MX2011001696A - Metodos para purificar anticuerpos usando cromatografia de afinidad con proteina a. - Google Patents

Abstract

Esta invención provee un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico que comprende poner en contacto la muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, con una columna de cromatografía de proteína A; eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna de cromatografía de proteína A con un regulador de pH de elución; y recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y tiene un pH de aproximadamente 3.2 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra; esta invención también provee un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico que comprende eluir con acetato o citrato, opcionalmente en presencia de aminoácidos; esta invención también provee un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico que comprende conducir el método dentro de ciertos intervalos de temperatura.

Description

MÉTODOS PARA PURIFICAR ANTICUERPOS USANDO CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD CON PROTEÍNA A A lo largo de esta solicitud, varias referencias son referidas por números arábigos entre paréntesis. Descripciones de estas publicaciones en su totalidad son incorporadas aquí por referencia en la solicitud para describir en forma más completa la técnica más avanzada a la cual pertenece esta invención. Las citas bibliográficas completas para esta referencia se pueden encontrar inmediatamente antes de las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En la década pasada, las solicitudes para anticuerpos monoclonales terapéuticos (mAbs) han incrementado significativamente. La estabilidad de Mab representa un desafío actual en la purificación y formulación de estas proteínas. La inestabilidad de Mab conduce a altos niveles de mAb agregado en formulaciones de proteína, que pueden tener desventajas que incluyen actividad de proteína cambiante y que conducen potencialmente a respuestas inmunológicas no deseadas en pacientes.

La cromatografía de afinidad con proteína A es una herramienta poderosa y ampliamente usada para purificar anticuerpos. A fin de eluir una proteína o anticuerpo de la resina de proteína A, se requieren condiciones acidas debido a la alta afinidad de los anticuerpos monoclonales a la resina.

La exposición a estas condiciones ácidas puede dar por resultado la formación de agregados de proteína. Algunas estrategias para enfrentar la agregación durante la cromatografía de proteína A han sido descritas anteriormente en la literatura (1 , 2, 3, 4, 5, 6). Además, un paso de mantenimiento de pH bajo después de la elución se requiere para la inactivación viral y también puede dar por resultado la formación de agregados de proteína (7, 8, 9).

Anteriormente, un enfoque para reducir la agregación de proteína en formulaciones de mAb era usar pasos de cromatografía adicionales. Esta solución es costosa en términos de materiales y tiempo de procesamiento; y también da por resultado pérdidas de producto con cada paso, lo que puede reducir el rendimiento global del producto de mAb.

Otro enfoque anterior para reducir la agregación de proteína en formulaciones de mAb era usar métodos de cromatografía avanzados, tales como corte de pico, para reducir la cantidad de agregación de proteína después del paso de cromatografía de afinidad. Esos enfoques consumen tiempo y a menudo no tienen éxito por lo que se necesitan pasos de cromatografía adicional para producir formulaciones de mAb adecuadas para uso humano.

Otro enfoque anterior para reducir la agregación de proteína en formulaciones de mAb era usar agentes estabilizadores que pudieran tener varias desventajas incluyendo cambios en actividad de proteína, dificultad en pasos de purificación adicionales y respuestas inmunológicas potencialmente indeseables en pacientes.

Los métodos que son el tema de la presente invención enfrentan la necesidad de procesos más simples y menos costosos para reducir la agregación de proteína en formulaciones de anticuerpo monoclonales a fin de purificar anticuerpos monoclonales monoméricos adecuados para uso humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención provee un primer método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior que comprenden: (a) poner en contacto la muestra con una columna de cromatografía de afinidad con proteína A; (b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna de cromatografía de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución; y (c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto (i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y (ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.5, por lo que purifica el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

Esta invención provee un segundo método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; (b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende citrato a una concentración de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M; y (c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto (i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y (ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.0, por lo que purifica el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

Esta invención provee un tercer método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior que comprende: (a) poner en contacto la muestra con una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; (b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende acetato a una concentración de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M; y (c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto (i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y (ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.5, por lo que purifica el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior a un pH de acervo de PAP de 6.1 como una función del tiempo a 4°C, 17°C y 37°C para un anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 mostrado en la figura 22). En la figura,? = pH 6.1 a 4°C, o = pH 6.1 a 17°C, y ? = pH 6.1 a 37°C.

La figura 2 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior a un pH de acervo de PAP de 3.5 como una función del tiempo a 4°C, 17°C y 37°C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 (SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 mostrado en la figura 22). En la figura,? = pH 3.5 a 4°C, o - pH 3.5 a 17°C, y ? = pH 3.5 a 37°C.

La figura 3 muestra la velocidad de formación de dímero a un pH de acervo de PAP de 6.1 como una función del tiempo a 4°C, 17°C y 37°C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura,? = pH 6.1 a 4°C, o = pH 6.1 a 17°C, y ? - pH 6.1 a 37°C.

La figura 4 muestra la velocidad de formación de dímero para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 a un pH de acervo de PAP de 3.5 como una función del tiempo a 4°C, 17°C y 37°C. En la figura,? = pH 3.5 a 4°C, y o = pH 3.5 a 17°C.

La figura 5 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 a un pH de acervo de PAP de 3.5 como una función del tiempo a 25°C y 30°C. En la figura,? = pH 3.5 a 25°C, y o = pH 3.5 a 30°C.

La figura 6 muestra la velocidad de formación de dímero para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 a un pH de acervo de PAP de 3.5 como una función del tiempo a 25°C y 30°C. En la figura,? = pH 3.5 a 25°C, y o = pH 3.5 a 30°C.

La figura 7 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior a un pH de 4.0, 4.5, y 5.0 como una función del tiempo a 21 °C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura,? = pH 4.0 a 21 °C, o = pH 4.5 a 21°C, y ? - pH 5.0 a 21°C.

La figura 8 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior a un pH de 4.0, 4.5, y 5.0 como una función del tiempo a 30°C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura,? = pH 4.0 a 30°C, o = pH 4.5 a 30°C, y ? = pH 5.0 a 30°C.

La figura 9 muestra la velocidad de formación de dímero a un pH de 4.0, 4.5, y 5.0 como una función del tiempo a 21 °C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura,? = pH 4.0 a 21 °C, o - pH 4.5 a 21 °C, y ? - pH 5.0 a 21°C.

La figura 10 muestra la velocidad de formación de dímero a un pH de 4.0, 4.5, y 5.0 como una función del tiempo a 30°C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura,? = pH 4.0 a 30°C, o = pH 4.5 a 30°C, y ? = pH 5.0 a 30°C.

La figura 11 muestra niveles de agregados de orden superior versus tiempo a 4°C, 17°C, 25°C y 30°C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 PAP a pH 3.5. En la figura,¦ = 30°C,? = 25°C, A -17°C, y x = 4°C.

La figura 12 muestra formación de agregado de orden superior como una función del tiempo y temperatura a pH 3.91 y concentración de citrato de 50 mM para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura, 0 = pH 3.91 a 4°C,? = pH 3.91 a 15°C, ? = pH 3.91 a 20°C; y x = pH 3.91 a 24°C.

La figura 13 muestra formación de agregado de orden superior como una función del tiempo a una concentración de citrato de 50 mM y 100 mM a temperatura ambiente para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura,¦ = pH 3.5 a 25°C, y? - pH 3.91 a 24°C.

La figura 14 muestra formación de agregado de orden superior como una función de concentración de citrato y tiempo a 25°C para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. En la figura, ? = 60 mM de citrato a pH 3.8, ü = 75 mM de citrato a pH 3.6, = 100 mM de citrato a pH 3.6, ^ = 85 mM de citrato a pH 3.4, y D = 40 mM de citrato a pH 3.4.

La figura 15A muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo anti-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 3.0.

La figura 15B muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo ant¡-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 3.5.

La figura 15C muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo anti-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 4.0.

La figura 16A muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo anti-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 4.5.

La figura 16B muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo anti-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 5.0.

La figura 16C muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo anti-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 5.5.

La figura 16D muestra los perfiles de DSC para el anticuerpo anti-DKK1 en 30 mM, 60 mM y 100 mM de citrato a pH 6.0.

La figura 17 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 para elución de 60 mM de citrato con y sin 50 mM de arginina a 25°C. En la figura, 0 = 60 mM de citrato + 50 mM de arginina a pH 3.5 y 25°C, y? - 60 mM de citrato sólo a pH 3.5 y 25°C.

La figura 18 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 para 100 mM de citrato elución con y sin 250 mM de arginina a 25°C. En la figura, 0 = 100 mM de citrato + 250 mM de arginina a pH 3.5 y 25°C, y G - 100 mM de citrato sólo a pH 3.5 y 25°C.

La figura 19 muestra la velocidad de formación de agregado de orden superior para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 para varias concentraciones de citrato en comparación con regulador de pH de fosfato como una función del tiempo a 25°C. En la figura, |QU] = 60 mM de citrato, = 75 mM de citrato, = 40 mM de citrato, = H3P04 = 100 mM de citrato, y [| = 85 mM de citrato.

