TW201928059A - 免疫球蛋白結合蛋白質,及使用其之親和性載體 - Google Patents
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Abstract
提供於酸性條件下的抗體解離率經提高之源自蛋白質L之免疫球蛋白結合蛋白質,及使用其之親和性載體。至少包含1個之免疫球蛋白結合結構域之變異體的免疫球蛋白結合蛋白質,及包含結合有該免疫球蛋白結合蛋白質之固相載體的親和性載體。該免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且具有所賦予之變異的胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性。
Description
本發明係關於免疫球蛋白結合蛋白質、使用其之親和性載體(affinity support),以及使用該親和性載體之抗體或其片段之單離方法。
抗體近年來廣為被利用於研究用試藥、抗體醫藥等。此等試藥或醫藥用之抗體,一般而言係藉由親和性層析而純化。抗體之親和性純化,一般而言係使用固定化有與免疫球蛋白特異性結合的物質之配位子的管柱。該配位子一般而言係使用蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L等之免疫球蛋白結合蛋白質。
抗體之親和性純化中,一般而言,首先係於中性條件下使抗體吸附於管柱後,藉由洗淨去除雜質,接著將管柱曝露於酸性條件,使所吸附的抗體自配位子解離、溶出。抗體之溶出,由於強的酸性條件下抗體可能受到變性等之損傷,因此較佳儘可能在溫和之酸性條件下進行。另一方面,溫和之酸性條件下,抗體不易由管柱溶出,因此抗體之純化效率降低。改善於溫和之酸性條件下抗體自親和性管柱之解離行為係受到期望。
蛋白質A係自比較以前即有使用的配位子蛋白質,提高於溫和之酸性條件下之抗體解離行為的技術亦自以前起即被研究。例如,專利文獻1中,藉由對蛋白質A之E結構域導入部位特異性突變,來提高於較溫和的酸性條件(pH4.5附近)下之抗體解離行為。
蛋白質L,由於係與免疫球蛋白輕鏈κ結構域結合,故使用於Fab或單鏈抗體(scFv)等之低分子抗體之純化。關於改變為親和性配位子用之蛋白質L的報告少。例如,專利文獻2及3中,記載包含蛋白質L之結構域或其變異體的免疫球蛋白κ鏈結合性多胜肽。專利文獻4中,記載具有由蛋白質L之免疫球蛋白輕鏈κ結構域結合性胜肽之胺基酸序列的15位、16位、17位及18位中選擇的1個以上之胺基酸殘基被取代之胺基酸序列,且其酸解離pH相較於取代導入前更向中性側偏移之免疫球蛋白κ鏈可變區域結合性胜肽。專利文獻5中,記載包含於蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域之胺基酸序列中,選自由第7位、第13位、第22位,及第29位所成之群的部位之至少2個以上,被離胺酸以外之鹼性胺基酸或具有羥基的胺基酸取代之胺基酸序列的免疫球蛋白結合結構域,其鹼安定性優良。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1] 日本專利第5229888號公報 [專利文獻2] 國際公開公報第2016/096643號 [專利文獻3] 美國專利第6884629號公報 [專利文獻4] 國際公開公報第2016/121703號 [專利文獻5] 國際公開公報第2017/069158號
[發明所欲解決之課題]
以往之親和性載體在溫和之酸性條件下抗體之純化效率不充分,用以作為親和性配位子使用之在溫和之酸性條件下的抗體解離率經提高之源自蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域受到需求。本發明提供在溫和之酸性條件下的抗體解離率經提高之包含源自蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域之變異體的免疫球蛋白結合蛋白質,及使用其之親和性載體。 [用以解決課題之手段]
本發明提供以下者: 一種免疫球蛋白結合蛋白質,其係免疫球蛋白結合蛋白質,其 包含至少1個免疫球蛋白結合結構域之變異體, 該免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列且係具有選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異之胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。
又,本發明提供編碼前述免疫球蛋白結合蛋白質的多核苷酸。 又,本發明提供包含前述多核苷酸之載體(vector)。 又,本發明提供包含前述載體之轉形體。 又,本發明提供包含固相載體(solid-phase support),與結合於該固相載體的前述免疫球蛋白結合蛋白質之親和性載體。 又,本發明提供使用前述親和性載體的抗體或其片段之單離方法。 又,本發明提供包含將前述免疫球蛋白結合蛋白質,於前述轉形體,或無細胞蛋白質合成系統中表現,或化學合成的免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法。
又,本發明提供以下者: 一種方法,其係免疫球蛋白結合結構域之變異體之製造方法,其包含 對由序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列或與此等具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽,施加選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。
又,本發明提供包含將前述免疫球蛋白結合蛋白質固定化於固相載體的親和性載體之製造方法。 [發明之效果]
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,對免疫球蛋白κ鏈之結合活性高,且於酸性條件下之抗體解離率高,故有用於作為親和性配位子。
本發明之例示性的實施形態係記載如下。 [1] 一種免疫球蛋白結合蛋白質,其係免疫球蛋白結合蛋白質,其 包含至少1個免疫球蛋白結合結構域之變異體, 該免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列且係具有選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異之胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。 [2] 如[1]之免疫球蛋白結合蛋白質,其中 前述(a)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(b)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(c)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(d)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(e)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(f)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(g)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(h)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(i)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(j)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(k)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(l)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(m)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(n)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。 [3] 如[1]或[2]之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述其他胺基酸殘基為Gln、Asp、Lys、Arg或His。 [4] 如[1]~[3]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且於選自由相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位、18位、20位、26位、28位、30位、32位、34位、35位、38位、42位、54位、57位及70位之位置所成之群的至少1個位置具有選自Gln、Asp、Lys、Arg及His的胺基酸殘基之胺基酸序列所構成。 [5] 如[1]~[4]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且具有以下之(a’)~(q’)之任一者的胺基酸序列所構成: (a’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的His; (b’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的His; (c’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的His; (d’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的Arg; (e’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的His; (f’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的His; (g’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的His; (h’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的His; (i’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的Arg; (j’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的Lys; (k’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的Lys; (l’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的Gln; (m’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的His; (n’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的His; (o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合; (p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及(m’)之組合; (q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合。 [6] 如[1]~[5]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列,為序列編號9表示之胺基酸序列。 [7] 如[1]~[6]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述至少85%之同一性為至少90%之同一性。 [8] 如[1]~[7]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其包含2個以上的前述免疫球蛋白結合結構域之變異體。 [9] 一種多核苷酸,其編碼如[1]~[8]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質。 [10] 一種載體,其包含如[9]之多核苷酸。 [11] 一種轉形體,其包含如[10]之載體。 [12] 一種親和性載體,其包含固相載體,與結合於該固相載體的如[1]~[8]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質。 [13] 一種抗體或其片段之單離方法,其使用如[12]之親和性載體。 [14] 一種免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法,其包含將如[1]~[8]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,於如[11]之轉形體,或無細胞蛋白質合成系統中表現,或化學合成。 [15] 一種方法,其係免疫球蛋白結合結構域之變異體之製造方法,其包含 對由序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列或與此等具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽,施加選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。 [16] 如[15]之製造方法,其中 前述(a)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(b)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(c)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(d)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(e)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(f)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(g)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(h)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(i)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(j)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(k)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(l)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(m)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(n)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。 [17] 如[15]或[16]之製造方法,其中前述其他胺基酸殘基為Gln、Asp、Lys、Arg或His。 [18] 如[15]~[17]中任一項之製造方法,其中 前述至少1個變異,為以下之(a’)~(q’)之任一者: (a’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為His; (b’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為His; (c’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為His; (d’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為Arg; (e’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為His; (f’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為His; (g’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為His; (h’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為His; (i’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為Arg; (j’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為Lys; (k’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為Lys; (l’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為Gln; (m’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為His; (n’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為His; (o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合; (p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及(m’)之組合; (q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合。 [19] 如[15]~[18]中任一項之製造方法,其中前述序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列,為序列編號9表示之胺基酸序列。 [20] 如[15]~[19]中任一項之製造方法,其中前述至少85%之同一性為至少90%之同一性。 [21] 如[15]~[20]中任一項之製造方法,其中前述免疫球蛋白結合結構域之變異體,相較於親結構域而言,於酸性條件下之抗體解離行為經提高。 [22] 如[15]~[21]中任一項之製造方法,其進一步包含將經施加前述變異之多胜肽,於[11]之轉形體,或無細胞蛋白質合成系統中表現,或化學合成。 [23] 一種親和性載體之製造方法,其包含將作為配位子的如[1]~[8]中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質固定化於固相載體。
本說明書中,胺基酸序列或核苷酸序列的同一性,可使用Karlin與Altschul之演算法BLAST(Pro.Natl. Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877)來決定。基於該BLAST演算法,係開發有稱為BLASTN、BLASTX、BLASTP、TBLASTN及TBLASTX的程式(J.Mol.Biol.,1990, 215:403-410)。使用此等程式時,係使用各程式之預設參數。此等之解析方法之具體的手法係眾所週知(參照www.ncbi.nlm.nih.gov)。
本說明書中,關於胺基酸序列及核苷酸序列的「至少85%之同一性」,係指85%以上之同一性、較佳為90%以上之同一性、更佳為95%以上之同一性、又更佳為97%以上之同一性、又再更佳為98%以上之同一性、又再更佳為99%以上之同一性。又,關於胺基酸序列及核苷酸序列的「至少90%之同一性」,係指90%以上之同一性、較佳為95%以上之同一性、更佳為97%以上之同一性、又更佳為98%以上之同一性、又再更佳為99%以上之同一性。
本說明書中,胺基酸序列及核苷酸序列上之「相當於…之位置」,可藉由將目標序列與參照序列(例如序列編號9表示之胺基酸序列),以對各胺基酸序列或核苷酸序列中存在的保存胺基酸殘基或核苷酸給予最大相同性的方式予以排列(比對)來決定。比對可使用眾所週知之演算法來實行,其順序係為所屬技術領域中具有通常知識者所週知。例如,比對可藉由以預設設定來使用Clustal W多重比對程式(Thompson,J.D.et al,1994,Nucleic Acids Res., 22:4673-4680)而進行。Clustal W,例如可於歐洲生物資訊學研究所(European Bioinformatics Institute:EBI [www. ebi.ac.uk/index.html]),或國立遺傳學研究所所營運的日本DNA資料庫(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])之網站上利用。
本說明書中,胺基酸殘基亦以如下之縮寫來記載:丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天門冬醯胺(Asn或N)、天門冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、麩醯胺(Gln或Q)、麩胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異白胺酸(Ile或I)、白胺酸(Leu或L)、離胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)、纈胺酸(Val或V);及任意之胺基酸殘基(Xaa或X)。又,本說明書中,胜肽之胺基酸序列,係遵照常規方法,以胺基末端(以下稱為N末端)位於左側、羧基末端(以下稱為C末端)位於右側的方式記載。
本說明書中,對於胺基酸序列的特定位置之「前」及「後」的位置,分別指鄰接於該特定位置之N末端側及C末端側的位置。例如,胺基酸殘基插入於特定位置之「前」及「後」的位置的情況時,插入後之胺基酸殘基係配置於鄰接於該特定位置之N末端側及C末端側的位置。
本說明書中,蛋白質L,係指藉由Finegoldia magna所生產的蛋白質之1種的蛋白質L。
本說明書中,「免疫球蛋白結合蛋白質」,係指具有對免疫球蛋白(或抗體或抗體之片段)之結合活性的蛋白質。本說明書中,「免疫球蛋白」(Ig),係包含IgG、IgA、IgD、IgE、IgM,及此等之次類型等之任意類型的免疫球蛋白。本說明書中之「抗體」,係指免疫球蛋白或包含抗原認識部位之其片段,例如。可包含IgG、IgA、IgD、IgE、IgM,及此等之次類型等之任意類型的免疫球蛋白、其片段、該等之變異體等。又,本說明書中之「抗體」,亦可為人類化抗體等之嵌合體抗體、抗體複合體,及包含抗原認識部位之其他免疫球蛋白修飾體等。又,本說明書中之「抗體之片段」,可為包含抗原認識部位的抗體之片段、亦可為不包含抗原認識部位的抗體之片段。不包含抗原認識部位的抗體之片段,例如可列舉僅由免疫球蛋白之Fc區域所構成的蛋白質、Fc融合蛋白質,及該等之變異體或修飾體等。
本說明書中「免疫球蛋白結合結構域」,係指免疫球蛋白結合蛋白質中所含有的,單獨即具有免疫球蛋白(或抗體或抗體之片段)結合活性之多胜肽的功能單位。該「免疫球蛋白結合結構域」之例子,可列舉具有對免疫球蛋白之κ鏈的結合活性之結構域,例如蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域,及具有免疫球蛋白κ鏈結合活性的該等之變異體。
該蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域的例子,可列舉Finegoldia magna 312株所產生的蛋白質L之B1結構域、B2結構域、B3結構域、B4結構域,及B5結構域,或F.magna 3316株所產生的蛋白質L之C1結構域、C2結構域、C3結構域,及C4結構域,其中,更佳為C1結構域、C2結構域、C3結構域及C4結構域。蛋白質L之B1結構域,係由序列編號1表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之B2結構域,係由序列編號2表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之B3結構域,係由序列編號3表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之B4結構域,係由序列編號4表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之B5結構域,係由序列編號5表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之C1結構域,係由序列編號6表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之C2結構域,係由序列編號7表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之C3結構域,係由序列編號8表示之胺基酸序列所構成。蛋白質L之C4結構域,係由序列編號9表示之胺基酸序列所構成。此等蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域,彼此之胺基酸序列的類似性高。表1顯示序列編號1~9表示之蛋白質L的結構域之胺基酸序列的比對。
該蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域之變異體的例子,可列舉由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。較佳為,該蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域之變異體的例子,可列舉由與序列編號6~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。
