〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔3〕前記他のアミノ酸残基がGln、Asp、Lys、Arg又はHisである、〔1〕又は〔2〕記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔4〕前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位、18位、20位、26位、28位、30位、32位、34位、35位、38位、42位、54位、57位及び70位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置にGln、Asp、Lys、Arg及びHisから選択されるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる、〔1〕〜〔3〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔5〕前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ以下の(a’)〜(q’)のいずれか:
(a’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるHis;
(b’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるHis;
(c’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるHis;
(d’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるArg;
(e’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるHis;
(f’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるHis;
(g’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるHis;
(h’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるHis;
(i’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるArg;
(j’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるLys;
(k’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるLys;
(l’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるGln;
(m’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるHis;
(n’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるHis;
(o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ;
(p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及び(m’)の組み合わせ;
(q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ、
を有するアミノ酸配列からなる、〔1〕〜〔4〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔6〕前記配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列が、配列番号9で示されるアミノ酸配列である、〔1〕〜〔5〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔7〕前記少なくとも85%の同一性が少なくとも90%の同一性である、〔1〕〜〔6〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔8〕前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体を2個以上含む、〔1〕〜〔7〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
〔9〕〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔10〕〔9〕記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔11〕〔10〕記載のベクターを含む形質転換体。
〔12〕固相担体と、該固相担体に結合した〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
〔13〕〔12〕記載のアフィニティー担体を用いる、抗体又はその断片の単離方法。
〔14〕〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、〔11〕記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。
〔15〕イムノグロブリン結合ドメインの変異体の製造方法であって、
配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれらと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリンκ鎖結合活性を有するポリペプチドに対して、以下の(a)〜(n):
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を加えることを含む、方法。
〔16〕前記(a)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(b)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(c)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(d)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(e)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(f)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(g)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(h)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(i)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(j)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(k)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(l)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(m)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(n)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換である、
〔15〕記載の製造方法。
〔17〕前記他のアミノ酸残基がGln、Asp、Lys、Arg又はHisである、〔15〕又は〔16〕記載の製造方法。
〔18〕前記少なくとも1つの変異が、以下の(a’)〜(q’)のいずれか:
(a’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(b’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(c’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(d’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基のArgへの置換;
(e’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(f’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(g’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(h’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(i’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基のArgへの置換;
(j’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基のLysへの置換;
(k’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基のLysへの置換;
(l’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基のGlnへの置換;
(m’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(n’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基のHisへの置換;
(o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ;
(p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及び(m’)の組み合わせ;
(q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ、
である、〔15〕〜〔17〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔19〕前記配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列が、配列番号9で示されるアミノ酸配列である、〔15〕〜〔18〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔20〕前記少なくとも85%の同一性が少なくとも90%の同一性である、〔15〕〜〔19〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔21〕前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、親ドメインと比べて酸性条件下での抗体解離挙動が向上している、〔15〕〜〔20〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔22〕前記変異を加えたポリペプチドを〔11〕記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することをさらに含む、〔15〕〜〔21〕のいずれか1項記載の製造方法。
