JP2011530606A - プロテインaアフィニティークロマトグラフィーを用いる抗体の精製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第1の方法であって、(a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、(b)溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、(c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ[ここで、該産物プールは、(i)5%未満の高次凝集体を含み、(ii)約3.5〜約4.5のpHを有する]、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
定義
本明細書中で用いる「タンパク質」または「ポリペプチド」なる語は、ペプチド結合により互いに共有結合したアミノ酸残基から構成されるポリペプチドを意味するものとする。
本発明は、単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための第1の方法であって、(a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、(b)溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、(c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ[ここで、該産物プールは、(i)5%未満の高次凝集体を含み、(ii)約3.5〜約4.5のpHを有する]、それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法を提供する。
タンパク質凝集の温度およびpH依存性を特徴づけるために、シトラート(100mM、pH3.5)を含有するPAP溶出プールに対する温度およびpHの効果を抗DKK−1モノクローナル抗体に関して評価した。抗ADDLモノクローナル抗体のような他のmAbにも同じ方法が利用可能である。
小規模:AKTA EXPLORER 100(商標)を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはHyclone(Logan,UT)から購入した。PAPのpH調節のためのトリス塩基はHyclone(Logan,UT)から購入した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験用のMABSELECT(商標)樹脂はGE Healthcareから購入した。デプス・フィルタード・セントレート(depth filtered centrate)を得、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Thermomixer R(Eppendorf)および2つの温度制御室を使用して、PAPおよびQPAPサンプルの温度を制御した。
MABSELECT(商標)樹脂(33.35mL)が充填されたカラム(1.7cm×14.5cm)を5CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)(PBS)で6.8mL/分(5分の滞留時間)で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを17℃で6.8mL/分の流量で樹脂1リットル当たり27g mAbでローディングした。ローディング後、該カラムを3CVのPBSで洗浄し、ついで4CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄した。該産物を8.3mL/分(4分の滞留時間)で0.1M クエン酸ナトリウム(pH3.5)で0.5〜3.0CVにわたって溶出させた。溶出後、PAP(9g/L)プールをpH3.5で17℃で30分間維持した。該低pH維持の後、pH3.5における該プロテインA産物(PAP)の一部を4、17および37℃で配置した。該PAP流の残りをpH6.1にクエンチし、4、17および37℃で配置した。pH条件3.5および6.1からのサンプル(280μL)を種々の時間間隔で採取し、トリス塩基(1M、20μL)を使用してpH6にクエンチし、HPSECを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。該カラムを5CVの50mM 水酸化ナトリウム、1M 塩化ナトリウムで8.3mL/分で再生させ、PBS中の20% エタノール中で保存した。
この実験は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを行うために、この段階を25℃で行ったこと以外は実験1Aに記載されているのと同じカラム、供給ストックおよび方法を用いた。溶出後、該PAP(8g/L、pH3.5)を細分し、25℃および30℃で配置した。両方の温度におけるサンプル(280μL)を種々の時間間隔で採取し、トリス塩基(1M、20μL)を使用してpH6にクエンチし、HPSECを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。該カラムを5CVの50mM 水酸化ナトリウム、1M 塩化ナトリウムで8.3mL/分で再生させ、PBS中の20% エタノール中で保存した。