本說明書中,免疫球蛋白結合結構域或免疫球蛋白結合蛋白質之「於酸性條件下之抗體解離行為」,意指於酸性條件下,較佳為pH3.0之條件下,該結構域或蛋白質與抗體之解離率的高低。又,本說明書中,「抗體解離行為之提高」,係指抗體之解離率更加增高。結構域與抗體之解離率,可藉由後述試驗例1記載的手法來測定。
1.免疫球蛋白結合蛋白質 本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,包含至少1個之源自蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域的免疫球蛋白結合結構域之變異體(以下亦稱為本發明之變異體)。本發明之變異體,可藉由對親結構域之源自蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域或其變異體施加特定之變異而得到。本發明之變異體,具有免疫球蛋白κ鏈結合性,且相較於親結構域而言,於酸性條件下之抗體解離行為經提高。具有本發明之變異體的本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,可作為親和性載體之配位子使用。
本發明之變異體之親結構域,可列舉源自蛋白質L之免疫球蛋白結合蛋白質,例如蛋白質L之C1結構域、C2結構域、C3結構域、C4結構域、B1結構域、B2結構域、B3結構域、B4結構域、B5結構域,及該等之變異體。其中,較佳為C1結構域、C2結構域、C3結構域、C4結構域,及該等之變異體;更佳為C4結構域及其變異體。
可作為該親結構域使用的蛋白質L之B1~B5結構域及C1~C4結構域,係分別由序列編號1~9表示之胺基酸序列所構成的多胜肽。可作為本發明之變異體之親結構域使用的蛋白質L之B1~B5結構域及C1~C4結構域之變異體,可列舉由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。
可作為該親結構域使用的蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域之變異體,可藉由對蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域之胺基酸序列,施加胺基酸殘基之插入、刪除、取代或缺失,或胺基酸殘基之化學修飾等之改變來製作。胺基酸殘基之插入、刪除、取代或缺失的手段,可列舉對編碼該結構域的多核苷酸之部位特異性突變(Site-specific mutaion)等之週知手段。
因此,本發明中之較佳的親結構域之例子,可列舉由序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列,或與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。更佳之親結構域之例子。可列舉由序列編號6~9之任一者表示之胺基酸序列,或與序列編號6~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。又更佳之親結構域的例子,可列舉由序列編號9表示之胺基酸序列,或與序列編號9表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質中所包含的本發明之變異體,為對上述親結構域之胺基酸序列導入選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異所得之多胜肽,且保持免疫球蛋白κ鏈結合活性者: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。
例如,本發明之變異體,係藉由對由序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列所構成的多胜肽,導入選自由上述(a)~(n)所成之群的至少1個變異而製造。或者,本發明之變異體,係藉由對由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之蛋白質L免疫球蛋白結合結構域變異體之多胜肽,導入選自由上述(a)~(n)所成之群的至少1個變異而製造。較佳為,該(a)~(i)及(l)~ (n)的位置之變異後之胺基酸殘基,以及該(j)及(k)的位置之變異前之胺基酸殘基,為藉著自中性朝向酸性條件下之變化,電荷狀態會變化的胺基酸。所製造之本發明之變異體,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性,且作為免疫球蛋白結合結構域而發揮功能。又,本發明之變異體,相較於變異前之結構域(親結構域)而言,於酸性條件下之抗體解離行為經提高,因此可適合地使用作為親和性配位子。
較佳為,上述(a)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(a)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的Ile取代為His。
較佳為,上述(b)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(b)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的Val取代為His。
較佳為,上述(c)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(c)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的Leu取代為His。
較佳為,上述(d)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為Arg。更佳為,上述(d)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的Lys取代為Arg。
較佳為,上述(e)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(e)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的Gln取代為His。
較佳為,上述(f)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(f)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的Ala取代為His。
較佳為,上述(g)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(g)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的Phe取代為His。
較佳為,上述(h)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(h)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的Gly取代為His。本發明之變異體具有該(h)之變異時,較佳為組合具有由上述(a)~(g)及下述(i)~(n)中選擇的任1者以上之變異。
較佳為,上述(i)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為Arg。更佳為,上述(i)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的Thr取代為Arg。
較佳為,上述(j)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為Lys。更佳為,上述(j)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的Glu取代為Lys。
較佳為,上述(k)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為Lys。更佳為,上述(k)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的Glu取代為Lys。
較佳為,上述(l)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為Gln。更佳為,上述(l)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的Asn取代為Gln。