〔23〕固相担体に、リガンドとして、〔1〕〜〔8〕のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、プロテインLのイムノグロブリン結合ドメインに由来するイムノグロブリン結合ドメインの変異体(以下、本発明の変異体ともいう)を少なくとも1つ含む。本発明の変異体は、親ドメインであるプロテインL由来のイムノグロブリン結合ドメイン又はその変異体に所定の変異を加えることによって得ることができる。本発明の変異体は、イムノグロブリンκ鎖結合性を有し、且つ親ドメインと比べて酸性条件下での抗体解離挙動が向上している。本発明の変異体を有する本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティー担体のリガンドとして使用することができる。
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を導入して得られたポリペプチドであって、イムノグロブリンκ鎖結合活性を保持しているものである。
(a’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるHis;
(b’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるHis;
(c’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるHis;
(d’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるArg;
(e’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるHis;
(f’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるHis;
(g’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるHis;
(h’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるHis;
(i’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるArg;
(j’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるLys;
(k’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるLys;
(l’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるGln;
(m’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるHis;
(n’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるHis;
(o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ;
(p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及び(m’)の組み合わせ、
(q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ;
を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリンκ鎖結合活性を有するポリペプチドが挙げられる。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、当該分野で公知の手法、例えばアミノ酸配列に基づく化学合成法や、リコンビナント法などにより製造することができる。例えば、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、Frederick M. AusbelらによるCurrent Protocols In Molecular Biologyや、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)などに記載されている公知の遺伝子組換え技術を利用して製造することができる。すなわち、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを大腸菌などの宿主に形質転換し、得られた組換え体を適切な液体培地で培養することにより、培養後の細胞から、目的のタンパク質を大量且つ経済的に取得することができる。好ましい発現ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能な既知のベクターのいずれをも用いることができ、例えば、米国特許第5,151,350号明細書に記載されているプラスミドや、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)などに記載されているプラスミドが挙げられる。また、形質転換のための宿主としては、特に限定されないが、大腸菌などのバクテリア、真菌類、昆虫細胞、哺乳類細胞等の組換えタンパク質を発現させるために用いられる公知の宿主を用いることができる。宿主中に核酸を導入することにより宿主を形質転換させるためには、各宿主に応じて当該技術分野において知られるいずれの方法を用いてもよく、例えば、Sambrookら編集のMolecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)などに記載されている公知の方法を利用することができる。得られた形質転換体(例えば細菌等の細胞)を培養して発現されたタンパク質を回収する方法は、当業者によく知られている。あるいは、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、無細胞タンパク質合成系を用いて発現させてもよい。
本発明のイムノグロブリン結合タンパク質は、アフィニティーリガンドとして使用することができる。本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固相担体に固定化することによって、該本発明のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとしたアフィニティー担体を製造することができる。当該アフィニティー担体は、プロテインL由来のイムノグロブリン結合タンパク質をリガンドとする担体であり、イムノグロブリンκ鎖結合活性を有する。また当該アフィニティー担体は、野生型プロテインLやそのドメインをリガンドとする担体に比べて、酸性条件下での抗体解離挙動が向上している。
本発明の一実施形態に係る抗体又はその断片(以下、単に抗体と表記する。)の単離方法を説明する。本実施形態に係る抗体の単離方法は、好適には、本発明のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化したアフィニティー担体に、抗体を含有する試料を通液し、該担体に抗体を吸着させる工程(第一の工程)、及び、該担体から該抗体を溶出させる工程(第二の工程)を含む。
配列番号10〜23のいずれかに示すアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメイン変異体(変異ドメイン)を複数個含むタンパク質をコードする遺伝子のそれぞれをpET−24a(+)ベクターに組み込んだプラスミドを、人工遺伝子合成メーカーより入手した。これらのプラスミドを大腸菌コンピテントセルBL21(DE3)(NEW ENGLAND BioLabs製)に形質転換して形質転換細胞を得た。
得られた形質転換細胞を、吸光度(OD600)が約10に到達するまで37℃でインキュベートした。その後、終濃度で1mMになるようにIPTG(Sigma−Aldrich製)を添加し、さらに4時間37℃でインキュベートして、組み換え型イムノグロブリンκ軽鎖結合タンパク質を発現させた。細胞を回収し、pH9.5のトリス緩衝液中で破砕した。得られた細胞破砕液から、陰イオン交換クロマトグラフィー(Q−セファロースFF、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)及び陽イオン交換クロマトグラフィー(SP−セファロースFF、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)によって、組み換えイムノグロブリン結合タンパク質を精製した。精製したイムノグロブリン結合タンパク質を、10mMクエン酸緩衝液pH6.6に対して16時間透析した。SDS−PAGEによって確認された組み換え型イムノグロブリン結合タンパク質の純度は95%以上であった。精製された組換え型イムノグロブリンκ軽鎖結合タンパク質を、それぞれKBP1〜14とした。
配列番号9に示すアミノ酸配列からなる野生型イムノグロブリン結合ドメインを複数個含むタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて、実施例1と同様の手順で、組換え型イムノグロブリンκ軽鎖結合タンパク質KBP0を製造した。
酸性条件下における、実施例1及び比較例1で作製したイムノグロブリン結合タンパク質のヒトIgGからの解離率を測定した。測定は、IgG Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare社製)をパッキングしたカラム(以下IgGカラム)を用いて以下の手順で行った。まずIgGカラムをAKTAprime plus(GE Healthcare社製)にセットし、20mMリン酸ナトリウム(和光純薬工業社製)/150mM塩化ナトリウム(和光純薬工業社製)水溶液(結合バッファー)で、IgGカラムを平衡化した。このIgGカラムに実施例1又は比較例1のイムノグロブリン結合タンパク質を流し、カラムへ吸着させた。カラムを結合バッファーで洗浄した後、pH3.0の50mMクエン酸ナトリウム水溶液、次いでpH2.5の50mMクエン酸ナトリウム水溶液に接触させて、該イムノグロブリン結合タンパク質をIgG Sepharose 6 Fast Flowから解離させた。PrimeView Evaluation(GE Healthcare社製)を用いて解離した該イムノグロブリン結合タンパク質のピーク面積を測定した。下記式により、実施例1又は比較例1のイムノグロブリン結合タンパク質のpH3.0での抗体解離率を算出した。
