KR101858266B1 - 친화성 크로마토그래피를 위한 세척용액 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 친화성 크로마토그래피를 위한 세척방법을 제공하고, 여기서 바람직하게는 높은 pH(8.0보다 큰)에서 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체, 및 비완충 염을 포함한 세척용액은, 용출액에서 생성물 농도를 증가시키고 회수된 생성물의 높은 수득률을 유지하면서, 고분자량 종류 및 숙주세포 단백질과 같은 불순물을 제거하는 데에 있어 효과적이다.

Description

친화성 크로마토그래피를 위한 세척용액 및 방법{WASH SOLUTION AND METHOD FOR AFFINITY CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 위한 세척방법을 제공한다.
친화성 크로마토그래피는 겔 매트릭스와 같은 고형 상에서 표적으로 관심 단백질의 우선적인 결합에 기초한, 세포 수확물과 같은 분자의 혼합물에서부터 관심 단백질의 정제를 허용한다. 이 고형 상 성분은 전형적으로, 칼럼으로 형성되고, 이를 통하여 관심 단백질을 포함한 혼합물이 적용된다. 포획단계라고 불리는 초기단계에서, 관심 단백질은 고형 상에서 표적에 특이적으로 결합하는 반면에, 혼합물 내에서 다른 성분은 칼럼을 통해 유동한다. 하지만, 고분자량(High molecular weight, HMW) 종류, 저분자량(Low molecular weight, LHW) 종류 및 숙주세포 단백질(Host cell protein, HCP)을 포함하는 혼합물 내의 특정 성분은 관심 단백질과 함께 불순물로서 칼럼 내에 남아있을 수도 있다. 따라서, 전형적으로 하나 이상의 세척단계가 수행되는데 여기서, 하나 이상의 세척용액은 고형 상에 관심 단백질의 결합을 유지하면서 이러한 불순물을 제거하기 위한 칼럼에 적용된다. 마지막으로, 세척단계에 의한 불순물의 제거 후, 관심 단백질은 용출단계에 의해 칼럼에서부터 회수되며, 여기서 고형 상 표적으로 관심 단백질의 결합을 방해하는 용출용액은 칼럼에 적용되고 관심 단백질은 용출 내에서 회수된다. 따라서, 고형 상 표적으로 관심 단백질의 결합을 방해하지 않거나 그렇지 않으면 바라지 않은 효과를 가지지 않으면서, 관심 단백질 정제에서 친화성 크로마토그래피의 효과는 불순물(가령, HMW, LHW, HCP)의 효과적인 제거를 허용하는 세척조건의 동정에 상당 부분으로 의존한다.
친화성 크로마토그래피의 특이적으로 유용한 유형은 항체 및 Fc 융합 단백질과 같은 면역글로불린 Fc 영역을 포함한 단백질의 정제를 위한 단백질 A 크로마토그래피이다. 다양한 세척용액은 다음 중 하나를 포함한 세척용액을 포함한 단백질 A 칼럼으로부터 불순물의 제거에 대해 설명되었다: 소수성 전해질(가령, pH 5.0-7.0에서의 테트라메틸암모늄 클로라이드, 테트라에틸암모늄 클로라이드,테트라프로필암모늄 클로라이드 또는 테트라부틸암모늄 클로라이드), 용매(가령, 5-20% 이소프로판올 또는 폴리프로필렌/헥실렌 글리콜), 요소(가령, 1-4M의 농도에서), 세제(가령, 0.1-1% Tween 20 또는 Tween 80), 중합체(가령, PEG400 또는 PEG8000과 같은 5-15% 폴리에틸렌 글리콜) 또는 pH 5.0 내지 7.0에서 0.8-2.0 M의 농도에서 Tris, HCl, 아세트산염, 황산염, 인산염 또는 시트르산염 완충제와 같은 대단히 농축된 완충용액(가령., Shukla, A.A 및 Hinckley, P. (2005) Biotechnol . Prog. 24:1115-11121; U.S. Patent Nos. 6,127,526 및 6,333,398 by Blank; 및 U.S. Patent No. 6,870,034 by Breece et al. 참조). 하지만, 이들 화학약품 중에서, 다수는 독성, 부식성, 인화성, 불안정성, 유해 폐기물로서 고비용 처리 및/또는 세척단계 동안에 오염물질의 효과 없는 제거를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 단점을 가진다.
단독으로 또는 세제(가령, Tween 20), 용매(가령, 헥실렌 글리콜), 또는 중합체체(가령, 폴리에틸렌 글리콜)와의 조합으로 염(염화나트륨과 같은)을 포함한 단백질 A 크로마토그래피 세척 완충제 역시 설명되어있다(U.S Patent No.6,870,034 by Breece et al.).
Barron 등은 pH 5.0-7.5의 인산염/아세트산염 완충제에서 0.5 내지 2.0M 아르기닌을 포함한(최선으로 1M 아르기닌, pH 5.0에서 0.1M 인산염/아세트산염 완충제) 단백질 A 크로마토그래피를 위한 중간 세척용액을 설명한다. 이 아르기닌 세척단계는 HCP 오염물질을 제거하는 것으로 보고된다. 저자는 pH 5.0-7.5에서 0.5-2.0M의 염화나트륨을 포함한 중간 세척용액을 또한 시험하였지만 NaCl 세척은 HCP에서 상당한 감소가 없는 것으로 나타났다고 보고하였다(Barron et al., "Improving Purity on Protein A Affinity Media Through Use of an Arginine Intermediate Wash Step", http://www.priorartdatabase.com/IPCOM/000127319).