較佳為,上述(m)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(m)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的Tyr取代為His。
較佳為,上述(n)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。該其他胺基酸殘基,較佳為Gln、Asp、Lys、Arg或His,更佳為His。更佳為,上述(n)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的Ile取代為His。
上述(a)~(n)之變異或其組合之適合的例子,可列舉(a)、(b)、(c)、(e)、(f)、(g)、(h)、(j)、(k)、(m)或(n)之單獨變異;(d)、(h)、(i)、(k)及(l)之組合;(d)、(i)、(k)、(l)及(m)之組合;以及(d)、(g)、(i)、(k)及(l)之組合。更適合的例子,可列舉I16H、V18H、L20H、Q28H、A30H、F32H、G34H、E38K、E42K、Y57H,或I70H之單獨變異;K26R、G34H、T35R、E42K及N54Q之組合;K26R、T35R、E42K、N54Q,及Y57H之組合,以及K26R、F32H、T35R、E42K及N54Q之組合。
使親結構域變異的手段,可列舉對編碼該親結構域之多核苷酸,以產生所期望之胺基酸殘基之取代、缺失、插入等的方式導入變異之方法。用以對多核苷酸導入變異之具體的手法,可列舉部位特異性突變、同源重組法、SOE(splicing by overlap extension)-PCR法(Gene,1989, 77:61-68)等,此等之詳細順序係所屬技術領域中具有通常知識者所週知。
以上述順序所得到的本發明之變異體的例子,可列舉由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且具有選自由上述(a)~(n)所成之群的至少1個變異之胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。
本發明之變異體之較佳的例子,可列舉由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且於選自由相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位、18位、20位、26位、28位、30位、32位、34位、35位、38位、42位、54位、57位及70位之位置所成之群的至少1個位置具有選自Gln、Asp、Lys、Arg及His的胺基酸殘基之胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。
本發明之變異體之更佳的例子,可列舉由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且至少具有以下之(a’)~(q’)之任一者的胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽: (a’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的His; (b’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的His; (c’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的His; (d’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的Arg; (e’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的His; (f’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的His; (g’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的His; (h’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的His; (i’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的Arg; (j’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的Lys; (k’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的Lys; (l’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的Gln; (m’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的His; (n’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的His; (o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合; (p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及(m’)之組合; (q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合。
本發明之變異體之又更佳的例子,可列舉由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且具有上述(a’)、(b’)、(c’)、(e’)、(f’)、(g’)、(h’)、(j’)、(k’)、(m’)及(n’)之任1者,或(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合;(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及(m’)之組合;或(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合的胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。
本發明之變異體之又更佳的例子,可列舉由與序列編號9表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且具有上述(a’)~(q’)之任一者的胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽。本發明之變異體之又再更佳的例子,可列舉由序列編號10~23之任一者表示之胺基酸序列所構成的多胜肽。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,只要包含上述本發明之變異體1個以上即可。較佳為,本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,包含本發明之變異體2個以上、更佳為3個以上、又更佳為4個以上。另一方面,本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,較佳為包含本發明之變異體12個以下、更佳為8個以下、又更佳為7個以下。例如,本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,較佳為包含本發明之變異體2~12個、更佳為3~8個、又更佳為4~7個。本發明之免疫球蛋白結合蛋白質包含2個以上之本發明之變異體時,該等之變異體可為相同種類者、亦可為不同種類者,較佳為相同種類。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,亦可包含上述本發明之變異體以外的具有對免疫球蛋白κ鏈之結合活性的其他免疫球蛋白結合結構域。該其他結構域之例子,可列舉不具有上述(a)~(n)表示之任何變異的蛋白質L之免疫球蛋白結合結構域或其變異體。
本發明之免疫球蛋白結合蛋白質的較佳例子,可列舉由自序列編號10~23選擇的1種或2種以上之胺基酸序列呈直鏈狀連結有2~12個、更佳為3~8個、又更佳為4~7個之胺基酸序列所構成的多胜肽;更佳之例子可列舉由呈直鏈狀連結之2~12個、更佳為3~8個、又更佳為4~7個之序列編號10~23之任一者之胺基酸序列所構成的多胜肽。但是,本發明之蛋白質的較佳例子不限定於此等。