pH3.0での抗体解離率=A/(A+B)
A:pH3.0で解離したイムノグロブリン結合タンパク質のピーク面積
B:pH2.5で解離したイムノグロブリン結合タンパク質のピーク面積
Claims (16)
- イムノグロブリン結合タンパク質であって、
イムノグロブリン結合ドメインの変異体を少なくとも1つ含み、
該イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列であって且つ以下の(a)〜(n):
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を有するアミノ酸配列からなり、イムノグロブリンκ鎖結合活性を有する、
イムノグロブリン結合タンパク質。 - 前記(a)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(b)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(c)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(d)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(e)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(f)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(g)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(h)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(i)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(j)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(k)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(l)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(m)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換であり、
前記(n)の変異が、配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換である、
請求項1記載のイムノグロブリン結合タンパク質。 - 前記他のアミノ酸残基がGln、Asp、Lys、Arg又はHisである、請求項1又は2記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位、18位、20位、26位、28位、30位、32位、34位、35位、38位、42位、54位、57位及び70位に相当する位置からなる群より選択される少なくとも1つの位置にGln、Asp、Lys、Arg及びHisから選択されるアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる、請求項1〜3のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体が、配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の同一性を有し且つ以下の(a’)〜(q’)のいずれか:
(a’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるHis;
(b’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるHis;
(c’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるHis;
(d’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるArg;
(e’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるHis;
(f’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるHis;
(g’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるHis;
(h’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるHis;
(i’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるArg;
(j’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるLys;
(k’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるLys;
(l’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるGln;
(m’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるHis;
(n’)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるHis;
(o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ;
(p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及び(m’)の組み合わせ;
(q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及び(l’)の組み合わせ、
を有するアミノ酸配列からなる、請求項1〜4のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。 - 前記配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列が、配列番号9で示されるアミノ酸配列である、請求項1〜5のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記少なくとも85%の同一性が少なくとも90%の同一性である、請求項1〜6のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 前記イムノグロブリン結合ドメインの変異体を2個以上含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項9記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項10記載のベクターを含む形質転換体。
- 固相担体と、該固相担体に結合した請求項1〜8のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質とを含む、アフィニティー担体。
- 請求項12記載のアフィニティー担体を用いる、抗体又はその断片の単離方法。
-
請求項1〜8のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を、請求項11記載の形質転換体、もしくは無細胞タンパク質合成系において発現させるか、又は化学合成することを含む、イムノグロブリン結合タンパク質の製造方法。 - イムノグロブリン結合ドメインの変異体の製造方法であって、
配列番号1〜9のいずれかで示されるアミノ酸配列又はこれらと少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つイムノグロブリンκ鎖結合活性を有するポリペプチドに対して、以下の(a)〜(n):
(a)配列番号9で示されるアミノ酸配列の16位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(b)配列番号9で示されるアミノ酸配列の18位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(c)配列番号9で示されるアミノ酸配列の20位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(d)配列番号9で示されるアミノ酸配列の26位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(e)配列番号9で示されるアミノ酸配列の28位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(f)配列番号9で示されるアミノ酸配列の30位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(g)配列番号9で示されるアミノ酸配列の32位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(h)配列番号9で示されるアミノ酸配列の34位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(i)配列番号9で示されるアミノ酸配列の35位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(j)配列番号9で示されるアミノ酸配列の38位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(k)配列番号9で示されるアミノ酸配列の42位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(l)配列番号9で示されるアミノ酸配列の54位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(m)配列番号9で示されるアミノ酸配列の57位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入;
(n)配列番号9で示されるアミノ酸配列の70位に相当する位置におけるアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換もしくは欠失、又は当該位置の前もしくは後の位置へのアミノ酸残基の挿入、
からなる群より選択される少なくとも1つの変異を加えることを含む、方法。 - 固相担体に、請求項1〜8のいずれか1項記載のイムノグロブリン結合タンパク質を固定化することを含む、アフィニティー担体の製造方法。
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