JPWO2016121703A1 - 変異型免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 配列番号21のアミノ酸配列において、第15位、第16位、第17位および第18位から選択される1つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド;
(2) 上記(1)のアミノ酸配列において、上記第15位、第16位、第17位および第18位を除く領域中で、1個以上20個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド;
(3) 上記(1)のアミノ酸配列に対して80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド(但し、上記(1)に規定されるアミノ酸配列における第15位、第16位、第17位および第18位から選択される1以上の位置のアミノ酸残基の置換は、(3)においてさらに変異しないものとする)。
上記[8]に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
(1) 配列番号21のアミノ酸配列において、第15位、第16位、第17位および第18位から選択される1つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド;
(2) 上記(1)のアミノ酸配列において、上記第15位、第16位、第17位および第18位を除く領域中で、1個以上20個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド;
(3) 上記(1)のアミノ酸配列に対して80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド(但し、上記(1)に規定されるアミノ酸配列における第15位、第16位、第17位および第18位から選択される1以上の位置のアミノ酸残基の置換は、(3)においてさらに変異しないものとする)。
(1) 発現プラスミド調製
LB5t−Wild.1d(配列番号16)のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列(配列番号22)を設計した。なお、実験上の都合から、塩基配列は、N末端にGlu−Glnが、および、C末端にGlyが付加されたアミノ酸配列をコードするように設計した。これらの1〜2残基の付加配列は、野生型PpL312のB5ドメインに由来する。次に、発現プラスミドの作製方法を図2に示す。LB5t−Wild.1dをコードするDNAは、同じ制限酵素サイトを有する2種の二本鎖DNA(f1とf2)を連結する形で調製し、発現ベクターのマルチクローニングサイトに組み込んだ。実際には、2種の二本鎖DNAと発現ベクターの計3種の二本鎖DNAを連結する3断片ライゲーションによって、コードDNA調製とベクター組込みを同時に実施した。2種の二本鎖DNAの調製方法は、互いに30塩基程度の相補領域を含む2種の一本鎖オリゴDNA(f1−1/f1−2、または、f2−1/f2−2)を、オーバーラップPCRによって伸長し、目的の二本鎖DNAを調製した。具体的な実験操作については、次の通りとなる。一本鎖オリゴDNAf1−1(配列番号23)/f1−2(配列番号24)を外注によって合成し(シグマジェノシス社)、ポリメラーゼとしてPyrobest(タカラバイオ社)を用い、オーバーラップPCR反応を行った。PCR反応生成物をアガロース電気泳動にかけ、目的のバンドを切り出すことで抽出した二本鎖DNAを、制限酵素BamHIとHindIII(いずれもタカラバイオ社)により切断した。同様に、一本鎖オリゴDNAf2−1(配列番号25)/f2−2(配列番号26)を外注によって合成し、オーバーラップPCR反応を経て、合成・抽出した二本鎖DNAを、制限酵素HindIIIとEcoRI(いずれもタカラバイオ社)により切断した。次に、プラスミドベクターpGEX−6P−1(GEヘルスケア・バイオサイエンス社)のマルチクローニングサイト中のBamHI/EcoRIサイトに上記2種の二本鎖DNAをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ligation high(TOYOBO社)を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
上記(1)で得られた各種LB5t変異体遺伝子を導入した形質転換細胞を、アンピシリン含有2×YT培地にて、37℃で終夜培養した。これらの培養液を、100倍量程度のアンピシリン含有2×YT培地に接種し、37℃で約2時間培養した後で、終濃度0.1mMになるようイソプロピル1−チオ−β−D−ガラクシド(以下、「IPTG」と略記する)を添加し、さらに25℃にて18時間培養した。
(1) IgG由来Fabフラグメントの調製