Sun 등은 또한, 0.1-2.0M의 농도 및 4.5-8.0의 pH에서 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체를 포함하는 세척 완충제로 단백질 A 칼럼과 같은 친화성 크로마토그래피 칼럼의 세척을 설명한다(U.S. Patent Publication Nos. 20080064860 및 20080064861; PCT Publication No. WO 2008/031020).
아르기닌은 또한, 친화성 크로마토그래피 칼럼 및 다른 유형의 정제 칼럼에서 단백질을 용출하기 위하여 이용되었다. 예를 들어, Arakawa et al.는 pH 4.1-5.0에서 0.5-2.0M 아르기닌을 포함하는 용출 완충제를 이용하여 단백질 A 칼럼에서부터 항체의 용출 방법을 설명한다(Arakawa et al. (2004) Protein Expression and purification 36:244-248; Tsumoto, K. et al. (2004) biotechnol. Prog. 20:1310-1308; U.S. Patent Publication No. 20050176109). 게다가, U.S. Patent Publication No. 7,501,495 (Ejima et al.)는 아르기닌 염산염을 포함한 현상액을 이용함으로써 겔 여과 칼럼에서 단백질 용출의 방법을 설명한다. Ghose 등은 용출액으로서 아르기닌 기울기를 이용하여 유도체화가 되지않은 실리카에서 관심 단백질 용출의 방법을 설명한다(Ghose, S. et al.(2004) Biotech. Bioeng. 87:413-423). U.S. Patent Publication No. 20030050450 ( Coffman et al.)은 Fc 포함 분자 및 단백질 A를 포함하는 복합체로부터 Fc 포함 분자 분리의 방법을 설명하고, 여기서 Fc/단백질 A 복합체는 소수성 상호작용 칼럼(Hydrophobic interaction column, HIC)에 적용되고 그 칼럼은 아르기닌을 포함한 완충제로 세척된다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 위한 유효하고 강력한 세척용액뿐만 아니라 이 용액을 이용한 세척방법을 제공한다. 이 세척용액은 용출단계에 앞서, 세척단계에서 적용되고, 이러한 이용은 친화성 매트릭스에 적용된 개시물질로부터 고분자량 종류(HMW) 및 숙주세포 단백질(HCP) 둘 모두를 효과적으로 제거하면서 친화성 매트릭스로부터 용출되는 관심 단백질의 고수득률 및 고농도를 야기한다. 이 세척용액은 아르기닌(또는 아르기닌 유도체) 및 할로겐 염과 같은 비완충 염 둘 모두의 존재에 의해 특징 된다. 바람직하게는, 세척용액은 8.0 이상의 높은 pH에 있다. 아르기닌(또는 아르기닌 유도체) 및 비완충 염의 이러한 조합은 아르기닌 또는 염을 단독으로 포함한 세척용액보다 불순물을 훨씬 많이 제거하며 회수된 관심 단백질의 고농도와 연관 있는 더욱 급격한 용출 최고점을 야기한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 관심 단백질이 결합된 친화성 크로마토그래피(AC) 매트릭스를 이용하여 정제된 관심 단백질의 생산 방법을 제공하고, 이 방법은 AC 매트릭스에서 관심 단백질의 용출에 앞서, (i) 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체, 및 (ii) 비완충 염을 포함하는 하나 이상의 세척용액으로 AC 매트릭스를 세척하는 것을 포함하는 방법이다. 바람직하게는, 관심 단백질은 하나 이상의 세척용액으로 세척하기에 앞서 AC 매트릭스 상에 로딩되고, 관심 단백질은 특히, AC 매트릭스에서 불순물을 제거하기 위해 하나 이상의 세척용액으로 세척 후 AC 매트릭스에서 용출된다.
바람직한 실시양태에서, AC 매트릭스는 단백질 A 칼럼이다. 다양한 다른 실시양태에서, AC 매트릭스는, 예를 들어, 단백질 G 칼럼, 단백질 A/G 칼럼, 단백질 L 칼럼, 고정 금속이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 칼럼, 칼모듈린 레진 칼럼, MEP HyperCelTM 칼럼, 말토오스 결합 단백질(MBP)에 결합한 칼럼, 글루타티온-S-전이효소에 결합하는 칼럼 및 Strep-Tag II에 결합하는 칼럼으로 구성되는 집단에서 선택될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 여기에서 설명된 친화성 매트릭스에 결합하는 다른 단백질이 또한 본 발명의 방법에 따른 정제에 적합하긴 하지만, 관심 단백질은 단백질 A 칼럼과 같은 AC 매트릭스에 결합하는 항체 또는 항체 단편이다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액은 바람직하게는 0.005-2.0M의 범위 내 농도에서, 더 바람직하게는 0.05-0.85M의 범위 내에서, 가장 바람직하게는 0.1-0.5M의 범위 내에서 아르기닌-HCl을 포함한다. 상세한 실시양태에서, 아르기닌-HCl은 0.1M 또는 약 0.1M, 0.25M 또는 약 0.25M, 또는 0.5M 또는 약 0.5M의 농도에서 존재한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액은 아세틸 아르기닌, N-알파-부티로일-아르기닌, 아그마틴, 아르긴산 및 N-알파-피바로일 아르기닌으로 구성되는 집단에서 선택된 유도체와 같은 아르기닌 유도체를 포함한다. D-아르기닌 또한 포함될지라도 가급적이면, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체는 L-아르기닌을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액 내에 비완충 염은 바람직하게는 0.1-2.0의 범위 내 농도에서 염화나트륨(NaCl)이다. 상세한 실시양태에서, NaCl은 0.75M 또는 약 0.75M, 1.0M 또는 약 1.0M, 또는 1.25M 또는 약 1.25M의 농도에서 존재한다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액 내에 비완충 염은 염화칼륨, 염화칼슘 및 염화마그네슘으로 이루어진 집단에서 선택된다.