2.免疫球蛋白結合蛋白質之製造 本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,可藉由該領域中週知之手法,例如基於胺基酸序列之化學合成法,或重組法等來製造。例如,本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,可利用Frederick M. Ausbel等人所著之Current Protocols In Molecular Biology,或Sambrook等編集之Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition, 2001)等所記載的週知之基因重組技術來製造。亦即,藉由將含有編碼本發明之免疫球蛋白結合蛋白質的多核苷酸之表現載體對大腸菌等之宿主轉形,並將所得之重組體以適切之液體培養基培養,可由培養後之細胞,大量且經濟地取得目標蛋白質。較佳之表現載體,只要是可於宿主細胞內複製之已知的載體則均可使用,例如,可列舉美國專利第5,151,350號說明書記載之質體,或Sambrook等編集之Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition,2001)等所記載的質體。又,用以轉形之宿主並無特殊限定,可使用大腸菌等之細菌、真菌類、昆蟲細胞、哺乳類細胞等之用以表現重組蛋白質的週知之宿主。為了藉由對宿主中導入核酸來使宿主轉形,只要依各宿主來使用該技術領域中已知的任意方法即可,例如,可利用Sambrook等編集之Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,3rd edition,2001)等所記載的週知方法。回收培養所得之轉形體(例如細菌等之細胞)並表現之蛋白質的方法,係為所屬技術領域中具有通常知識者眾所週知。或者,本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,亦可使用無細胞蛋白質合成系統表現。
因此,又,本發明提供編碼本發明之免疫球蛋白結合蛋白質的多核苷酸(DNA等)、包含其之載體,及包含該等之轉形體。
3.親和性載體 本發明之免疫球蛋白結合蛋白質,可作為親和性配位子使用。藉由將本發明之免疫球蛋白結合蛋白質固定化於固相載體,可製造以該本發明之免疫球蛋白結合蛋白質作為配位子的親和性載體。該親和性載體,為以源自蛋白質L之免疫球蛋白結合蛋白質為配位子的載體,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性。又,該親和性載體,相較於以野生型蛋白質L或其結構域為配位子的載體而言,於酸性條件下之抗體解離行為經提高。
本發明之親和性載體中包含的固相載體之形狀,可為粒子、膜、試驗盤、管、針狀、纖維狀等之任意形態。該載體可為多孔性亦可為非多孔性。此等載體亦可使用作為填充床,或亦可以懸浮形態來使用。懸浮形態係包含流動層(expanded bed)及已知作為純粹懸浮物者,該形態中粒子可自由運動。連續床(monolith)、填充床及流動層的情況時,分離順序一般而言係遵照以濃度梯度所進行之習知層析法。純粹懸浮物的情況時,係使用批次法。較佳為,該載體為填充劑。或者載體亦可為如晶片、毛細管或濾器之形態。
一實施形態中,該固相載體,粒徑較佳為20μm以上200μm以下。例如載體為合成聚合物時,粒徑較佳為20μm以上、更佳為30μm以上,且較佳為100μm以下、更佳為80μm以下,例如較佳為20~100μm、更佳為30~ 80μm。例如載體為多糖時,粒徑較佳為50μm以上、更佳為60μm以上,且較佳為200μm以下、更佳為150μm以下,例如較佳為50~200μm、更佳為60~150μm。粒徑未達20μm時,於高流速下管柱壓力增高,不耐實用。粒徑超過200μm時,可能有免疫球蛋白結合於親和性載體之量(結合容量)不良的情況。再者,本說明書中之「粒徑」,係指藉由雷射繞射散射式粒度分布測定裝置所得到的體積平均粒徑,更詳細而言意指以根據ISO 13320及JIS Z 8825-1之雷射繞射法所測定的體積平均粒子徑。具體而言,係指藉由雷射散射繞射法粒度分布測定裝置(例如LS 13 320 ((股)Beckman Coulter等)測定粒徑分布,使用Fluid R.I.Real 1.333、Sample R.I.Real 1.54 Imaginary 0等作為光學模式,測定體積基準之粒度分布所求得的平均粒子徑。
一實施形態中,該固相載體較佳為多孔質,較佳為50m2
/g以上、更佳為80m2
/g以上,且較佳為150m2
/ g以下、更佳為130m2
/g以下,例如較佳為具有50~150m2
/ g、更佳為具有80~130m2
/g之比表面積。此處,比表面積未達50m2
/g時,結合容量可能有不良的情況,另一方面,超過150m2
/g時,因載體之強度不良,故可能有於高流速下載體被破壞,管柱壓力上昇的情況。再者,本說明書中之「比表面積」,係指以汞細孔計得到之細孔徑10~5000 nm的細孔所具有之表面積除以粒子之乾燥重量的值。
一實施形態中,該固相載體,體積平均細孔徑較佳為100nm以上1400nm以下。例如載體為合成聚合物時,體積平均細孔徑較佳為100nm以上、更佳為200nm以上,且較佳為400nm以下、更佳為300nm以下,例如較佳為100~400nm、更佳為200~300nm。例如載體為多糖時,體積平均細孔徑較佳為500nm以上、更佳為800nm以上,且較佳為1400nm以下、更佳為1200nm以下,例如較佳為500~1400nm、更佳為800~1200nm。此處,體積平均細孔徑未達100nm時,可能有高流速下之結合容量降低變得顯著的情況,另一方面,超過1400nm時,與流速無關地可能有結合容量降低的情況。再者,本說明書中之「體積平均細孔徑」,係指以汞細孔計所得到之細孔徑10~5000nm之細孔的體積平均細孔徑。
該固相載體滿足上述範圍之粒徑、比表面積,及細孔徑分布時,作為純化對象溶液之流道的粒子間之間隙及粒子內之較大的細孔徑,與純化對象分子之結合表面積的平衡係得到最佳化,維持高流速下之結合容量在高的量。
該固相載體之材質,例如為具有親水性表面之聚合物,例如,係藉由親水化處理而於外表面(及若存在時於內表面亦)具有羥基(-OH)、羧基(-COOH)、胺基羰基(-CONH2
,或N取代型)、胺基(-NH2
,或取代型),或寡或聚乙烯氧基的聚合物。一實施形態中,該聚合物,可為對聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇系等之合成聚合物進行過親水化處理之聚合物,較佳為對如經多官能(甲基)丙烯酸酯、二乙烯基苯等之多官能單體交聯的共聚物之合成聚合物進行過親水化處理之聚合物。該聚合物係藉由週知之方法而容易地製造(例如參照J.MATER.CHEM1991,1(3),371-374之方法)。或者,亦使用如TOYOPEARL(東曹公司)之市售品。其他實施形態之聚合物,係葡聚糖、澱粉、纖維素、普魯蘭糖、洋菜糖等之多糖類。該多糖類係藉由週知之方法而容易地製造(例如參照日本專利第4081143號之方法)。或者,亦使用如瓊脂糖(GE Healthcare Bioscience公司)之市售品。其他實施形態中,亦可為二氧化矽、氧化鋯等之無機載體。
一實施形態中,使用作為該固相載體的多孔性粒子之一具體例子,例如可列舉含有20~50質量%之交聯性乙烯基單體與3~80質量%之含有環氧基之乙烯基單體、20~80質量%之含有二醇基之乙烯基單體的共聚物,且粒徑為20~80μm,比表面積為50~150m2
/g,體積平均細孔徑為100~400nm的多孔性有機聚合物粒子。
再者,將該固相載體以汞細孔計測定時之細孔徑10~5000nm的細孔之滲入體積(細孔體積),較佳為1.3mL/g以上7.0mL/g以下。例如載體為合成聚合物時,細孔體積較佳為1.3mL/g以上,且較佳為7.0mL/g以下、更佳為5.0mL/g以下、又更佳為2.5mL/g以下,例如較佳為1.3~7.0mL/g、更佳為1.3~5.0mL/g、又更佳為1.3~2.5mL/ g。又,例如載體為多糖時,細孔體積較佳為3.0~6.0mL/ g。
配位子(亦即本發明之免疫球蛋白結合蛋白質)對該固相載體之結合方法,可使用將蛋白質固定化於載體之一般的方法來進行。例如,可列舉使用具有羧基之載體,將該羧基以N-羥基琥珀酸醯亞胺活性化,與配位子之胺基反應之方法;使用具有胺基或羧基之載體,於水溶性碳二醯亞胺等之脫水縮合劑存在下與配位子之羧基或胺基反應,而形成醯胺鍵之方法;使用具有羥基之載體,以溴化氰等之鹵化氰活性化,與配位子之胺基反應之方法;將載體之羥基予以甲苯磺醯化或三氟乙基磺醯化,與配位子之胺基反應之方法;藉由雙環氧化物、表氯醇等,將環氧基導入載體,與配位子之胺基、羥基或硫醇基反應之方法;使用具有環氧基之載體,與配位子之胺基,又,羥基或硫醇基反應之方法等。上述當中,就於實施反應之水溶液中的安定性之觀點,較期望為透過環氧基使配位子鍵結的方法。