La figura 20 muestra el efecto de la concentración de anticuerpo monoclonal para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 sobre la velocidad de agregación de orden superior a 25°C con el tiempo en 15 mM de citrato. En la figura,? = 8 mg/ml de mAb anti-DKK-1 ,¦ = 14 mg/ml de mAb anti-DKK-1 , y ? = 34 mg/ml de mAb anti-DKK-1.

La figura 21 muestra el efecto de concentración de anticuerpo monoclonal para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 sobre la velocidad de agregación de orden superior con el tiempo a pH 4.0 en 15 mM de citrato a 21°C y 85 mM de acetato a 25°C. En la figura, · = 5 mg/ml de mAb anti-DKK-1 en acetato, + = 11 mg/ml de mAb anti-DKK-1 en acetato, ? = 37 mg/ml de mAb anti-DKK-1 en acetato, y? - 7 mg/ml de mAb anti-DKK-1 en citrato.

La figura 22 muestra las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 para las cadenas pesada y ligera (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2).

La figura 23 muestra las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-ADDL # 1 para las cadenas pesada y ligera (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4).

La figura 24 muestra las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-ADDL # 2 para las cadenas pesada y ligera (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6).

La figura 25 muestra las secuencias de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-hlL-13ra-1 para las cadenas pesada y ligera (SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8).

La figura 26 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región Fe de lgG2m4 del anticuerpo monoclonal comparada con la de las regiones Fe de IgGI, lgG2 e lgG4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "proteína" o "polipéptido", como se usa aquí, significa un polipéptido hecho de residuos de aminoácido covalentemente enlazados entre sí por enlaces peptídicos.

Como se usa aquí, los términos "anticuerpos", "inmunoglobulina", y "molécula de inmunoglobulina" se usarán intercambiablemente. Cada anticuerpo tiene una estructura única que le permite unirse a su antígeno específico, pero todos los anticuerpos tienen la misma estructura general que se describe aquí. La unidad estructural de anticuerpo básica se sabe que comprende un tetrámero de subunidades. Cada tetrámero tiene dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 1 10 o más aminoácidos principalmente responsables de reconocimiento de antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de función efectora (10).

El término fragmento "Fe" se refiere a la región C-terminal de 'cristalizada por fragmento' del anticuerpo que contiene los dominios CH2 y CH3. El término fragmento "Fab" se referirá a la región de 'unión de antígeno de fragmento' del anticuerpo que contiene los dominios VH> CH1 , VL y C|_.

El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa aquí, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) típicamente incluirán anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada mAb es dirigido contra un solo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto a que pueden ser sintetizados por cultivo de hibridoma, no contaminados por otras inmunoglobulinas. El término "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe considerarse como que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales de la presente se pueden hacer por el método de hibridoma primero descrito por Kohler ef al, (1975) Nature, 256:495, o se pueden hacer por métodos de ADN recombinante (1 1 ).

El término "anticuerpo monoclonal monomérico" como se usa aquí, se referirá a una molécula de anticuerpo que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, es decir, un monómero.

Como se usa aquí, un anticuerpo "anti-DKK-1 " significa un anticuerpo monoclonal con las secuencias de aminoácidos para las cadenas ligera y pesada como se expone en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2, véase figura 22.

Como se usa aquí, un anticuerpo "anti-ADDL" significa un anticuerpo monoclonal con las secuencias de aminoácidos para cadenas pesada y ligera expuestas aquí en SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 o SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, véase figura 23 y figura 24, respectivamente.

Como se usa aquí, un anticuerpo "anti-hlL-13ra1 " significa un anticuerpo monoclonal con las secuencias de aminoácidos para cadenas pesada y ligera como se expone en SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO: 8, véase figura 25.

Como se usa aquí, un "anticuerpo de lgG2 modificado" significa un anticuerpo que tiene región Fe de "lgG2m4" de un anticuerpo monoclonal como es representado por la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 26.

El término "dímero" como se usa aquí significa una molécula biológica que consiste de dos subunidades llamadas monómeros. "Dímeros" de la presente invención significa una molécula que contiene dos anticuerpos monoclonales monoméricos.

El término "agregado de orden superior" o "HOA" como se usa aquí significa oligómeros grandes de anticuerpos monoclonales monoméricos, que son típicamente mayores que 300 kDa, es decir, peso molecular de dímero.

El término "agregado" o "agregación" como se usa aquí, significa aglomeración u oligomerización de dos o más moléculas individuales, es decir, agregado de proteína o agregación de proteína. Los agregados de proteína pueden ser solubles o ¡nsolubles.

Una "impureza", como se usa aquí, significa un material que es diferente del producto de proteína deseado, tal como agregados de proteína. La impureza puede ser una variante de la proteína deseada u otra proteína. Ejemplos específicos de impurezas en la presente incluyen proteínas de la célula hospedera que producen la proteína deseada, tales como proteínas hospederas, proteínas lixidiadas A, ADN, ARN, etc (véase, v.gr., publicación de solicitud de patente de E.U.A. No. US 2005/0038231).

El término "degradación de proteína", como se usa aquí, significa un anticuerpo monoclonal monomérico o proteína que se degrada bajo cierta condición para formar un dímero o agregado de orden superior.

La recuperación primaria produce la corriente de alimentación a la cromatografía de proteína A. un término usado para describir esta corriente de alimentación se denomina "centrado filtrado en profundidad" y, como se usa aquí significa un anticuerpo monoclonal o solución de proteína que ha sido procesado a través de centrifugación (remoción de células y residuos) y filtración a profundidad (remoción de residuos finos es decir < 10 µ??). En esta invención, el producto filtrado a profundidad se usa como la solución de alimentación para los experimentos de laboratorio de cromatografía de afinidad con proteína A y para la producción de varios lotes clínicos.

El término "cromatografía de afinidad con proteína A" se referirá a la separación o purificación de sustancias y/o partículas usando proteína A, en donde la proteína A es generalmente inmovilizada sobre una fase sólida. La proteína A es una proteína de pared celular de 40-60 kD originalmente encontrada en Staphylococcus aureus. La unión de anticuerpos a resina de proteína A es altamente específica. La proteína A se une con alta afinidad a la región Fe de inmunoglobulinas. Se une con alta afinidad a lgG1 y lgG2 humanas así como lgG2a y lgG2b de ratón. La proteína A se une con afinidad moderada a IgM, IgA y IgE humanas, así como a lgG3 y lgG1 de ratón. Una proteína que comprende una región CH2/CH3 puede ser unida reversiblemente a, o adsorbida por, la proteína A. Las columnas de cromatografía de afinidad con proteína A para usarse en cromatografía de afinidad con proteína A en la presente incluyen, pero no se limitan a, proteína A inmovilizada sobre una fase sólida de agarosa, por ejemplo las columnas de MABSELECT™ o MABSURE™ (Amersham Biosciences Inc.); proteína A inmovilizada sobre una fase sólida de poliestireno, por ejemplo columnas POROS 50A™ (Applied Biosystems Inc.).

"Muestra", cuando se usa en conexión con los presentes métodos, incluye, pero no se limita a cualquier tejido corporal, sangre, suero, plasma, fluido cerebroespinal, linfocitos, exudado o sobrenadante de un cultivo de células.

Los términos "carga" o "cargando" significa la cantidad de proteína por volumen unitario.

El término "contacto" como se usa aquí significa poner en contacto un anticuerpo monoclonal con resina de proteína A en la columna de cromatografía de afinidad con proteína A.

El término "regulador de pH de elución", como se usa aquí, significa un regulador de pH que comprende una especie primaria, tal como citrato de sodio o acetato de sodio, que se usa para eluir el anticuerpo de la columna de afinidad de proteína A.

Como se usa aquí, el término "citrato" significa la especie aniónica presente en regulador de pH de elución como se deriva del ácido o sal correspondiente.

Como se usa aquí, el término "acetato" significa la especie aniónica presente en el regulador de pH de elución como se deriva del ácido o sal correspondiente.

El término "fracción", como se usa aquí, en "recolección de una o más fracciones" significa el resultado de un proceso de separación en el cual una cierta cantidad de una mezcla (sólida, líquida, soluto o suspensión) es dividida en un número de cantidades más pequeñas ("fracciones") en las cuales la composición cambia de acuerdo con un gradiente. Aquí, las fracciones son recolectadas a medida que el anticuerpo monoclonal monomérico es eluido de la columna de afinidad de proteína A.

El término "regulador de pH de regeneración", como se usa aquí, significa el regulador de pH usado para limpiar la columna para remover impurezas unidas. Por ejemplo, un regulador de pH con alto contenido de sal, uno que contiene NaOH, o un regulador de pH que contiene ácido fosfórico (13).

El término "volumen de columna" o "CV" como se usa aquí, significa el volumen de resina empacada dentro de la columna incluyendo cualquier volumen de huecos. Por ejemplo, si una columna de 10 mi en empacada con 2 mi de resina, entonces un CV es 2 mi.

El término "tiempo de residencia", como se usa aquí, significa una cantidad de tiempo que una porción del producto interactúa con la resina.