ヒト化モノクローナルIgG製剤を原料として、これをパパインによって、FabフラグメントとFcフラグメントに断片化し、Fabフラグメントのみを分離精製することで調製した。具体的には、軽鎖がκ鎖からなる抗RSVモノクローナルIgG(一般名「パリビズマブ」,製品名「シナジス」,アッヴィ社)製剤を、パパイン消化用緩衝液(0.1M AcOH−AcONa,2mM EDTA,1mMシステイン,pH5.5)に溶解し、Papain Agarose from papaya latexパパイン固定化アガロース(SIGMA社)を添加し、ローテーターで混和させながら、37℃で約8時間インキュベートした。パパイン固定化アガロースから分離した反応溶液(FabフラグメントとFcフラグメントが混在)から、MabSelect SuReカラム(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を利用したアフィニティクロマトグラフィにより、素通り画分でIgG−Fabを回収することで分離精製した。分取したIgG−Fab溶液を、Superdex 75 10/300 GLカラム(平衡化および分離には標準緩衝液を使用)を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて精製し、IgG−Fab溶液(aRSV−Fab)を得た。なお、実施例1と同様に、クロマトグラフィによるタンパク質精製は、AKTAprime plusシステムを利用して実施した。
表面プラズモン共鳴を利用したバイオセンサーBiacore3000(GEヘルスケア・バイオサイエンス社)を用いて、実施例1(2)で取得した各種LB5t変異体のIgG−Fabとの親和性を解析した。本実施例では、実施例2(1)で取得したIgG−Fabをセンサーチップに固定化し、各種ペプチドをチップ上に流して、両者の相互作用を検出した。IgG−FabのセンサーチップCM5への固定化は、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)およびN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)を用いたアミンカップリング法にて行い、ブロッキングにはエタノールアミンを用いた(センサーチップや固定化用試薬は、全てGEヘルスケアバイオサイエンス社製)。IgG−Fab溶液は、固定化用緩衝液(10mM CH3COOH−CH3COONa,pH4.5)を用いて10倍程度に希釈し、Biacore 3000付属のプロトコルに従い、センサーチップへ固定した。また、チップ上の別のフローセルに対して、EDC/NHSにより活性化した後にヒト血清アルブミン(和光純薬社製)を固定化する処理を行うことで、ネガティブ・コントロールとなるリファレンスセルも用意した。各種LB5t変異体は、ランニング緩衝液(20mM NaH2PO4−Na2HPO4,150mM NaCl,0.005% P−20,pH7.4)を用いて、0.01、0.1、1または10μMに濃度を調整したタンパク質溶液を、流速40μL/minで1分間センサーチップに添加した。測定温度25℃にて、添加時(結合相,1分間)および添加終了後(解離相,1分間)の結合反応曲線を順次観測した。各々の観測終了後に、約20mM NaOHを添加して洗浄した。得られた結合反応曲線(リファレンスセルの結合反応曲線を差し引いた結合反応曲線)に対して、システム付属ソフトBIA evaluationを用いた1:1の結合モデルによるフィッティング解析を行い、aRSV−Fabに対する親和定数(KA=kon/koff)を算出した。比較例2で測定した、野生型のLB5t−Wild.1dの各種結合パラメータと共に、解析結果を表2に示す。
(1) Fabフラグメント固定化担体の調製
カップリング目的官能基をアミノ基とする市販のリガンド固定化用カップリングカラムを利用して、実施例2で得られたaRSV−Fabを固定化したアフィニティ分離マトリックスを作製した。
実施例1(2)で調製した各種LB5t変異体を、実施例3(1)で調製したaRSV−Fab固定化カラムを利用したアフィニティ精製クロマトグラフィにより、LB5t変異体の溶出ピークトップにおけるpH(酸解離pH)を解析した。具体的には、クロマトシステムとしては、AKTAprime plusシステムを利用し、イオン交換用緩衝液A(50mM クエン酸−クエン酸Na,pH5.5)にて平衡化したカラムに、約0.1mg/mLに調整した各種LB5t変異体のタンパク質溶液を0.1mL添加し、pH5.5からpH2.5へのpH直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換用緩衝液Aとイオン交換用緩衝液B(50mM CH3COOH−CH3COONa,1M NaCl,pH2.5)を利用しており、カラムに20カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Bの濃度を0%から100%に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離pHを評価した。実際のデータの一例として、各種LB5tの第16位に変異を導入した変異体に関し、比較例3の野生型LB5tとの比較も出来る形で重ね合わせたクロマトグラフィのチャートを図3に示した。この実験において、本発明で得られた各種LB5t変異体(LB5t−T16A.1d、LB5t−T16D.1d、LB5t−T16H.1d)が、変異を導入していないLB5t−Wild.1dよりも早く溶出した。これは、より中性側に近いpHで各種LB5t変異体が溶出されることを示している。即ち、本発明のペプチドは、VL−κ鎖可変領域含有タンパク質と解離するpHがより中性側に改変されたことを示すデータであるといえる。この実験系における、各々の溶出位置(ピークトップ)におけるpH値を、比較例3の結果も併せて表3に示す。