Agilent 1100(商標)HPLC系(Agilent,Palo Alto,CA)上でPOROS(商標)プロテインA ID免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのPAPまたはQPAPサンプルをmAb単量体濃度に関して分析した。Agilent 1100(商標)HPLC系上でTosohサイズ排除カラム(0.78cm ID×30cm長)を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体(二量体およびそれ以上の高次凝集体)を定量した。溶液pHを測定するために、pHプローブ(±0.1pH単位の精度)およびメーター(温度補償を伴うもの)(共にFisher Scientificから入手)を使用した。
抗DKK−1抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製し、種々のpH(3.5、6.1)および温度(4℃〜37℃)値で維持して、タンパク質凝集に対するpHおよび温度の効果を判定した。HPSEC分析による判定によると、37℃で3.5日間までの維持期間にわたり、プロテインAアフィニティーカラムからの産物溶出の後で該PAP流をpH6.1にクエンチした場合、タンパク質凝集は生じなかった(図1)。3.5日の時点で、pH6.1および37℃で、高次凝集体レベルは0.8%から1.3%に増加した一方、抗体レベルは98%から97%に減少した。該二量体はpH6.1において全ての温度で一定レベルのままであった(図3)。該単量体は4℃および17℃、pH6.1で安定なままであった(図1および3を参照されたい)。
タンパク質凝集に対するpHの影響を特徴づけるために、QPAP溶出プールに対するpH(3.5〜5.0)の効果を抗DKK1モノクローナル抗体に関して評価した。抗ADDLモノクローナル抗体のような他のmAbにも同じ方法が利用可能である。
小規模:AKTA EXPLORER 100(商標)(GE Healthcare)を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはHyclone(Logan,UT)から購入した。PAPのpH調節のためのトリス塩基はHyclone(Logan,UT)から購入した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験用のMABSELECT(商標)樹脂はGE Healthcareから購入した。デプス・フィルタード・セントレート(depth filtered centrate)をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Thermomixer R(Eppendorf)および2つの温度制御室を使用して、PAPおよびQPAPサンプルの温度を制御した。
MABSELECT(商標)樹脂(33.35mL)が充填されたカラム(1.7cm×14.5cm)を5CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)(PBS)で6.8mL/分(5分の滞留時間)で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを、室温(21℃)で6.8mL/分の流量を用いて、樹脂1リットル当たり25g mAbでローディングした。ローディング後、該カラムを3CVのPBSで洗浄し、ついで4CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)で洗浄した。該産物を8.3mL/分(4分の滞留時間)で0.1M クエン酸ナトリウム(pH3.5)で0.5〜3.0CVにわたって溶出させた。溶出後、PAP(6.9g/L)プールを、1M トリス塩基(16v%)を使用してpH6にクエンチした。
このQPAP流を該pH実験のための供給体として使用した。シトラート溶液(4M、50〜100μL)を、該溶液pHが5.0に到達するまで、該QPAP(20mL)に加えた。この溶液のサンプル(2mL)をpH5.0で採取し、21℃および30℃で配置した。pH4.5および4.0における溶解状態を得るために、この手順を繰返した。サンプル(100μL)を種々の時点で採取し、トリス塩基(0.5〜1M、10〜30μL)を使用してpH6にクエンチし、HPSECを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。
Agilent 1100(商標)HPLC系(Agilent,Palo Alto,CA)上でPOROS(商標)プロテインA ID免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのPAPまたはQPAPサンプルをmAb濃度に関して分析した。Agilent 1100(商標)HPLC系上でTosohサイズ排除カラム(0.78cm ID×30cm長)を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体(すなわち、二量体およびそれ以上の高次凝集体)を定量した。溶液pHを測定するために、pHプローブ(Fisher Scientific)(+/− 0.1pH単位の精度を有するもの)およびメーター(Fisher Scientific)(温度補償を伴うもの)を使用した。