El término "velocidad de flujo", como se usa aquí, significa el volumen de columna dividido entre el tiempo de residencia. Por ejemplo, la velocidad de flujo para una columna con 10 mi de resina a un tiempo de residencia especificado de 5 min sería como sigue: 10 mi = 2 ml/min 5 min El término "producto de proteína A" o "PAP", como se usa aquí, significa el producto que es eluido de la columna de cromatografía de afinidad con proteína A usando un ácido como citrato de sodio o acetato de sodio.

El término "producto de proteína A extinguido" o "QPAP", como se usa aquí, significa la adición de base a PAP, que tal como una base tris o una solución de fosfato, para elevar el pH de PAP de aproximadamente pH 3.0 a 4.0 a aproximadamente 6.0 a 7.5.

El término "rendimiento", como se usa aquí, significa la cantidad de producto recuperado dividido entre la cantidad de productos cargado en la columna multiplicado por 100. Por ejemplo, una columna cargada con una solución que contiene 100 gramos de producto, pero de la cual 80 gramos de producto fue recuperada de la corriente de elución, tendría un rendimiento de 80%.

El término "calorimetría de escudriñamiento diferencial" o "DSC", como se usa aquí, significa una técnica termoanalítica que mide la diferencia en la cantidad de calor requerido para incrementar la temperatura de una muestra y referencia como una función de temperatura. Para proteínas, DSC provee información sobre la estabilidad térmica de una proteína y sus dominios individuales y sobre la solubilidad de las formas no dobladas de la proteína.

El término "cromatografía de líquidos de alta presión o alto rendimiento" o "CLAR", como se usa aquí, significa una forma de cromatografía en columna que utiliza alta presión para separar, identificar y cuantificar compuestos. CLAR usa una columna que contiene una fase estacionaria a una temperatura especificada, una bomba para la solución de fase móvil y un detector para cuantificar cada compuesto inyectado en la columna.

El término "cromatografía de exclusión de tamaño de alta presión" o "HPSEC" significa un método cromatográfico que usa alta presión (20 a 150 bar) para separar partículas basadas en su peso molecular o volumen hidrodinámico. En esta invención, esta técnica se aplica para la separación y cuantificación de anticuerpos monoclonales, dímeros y agregados de orden superior.

El término "escala pequeña", como se usa aquí, significa un tamaño de columna de afinidad de proteína A menor que 300 mi de resina.

El término "agente estabilizador", como se usa aquí, significa un agente, tal como arginina, prolina, o histidina, que reduce la velocidad de formación de agregado de proteína.

El término "muestra en tiempo cero", como se usa aquí, significa el tiempo de inicio del experimento, que representa inmediatamente después de que el producto ha sido eluido de la resina.

Modalidades de la invención Esta invención provee un primer método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con una columna de cromatografía de proteína A; (b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna de cromatografía de proteína A con un regulador de pH de elución; y (c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto (i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y (ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

En una modalidad del método anterior, el regulador de pH de elución es acetato o citrato.

En una modalidad adicional, la concentración de citrato en el regulador de pH de elución es de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En una modalidad adicional, la concentración de acetato es de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En otra modalidad del método anterior, el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 4°C.

En una modalidad adicional, el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 4°C.

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal monomérico es un anticuerpo IgG.

En una modalidad adicional, el anticuerpo monoclonal monomérico es una lgG1 o un anticuerpo lgG2 modificado.

En otra modalidad el anticuerpo lgG1 es un anticuerpo anti-ADDL. Un ejemplo es el anticuerpo anti-ADDL del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en la figura 23 (Véase, v.gr., solicitud internacional del PCT No. PCT/US2005/038125).

En una modalidad adicional, el anticuerpo lgG2 modificado es un anticuerpo lgG2m4 (figura 26) (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 11/581 ,931).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-DKK-1. Un ejemplo es el anticuerpo anti-DKK-1 del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 en la figura 22 (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 12/012,885).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-ADDL. Un ejemplo es el anticuerpo anti-ADDL del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 en la figura 24 (Véase, v.gr., solicitud internacional del PCT No. PCT/US2006/040508).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-hlL-13ra-1. Un ejemplo es el anticuerpo anti-hlL-13ra-1 del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:7 y SEQ ID N0:8 en la figura 25 (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 11/875,017).

En una modalidad, un aminoácido se añade al regulador de pH de elución a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En una modalidad adicional, el aminoácido usado es histidina, prolina o arginina.

Esta invención provee un segundo método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con a una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; (b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende citrato a una concentración de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M; y (c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto (i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y (¡i) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.0, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra. En una modalidad del método anterior, el regulador de pH de elución es acetato o citrato.

En una modalidad adicional, la concentración de citrato en el regulador de pH de elución es de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En una modalidad adicional, la concentración de acetato es de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En otra modalidad del método anterior, el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 4°C.

En una modalidad adicional, el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 4°C.

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal monomérico es un anticuerpo IgG.

En una modalidad adicional, el anticuerpo monoclonal monomérico es una lgG1 o un anticuerpo lgG2 modificado.

En otra modalidad, el anticuerpo lgG1 es un anticuerpo anti-ADDL. Un ejemplo es el anticuerpo anti-ADDL del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en la figura 23 (Véase, v.gr. solicitud internacional del PCT No. PCT/US2005/038125).

En una modalidad adicional, el anticuerpo lgG2 modificado es un anticuerpo lgG2m4 (figura 26) (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 11/581 ,931).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-DKK-1. Un ejemplo es el anticuerpo anti-DKK-1 del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 en la figura 22 (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 12/012,885).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-ADDL. Un ejemplo es el anticuerpo anti-ADDL del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6 en la figura 24 (Véase, v.gr., solicitud internacional del PCT No. PCT/US2006/040508).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-hlL-13ra-1. Un ejemplo es el anticuerpo anti-WL-13ra-1 del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO: 8 en la figura 25 (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 11/875,017).

En una modalidad, un aminoácido se añade al regulador de pH de elución a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En una modalidad adicional, el aminoácido usado es histidina, prolina o arginina.

Esta invención provee un tercer método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: (a) poner en contacto la muestra con una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; (b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende acetato a una concentración de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M; y (c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto (i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y (ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

En una modalidad del método anterior, el regulador de pH de elución es acetato o citrato.

En una modalidad adicional, la concentración de citrato en el regulador de pH de elución es de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En una modalidad adicional, la concentración de acetato es de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.0 5 M.

En otra modalidad del método anterior, el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 4°C.

En una modalidad adicional, el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 4°C.

En una modalidad, el anticuerpo monoclonal monomérico es un anticuerpo IgG.

En una modalidad adicional, el anticuerpo monoclonal monomérico es una lgG1 o un anticuerpo lgG2 modificado.

En otra modalidad, el anticuerpo lgG1 es un anticuerpo anti-ADDL. Un ejemplo es el anticuerpo anti-ADDL del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en la figura 23 (Véase, v.gr. solicitud internacional del PCT No. PCT/US2005/038125).

En una modalidad adicional, el anticuerpo lgG2 modificado es un anticuerpo lgG2m4 (figura 26) (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 11/581 ,931).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-DKK-1. Un ejemplo es el anticuerpo anti-DKK-1 del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 en la figura 22 (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 12/012,885).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-ADDL. Un ejemplo es el anticuerpo anti-ADDL del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en la figura 24 (Véase, v.gr., solicitud internacional del PCT No. PCT/US2006/040508).

En otra modalidad, el anticuerpo lgG2m4 modificado es un anticuerpo anti-hlL-13ra-1. Un ejemplo es el anticuerpo anti-hlL-13ra-1 del cual las cadenas pesada y ligera están representadas como SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8 en la figura 25 (Véase, v.gr., U.S. Serie No. 11/875,017).

En una modalidad, un aminoácido se añade al regulador de pH de elución a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM. Como se usa aquí, "aproximadamente" significa ± 0.015 M.

En una modalidad adicional, el aminoácido usado es histidina, prolina o arginina.

En una modalidad adicional de cada uno de los métodos anteriormente descritos, el acervo de producto de proteína A tiene un pH de 3.2 o mayor.

Esta invención se entenderá mejor a partir de los ejemplos que siguen. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los métodos específicos y resultados descritos son simplemente ilustrativos de la invención como se describe en forma más completa en las reivindicaciones que se dan a continuación.

EJEMPLO 1 Reducción de temperatura para reducir los niveles de agregados de proteína durante elución de cromatografía de afinidad con proteína A y subsecuente mantenimiento de pH bajo Para caracterizar la temperatura y dependencia del pH de agregación de proteína, el efecto de temperatura y pH sobre el acervo de elución de PAP que contiene citrato (100 mM, pH 3.5) se evaluó con respecto a un anticuerpo monoclonal anti-DKK-1. El mismo procedimiento se puede utilizar con otros mAbs tales como anticuerpos monoclonales anti-ADDL.