상세한 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 8.0보다 크며, 바람직하게는 최소한 8.1, 더 바람직하게는 최소한 8.5, 좀 더 바람직하게는 최소한 8.9이다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 8.1-9.5의 범위 내에 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 8.5-9.5의 범위 내에 있다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 약 9.0이다. 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 9.0이다.
여기에서 설명된 아르기닌 및 비완충 염의 세척 조합은 바람직하게 두 가지 모두의 성분(즉, AC 매트릭스는 (i) 아르기닌 또는 아르기닌 유도체; 및 (ii) 비완충 염 둘 모두를 포함한 한 가지 세척용액으로 세척된다)을 포함한 단일 세척용액에서 적용된다. 대안적으로, 하나는 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하고(바람직하게는 8.0보다 큰 pH에서), 다른 하나는 비완충 염을 포함하는 두 개의 세척용액은 협동 세척(tandem wash)으로 이용될 수 있다. 따라서, 세척방법의 다른 실시양태에서, AC 매트릭스는 첫 번째 세척용액과 두 번째 세척용액 등 두 가지 세척용액으로 세척된다. 하나의 실시양태에서, 첫 번째 세척용액은 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체를 포함하고, 두 번째 세척용액은 비완충 염을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 첫 번째 세척용액은 비완충 염을 포함하고, 두 번째 세척용액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함한다.
본 발명의 세척방법은 고분자량(HMW) 종류 및 숙주세포 단백질(HCP)를 포함한 여러 가지 불순물의 제거에 있어 유용하다.
다른 양상에서, 본 발명은 단백질 A 칼럼을 이용하여 정제된 항체, 또는 항체의 단편의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 단백질 A 칼럼 상에서 항체, 또는 항체의 단편을 포함한 혼합물을 로딩하는 것; (b) 0.05-2.0M의 범위 내 농도(더 바람직하게는 0.05-0.85M, 가장 바람직하게는 0.1-0.5M)에서 아르기닌-HCl, 및 0.1-2.0M의 범위 내 농도에서 염화나트륨을 포함한 세척용액으로 단백질 A 칼럼을 세척하는 것(여기서 세척용액은 단백질 A 칼럼으로부터 불순물을 제거한다); 및 (c) 단백질 A 칼럼에서 항체, 또는 항체의 단편을 용출하는 것을 포함한다. 상세한 실시양태에서, 아르기닌-HCl은 0.1M 또는 약 0.1M, 0.25M 또는 약 0.25M, 또는 0.5M 또는 약 0.5M의 농도에서 존재한다. 상세한 실시양태에서, NaCl은 0.75M 또는 약 0.75M, 1.0M 또는 약 1.0M, 또는 1.25M 또는 약 1.25M의 농도에서 존재한다. 다양한 실시양태에서, 세척용액의 pH는 8.0보다 크고, 바람직하게는 최소한 8.1, 더 바람직하게는 최소한 8.5, 더 바람직하게는 9.0, 8.1-9.5의 범위 내 또는 8.5-9.5의 범위 내에 있다.
본 발명은 불순물을 제거하기 위해 관심 단백질의 용출에 앞서, 칼럼에 적용되는 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성 크로마토그래피를 위한 새로운 세척용액을 제공한다. 새로운 세척용액은 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체, 및 비완충 염으로 이루어진다. 일반적으로, 세척용액은 수용액이다.
여기서 이용된 바와 같이, "비완충 염"이라는 용어는 산 또는 염기의 첨가시에 적용된 조건(높은 pH와 같은)하에서 세척용액의 pH를 유지하는 것에 실질적으로 기여하지 않는 그러한 유형, 및 농도에서 세척용액 내에 존재하는 염을 나타낸다. 일반적으로, 비완충 염은 이온 염이다. 비완충 염은 Cl 또는 Br(더 바람직하게는 Cl)로 이루어진 것들을 포함한 할로겐 염을 포함하고, 특히, Na, K, Ca 및 Mg(더 바람직하게는 Na 또는 K)를 포함한 알칼리 토금속 또는 알칼리 금속으로 이루어진 할로겐 염을 포함한다. 용어, "비완충 염"은 적용된 조건하에서 세척용액의 pH를 유지하는 데에 실질적으로 기여하는 아세트산 나트륨, 인산 나트륨 및 트리스(Tris)와 같은 완충 염을 포함하지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 비완충 염은 할로겐 염(예를 들어, Cl 또는 Br을 포함)이다. 다른 실시양태에서, 비완충 염은 나트륨(Na), 칼륨(K), 칼슘(Ca) 또는 마그네슘(Mg), 더 바람직하게는, 나트륨(K) 또는 칼륨(K)으로 구성된 할로겐 염이다. 또 다른 실시양태에서, 비완충 염은 NaCl, KCl, CaCl2, 및 MgCl2로 이루어진 집단에서 선택된다. 특별하게 바람직한 실시양태에서, 비완충 염은 염화나트륨이다. 일반적으로, 비완충 염은 최소한 1M의 "고" 농도에서 이용된다. 다른 적합한 농도 및 농도 범위는 아래에서 더 설명된다.