実施例1にて調製したLB5t−Wild.1dの発現プラスミドを用いて、実施例1と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。
比較例1で調製したLB5t−Wild.1dに関し、実施例2(1)で調製したRSV−Fabとの親和性を、実施例2(2)と同様の手法にて解析した。その解析結果を、上記の表2に併せて示した。
比較例1で調製したLB5t−Wild.1dに関し、実施例3(1)で調製したRSV−Fab固定化担体を用いて、実施例3(2)と同様の手法にて酸解離pHを解析した。その解析結果を、上記の表3に併せて示した。
配列番号1に示されるPpL312に含まれるVL−κ結合ドメイン間のアミノ酸配列を利用し、配列番号46で示されるB5ドメイン変異体のアミノ酸配列を4個連結した配列番号51のアミノ酸配列(「LB5t−T16H.4d」)を設計した。配列番号51のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、当該ペプチドをコードする塩基配列(配列番号52)を設計した。配列番号52のDNAの5’末端にPstI認識サイト、3’末端にXbaI認識サイトを付与したDNA(配列番号53)の人工合成遺伝子を、ユーロフィンジェノミクス社への外注によって全合成した。このサブクローニング後の発現プラスミドを、制限酵素PstIおよびXbaI(タカラバイオ社)で消化し、取得したDNA断片を、同じ制限酵素で消化したブレビバチルス発現用ベクターpNCMO2(タカラバイオ社)へライゲーションし、LB5t−T36H.4dのアミノ酸配列をコードするDNAがブレビバチルス発現用ベクターpNCMO2に挿入された発現プラスミドを調製した。なおライゲーション反応は、Ligation high(TOYOBO社)を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施し、プラスミドの調製にはエシェリヒア・コリJM109株(タカラバイオ社)を用いた。各々の発現プラスミドDNA塩基配列の確認は、DNAシークエンサー3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems社)を用いて行った。BigDye Terminator v.1.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems社)を用いて、付属のプロトコルに従い、各々のプラスミドDNAのシークエンシングPCR反応を行い、そのシークエンシング産物をプラスミド精製キット(Applied Biosystems社,「BigDye XTerminator Purification Kit」)を用いて添付のプロトコルに従い精製し、配列解析に用いた。
実施例4で調製したLB5t−T16H.4dを、水不溶性セルロース担体へ固定化した。水不溶性セルロース担体としては、結晶性高架橋セルロース(JNC社製,特開2009−242770号公報またはUS20090062118Aに記載に方法により得られるゲル)を使用した。この際、エポキシ法を固定化方法として利用した。
実施例5で作製した担体1mL−gelを充填したTricorn 5/50 column(GEヘルスケアバイオサイエンス社)をクロマトシステムAKTAavant 25に接続し、実施例2の(1)で調製したaRSV−Fabの溶出ピークトップにおけるpH(酸解離pH)を解析した。具体的には、イオン交換用緩衝液A(50mM クエン酸−クエン酸Na,pH5.0)にて平衡化したカラムに、1.0mg/mLに調整したaRSV−Fab溶液を1.0mL添加し、pH5.0からpH2.4へのpH直線勾配にて溶出させた。より具体的には、イオン交換用緩衝液Aとイオン交換用緩衝液B(50mM クエン酸−クエン酸Na,pH2.4)を利用しており、カラムに20カラムボリューム分の緩衝液を通液する際に、緩衝液Bの濃度を0%から100%に直線的に上げていく工程にて、溶出位置から酸解離pHを評価した。結果を表5に示す。
(1) 発現プラスミド調製、および、タンパク質の発現と精製
LB5t−Wild.1d(配列番号16)、LB1t−Wild.1d(配列番号12)、またはLC4t−Wild.1d(配列番号20)の変異体の発現プラスミドを追加で調製した。LB1t−Wild.1dおよびLC4t−Wild.1dのコードDNAを有する変異導入用発現プラスミドは、表6に示す配列番号54〜61の一本鎖オリゴDNAを用いて、実施例1(1)の記載と同様の手法にて調製した。調製した発現プラスミドにおいて目的のペプチドをコードするDNAについて、LB1t−Wild.1dは配列番号62の塩基配列、LC4t−Wild.1dは配列番号63の塩基配列であることを、実施例1(1)の記載と同様の手法にて、塩基配列解析で確認した。