環氧基開環所生成之開環環氧基的羥基,係扮演使載體表面親水化,防止蛋白質等之非特異吸附,並且於水中提高載體之韌性,防止高流速下之載體的破壞之角色。因此,於固定化配位子之後的載體中存在有未與配位子鍵結之殘餘的環氧基時,較佳使該殘餘的環氧基開環。載體中之環氧基的開環方法,例如可列舉於水溶劑中藉由酸或鹼於加熱或室溫下攪拌該載體之方法。又,亦能夠以巰基乙醇、硫甘油等之具有巰基之阻攔劑(blocking agent)或單乙醇胺等之具有胺基之阻攔劑,來使環氧基開環。更佳之開環環氧基,為將載體中所含有的環氧基以硫甘油開環而得到的開環環氧基。硫甘油具有作為原料而言較巰基乙醇等毒性更低,且加成有硫甘油之環氧開環基,較具有胺基之阻攔劑所得的開環基非特異吸附更低,且動態結合量較高之優點。
亦可依需要於固相載體與配位子之間導入任意長度之分子(間隔子)。間隔子之例子可列舉聚亞甲基鏈、聚乙二醇鏈、糖類等。
本發明之親和性載體,由於具有於酸性條件下之抗體解離行為經提高的配位子,因此可於對抗體造成變性等之損傷少的比較溫和之酸性條件,較佳為pH3.0~4.0之條件下,效率良好地溶出結合於配位子的抗體。又,本發明之親和性載體,由於使用具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之配位子,故不僅IgG、IgM、IgA、IgD、IgE等之免疫球蛋白,亦可使用於Fab或單鏈抗體(scFv)等之低分子抗體之純化。
4.抗體或其片段之單離方法 說明本發明之一實施形態之抗體或其片段(以下僅表述為抗體)之單離方法。本實施形態之抗體之單離方法,適宜者為包含對固定化有本發明之免疫球蛋白結合蛋白質之親和性載體,使含有抗體之試樣通液,使抗體吸附於該載體之步驟(第一步驟),及由該載體使該抗體溶出之步驟(第二步驟)。
該第一步驟中,對填充有本發明之親和性載體的管柱等,使含有抗體之試樣,以抗體吸附於配位子(本發明之免疫球蛋白結合蛋白質)的條件流過。該第一步驟中,試樣中之抗體以外的物質,絕大部分不吸附於配位子地通過管柱。之後,依需要,亦可為了將微弱地保持於配位子的一部分物質去除,而將載體以含有NaCl等之鹽之中性緩衝液洗淨。
該第二步驟中,係使pH3.0~4.0之適當的緩衝液流過,使吸附於配位子之抗體溶出。藉由回收該溶出液,可由試樣中單離抗體。
本發明之抗體之單離方法的一實施形態中,經單離的抗體,係作為抗體醫藥使用。因此,一實施形態中,本發明提供使用本發明之親和性載體的抗體醫藥之製造方法。該方法之順序,除了使用含有作為目標的抗體醫藥之試樣以外,基本上與上述抗體之單離方法的順序相同。 [實施例]
以下,列舉實施例以進一步具體說明本發明。又,以下之記載為概括顯示本發明之態樣者,本發明不無特殊理由地受該記載所限定。
實施例1 免疫球蛋白κ鏈結合蛋白質(KBP1~14)之製作 由人工基因合成廠商獲得將編碼包含複數個之由序列編號10~23之任一者所示胺基酸序列所構成的免疫球蛋白結合結構域變異體(變異結構域)之蛋白質的基因分別接入pET-24a(+)載體而得的質體。將此等質體對大腸菌勝任細胞BL21(DE3)(NEW ENGLAND BioLabs製)轉形而得到轉形細胞。 將所得之轉形細胞,於37℃培養至吸光度(OD600)約到達10。之後,以終濃度成為1mM的方式添加IPTG (Sigma-Aldrich製),進一步於37℃培養4小時,使重組型免疫球蛋白κ輕鏈結合蛋白質表現。回收細胞,於pH9.5之TRIS緩衝液中使其破碎。藉由陰離子交換層析(Q-瓊脂糖FF、GE Healthcare Bioscience公司製)及陽離子交換層析(SP-瓊脂糖FF、GE Healthcare Bioscience公司製),由所得之細胞破碎液,純化重組免疫球蛋白結合蛋白質。將所純化之免疫球蛋白結合蛋白質,對10mM檸檬酸緩衝液pH6.6透析16小時。以SDS-PAGE所確認之重組型免疫球蛋白結合蛋白質的純度為95%以上。所純化之重組型免疫球蛋白κ輕鏈結合蛋白質,分別稱為KBP1~14。
比較例1 免疫球蛋白κ輕鏈結合蛋白質(KBP0)之製作 使用接入有編碼包含複數個之由序列編號9所示胺基酸序列所構成的野生型免疫球蛋白結合結構域的蛋白質之基因的質體,以與實施例1相同的順序,製造重組型免疫球蛋白κ輕鏈結合蛋白質KBP0。
實施例1及比較例1所製作的免疫球蛋白κ輕鏈結合蛋白質(KBP0~14)之構造示於表2。
試驗例1 免疫球蛋白結合蛋白質之抗體解離率之測定 測定於酸性條件下實施例1及比較例1所製作的免疫球蛋白結合蛋白質之自人類IgG的解離率。測定係使用裝填有IgG Sepharose 6 Fast Flow(GE Healthcare公司製)的管柱(以下稱IgG管柱)由以下之順序進行。首先將IgG管柱設置於AKTAprime plus(GE Healthcare公司製),以20mM磷酸鈉(和光純藥工業公司製)/150mM氯化鈉(和光純藥工業公司製)水溶液(結合緩衝液),將IgG管柱平衡化。使實施例1或比較例1之免疫球蛋白結合蛋白質流過該IgG管柱,吸附於管柱。將管柱以結合緩衝液洗淨後,使pH3.0之50mM檸檬酸鈉水溶液、接著以pH2.5之50mM檸檬酸鈉水溶液進行接觸,使該免疫球蛋白結合蛋白質自IgG Sepharose 6 Fast Flow解離。使用PrimeView Evaluation(GE Healthcare公司製)測定所解離之該免疫球蛋白結合蛋白質的峰值面積。藉由下述式,算出實施例1或比較例1之免疫球蛋白結合蛋白質於pH3.0的抗體解離率。 於pH3.0的抗體解離率=A/(A+B) A:於pH3.0解離的免疫球蛋白結合蛋白質之峰值面積 B:於pH2.5解離的免疫球蛋白結合蛋白質之峰值面積
結果示於表2。包含變異結構域之蛋白質KBP1~14,相較於包含野生型結構域之蛋白質KBP0而言,於pH3.0的抗體解離率較高。再者由在pH3.0條件下與pH2.5條件下的峰值測定值所評估之免疫球蛋白結合蛋白質與抗體的解離量之總量,KBP0與KBP1~14係同等。由此等結果可知,包含變異結構域之KBP1~14,於pH3.0之酸性條件下的抗體解離行為有所提高。藉由使用了此等之變異結構域的親和性試驗,顯示出即使於pH3.0左右之比較溫和的條件下,亦可使抗體效率良好地由配位子解離。
Claims (16)
- 一種免疫球蛋白結合蛋白質,其係免疫球蛋白結合蛋白質,其 包含至少1個免疫球蛋白結合結構域之變異體, 該免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性的胺基酸序列且係具有選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異之胺基酸序列所構成,具有免疫球蛋白κ鏈結合活性: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。
- 如請求項1之免疫球蛋白結合蛋白質,其中 前述(a)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(b)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(c)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(d)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(e)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(f)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(g)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(h)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(i)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(j)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(k)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(l)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(m)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基, 前述(n)之變異,為於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基。
- 如請求項1或2之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述其他胺基酸殘基為Gln、Asp、Lys、Arg或His。