세척성분의 이러한 새로운 조합은 회수에 영향을 미치지 않으면서, 통상적으로 이용되는 절차보다도 훨씬 더 많은 불순물을 제거한다. 게다가, 이러한 세척조건은 용출액에서 관심 단백질의 더 높은 농도와 연관있는 더욱 급격한 용출 최고점을 야기하며, 이는 추가적인 다운스트림 정제과정의 성능을 높이는데 유리하다.
숙주세포 단백질(HCP)과 고분자량(HMW) 종류 및 저분자량(LMW) 종류와 같은 생성물-관련 불순물을 포함한 불순물의 제거효율은 관심 단백질의 다운스트림 과정 동안에 주요 요인이다. 친화성 크로마토그래피는 관심 단백질(예를 들어, 항체)에 대한 다수-단계 정제과정 중 첫 번째 단계로서 주로 이용되고 친화성 크로마토그래피 후, 관심 단백질의 순도는 차후 정제단계의 종류와 수에 현저하게 영향을 미친다. 친화성 크로마토그래피에 대한 또 다른 중요한 역할은 생성물을 농축하는 것인데, 이것은 차후 정제단계에서 비교적으로 더 작고, 덜 비용이 드는 칼럼의 이용을 허용한다.
따라서, 이는 친화성 크로마토그래피 단계 동안에 불순물의 제거를 최적화하기 위해 특히 중요하다.
일반적으로 pH 3 내지 4의 낮은 pH 조건은 친화성 매트릭스에서 결합된 관심 단백질을 용출하는 데 있어 필수적이고 잠재적으로 집합체 유도의 결점을 가지고 있다. 역사적으로, pH 5-5.5와 같은 덜 엄중한 조건은 관심 단백질과 친화성 매트릭스 간의 상호작용을 유지하는 동안 칼럼에서 비특이적으로 결합한 불순물을 세척하는데 이용되었다. 그러나, 관심 단백질의 회수는 특히 높은 로딩 밀도에서 수행할 때, 이러한 조건에서 관심 단백질의 부분적인 용출 때문에 종종 감소된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에서 제공된 세척용액은 8.0보다 큰 높은 pH에서 유리하게 수행되며, 이는 불순물의 제거를 허용하면서 친화성 매트릭스에 관심 단백질의 결합을 유지한다.
본 발명에서 제공된 친화성 크로마토그래피를 위한 새로운 세척용액은 아르기닌(또는 아르기닌 유도체)과 비완충 염의 혼합물에 기반하고 바람직하게는 높은 pH에서 수행된다. 통상적인 수확물 또는 세포의 추출물에 존재하는 불순물의 대형 생물물리학적 다양성은 크로마토그래피 매체의 고형 상 및/또는 결합된 관심 단백질과 상호작용의 매우 다양한 형식을 야기한다. 불순물의 대략 강한 테더링(tethering)은 수소결합, 정전기 상호작용, 소수성 및 반데르발스 힘 또는 이러한 유형의 상호작용의 조합과 같은, 2개의 분자 간의 비-공유 분자 간 상호작용의 결과일 수도 있다. 따라서, 불순물을 제거하기 위한 여러 가지 상이한 기법의 조합은 불순물 제거를 위한 단일 기법에 기초한 접근보다 훨씬 더 효과적일 것이다.
세척용액 내 비완충 염의 효과에 대해서, 본 명세서에서 분석 데이터에 기반하여, 관심 단백질과 친화성 매트릭스의 리간드 사이의 고친화성 상호작용은 높은 비완충 염 농도에서의 세척에 의해 깨지지 않는 반면에, 고정된 리간드 또는 결합된 관심 단백질 중 하나에 있는 하전된 잔기에 비특이적으로 묶인 하전된 오염물질은 효과적으로 제거된다. 따라서, 기법에 의해 한정됨 없이, 고정된 리간드에 결합 표적의 특이적 결합을 방해하지 않으면서, 세척용액에 이용되는 비완충 염은 친화성 크로마토그래피 매트릭스의 하나 이상의 성분(예를 들어, 레진과 같은 매트릭스의 화학적 서포트(support), 매트릭스에 고정된 친화성 리간드 및/또는 매트릭스에 고정된 리간드에 결합된 관심의 표적)상에 있는 하전된 잔기에 비특이적으로 묶인 하전된 오염물질(불순물) 간의 이온 상호작용을 깨기 위한 능력을 갖는다고 생각된다.
세척용액 내 아르기닌의 효과에 대해서, 아르기닌은 침전된 특정 단백질을 녹일 수 있고(Umetsu, M. et al. (2005) Biochem . Biophys . Res . Commun . 328:189-197; Tsumoto, K. et . al. (2003) Biochem . Biophys . Res . Commun . 312:1383-1386), 집합체의 형성을 감소시키고(Arakawa, T. et al.(2003) Biochem . Biophys . Res . Commun . 304:148-152), 표면으로 단백질의 비특이적 흡착을 감소시킨다고(Ejima, D. et al. (2005) J. Chromatogr . A. 1094:49-55) 보고되었다. 기법에 의해 한정됨 없이, 단백질 집합의 감소는 단백질 상의 소수성 패치(patch)의 마스킹(masking)에서부터 기원할 수도 있으며, 이들 패치는 아르기닌과 상호작용한다. 이러한 상호작용은 아르기닌 상의 구아니디움 기와 단백질 상의 트립토판 기 사이에서, 또는 아르기닌의 집단화에 의해 소수성 패치의 형성을 통해 일어날 수도 있으며, 또는 이러한 효과의 조합이 될 수도 있다.