Materiales y métodos Pequeña escala: Todos los experimentos a pequeña escala se realizaron usando un AKTA EXPLORER 100™. Reguladores de pH de fosfato, citrato e hidróxido de sodio se compraron de Hyclone (Logan, UT). Base de tris para ajuste de pH del PAP se compró de Hyclone (Logan, UT). Resina MABSELECT™ para experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A se compró de GE Healthcare. El centrado filtrado a profundidad se obtuvo y se usó como un abastecimiento de alimentación para los experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A. Un termomezclador R (Eppendorf) y dos cuartos con temperatura controlada se usaron para controlar las temperaturas de muestra de PAP y QPAP.

Experimento 1A Una columna (1.7 cm x 14.5 cm) empacada con Resina MABSELECT™ (33.35 mi) fue equilibrada con 5 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2 (PBS) a 6.8 ml/min (tiempo de residencia de 5 minutos). El centrado filtrado a profundidad se cargó a 27 g mAb por litro de resina usando una velocidad de flujo de 6.8 ml/min a 17°C. Después de la carga, la columna se lavó con 3 CVs de PBS seguido por 4 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2. El producto fue eluido con citrato de sodio 0.1 M pH 3.5 para 0.5-3.0 CVs a 8.3 ml/min (tiempo de residencia de 4 min). Después de la elución, el acervo de PAP (9 g/l) se mantuvo a 17°C durante 30 minutos a pH 3.5. Después de mantener el pH bajo, una porción del producto de proteína A (PAP) a pH 3.5 se colocó a 4, 17 y 37°C. El resto de la corriente de PAP se extinguió a pH 6.1 y se colocó a 4, 17 y 37°C. Muestras (280 µ?) de condiciones de pH de 3.5 y 6.1 se tomaron en varios intervalos de tiempo, se extinguieron usando base de tris (1 M, 20 µ?) a pH 6 y se analizaron para contenido de agregado de proteína usando HPSEC. La columna se regeneró con 5 CVs de hidróxido de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M a 8.3 ml/min y se almacenó en 20% de etanol en PBS.

Experimento 1 B Este experimento usó la misma columna, abastecimiento de alimentación, y procedimiento para realizar cromatografía de afinidad con proteína A como se describe en el experimento 1A con la excepción que este paso se realizó a 25°C. Después de la elución, el PAP (8 g/l, pH 3.5) se subdividió y se colocó a 25°C y 30°C. Se tomaron muestras (280 µ?) a ambas temperaturas en varios intervalos de tiempo, se extinguieron usando base de tris (1M, 20 µ?) a pH 6, y se analizaron para contenido de agregado de proteína usando HPSEC. La columna se regeneró con 5 CVs de hidróxido de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M a 8.3 ml/min y se almacenó en 20% de etanol en PBS.

Análisis Todas las muestras de PAP o QPAP se analizaron para concentración de monómero de mAb usando un cartucho de inmunoafinidad de ID de proteína A POROS™ en un sistema de CLAR Agilent 1100™ (Agilent, Palo Alto, CA). Los agregados de proteína (dímeros y agregados de orden superior) en cada muestra se cuantificaron usando una columna de exclusión de tamaño Tosoh (0.78 cm ID x 30 cm de longitud) en un sistema de CLAR Agilent 1100™. Una sonda de pH (exactitud de unidad de pH ± 0.1) y un medidor con compensación de temperatura (ambos de Fisher Scientific) se usaron para medir el pH de la solución.

Resultados y discusión Un anticuerpo anti-DKK-1 se purificó usando cromatografía de afinidad con proteína A y se mantuvo a varios valores de pH (3.5, 6.1) y temperatura (4°C-37°C) para determinar el efecto de pH y temperatura sobre agregación de proteína. La agregación de proteína no ocurrió cuando la corriente de PAP se extinguió a pH 6.1 después de elución del producto de la columna de afinidad de proteína A hasta por 3.5 días de tiempo de mantenimiento a 37°C, como se determina por análisis de HPSEC (figura 1). A 3.5 días, el nivel de agregado de orden superior incrementó de 0.8% a 1.3% mientras que el nivel de anticuerpo disminuyó de 98% a 97% a pH 6.1 y 37°C. El dímero permaneció a un nivel constante a todas las temperaturas a pH 6.1 (figura 3). El monómero se mantuvo estable a 4°C y 17°C a pH 6.1 (Véase figures 1 y 3).

A pH 3.5, el nivel de agregados de orden superior (HOA) incrementó significativamente al incrementar la temperatura (figura 2). Además, el nivel de dímero incrementó en 0.8% a pH 3.6 al incrementar la temperatura hasta 17°C (figura 4). A 37°C y pH 3.6, la estabilidad del monómero disminuyó rápidamente (Véase figuras 2 y 4), lo que promueve la precipitación significativa de agregados de proteína. Esta precipitación pudo afectar la exactitud de la cuantificación de los niveles de agregado de proteína por HPSEC y representa una limitación de este método. Cuando la temperatura es reducida a 4°C, el nivel de HOA fue sólo 0.7% después de 30 minutos y 1.5% después de 8 horas (figura 2). Por lo tanto, al reducir la temperatura del PAP de 17°C a 4°C, el nivel de HOA fue reducido significativamente por 4%-7%.

Se realizó un experimento adicional a 25°C y 30°C para cuantificar el efecto de temperatura más alta (> 17°C) sobre la formación de agregado de proteína. El nivel de agregados de orden superior (HOA) en el PAP (pH 3.5, 9 mg/ml de anticuerpo anti-DKK-1) incrementó en 1.5%-3.0% cada 20 minutos a 25°C y por 4%-6% cada 20 minutos a 30°C (figura 5). El nivel de dímero incrementó a 7% durante 4 horas a 25°C y a 10% durante 1.5 horas a 30°C (figura 6). Además, la muestra en tiempo cero (después de elución y recolección del producto) para el experimento a 25°C contenía 0.6% de HOA. Por consiguiente, el HOA no se formó mientras el producto se unía o se eluía de la columna para este experimento.

EJEMPLO 2 Incremento del pH del acervo de PAP para reducir los niveles de agregados de proteína durante la elución de cromatografía de afinidad con proteína A y subsecuente mantenimiento de pH bajo Para caracterizar el impacto del pH sobre la agregación de proteína, el efecto de pH (3.5-5.0) sobre el acervo de elución de QPAP se evaluó con respecto a un anticuerpo monoclonal anti-DKK1. El mismo procedimiento se puede utilizar con otros mAbs tales como anticuerpos monoclonales anti-ADDL.

Materiales y métodos Pequeña escala: Todos los experimentos a pequeña escala se realizaron usando un AKTA EXPLORER 100™ (GE Healthcare). Reguladores de pH de fosfato, citrato e hidróxido de sodio se compraron de Hyclone (Logan, UT). Base de tris para ajuste de pH del PAP se compró de Hyclone (Logan, UT). Resina MABSELECT™ para experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A se compró de GE Healthcare. El centrado filtrado a profundidad se usó como un abastecimiento de alimentación para los experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A. Un termomezclador R (Eppendorf) y dos cuartos con temperatura controlada se usaron para controlar las temperaturas de muestra de PAP y QPAP.

Experimento 2A Una columna (1.7 cm x 14.5 cm) empacada con Resina MABSELECT™ (33.35 mi) fue equilibrada con 5 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2 (PBS) a 6.8 ml/min (tiempo de residencia de 5 minutos). El centrado filtrado a profundidad se cargó a 25 g mAb por litro de resina usando una velocidad de flujo de 6.8 ml/min a temperatura ambiente (21 °C). Después de la carga, la columna se lavó con 3 CVs de PBS seguido por 4 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2. El producto fue eluído con citrato de sodio 0.1 M, pH 3.5 para 0.5-3.0 CVs a 8.3 ml/min (tiempo de residencia de 4 min). Después de la elución, el acervo de PAP (6.9 g/l) se extinguió usando base de tris 1 M (16 v%) a pH 6.

Experimento 2B Esta corriente de QPAP sirvió como la alimentación para el experimento de pH. Se añadió solución de citrato (4 M, 50 a 100 µ?) al QPAP (20 mi) hasta que el pH de la solución alcanzó 5.0. Una muestra de esta solución (2 mi) se tomó a pH 5.0 y se colocó a 21 °C y 30°C. Este procedimiento se repitió para generar condiciones de solución a pH 4.5 y 4.0. Se tomaron muestras (100 µ?) en varios puntos de tiempo, se extinguieron usando base de tris (0.5-1 M, 10-30 µ?) a pH 6, y se analizaron para contenido de agregado de proteína usando HPSEC.

Análisis Todas las muestras de PAP o QPAP se analizaron para concentración de mAb usando un cartucho de inmunoafinidad de ID de proteína A POROS™ en un sistema de CLAR Agilent 1100™ (Agilent, Palo Alto, CA). Los agregados de proteína, es decir, dímero y agregados de orden superior, en cada muestra se cuantificaron usando una columna de exclusión de tamaño Tosoh (0.78 cm de ID x 30 cm de longitud) en un sistema de CLAR Agilent 1100™. Una sonda de pH (Fisher Scientific) con una exactitud de unidad de pH de +/- 0.1 (Fisher Scientific) con compensación de temperatura se utilizó para medir el pH de la solución.