タンパク質凝集に対するpHの効果を判定するために、該QPAPのpHをpH4.0〜pH5.0に低下させた。該単量体は21℃および30℃でpH4.5またはそれ以上で少なくとも2.5時間にわたり安定であった(図7および9、ならびに8および10を参照されたい)。pH4.0におけるHOAレベルは21℃では0.9%〜2.0%の範囲であり、30℃では2.5時間にわたり3%〜13%の範囲であった(図7および図8)。pH4.0におけるHOAレベルは温度上昇と共に増加し、これは、実施例1においてpH3.5で見られたのと同じ傾向である。該二量体レベルは21℃、pH4.0〜5.0で一定のままであったが、pH4.0で温度が30℃に上昇すると増加した(図9および図10)。
溶出バッファーのpHおよび濃度の影響を分離して、PAPプールにおけるタンパク質凝集に対する両方のパラメーターの影響を特徴づけした。また、該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーから該単量体を溶出させるのに必要な溶出バッファーの最小濃度を決定した。これを抗DKK1モノクローナル抗体に関して評価した。
小規模:AKTA EXPLORER 100(商標)(GE Healthcare)を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはHyclone(Logan,UT)から購入した。PAPのpH調節のためのトリス塩基はHyclone(Logan,UT)から購入した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験用のMABSELECT(商標)樹脂はGE Healthcareから購入した。デプス・フィルタード・セントレート(depth filtered centrate)をプロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Thermomixer R(Eppendorf)を使用して、PAPおよびQPAPサンプルの温度を制御した。
MABSELECT(商標)樹脂(1.06mL)が充填されたカラム(0.5cm×5.4cm)を5CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)(PBS)で0.2mL/分(5分の滞留時間)で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを、室温(17℃〜21℃)で0.2mL/分の流量を用いて、樹脂1リットル当たり25g mAbでローディングした。ローディング後、該カラムを3CVのPBS、ついで4CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)で0.2mL/分で洗浄した。0.5〜1.0mL/分(1〜2分の滞留時間)で少なくとも2.5CVにわたる10%の0.1M クエン酸ナトリウム(pH3.5)(10mM シトラート)での段階勾配を用いて、該産物を溶出させた。20%、30%および100%の0.1M クエン酸ナトリウム(pH3.5)バッファー(それぞれ20mM、30mMおよび100mM シトラート)を使用して、この溶出段階を更に3回繰返した。溶出後、該PAP流の全てを、1M トリス塩基を使用してpH6にクエンチした。該カラムを50mM 水酸化ナトリウム、1M 塩化ナトリウムで0.5〜1.0mL/分で再生させ、PBS中の20v%エタノール中で保存した。
MABSELECT(商標)樹脂(10.4mL)が充填されたカラム(1.1cm×10.9cm)を5CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)(PBS)で2.2mL/分(5分の滞留時間)で平衡化した。デプス・フィルタード・セントレートを、室温(17℃〜20℃)で2.1mL/分の流量を用いて、樹脂1リットル当たり27g mAbでローディングした。ローディング後、該カラムを3CVのPBS、ついで4CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)で2.1mL/分で洗浄した。2.6mL/分(4分の滞留時間)で0.5〜3CVにわたる60%の0.1M クエン酸ナトリウム(pH3.5)(60mM シトラート)または40%の0.1M クエン酸ナトリウム(pH3.0)(40mM シトラート)での段階勾配を用いて、該産物を溶出させた。溶出直後、該PAP(11g/L)プールのサンプルを25℃のサーモミキサー(thermomixer)内に配置した。時間ゼロサンプルを溶出直後に採取し、トリス塩基でクエンチし、タンパク質凝集体含量分析のためにHPSECに付した。サンプル(200μL)を種々の時間間隔で採取し、トリス塩基(0.5〜1M、5〜10μL)を使用して直ちにpH6にクエンチし、HPSECを用いてタンパク質凝集体含量に関して分析した。該プロテインAアフィニティーカラムを5CVの50mM 水酸化ナトリウム、1M 塩化ナトリウムで2.4mL/分で再生させ、PBS中の20% エタノール中で保存した。該60% シトラート溶出(60mM シトラート)のために、該PAPプールを別々の2mL アリコートに細分した。シトラート(4M、5〜10μL)を、pH3.4または3.6に達するようアリコートに加えた。リン酸(8v%、10μL)を、pH3.6に達するようアリコートに加えた。