세척용액 내 8.0보다 큰 pH의 이용에 대해서, 염기성 pH는 HCP 및 HMW를 부분적으로 변성시키는 반면에, 단량체 항체를 포함한 안정된 단백질은 이러한 조건에서 영향을 받지 않는다. 기법에 의해 한정됨 없이, 오염물질 단백질의 변성은 구조에서 약간의 변화로 명시될 수도 있으며, 이는 비특이적 결합을 약화시키는데에 충분할 수도 있다. 따라서, 세척용액의 높은 pH는 결합된 관심 단백질 또는 친화성 매트릭스의 고형 서포트와의 이것들의 상호작용을 불안정화시킴으로써 불순물의 제거를 증가시키는데 유익할 수 있다.
따라서, 하나의 양상에서, 본 발명은 관심 단백질이 결합된 친화성 크로마토그래피(AC) 매트릭스를 이용하여 정제된 단백질 생성의 방법을 제공하고, 상기 방법은 AC 매트릭스에서 관심 단백질의 용출에 앞서, (i) 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체, 및 (ii) 비완충 염을 포함한 하나 이상의 세척용액으로 AC 매트릭스 를 세척하는 것을 포함한다.
여기에 이용된 바와 같이, 용어, "친화성 크로마토그래피 매트릭스" 또는 "AC 매트릭스"는 고형 상 매체, 일반적으로 겔 또는 레진을 나타내기 위한 것이며, 이는 수용체 및 리간드, 효소 및 기질 또는 항원 및 항체 사이와 같은 관심 단백질 및 AC 매트릭스 사이의 매우 특이적인 결합 상호작용에 기반한 생화학적 혼합물의 분리를 허용한다. 따라서, 고형 상 매체는 관심 단백질이 완충조건에 의존하여 가역적으로 부착할 수 있는 표적을 포함한다. AC 매트릭스로 구성될 수 있는 고정된 또는 고형 상 매체의 비-한정 예시는 아가로오스 구슬(상업적으로 이용할 수 있는 세파로오스 매트릭스와 같은)과 같은 겔 매트릭스, 및 다공성의 유리 구슬(상업적으로 이용할 수 있는 ProSep 매트릭스와 같은)과 같은 유리 매트릭스를 포함한다.
AC 매트릭스로 관심 단백질의 결합은 칼럼 크로마토그래피에 의해 일반적으로 이루어진다. 즉, AC 매트릭스는 칼럼으로 형성되며, 관심 단백질을 포함한 생화학적 혼합물은 칼럼을 통해 유동되고, 뒤이어 하나 이상의 세척 용액의 칼럼을 통한 유동에 의해 칼럼이 세척되고, 뒤이어 칼럼을 통한 용출 완충제의 유동에 의해 칼럼에서 관심 단백질이 용출된다.
대안적으로, AC 매트릭스로의 관심 단백질의 결합은 일괄처리(batch treatment)에 의해 이루어질 수 있으며, 관심 단백질을 포함한 생화학적 혼합물은 AC 매트릭스에 관심 단백질의 결합을 허용하기 위해 관 내 AC 매트릭스와 배양되고, 고형 상 매체는 관(예를 들어, 원심분리로)에서 제거되고, 고형 상 매체는 불순물을 제거하기 위해 세척되며 다시 회복(예를 들어, 원심분리로)되고 그리고 관심 단백질은 고형 상 매체에서 용출된다.
또 다른 실시양태에서, 일괄처리 및 칼럼 크로마토그래피의 조합이 이용 되어질 수 있다. 예를 들어, AC 매트릭스로의 관심 단백질의 개시결합은 일괄처리에 의해 이루어질 수 있고, 그 후, 고형 상 매체는 칼럼으로 압축될 수 있고, 뒤이어 칼럼의 세척 및 칼럼에서 관심 단백질의 용출이 수행될 수 있다.
특정 고형 상 매트릭스의 성질, 특히 고형 상에 부착되는 표적의 결합 성질은 고형 상 매트릭스를 이용하여 정제될 수 있는 단백질의 유형을 결정한다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 고형 상에 부착되는 표적으로서, AC 매트릭스는 특정 면역글로불린의 Fc 영역 내부에서 CH2 및 CH3 도메인에 특이적으로 결합하는 박테리아의 세포벽 단백질, 단백질 A를 포함하는 단백질 A 칼럼이다. 단백질 A의 결합 성질은 당분야에서 잘 확립되어있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 관심 단백질(정제되기 위한)은 항체 또는 Fc 영역을 포함한 항체 단편이다. 게다가, 단백질 A 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있는 추가적인 단백질은 Fc 융해 단백질을 포함한다. 어느 단백질이 단백질 A 매트릭스에 특이적으로 결합할 수 있는 한에 있어서, 이는 본 발명에 따라서 정제될 수 있다.