Resultados y discusión El pH del QPAP se redujo a entre pH 4.0 y pH 5,0 para determinar el efecto de pH sobre agregación de proteína. El monómero fue estable a 21 °C y 30°C a pH 4.5 o mayor durante por lo menos 2.5 horas (Véase las figuras 7 y 9, y 8 y 10). Los niveles de HOA a pH 4.0 a 21 °C variaron de 0.9%-2.0% y a 30°C variaron de 3%-13% durante 2.5 horas (figura 7 y figura 8). El nivel de HOA a pH 4.0 incrementó al incrementar la temperatura, que es la misma tendencia descubierta en el ejemplo 1 a pH 3.5. El nivel de dímero se mantuvo constante a 21 °C y pH 4.0-5.0 pero incrementó cuando la temperatura se incrementó a 30°C a pH 4.0 (figura 9 y figura 10).

Además de la temperatura, el pH también afectó la velocidad cinética de formación de agregados de proteína en el acervo de PAP. A medida que el pH del acervo de PAP incrementó, la velocidad de agregado de orden superior y dímero disminuyó significativamente. El impacto de cambio de concentración iónica en este experimento fue modulado usando un ácido altamente concentrado. A fin de evitar agregación de proteína durante la elución de cromatografía de afinidad con proteína A y el paso subsecuente de mantenimiento de pH bajo, la elución se puede realizar a un pH más alto.

EJEMPLO 3 Desacoplamíento del efecto de la concentración del regulador de pH de elución y pH para reducir los niveles de agregados de proteína durante la elución de cromatografía de afinidad con proteína A v subsecuente mantenimiento de pH bajo El impacto del pH del regulador de pH de elución y la concentración se desacopló para caracterizar el impacto de ambos parámetros sobre la agregación de proteína en el acervo de PAP. Además, la concentración mínima de regulador de pH de elución necesaria para fluir el 1% de monómero de la columna de cromatografía de proteína A se determinó. Esto se evaluó con respecto a un anticuerpo monoclonal anti-DKK1.

Materiales y métodos Pequeña escala: Todos los experimentos a pequeña escala se realizaron usando un AKTA EXPLORER 100™ (GE Healthcare). Reguladores de pH de fosfato, citrato e hidróxido de sodio se compraron de Hyclone (Logan, UT). Base de tris para ajuste de pH del PAP se compró de Hyclone (Logan, UT). Resina MABSELECT™ para experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A se compró de GE Healthcare. El centrado filtrado a profundidad se usó como un abastecimiento de alimentación para los experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A. Un termomezclador R (Eppendorf) se usó para controlar las temperaturas de muestra de PAP y QPAP.

Experimento A Una columna (0.5 cm x 5.4 cm) empacada con Resina MABSELECT™ (1.06 mi) fue equilibrada con 5 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2 (PBS) a 0.2 ml/min (tiempo de residencia de 5 minutos). El centrado filtrado a profundidad se cargó a 25 g mAb por litro de resina usando una velocidad de flujo de 0.2 ml/min a temperatura ambiente (17°C-25°C). Después de la carga, la columna se lavó con 3 CVs de PBS seguido por 4 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2 a 0.2 ml/min. El producto fue eluido usando un gradiente de pasos con 10% de citrato de sodio 0.1 M, pH 3.5 (10 mM de citrato) para por lo menos 2.5 CVs a 0.5-1.0 ml/min (tiempo de residencia de 1-2 min). Este paso de elución se repitió tres veces adicionales usando 20%, 30% y 100% de citrato de sodio 0.1 M, regulador de pH, pH 3.5, 20 mM, 30 mM y 100 mM de citrato, respectivamente). Después de la elución, todas las corrientes de PAP se extinguieron a pH 6 usando base de tris 1 M. La columna se regeneró con hidróxido de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M a 0.5-1.0 ml/min y se almacenaron en 20 % en volumen de etanol en PBS.

Experimento B Una columna (1.1 cm x 10.9 cm) empacada con Resina MABSELECT™ (10.4 mi) fue equilibrada con 5 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2 (PBS) a 2.2 ml/min (tiempo de residencia de 5 minutos). El centrado filtrado a profundidad se cargó a 27 g mAb por litro de resina usando una velocidad de flujo de 2.1 ml/min a temperatura ambiente (17°C-20°C). Después de la carga, la columna se lavó con 3 CVs de PBS seguido por 4 CVs de fosfato de sodio 6 mM, pH 7.2 a 2.1 ml/min. El producto fue eluido con un gradiente de pasos de 60% de citrato de sodio 0.1 M pH 3.5 (60 mM de citrato) o 40% de citrato de sodio 0.1 M pH 3.0 (40 mM de citrato) para 0.5-3 CVs a 2.6 ml/min (tiempo de residencia de 4 min). Después de la elución inmediata, muestras de acervo de PAP (11 g/l) se colocaron en un termomezclador a 25°C. Una muestra en tiempo cero se tomó inmediatamente después de elución, se extinguió con base de tris, y se colocó en HPSEC para análisis de contenido de agregado de proteína. Se tomaron muestras (200 µ?) en varios intervalos de tiempo, se extinguieron inmediatamente usando base de tris (0.5-1 M, 5-10 µ?) a pH 6, y se analizaron para contenido de agregado de proteína usando HPSEC. La columna de afinidad de proteína A se regeneró con 5 CVs de hidróxido de sodio 50 mM, cloruro de sodio 1 M a 2.4 ml/min y se almacenó en 20% de etanol en PBS. Para la elución de 60% de citrato (60 mM de citrato), el acervo de PAP se subdividió en alícuotas separadas de 2 mi. Se añadió citrato (4 M, 5-10 µ?) a una alícuota para alcanzar pH 3.4 ó 3.6. Se añadió ácido fosfórico (8% en volumen, 10 µ?) a una alícuota para alcanzar pH 3.6.

Experimento C: La concentración de citrato se redujo a 50 mM en el regulador de pH de elución de proteína A para determinar si la concentración de ácido tiene un impacto sobre la estabilidad de anti-DKK-1. Esta concentración de ácido reducida impactó el gradiente de la pendiente de pH durante la elución, lo que dio por resultado un pH de acervo de PAP superior de 3.9 versus 3.6.

El concentrado filtrado en profundidad (1.7 g/l anti-DKK-1 mAb) se cargó en una columna de proteína A (V = 33.35 ml_s, Placas: 2026 N/m2, Asimetría: 1.33) usando un tiempo de residencia de 5 minutos a 23-25°C. Después de cargar, la columna se lavó con 3 CVs de PBS seguido por 4 CVs de fosfato de sodio 6 mM pH 7.2 a 0.2 ml/min. Para la elución, un gradiente de 50% de citrato 100 mM, pH 3.5 se usó para eluir el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 de la resina. Durante la elución, las fracciones se recolectaron cada 0.5 CV de 0.5 a 3.0 CVs. Estas fracciones se analizaron para concentración de monómero, pH, y conductividad y después se pusieron en acervo para una concentración final de 7.2 g/l. Muestras de la corriente de PAP se colocaron a varias temperaturas (4, 15, 20, y 23-25°C) y valores de pH (3.9, 4.2, 4.5, 5.0) y se analizaron en varios puntos de tiempo para agregación usando HPSEC (figura 11).

El gradiente de pH cambió ligeramente cuando la concentración de ácido se redujo a 50 mM, lo que dio por resultado un pH de PAP de 3.9 versus 3.6 para citrato 100 mM. Sin embargo, los perfiles de elución se traslaparon y la ventana de recolección de producto siguió siendo la misma. El rendimiento de proteína A para el 50% de elución fue 94%. El perfil de HOA usando la elución de citrato 50 mM a las diversas temperaturas anteriores se muestra en la figura 12. Una comparación entre eluciones de citrato a 50 mM y 100 mM a 23-25X se representa en la figura 13.

Análisis Todas las muestras de PAP se analizaron para concentración de mAb usando un cartucho de inmunoafinidad POROS™ Protein A ID en un sistema de CLAR Agilent 1100™ (Agilent. Palo Alto, CA). Los agregados de proteína, es decir, dímeros y agregados de orden superior, en cada muestra se cuantificaron usando una columna de exclusión de tamaño de Tosoh (0.78 cm ID x 30 cm de longitud) en un sistema de CLAR Agilent 1100™. Una sonda de pH (Fisher Scientific) con exactitud de unidad de ± 0.1 pH y medidos (Fisher Scientific) con compensación de temperatura se utilizó para medir el pH de la solución.

Resultados y discusión La columna de afinidad de proteína A se eluyó con varias concentraciones de citrato para determinar la concentración más baja de citrato posible para elución del monómero a partir de la resina. Las concentraciones de citrato de 10% en volumen y 20% en volumen eluyeron 80% del monómero que se unió a la columna (no mostrada). Cuando la concentración de citrato se incrementó a 30% en volumen, sólo 2% de monómero adicional se eluyó de la columna. Por lo tanto, la concentración mínima para eluir > 80% de monómero de la columna fue de 20 mM de citrato.