aRSV−Fab固定化担体、またはaIgE−Fab固定化担体を用いて、(1)にて調製した各種VL−κ鎖結合ドメイン変異体のFabに対する酸解離pHの評価を行った。aIgE−Fabは、抗IgEモノクローナルIgG製剤(一般名「オマリズマブ」,製品名「ゾレア」,ノバルティスファーマ社)より、実施例2(1)に記載の手法にて調製し、aRSV−Fab固定化担体は実施例3(1)に記載の手法にて、市販のプレパックカラムに固定化することで調製した。各種VL−κ鎖結合ドメイン変異体のaRSV−FabまたはaIgE−Fabに対する酸解離pHは、実施例3(2)記載と同様のクロマトグラフィ実験にて評価した。
実施例7(1)にて調製したLB1t−Wild.1dおよびLC4t−Wild.1dの発現プラスミドを用いて、実施例7と同様の手法にて、形質転換細胞を調製し、培養・精製を経て、タンパク質溶液を調製した。
比較例4で調製したLB1t−Wild.1dに関し、実施例3(1)で調製したaRSV−Fab固定化担体を用いて、実施例7(2)と同様の手法にて酸解離pHを解析した。また、比較例4で調製したLC4t−Wild.1dに関し、実施例7(2)で調製したaIgE−Fab固定化担体を用いて、実施例7(2)と同様のクロマトグラフィ実験にて酸解離pHを解析した。その解析結果を、上記の表8および表9に併せて示した。
Claims (12)
- 下記(1)〜(3)のいずれかの免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
(1) 配列番号21のアミノ酸配列において、第15位、第16位、第17位および第18位から選択される1つ以上のアミノ酸残基が置換されているアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、置換導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド;
(2) 上記(1)のアミノ酸配列において、上記第15位、第16位、第17位および第18位を除く領域中で、1個以上20個以下のアミノ酸残基が欠失、置換および/または付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド;
(3) 上記(1)のアミノ酸配列に対して80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、その酸解離pHが、変異導入前に比べて中性側にシフトしている免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド(但し、上記(1)に規定されるアミノ酸配列における第15位、第16位、第17位および第18位から選択される1以上の位置のアミノ酸残基の置換は、(3)においてさらに変異しないものとする)。 - 上記(1)に規定されるアミノ酸配列が配列番号12〜20のいずれかのアミノ酸配列である請求項1に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
- 上記(1)に規定されるアミノ酸配列において、第16位または第18位のいずれかの位置のアミノ酸残基が置換されている請求項1に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
- 上記(1)に規定されるアミノ酸配列において、第15位がHisに、第16位がAla、AspまたはHisに、第17位がHisに、第18位がAsp、GlnまたはHisに置換されている請求項1〜3のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
- 上記(2)に規定されるアミノ酸配列において、上記欠失、置換および/または付加されたアミノ酸残基の位置がN末端および/またはC末端である請求項1〜4のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
- 上記(3)に規定されるアミノ酸配列において、上記配列同一性が95%以上である請求項1〜5のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドを2個以上連結した複数ドメインを有することを特徴とする免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド、または請求項7に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体が、リガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
- 免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を製造する方法であって、
請求項8に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンκ鎖可変領域を含むタンパク質を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチドまたは請求項7に記載の免疫グロブリンκ鎖可変領域結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするDNA。
- 請求項10に記載のDNAを含むことを特徴とするベクター。
- 請求項11に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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