다양한 단백질 A 레진은 당업계에서 잘 알려져 있고 본 발명에서 이용하기에 적합하다. 상업적으로 이용할 수 있는 단백질 A 레진의 비-한정 예시는 MabSlelect, MabSelect Xtra, MabsSelect Sure, rProtein A Sepharose FF, rmpProtein A Sepharose FF, Protein A Sepharose CL-4B 및 nProtein A Sepharose 4 FF (GE Healthcare에서 모두 상업적으로 이용할 수 있음); ProSep A ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra 및 ProSep-Va Ultra Plus (Millipore에서 모두 상업적으로 이용할 수 있음); Poros A 및 Mabcapture A (Poros에서 둘 다 상업적으로 이용할 수 있음); IPA-300, IPA-400 및 IPA-500 (RepliGen Corp.에서 모두 상업적으로 이용할 수 있음); Affigel protein A 및 Affiprep protein A (Bio-Rad에서 둘 다 상업적으로 이용할 수 있음); MABsorbent A1P 및 MABsorbent A2P (Affinity Chromatography Ltd.에서 둘 다 상업적으로 이용할 수 있음); Protein A Ceramic Hyper D F (Pall Corporation에서 상업적으로 이용할 수 있음); Ultralink Immobilized protein A 및 Agarose Protein A (PIERCE에서 둘 다 상업적으로 이용할 수 있음); 및 Protein A Cellthru 300 및 Protein A Ultraflow (Sterogen Bioseparations에서 둘 다 상업적으로 이용할 수 있음)를 포함한다.
단백질 A 크로마토그래피에 더하여, 본 발명의 세척방법은 다른 친화성 크로마토그래피 시스템에도 적용될 수 있다. 예를 들어, 다른 실시양태에서, AC 매트릭스는 단백질 G 칼럼, 단백질 A/G 칼럼 또는 단백질 L 칼럼일 수 있는데, 이들 각각은 또한 당업계에서 확립된 결합 성질을 갖는 면역글로불린-결합 박테리아 단백질이 될 수 있다. 따라서 단백질 G 매트릭스, 단백질 A/G 매트릭스 또는 단백질 L 매트릭스인 AC 매트릭스는 항체, Fc 융합 단백질 및 Fc 영역을 포함한 항체 단편을 정제하기 위해 이용될 수 있다.
AC 매트릭스의 다른 비-한정 예시, 및 이들이 정제에 유효한 단백질의 유형은 다음을 포함한다: 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC) 칼럼(히스티딘-표지 단백질과 같은 금속 이온에 대한 친화성이 있는 단백질의 정제를 위해), 칼모듈린 레진 칼럼(칼모듈린 결합 펩티드(CBP)로 표지된 단백질의 정제를 위해), MEP HyperCelTM 칼럼(면역글로불린에 선택적으로 결합하는 셀룰로오스 매트릭스), 말토오즈 결합 단백질(MBP)에 결합하는 칼럼(MBP로 표지된 단백질에 선택적으로 결합하는 Dextrin SepharoseTM 레진과 같은), 글루타치온-S-전이효소(GST)에 결합하는 칼럼(GST로 표지된 단백질에 선택적으로 결합하는 Glutathione SepharoseTM 레진과 같은) 그리고 Strep-Tag II에 결합하는 칼럼(Strep-Tag II으로 표지된 단백질에 선택적으로 결합하는 Strep-TactinTM Sepharose 레진과 같은). 게다가, 고형 상에 부착된 표적으로서 항체를 포함하는 면역친화성 매트릭스는 고형 상에 부착된 항체에 특이적으로 결합하는 관심 항원을 정제하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 관심이, 단백질 A 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제에 관련하여 특히 여기에서 설명되긴 하지만, 임의의 단백질이 특정 AC 매트릭스에 선택적으로 결합한다고 당업계에서 알려진 한에 있어서, 상기 단백질은 여기에 설명된 바와 같은 세척방법을 이용하여 정제할 수 있다.
본 발명의 세척용액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 아르기닌은 자연 아미노산 아르기닌(예를 들어, L-아르기닌), D-아르기닌 또는 아르기닌 유도체일 것이다. 아르기닌 유도체의 비-한정 예시는 아세틸 아르기닌 및 N-알파-부티로일-아르기닌, 아그마틴, 아르긴산 및 N-알파-피바로일 아르기닌과 같은 아실화 아르기닌을 포함한다. 아르기닌 또는 아르기닌 유도체는 산부가염(acid addition salt)의 형태로 이용될 수 있다. 산부가염을 형성할 수 있는 산의 예로 염산 등을 포함한다.
세척 용액 내 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 일반적으로 0.05M 내지 2.0M(예를 들어, 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 0.5M, 0.55M, 0.6M, 0.65M, 0.7M, 0.75M, 0.8M, 0.85M, 0.9M, 0.95M, 1.0M, 1.1M, 1.15M, 1.20M, 1.25M, 1.30M, 1.35M, 1.40M, 1.45M, 1.5M, 1.55M, 1.6M, 1.65M, 1.7M, 1.75M, 1.8M, 1.85M, 1.9M, 1.95M, 또는 2.0M), 더 바람직하게는 0.05 내지 0.85M(20℃의 물에서 아르기닌의 상층 용해도임) (예를 들어, 0.05M, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 0.5M, 0.55M, 0.6M, 0.65M, 0.7M, 0.75M, 0.8M, 또는 0.85M), 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.5M(예를 들어, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 또는 0.5M)이다. 다양한 실시양태에서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 예를 들어, 0.05M, 0.1M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M 또는 0.8M, 또는 0.1M 내지 0.5M이 될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세척 용액 내 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 농도는 0.25M 보다 크다. 상세한 실시양태에서, 아르기닌은 0.1M 또는 약 0.1M, 0.25M 또는 약 0.25M, 또는 0.5M 또는 약 0.5M의 농도에서 존재한다.