Diferentes concentraciones de citrato se probaron para determinar el impacto de concentración de citrato sobre la estabilidad del monómero a varios puntos de pH. Cuando la concentración de citrato se redujo a 60 mM y el pH se incrementó a 3.8, el nivel de HOA fue de 0.3% versus 4%-5% para citrato 100 mM (pH 3.5) a 25°C (figura 14). A medida que la concentración de citrato se redujo a 40 mM de citrato a pH 3.6, el nivel de HOA permaneció a 0.3% durante por lo menos 3 horas. Por lo tanto, la estabilidad del monómero fue una función de la concentración de citrato así como el pH. Cuando se añadió ácido fosfórico en lugar de citrato para ajustar el pH del acervo de elución, el nivel de HOA incrementó en aproximadamente 0.3% para cada muestra de punto de tiempo hasta 2 horas. Por lo tanto, la adición de ácido fosfórico incrementó la ve de formación de HOA más rápido que el citrato al mismo pH de solución (3.6).

En el pH del acervo de PAP de 3.6, las siguientes cuatro concentraciones de ácido diferentes se probaron: 40 mM, 75 mM, y 100 mM de citrato, y 60 mM de citrato con 0.1% en volumen de ácido fosfórico. El nivel de HOA incrementó a medida que la concentración de citrato se incrementó. Además, el nivel de HOA incrementó significativamente con el tiempo a concentraciones de citrato mayores que 75 mM. Por ejemplo, dentro de un marco de tiempo de una hora, la velocidad de HOA en 100 mM de citrato fue de 2% por 20 minutos comparada con 0.2%-0.3% por 20 minutos en 75 mM de citrato al mismo pH de 3.6. La adición de ácido fosfórico al acervo de PAP incrementó la velocidad de formación de HOA que el citrato al mismo pH de solución de 3.6. La concentración de citrato en el acervo de PAP tuvo un impacto sobre la formación de HOA cuando el pH se mantuvo constante.

A partir de la figura 12 anterior, el PAP fue extremadamente estable y contenía < 0.4% HOA a < 15°C durante por lo menos 12 horas con la condición de elución de citrato de 50 mM a pH 3.9. El mAb anti-DKK-1 también mostró estabilidad mejorada a temperaturas más altas en el PAP. Después de mantenerse 12 horas a 20-25°C, el PAP contenía 1.0%-1.4% de HOA. El nivel de HOA en el PAP para el tiempo de mantenimiento de pH bajo de 30-60 minutos fue de 0.2%-0.4% a 20-25X, que está por abajo del nivel de 3%-6% de HOA en el lote como se muestra por la comparación en la figura 13. La cantidad total de degradación de proteína (HOA más dímero) en el PAP con 50 mM de citrato fue de 1.5%, lo que cumplió la meta de < 5%. Por lo tanto, la reducción de la concentración de citrato y el incremento en el pH se probó que reduce significativamente el nivel de HOA en el PAP de 3%-6% a 0.5% para un tiempo de mantenimiento de < 60 minutos.

EJEMPLO 4 Impacto de pH y concentración de citrato sobre el desdoblamiento inducido térmicamente de un anticuerpo monoclonal como se mide por calorimetría de escudriñamiento diferencial La calorimetría de escudriñamiento diferencial es una herramienta usada para medir la estabilidad de la proteína. La estabilidad de la proteína depende en gran medida del ambiente, que tiene la capacidad tanto de estabilizar como de desestabilizar la estructura doblada de la proteína. DSC opera midiendo la capacidad de calor de una solución de proteína durante una rampa de temperatura en comparación con la capacidad de calor de una referencia de solvente. La capacidad de calor diferencial entre la solución de proteína y la referencia de solvente provee un perfil que representa la desnaturalización de la proteína. A partir de este perfil, la temperatura de fusión aparente I se puede determinar. La desnaturalización de una proteína en un estado desdoblado a menudo da por resultado eventos no deseables, tales como agregación o degradación química (19, 20, 21 , 22, 23).

La calorimetría de escudriñamiento diferencial (DSC) provee algún discernimiento en los mecanismos de doblamiento al medir el desdoblamiento inducido por temperatura de proteínas. La información provista por DSC es útil en una variedad de aplicaciones que implican la estabilidad de la proteína, tal como selección de clon, desarrollo de formulación y caracterización de proteína (24, 25). Al tener un método relativamente fácil para identificar el compuesto de fármaco más estable temprano en el proceso de desarrollo se provee una gran ventaja al acortar potencialmente el tiempo para el mercado. DSC también es crítica en el desarrollo de la formulación. Cambios en el ambiente de la proteína, tales como pH, concentración iónica, y otros excipientes pueden impactar la estructura doblada de la proteína, dando por resultado un cambio en la temperatura de fusión. Al determinar selectivamente varios aditivos en el regulador de pH de la formulación, DSC provee una forma rápida para optimizar la composición del regulador de pH.

La agregación de proteínas terapéuticas tiene implicaciones muy serias que varían desde dificultades en el procesamiento de purificación hasta respuestas inmunogénicas in vivo. La desnaturalización, y la subsecuente agregación, de las proteínas son sensibles a muchas cosas, incluyendo pH y temperatura. Por lo tanto, es crítico para la estabilidad de las proteínas terapéuticas regular estos dos factores.

Los anticuerpos monoclonales tienen múltiples dominios, cada uno de los cuales es impactado de manera diferente por el pH y la concentración iónica. DSC se usó para evaluar el efecto de la concentración iónica (concentraciones de citrato de 30 mM, 60 mM, y 100 mM) y el pH (3.0 a 6.0) sobre la estabilidad térmica de la proteína.

Materiales v métodos Se prepararon soluciones a una concentración de 30 mM, 60 mM y 100 mM de ácido cítrico (Sigma, St. Louis). Las soluciones de citrato se ajustaron en pH a valores objetivo de 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, y 6.0 unidades de pH usando hidróxido de sodio (Fisher Chemicals). Las mediciones de pH se obtuvieron usando un medidor Accumet pH meter (Fisher Scientific).

Un anticuerpo anti-DKK-1 a 54.2 mg/ml en el regulador de pH de la formulación se diluyó a 1 mg/ml con los reguladores de pH de citrato en cada pH. La concentración y el pH de las soluciones de 1 mg/ml finales se midió. El regulador de pH de la formulación se diluyó a la misma relación para usarse como el regulador de pH de referencia.

La calorimetría de escudriñamiento diferencial (DSC) se condujo en un MicroCal™ VP-DSC. La temperatura se incrementó de 25°C a 95°C a una velocidad de 1°C/min. Los perfiles de DSC en bruto se analizaron sustrayendo el regulador de pH de referencia, normalizando las concentraciones y realizando corrección de línea basal usando software Origin. Las muestras se operaron por duplicado.

Resultados y discusión El impacto del pH y concentración de citrato sobre la estabilidad térmica de un anticuerpo anti-DKK1 se examinó usando DSC. Los resultados indican que la temperatura de fusión se redujo a medida que el pH se redujo.

Los resultados también sugieren que el citrato también tiene un impacto más grande sobre la estabilidad térmica de ese anticuerpo monoclonal a valores de pH bajos.

A valores de pH por abajo de 4.5, el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 diluido con reguladores de pH de citrato es más térmicamente estable en concentraciones de citrato bajo (figuras 15A, 15B, 15C). A pH 3.0, parece ser que el citrato 100 mM ha desdoblado por completo la proteína y las transiciones no están presentes en el perfil. Para citrato 30 mM y 60 mM, una sola transición es evidente, lo que sugiere que dos de los dominios de anticuerpos son desdoblados. Los datos soportan que esta transición individual representa el desdoblamiento de la región Fab del anticuerpo. A medida que el pH se incrementa a 4.0, la temperatura de desdoblamiento de los dominios se incrementó y se encontraron tres transiciones. La transición menos estable es muy probablemente el desdoblamiento del dominio de CH2, seguido por el fragmento Fab y el dominio CH3.

A valores de pH de 4.5 y superiores, las temperaturas de transición aparentes para el anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 son independientes de la concentración de citrato (figuras 16A, 16B, 16C, 16D). Las temperaturas de fusión para el anticuerpo incrementan a medida que se incrementa el pH. A valores de pH superiores, dos dominios desdoblan simultáneamente, dando por resultado un perfil que tiene una entalpia grande para una transición y una segunda transición con una entalpia más baja. A partir de los resultados se concluye con otros anticuerpos monoclonales que el dominio CH2 y Fab tienen temperaturas de fusión similares a valores de pH altos, correspondiendo a la primera transición grande. El desdoblamiento del dominio CH3 tiene una temperatura de fusión más alta y corresponde a la segunda transición.

La concentración de citrato y el pH impactan el desdoblamiento inducido térmicamente de anticuerpos monoclonales. A medida que el pH se reduce, la estabilidad térmica de un anticuerpo monoclonal anti-DKK-1 disminuye. La concentración de citrato sólo impacta las temperaturas de transición aparentes a valores de pH bajos. Concentraciones más bajas de citrato dan por resultado temperaturas de fusión más altas.