酸濃度が抗DKK−1の安定性に影響を及ぼすかどうかを判定するために、該プロテインA溶出バッファーにおいて該シトラート濃度を50mMに減少させた。この減少した酸濃度は溶出中のpH傾きの勾配に影響を及ぼし、これは、3.6に対して3.9の、より高いPAPプールpHを与えた。
Agilent 1100(商標)HPLC系(Agilent,Palo Alto,CA)上でPOROS(商標)プロテインA ID免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのPAPサンプルをmAb濃度に関して分析した。Agilent 1100(商標)HPLC系上でTosohサイズ排除カラム(0.78cm ID×30cm長)を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体(すなわち、二量体およびそれ以上の高次凝集体)を定量した。溶液pHを測定するために、pHプローブ(Fisher Scientific)(± 0.1pH単位の精度を有するもの)およびメーター(Fisher Scientific)(温度補償を伴うもの)を使用した。
該樹脂からの該単量体の溶出のための可能なシトラートの最低濃度を決定するために、該プロテインAアフィニティーカラムを種々のシトラート濃度で溶出させた。該10v%および20v% シトラート濃度は、該カラムに結合した該単量体の80%を溶出させた(非表示)。該シトラート濃度を30v%に増加させると、僅か2%の追加的単量体が該カラムから溶出した。したがって、該カラムから80%以上の単量体を溶出させるための最小濃度は20mM シトラートであった。
示差走査熱量測定法は、タンパク質安定性を測定するために用いられる手段である。タンパク質安定性は環境に大きく左右され、そのような環境は、タンパク質のフォールディング(折り畳み)構造を安定化する及び不安定化する両方の能力を有する。DSCは、溶媒対照の熱容量と比較して温度上昇中のタンパク質溶液の熱容量を測定することにより実施される。タンパク質溶液と溶媒対照との間の熱容量の差は、該タンパク質の変性を表すプロファイルを提供する。このプロファイルから、見掛け上の融点Iが決定されうる。アンフォールディング状態へのタンパク質の変性は、しばしば、凝集または化学分解のような望ましくない事象を引き起こす(19,20、21,22,23)。
30mM、60mMおよび100mMの濃度のクエン酸(Sigma,St.Louis)の溶液を調製した。水酸化ナトリウム(Fisher Chemicals)を使用して、該シトラート溶液を3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5および6.0 pH単位の目標値にpH調節した。Accumet pHメーター(Fisher Scientific)を使用して該pH測定値を得た。
抗DKK1抗体の熱安定性に対するpHおよびシトラート濃度の影響を、DSCを用いて調べた。結果は、pHの減少と共に融点が低下すること示している。結果はまた、シトラートが、低pH値におけるこのモノクローナル抗体の熱安定性に、より大きな影響を及ぼすことを示唆している。
該プロテインAアフィニティー樹脂からタンパク質または抗体を溶出させるためには、酸条件が要求される。低pH(3〜4)でのこれらの酸条件に対する曝露はタンパク質凝集体の形成を引き起こしうる。プロテインA溶出バッファーへの安定剤の添加は低pHにおいてタンパク質の安定性を増加させることが示された。該溶出バッファー中のアルギニンの存在が高次凝集体のレベルを減少させ、それによりmAb安定性を増加させるかどうかを判定するために、この実験のための安定剤としてアルギニンを選択した。全ての実験は25℃で行った。
シトラートおよびアセタートバッファーにおけるタンパク質濃度の影響を調べて、各バッファー系における凝集率に対する濃度の効果を判定した。また、pH4.0におけるシトラートおよびアセタートバッファーを比較して、凝集に対する該酸タイプの効果を判定した。
小規模:AKTA EXPLORER 100(商標)(GE Healthcare)を使用して全ての小規模実験を行った。リン酸ナトリウムバッファーはHyclone(Logan,UT)から購入した。アセタートおよびシトラートはFisher Scientific(Pittsburgh,PA)から購入した。PAPのpH調節のためのトリス塩基はHyclone(Logan,UT)から購入した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験用のMABSELECT(商標)樹脂はGE Healthcareから購入した。クエンチされたプロテインA産物をこれらの実験のための供給ストックとして使用した。Thermomixer R(Eppendorf)を使用して、PAPおよびQPAPサンプルの温度を制御した。