본 발명의 세척용액은 또한 위에서 설명된 바와 같은, 비완충 염을 포함하고, 이는 친화성 매트릭스의 하나 이상의 성분과 불순물 사이의 이온 상호작용을 깨는데 충분한 농도 및 유형을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 비완충 염은 할로겐 염이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 비완충 염은 염화나트륨(NaCl)이다. 다른 실시양태에서, 비완충 염은, 예를 들어, 염화칼륨(KCl), 염화칼슘(Ca2Cl) 또는 염화마그네슘(MgCl2)이 될 수 있다. 세척용액에서 비완충 염의 농도는 일반적으로 0.1M 내지 2.0M(예를 들어, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.25M, 0.3M, 0.35M, 0.4M, 0.45M, 0.5M, 0.55M, 0.6M, 0.65M, 0.7M, 0.75M, 0.8M, 0.85M, 0.9M, 0.95M, 1.0M, 1.1M, 1.15M, 1.20M, 1.25M, 1.30M, 1.35M, 1.40M, 1.45M, 1.5M, 1.55M, 1.6M, 1.65M, 1.7M, 1.75M, 1.8M, 1.85M, 1.9M, 1.95M, 또는 2.0M), 또는 0.5M 내지 1.5M(예를 들어, 0.5M, 0.55M, 0.6M, 0.65M, 0.7M, 0.75M, 0.8M, 0.85M, 0.9M, 0.95M, 1.0M, 1.1M, 1.15M, 1.2M, 1.25M, 1.3M, 1.35M, 1.4M, 1.45M, 또는 1.5M), 또는 1M 내지 2M(예를 들어, 1M, 1.1M, 1.15M, 1.2M, 1.25M, 1.3M, 1.35M, 1.4M, 1.45M, 1.5M, 1.55M, 1.6M, 1.65M, 1.7M, 1.75M, 1.8M, 1.85M, 1.9M, 1.95M, 또는 2.M)이다. 특정 실시양태에서, 세척용액 내 비완충 염의 농도는 1M 이거나 이보다 크다. 상세한 실시양태에서, 세척용액 내 비완충 염은 0.75M 또는 약 0.75M, 1.0M 또는 약 1.0M, 또는 1.25M 또는 약 1.25M의 농도에서 존재한다.
낮은 pH 또한 본 발명의 세척용액과 이용하는데 적당하지만 본 발명의 세척용액의 pH는 일반적으로 8.0보다 크다. 상세한 실시양태에서, pH는 8.0보다 크고, 바람직하게는 최소한 8.1, 더 바람직하게는 최소한 8.5 또는 8.9이다. 하나의 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 8.1-9.5의 범위 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 8.5-9.5의 범위 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 약 9.0이다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 세척용액의 pH는 9.0이다. 대안적으로, 정제되기 위한 관심 단백질에 따라서, 더 낮은 pH 값, 예를 들어, pH 5.0-8.0의 범위 내 pH, 또는 7.5 또는 7.0 또는 6.5 또는 5.0의 pH가 이용될 수 있다. 정제되기 위한 단백질의 성질에 따라서, 당업자는 세척용액에 대한 적합한 pH를 선택할 수 있다. 따라서, 세척용액은 pH의 조절 및/또는 유지를 위해 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 세척용액 내에 포함될 수 있는 일반적인 완충제의 비-한정 예시는 트리스(트리스(하이드록시메틸)메틸아민), 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 히스티딘, 트리에탄올아민, 디에탄올아민, 포름산염, 아세트산염, MES(2-(N-모폴리노)에탄설폰산), 인산염, HEPES(4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), 시트르산염, MOP(3-(N-모폴리노)프로판설폰산), TAPS(3-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 비신(N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), 트리신(N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), TES(2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), PIPES(피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), 카코딜산염(디메틸아르신 산) 및 SSC(살린 소듐 시트르산)를 포함한다.
본 명세서에서 설명된 아르기닌과 비완충 염의 세척조합은 바람직하게는 두 가지 모두의 성분을 포함한 단일 세척용액에서 적용된다. 대안적으로, 하나는 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 포함하고(바람직하게는 높은 pH에서), 다른 하나는 비완충 염을 포함하는 두 개의 세척용액은 협동 세척으로 이용될 수 있다. 따라서, 세척방법의 다른 실시양태에서, AC 매트릭스는 관심 단백질의 용출에 앞서, 첫 번째 세척용액과 두 번째 세척용액 등 두 가지 세척용액으로 세척된다. 하나의 실시양태에서, 첫 번째 세척용액은 아르기닌, 또는 아르기닌 유도체(바람직하게는 8.0보다 큰 pH에서)를 포함하고, 두 번째 세척용액은 비완충 염을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 첫 번째 세척용액은 비완충 염을 포함하고, 두 번째 세척용액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체(바람직하게는 8.0보다 큰 pH에서)를 포함한다. 세척용액에 대한 바람직한 농도, 농도범위 및 pH 조건뿐만 아니라 적합한 아르기닌 유도체 및 비완충 염의 예시도 위에 설명되었다.