- 如請求項1~3中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且於選自由相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位、18位、20位、26位、28位、30位、32位、34位、35位、38位、42位、54位、57位及70位之位置所成之群的至少1個位置具有選自Gln、Asp、Lys、Arg及His的胺基酸殘基之胺基酸序列所構成。
- 如請求項1~4中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述免疫球蛋白結合結構域之變異體,係由與序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列具有至少85%之同一性且具有以下之(a’)~(q’)之任一者的胺基酸序列所構成: (a’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的His; (b’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的His; (c’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的His; (d’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的Arg; (e’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的His; (f’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的His; (g’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的His; (h’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的His; (i’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的Arg; (j’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的Lys; (k’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的Lys; (l’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的Gln; (m’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的His; (n’)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的His; (o’)該(d’)、(h’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合; (p’)該(d’)、(i’)、(k’)、(l’)及(m’)之組合; (q’)該(d’)、(g’)、(i’)、(k’)及(l’)之組合。
- 如請求項1~5中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列,為序列編號9表示之胺基酸序列。
- 如請求項1~6中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其中前述至少85%之同一性為至少90%之同一性。
- 如請求項1~7中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,其包含2個以上的前述免疫球蛋白結合結構域之變異體。
- 一種多核苷酸,其編碼如請求項1~8中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質。
- 一種載體,其包含如請求項9之多核苷酸。
- 一種轉形體,其包含如請求項10之載體。
- 一種親和性載體,其包含固相載體,與結合於該固相載體的如請求項1~8中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質。
- 一種抗體或其片段之單離方法,其使用如請求項12之親和性載體。
- 一種免疫球蛋白結合蛋白質之製造方法,其包含將如請求項1~8中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質,於如請求項11之轉形體,或無細胞蛋白質合成系統中表現,或化學合成。
- 一種方法,其係免疫球蛋白結合結構域之變異體之製造方法,其包含 對由序列編號1~9之任一者表示之胺基酸序列或與此等具有至少85%之同一性的胺基酸序列所構成,且具有免疫球蛋白κ鏈結合活性之多胜肽,施加選自由以下之(a)~(n)所成之群的至少1個變異: (a)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的16位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (b)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的18位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (c)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的20位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (d)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的26位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (e)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的28位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (f)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的30位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (g)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的32位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (h)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的34位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (i)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的35位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (j)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的38位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (k)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的42位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (l)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的54位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (m)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的57位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入; (n)於相當於序列編號9表示之胺基酸序列的70位之位置的胺基酸殘基取代為其他胺基酸殘基或缺失,或胺基酸殘基對該位置之前或後的位置之插入。
- 一種親和性載體之製造方法,其包含將如請求項1~8中任一項之免疫球蛋白結合蛋白質固定化於固相載體。
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