Agilent 1100(商標)HPLC系(Agilent,Palo Alto,CA)上でPOROS(商標)プロテインA ID免疫アフィニティーカートリッジを使用して、サンプルを単量体mAb濃度に関して分析した。Agilent 1100(商標)HPLC系上でTosohサイズ排除カラム(0.78cm ID×30cm長)を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体(すなわち、二量体およびそれ以上の高次凝集体)を定量した。溶液pHを測定するために、pHプローブ(Fisher Scientific)(+/− 0.1pH単位の精度を有するもの)およびメーター(Fisher Scientific)(温度補償を伴うもの)を使用した。
シトラートおよびアセタートバッファーにおけるmAb濃度の効果を調べて、各バッファー系における凝集率に対する濃度の影響を判定した。シトラート(15mM、pH3.5)溶液では、mAb濃度が増加するにつれて、高次凝集体形成の比率も増加した(図20)。例えば、1時間の維持時間の後、高次凝集体のレベルは8mg/mL mAb濃度における0.3%から34mg/mL mAb濃度における2.6%へと増加した。したがって、溶液中のタンパク質の濃度は低pHのシトラート緩衝系における高次凝集体形成の比率に影響を及ぼす。しかし、アセタート(85mM、pH4.0)溶液では、高次凝集体のレベルは5mg/mL、11mg/mLおよび37mg/mL mAb濃度において1%未満と一定のままであった(図21)。
温度およびpHに加えて、タンパク質濃度もPAPプールにおけるタンパク質凝集体形成の比率に影響を及ぼした。pH3.5のシトラート緩衝溶液においては、mAb濃度が増加するにつれて、高次凝集体の比率が有意に増加した。しかし、pH4.0のアセタート緩衝溶液においては、5mg/mLから37mg/mLまでの範囲の種々のタンパク質濃度で高次凝集体のレベルは1%未満のままであった。5mg/mL〜11mg/mLの濃度のタンパク質の存在下のpH4.0の該アセタートおよびシトラートバッファー系を比較したところ、該mAbは該アセタートバッファーにおいて、より高い安定性を示した。したがって、溶出バッファーのタイプはmAb安定性において何らかの役割を果たしており、アセタートはpH4.0においてシトラートバッファーより安定である。アセタートはプロテインAアフィニティーカラムからのmAb溶出のための代替的バッファーとして使用可能である。
小規模:AKTA EXPLORER 100(商標)を使用して全ての小規模実験を行った。ホスファート、シトラートおよび水酸化ナトリウムバッファーはHyclone(Logan,UT)から購入した。PAPのpH調節のためのトリス塩基はHyclone(Logan,UT)から購入した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験用のMABSELECT(商標)樹脂はGE Healthcareから購入した。デプス・フィルタード・セントレート(depth filtered centrate)を得、プロテインAアフィニティークロマトグラフィー実験のための供給ストックとして使用した。Thermomixer R(Eppendorf)および2つの温度制御室を使用して、PAPおよびQPAPサンプルの温度を制御した。
MABSELECT(商標)樹脂(10mL)が充填されたカラム(1.7cm×14.5cm)を5CVの6mM リン酸ナトリウム、100mL NaCl(pH7.2)バッファーで2.0mL/分(5分の滞留時間)で平衡化した。表1に挙げられている温度で2.0mL/分の流量を用いて、デプス・フィルタード・セントレートを、表1に挙げられている濃度(樹脂1リットル当たりのmAbのg)でローディングした。ローディング後、該カラムを3CVの6mM リン酸ナトリウム、100mM NaCl(pH7.2)バッファーで2ml/分で洗浄し、ついで4CVの6mM リン酸ナトリウム(pH7.2)で2ml/分で洗浄した。2ml/分の100%の段階勾配(0.5から開始し3.5で終了する)(4分の滞留時間)で3CVの溶出バッファー(目標pH値にするためのクエン酸無水物およびクエン酸三ナトリウム塩の混合物)を使用して、該産物を溶出させた。
・60mM クエン酸ナトリウム,pH3.5。
・40mM クエン酸ナトリウム,pH3.2。
・40mM クエン酸ナトリウム,pH3.8。
・80mM クエン酸ナトリウム,pH3.2。
・80mM クエン酸ナトリウム,pH3.8。
Agilent 1100(商標)HPLC系(Agilent,Palo Alto,CA)上でPOROS(商標)プロテインA ID免疫アフィニティーカートリッジを使用して、全てのサンプルをmAb単量体濃度に関して分析した。Agilent 1100(商標)HPLC系上でTosohサイズ排除カラム(0.78cm ID×30cm長)を使用して、各サンプル中のタンパク質凝集体(二量体およびそれ以上の高次凝集体)を定量した。溶液pHを測定するために、pHプローブ(±0.1pH単位の精度)およびメーター(温度補償を伴うもの)(共にFisher Scientificから入手)を使用した。
pH、温度、バッファー濃度およびタンパク質ローディングの効果を調べて、収率およびたんぱく質凝集に対するそれらの影響を判定した。前記実験の結果は以下の表1において見出されうる。
Claims (19)
- 単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、