EJEMPLO 5 El efecto de estabilizadores de aminoácidos sobre agregación de proteínas Se requieren condiciones ácidas para eluir una proteína o anticuerpo de la resina de afinidad de proteína A. La exposición a esas condiciones ácidas a pH bajo (3-4) puede dar por resultado la formación de agregados de proteína. La adición de un estabilizador al regulador de pH de elución de proteína A se ha mostrado que incrementa la estabilidad de una proteína a pH bajo. La arginina se seleccionó como el estabilizador para este experimento para determinar si la presencia de arginina en el regulador de pH de elución disminuía el nivel de agregados de orden superior y subsecuentemente incrementaba la estabilidad de mAb. Todos los experimentos se realizaron a 25°C.

Para una elución usando una concentración de citrato de 60 mM con y sin arginina (50 mM), hubo sólo una disminución de 0.01% en por ciento de HOA por hora comparado con el control (figura 17). Sin embargo, para una elución usando una concentración de 100 mM de citrato con y sin arginina (250 mM), hubo una disminución de 2.9% en por ciento de agregado de orden superior por hora comparado con el control (figura 18). Por lo tanto, la arginina fue efectiva en la disminución de los niveles de agregados de orden superior en una solución de citrato 100 mM y se puede usar como otra opción para reducir los niveles de agregados durante la cromatografía de afinidad con proteína A y subsecuentes pasos de mantenimiento de pH bajo.

EJEMPLO 6 Investigación del efecto de la concentración de proteína sobre la estabilidad del monómero en reguladores de pH de elución de citrato v acetato usados en cromatografía de afinidad con proteína A El impacto de la concentración de proteína en los reguladores de pH de citrato y acetato se investigó para determinar el efecto de la concentración sobre la velocidad de agregación en cada sistema regulador de pH. Además, los reguladores de pH de citrato y acetato a pH 4.0 se comparó para determinar el efecto del tipo de ácido sobre la agregación.

Materiales v métodos Pequeña escala: Todos los experimentos a pequeña escala se realizaron usando un AKTA EXPLORER 100™ (GE Healthcare). Reguladores de pH de fosfato de sodio se compraron de Hyclone (Logan, UT). Acetato y citrato se compraron de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). Base de tris para ajuste de pH del PAP se compró de Hyclone (Logan, UT). Resina MABSELECT™ para experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A se compró de GE Healthcare. El producto de proteína A extinguido se usó como el alimento abastecedor para estos experimentos. Un termomezclador R (Eppendorf) y se usó para controlar las temperaturas de muestra de PAP y QPAP.

La corriente de QPAP sirvió como el material de alimentación para este experimento. El material de alimentación se diafiltró en cuatro a cinco volúmenes de regulador de pH de fosfato de sodio usando una membrana de 30kDa a una velocidad de centrífuga de 4500 rpm. Después de la diafiltración, cada solución se concentró ya sea a 1x, 2x, y 4x de la concentración original. La mitad de las muestras a las diversas concentraciones se diafiltró en por lo menos cuatro volúmenes de solución de acetato de sodio (50 mM, pH 5.0).

Para el primer conjunto de las tres soluciones concentradas diferentes tomadas del ejemplo 2, se añadió citrato (15 mM) a cada solución para alcanzar pH 4.0. Muestras (2 mi) de cada solución se tomaron y se pusieron a 21 °C (figura 7). Para el segundo conjunto de solución concentrada, se añadió ácido acético glacial para alcanzar pH de 4.0 (85 mM total de acetato). Muestras (2 mi) de cada solución se tomaron y se pusieron a 25°C. Para cada conjunto de experimentos, las muestras (140 µ?) se tomaron en varios puntos de tiempo, se extinguieron usando base tris (0.25 M-1.0 M, 10-20 µ?) a pH 6, y se analizaron para contenido de agregado de proteína usando HPSEC.

Análisis Las muestras se analizaron para concentración de mAb monomérico usando un cartucho de inmunoafinidad POROS™ Protein A ID en un sistema de CLAR Agilent 1100™ (Agilent. Palo Alto, CA). Los agregados de proteína, es decir, dímeros y agregados de orden superior, en cada muestra se cuantificaron usando una columna de exclusión de tamaño de Tosoh (0.78 cm ID x 30 cm de longitud) en un sistema de CLAR Agilent 1100™. Una sonda de pH (Fisher Scientific) con exactitud de unidad de +/- 0.1 pH y medidos (Fisher Scientific) con compensación de temperatura se utilizó para medir el pH de la solución.

Resultados y discusión El efecto de la concentración de mAb en reguladores de pH de citrato y acetato se investigó para determinar el impacto de la concentración sobre la velocidad de agregación en cada sistema regulador de pH. A medida que la concentración de mAb incrementó en la solución de citrato (15 mM, pH 3.5), la velocidad de formación de agregado de orden superior se incrementó también (figura 20). Por ejemplo, después de un tiempo de mantenimiento de una hora, el nivel de agregado de orden superior se incrementó de 0.3% a 8 mg/ml la concentración de mAb a 2.6% a una concentración de mAb de 34 mg/ml. Por lo tanto, la concentración de proteína en solución impacta la velocidad de la formación de agregado de orden superior en un sistema regulado en su pH con citrato a pH bajo. Sin embargo, para la solución de acetato (85 mM, pH 4.0), el nivel de agregados de orden superior permaneció constante a menos de 1 % para concentraciones de mAb de 5 mg/ml, 11 mg/ml, y 37 mg/ml (figura 21). Para determinar el impacto de tipo ácido sobre la formación de agregado de orden superior, los resultados de este experimento de acetato a pH 4.0 a 25°C se graficaron con los resultados del experimento de citrato a pH 4.0 a 21 °C (figura 21). A pH 4.0, la velocidad de agregados de orden superior empieza a incrementar por 0.2% cada 30 miembros en un sistema regulado en su pH con citrato mientras que el nivel de agregados de orden superior permanece constante en el sistema regulado en su pH con acetato. Por lo tanto, a pH 4.0, la estabilidad de mAb fue mayor en regulador de pH de acetato que de citrato.

Conclusiones Además de la temperatura y pH, la concentración de proteína también afectó la velocidad de formación de agregado de proteína en el acervo de PAP. A medida que la concentración de mAb se incrementó en una solución regulada en su pH con citrato a pH 3.5, la velocidad de agregado de orden superior se incrementó significativamente. Sin embargo, el nivel de agregados de orden superior permaneció menor que 1 % en una solución regulada en su pH con acetato a pH 4.0 para varias concentraciones de proteína, que varió de 5 mg/ml a 37 mg/ml. Cuando los sistemas reguladores de pH de acetato y citrato se comparan a pH 4.0 con una concentración de proteína de 5 mg/ml a 11 mg/ml, el mAb contenía mayor estabilidad en el regulador de pH de acetato. Por lo tanto, el tipo de regulador de pH de elución jugó un papel en la estabilidad de mAb con acetato siendo más estable que el regulador de pH de citrato a pH 4.0. El acetato se puede usar como un regulador de pH alternativo para elución de mAb de una columna de afinidad de proteína A.

EJEMPLO 7 Investigación del efecto del pH, temperatura, concentración de regulador de pH y carga de proteína sobre el nivel de agregados de proteína durante la elución de cromatografía de afinidad con proteína A v subsecuente mantenimiento de pH bajo Materiales y métodos Pequeña escala: Todos los experimentos a pequeña escala se realizaron usando un AKTA EXPLORER 100™. Reguladores de pH de fosfato, citrato e hidróxido de sodio se compraron de Hyclone (Logan, UT).

Base de tris para ajuste de pH del PAP se compró de Hyclone (Logan, UT). Resina MABSELECT™ para experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A se compró de GE Healthcare. El centrado filtrado a profundidad se obtuvo y se usó como un abastecimiento de alimentación para los experimentos de cromatografía de afinidad con proteína A. Un termomezclador R (Eppendorf) y dos cuartos con temperatura controlada se usaron para controlar las temperaturas de muestra de PAP y QPAP.

Experimento Una columna (1.7 cm x 14.5 cm) empacada con resina MABSELECT™ (10 mi) fue equilibrada con 5 CVs de fosfato de sodio 6 mM, 100 mM NaCL, regulador de pH, pH 7.2, a 2.0 ml/min (tiempo de residencia de 5 minutos). El centrado filtrado a profundidad se cargó a la concentración listada en el cuadro 1 (g de mAb por litro de resina) usando una velocidad de flujo de 2.0 ml/min a la temperatura listada en el cuadro 1. Después de la carga, la columna se lavó con 3 CVs de fosfato de sodio 6 mM, NaC1 100 mM, regulador de pH, pH 7.2, a 2 ml/min, que fue seguido por 4 CVs de fosfato de sodio 6 mM, regulador de pH, pH 7.2, a 2 ml/min. El producto fue eluido con 3 CVs de regulador de pH de elución (mezcla de ácido cítrico anhidro y sal de citrato de trisodio a un valor de pH objetivo) a un ardiente de pasos de 100% a 2 ml/min (inicio a 0.5 y fin a 3.5) (tiempo de residencia de 4 min).