b)溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、
c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
i)5%未満の高次凝集体を含み、
ii)約3.5〜約4.5のpHを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。 - 該溶出バッファーがシトラートまたはアセタートである、請求項1記載の方法。
- 該溶出バッファーがシトラートである、請求項2記載の方法。
- 該溶出バッファーにおけるシトラートの濃度が約0.030M〜約0.085Mである、請求項3記載の方法。
- 該溶出バッファーがアセタートである、請求項2記載の方法。
- 該溶出バッファーにおけるアセタートの濃度が約0.050M〜約0.200Mである、請求項5記載の方法。
- 該方法を約4℃〜約30℃の温度で行う、請求項1記載の方法。
- 該方法を約15℃〜約27℃の温度で行う、請求項7記載の方法。
- 該単量体モノクローナル抗体がIgG抗体である、請求項1記載の方法。
- 該単量体モノクローナル抗体がIgG1または修飾IgG2抗体である、請求項9記載の方法。
- 該単量体モノクローナル抗体がIgG2m4抗体である、請求項10記載の方法。
- 該IgG2m4抗体が抗DKK1抗体である、請求項11記載の方法。
- 段階(b)における溶出バッファーにアミノ酸を約50mM〜約500mMの濃度まで加える、請求項1記載の方法。
- 該アミノ酸がアルギニン、プロリンまたはヒスチジンである、請求項13記載の方法。
- 単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと約15℃〜約27℃の温度で接触させ、
b)約0.030M〜約0.085Mの濃度のシトラートを含む溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、
c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
i)5%未満の高次凝集体を含み、
ii)約3.5〜約4.0のpHを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。 - 単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと約15℃〜約27℃の温度で接触させ、
b)約0.050M〜約0.200Mの濃度のアセタートを含む溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、
c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
i)5%未満の高次凝集体を含み、
ii)約3.5〜約4.5のpHを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。 - 単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと接触させ、
b)溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、
c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
i)5%未満の高次凝集体を含み、
ii)約3.2〜約4.5のpHを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。 - 単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと約15℃〜約27℃の温度で接触させ、
b)約0.030M〜約0.085Mの濃度のシトラートを含む溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、
c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
i)5%未満の高次凝集体を含み、
ii)約3.2〜約4.0のpHを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。 - 単量体モノクローナル抗体、宿主細胞不純物、二量体およびそれ以上の高次凝集体を含むサンプルから該単量体モノクローナル抗体を精製するための方法であって、
a)該サンプルをプロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムと約15℃〜約27℃の温度で接触させ、
b)約0.050M〜約0.200Mの濃度のアセタートを含む溶出バッファーで該プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムから該単量体モノクローナル抗体を溶出させ、
c)段階(b)からの該単量体モノクローナル抗体の画分の1以上を集めてプロテインA産物プールを形成させ、ここで、該産物プールは、
i)5%未満の高次凝集体を含み、
ii)約3.2〜約4.5のpHを有し、
それにより、該単量体モノクローナル抗体を該サンプルから精製することを含む方法。
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