Los reguladores de pH de elución usados en este experimento son como sigue: • 60 mM de citrato de sodio, pH 3.5 • 40 mM de citrato de sodio, pH 3.2 • 40 mM de citrato de sodio, pH 3.8 • 80 mM de citrato de sodio, pH 3.2 · 80 mM de citrato de sodio, pH 3.8 Después de la elución, la muestra de eluyente del producto se analizó para contenido de agregado de proteína usando HPSEC en los siguientes puntos de tiempo: 0, 15, 30, 60, 120 min. La muestra será 200 microlitros con 40 microlitros de base de tris 0.25M añadida para extinguir la muestra. La columna se regeneró con 5 CVs de hidróxido de sodio 50 mM, regulador de pH de cloruro de sodio 1 M a 2.0 ml/min y se almacenó en 20 % en volumen de solución de etanol en PBS.

Análisis Todas las muestras se analizaron para concentración de monómero de mAb usando un cartucho de inmunoafinidad de ID de proteína A POROS™ en un sistema de CLAR Agilent 1100™ (Agilent, Palo Alto, CA). Los agregados de proteína (dímeros y agregados de orden superior) en cada muestra se cuantificaron usando una columna de exclusión de tamaño Tosoh (0.78 cm de ID x 30 cm de longitud) en un sistema de CLAR Agilent 1100™. Una sonda de pH (exactitud de unidad de pH ± 0.1) y un medidor con compensación de temperatura (ambos de Fisher Scientific) se usaron para medir el pH de la solución.

Resultados El efecto del pH, temperatura, concentración de regulador de pH y carga de proteína se investigó para determinar su impacto sobre el rendimiento y agregación de proteína. Los resultados del experimento anterior se pueden encontrar en el cuadro 1 siguiente.

A 10 grados C y pH 3.2, la carga o concentración de citrato no impacta significativamente el rendimiento o los niveles de agregación. A 10 grados C y pH 3.8, la carga y/o concentración de citrato reduce el rendimiento pero los agregados permanecen a niveles bajos (< 5%). A 30 grados C y pH 3.2, la carga no impacta significativamente la agregación pero la temperatura tiene un gran efecto sobre la disminución del rendimiento e incremento de los niveles de agregación para una concentración de 80 mM de citrato pero se ve poco efecto en una concentración de 40 mM de citrato. A medida que el pH cambia de 3.2 a 3.8 a 30C, los niveles de agregado disminuyen significativamente y el rendimiento incrementa a una concentración de 40 a 80 mM de citrato.

CUADRO 1 Datos de agregación para mAb anti-DKK-1 a varias concentraciones. pH. carga de proteína y temperaturas Referencias (1) Shakula et al_, "Strategies to address aggregation during Protein A chromatography," Bioprocess International, pp. 36-44, (Mayo de 2005). (2) Shakula et al., "Protein aggregation kinetics during Protein A chromatography case study for an Fe fusión protein," Journal of Chromatography. 1171 . pp. 22-28 . (2007). (3) Cromwell et al.. "Protein Aggregation and Bioprocessing," The AAPS Journal. 8(3), pp.E572-E579, (2006). (4) Mezzasalma et al., "Enhancing recombinant protein quality and yield by protein stability profiling," Journal of Biomolecular Screening. 12, pp. 418- 428, (2007). (5) Arakawa et al., "Elution of antibodies from a Protein A column by aqueous arginine solutions," Protein Expression & Purification, 36, pp. 244-248, (2004). (6) Arakawa et al., "Aggregation Analysis of Therapeutic Proteins, Part 1 ," Bioprocess International 4( 0):42-43, (Nov. 2006). (7) FDA USDHHS, "Points to consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use," Center for Bioloqics Evaluation and Research, (28 de febrero de 997). (8) FDA USDHHS, "Guidance for Industry: Q5A Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin," Center for Drug Evaluation of Research, ICH, Center for Biologics Evaluation and Research., (Septiembre de 1998). (9) Brorson, et al., "Bracketed generic inactivation of rodent retroviruses by low pH treatment for monoclonal antibodies and recombinant proteins," Biotechnoloav and Bioenaineerina. v. 82, n.3, pp. 321-329, (May 5, 2003). (10) Véase generalmente, Fundamental Immunoloqy. Paul, W., ed., 2a. ed., Raven Press, N.Y., Cap. 7 (1989) (11) Patente de E.U.A. No. 4,816,567. (12) Solicitud de patente de E.U.A. US 2005/0038231. (13) Tugcu et al., Biotechnoloqy and Bioengineerinq, v. 99, pp.599-613 (2007). (14) Solicitud internacional del PCT No. PCT/US2005/038125. (15) US Serie No. 11/581 ,931. (16) US Serie No. 12/012,885. (17) Solicitud internacional del PCT No. PCT/US2006/040508. (18) US Serie No. 11/875,017. (19) Johnson, CM., "Differential Scanning Calorimetry: Theory and Practice," Micro Cal Application Notes, pp.1 -9, (2005). (20) Acharaya, P., "Using DSC to make downstream purification processing more economically viable," Micro Cal Application Notes, pp. 1-4, (2006). (21) Acharaya, P., Structural studies as a screening tool in development of protein purification processes, Current trends in Microcalorimetrv. 18-21 de julio de 2007 (Boston, MA). (22) Wen et al., "Application of DSC for antibodies and Fc-conjugated proteins," American Pharmaceutical Review, 10(6), pp 10-15, (2007); Wen, J., Studying antibodies and Fc related proteins by DSC, Current trends in Microcalorimetrv. 18-21 de julio de 2007 (Boston, MA). (23) Demarst, S., "Better guidance in antibody therapeutics process development using DSC," Micro Cal Application Notes, pp. 1-3, (2005). (24) lonescu, et al., "Contribution of variable domains to the stability of humanized IgGI monoclonal antibodies," Journal of Pharmaceutical Sciences, Wiley Interscience, www.interscience.wiley.com [doi: 10.1002/jps.21 104]. (25) Van Burén et al., "Elucidation of Two Major Aggregation Pathways in an lgG2 anitbody" Journal of Pharmaceutical Sciences. Wiley Interscience, www.interscience.wiley.com [doi: 10.1002/jps.21514].

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: a) poner en contacto la muestra con una columna de cromatografía de proteína A; b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna de cromatografía de proteína A con un regulador de pH de elución; y c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y i¡) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

2 - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el regulador de pH de elución es citrato o acetato.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el regulador de pH de elución es citrato.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la concentración de citrato en el regulador de pH de elución es de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el regulador de pH de elución es acetato.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque la concentración de acetato en el regulador de pH de elución es de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 4°C a aproximadamente 30°C.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el método es conducido a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo monoclonal monomérico es un anticuerpo IgG.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el anticuerpo monoclonal monomérico es una lgG1 o un anticuerpo lgG2 modificado.

11. - El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el anticuerpo monoclonal monomérico es un anticuerpo lgG2m4.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el anticuerpo lgG2m4 es un anticuerpo anti- DKK1.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque un aminoácido se añade al regulador de pH de elución en el paso (b) a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 500 mM.

14. - El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el aminoácido es arginina, prolina o histidina.

15. - Un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: a) poner en contacto la muestra con a una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende citrato a una concentración de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M; y c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.0, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

16. - Un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: a) poner en contacto la muestra con a una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende acetato a una concentración de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M; y c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y ii) tiene un pH de aproximadamente 3.5 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

17.- Un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: a) poner en contacto la muestra con una columna de cromatografía de proteína A; b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna de cromatografía de proteína A con un regulador de pH de elución; y c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y ii) tiene un pH de aproximadamente 3.2 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

18. - Un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: a) poner en contacto la muestra con a una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende citrato a una concentración de aproximadamente 0.030 M a aproximadamente 0.085 M; y c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y ¡i) tiene un pH de aproximadamente 3.2 a aproximadamente 4.0, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.

19. - Un método para purificar un anticuerpo monoclonal monomérico de una muestra, en donde la muestra comprende el anticuerpo monoclonal monomérico, impurezas de células hospederas, dímeros y agregados de orden superior, que comprende: a) poner en contacto la muestra con a una columna cromatográfica de afinidad con proteína A a una temperatura de aproximadamente 15°C a aproximadamente 27°C; b) eluir el anticuerpo monoclonal monomérico de la columna cromatográfica de afinidad con proteína A con un regulador de pH de elución que comprende acetato a una concentración de aproximadamente 0.050 M a aproximadamente 0.200 M; y c) recolectar una o más fracciones del anticuerpo monoclonal monomérico del paso (b) para formar un acervo de producto de proteína A, en donde el acervo de producto i) comprende menos de 5% de agregado de orden superior, y i¡) tiene un pH de aproximadamente 3.2 a aproximadamente 4.5, purificando así el anticuerpo monoclonal monomérico de la muestra.