본 발명의 세척방법은 고분자량(HMW) 종류 및 숙주세포 단백질(HCP)를 포함한 여러 가지 불순물의 제거에 있어 유용하다. 실시예에서 상세하게 설명된 바와 같이, 본 발명의 세척용액은 용출액에서 관심 단백질의 고수득률 및 고농도를 달성하면서, 용출액에서 HMW 종류 및 HCP 둘 모두를 감소시키는데 유효하다. 예를 들어, 여러 가지 실시양태에서, 여기에서 설명된 세척방법의 이용은 관심 단백질의 고수득률을 야기하고, 이는 95%보다 크고, 더 바람직하게는 96%보다 크고, 좀 더 바람직하게는 97%보다 크다. 용출액에서 % HMW로 표현될 수 있는, 용출액 내 HMW 종류의 감소에 대하여, 여러 가지 실시양태에서 여기에 설명된 세척방법의 이용은 용출액에서 10% 미만, 또는 5% 미만, 또는 2.0% 미만, 또는 1% 미만 또는 0.5% 미만인 % HMW를 야기한다. 로그 감소 값(LRV)으로 표현될 수 있는 용출액 내 HCP의 감소에 대하여, 여러 가지 실시양태에서, 여기에 설명된 세척방법의 이용은 용출액에서 최소한 1.1, 또는 최소한 1.3, 또는 최소한 1.5, 또한 최소한 2.0, 또한 최소한 2.3, 또는 최소한 2.5, 또는 최소한 2.7인 HCP에 대한 LRV를 야기한다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피 동안 세척단계에 대하여 여기에서 설명되지만, 당업자에게는 친화성 크로마토그래피 매트릭스에서 관심 단백질의 정제를 이루기 위해 세척단계 전 또는 후 둘 모두에서 추가적인 단계가 수행된다는 것이 쉽게 명확해질 것이다. 예를 들어, 세척단계에 앞서, 본 발명의 방법은 평형단계(여기서, 친화성 크로마토그래피 매트릭스는 로딩 완충제로 평형화된다), 및 로딩 또는 포획단계(여기서, 관심 단백질을 포함한 생화학적 혼합물(예를 들어, 세포 수확물)은 AC 매트릭스에 적용된다)를 포함할 수 있다. 평형상태에 적합한 조건 및 로딩 완충제는 AC 매트릭스의 성질 및 정제될 관심 단백질에 따라 다양할 것이고, 당업자는 당업계에서 잘 확립된 방법 및 정보를 이용하여 이러한 조건을 쉽게 결정할 수 있다. 단백질 A 칼럼 상 항체의 정제를 위한 평형상태 및 로딩 완충제의 비-한정 예시는 실시예 1과 2에 제시되어 있다. 게다가, 위에 언급한 대로 세척단계 후, 본 발명의 방법은 통상적인 세척용액을 활용한 하나 이상의 추가적인 세척단계, 및/또는 용출단계를 포함할 수 있으며, 여기서 용출 완충제는 매트릭스에서 관심 단백질을 용출하기 위해 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 적용된다. 용출 완충액에 대한 적합한 조건은 AC 매트릭스의 성질 및 정제될 관심 단백질에 따라 다양할 것이고, 당업자는 당업계에서 잘 확립된 방법 및 정보를 이용하여 이러한 조건을 쉽게 결정할 수 있다. 일반적으로, AC 매트릭스에서 관심 단백질의 용출은 산성 pH에서 수행된다. 단백질 A 칼럼 상에서 항체의 정제를 위한 용출 완충제의 비-한정 예시는 실시예 1과 2에 제시되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 항체의 단백질 A 동안 항체-포함 혼합물에서 불순물을 제거하기 위한 바람직한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 단백질 A 칼럼을 이용하여 정제된 항체, 또는 항체 단편의 생성방법을 제공하며, 이 방법은 다음을 포함한다:
(a) 단백질 A 칼럼 상에 항체, 또는 항체 단편을 포함하는 혼합물을 로딩;
(b) (i) 0.05-2.0M의 범위 내 농도(더 바람직하게는 0.05-0.85M의 범위 내, 가장 바람직하게는 0.1-0.5M의 범위 내에서)에서 아르기닌-HCl 및 (ii) 0.1-2.0M의 범위 내 농도에서, 염화나트륨을 포함한 세척용액으로 단백질 A 칼럼을 세척, 여기서 세척용액은 단백질 A 칼럼에서 불순물을 제거한다; 그리고
(c) 단백질 A 칼럼에서 항체, 또는 항체 단편을 용출.
바람직하게는 세척용액은 8.0보다 큰 pH에 있다. 아르기닌-HCl에 대한 바람직한 농도 및 농도 범위는 위에서 설명된 바와 같다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 아르기닌-HCl은 약 0.25M의 농도 또는 0.25M의 농도에 있다. 염화나트륨에 대한 바람직한 농도 및 농도 범위는 위에서 설명된 바와 같다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 염화나트륨은 약 1M의 농도 또는 1M의 농도에 있다. 바람직한 pH 및 pH 범위 또한 위에서 설명된 바와 같다. 예를 들어, 하나의 실시양태에서, 세척용액의 pH는 8.1-9.5의 범위 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 세척용액의 pH는 8.5 또는 이보다 크다. 또 다른 실시양태에서, 세척용액의 pH는 9.0이다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 더 설명되며, 이는 더 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 이 명세서의 전체에 걸쳐서 인용된 모든 참조, 특허 및 공개된 특허 출원의 내용은 전적으로 참조로서 여기에 명백하게 편입된다.
실시예 1 : 아르기닌/ 비완충 염 세척용액과 다른 세척용액의 비교
이 실시예에서, 친화성 크로마토그래피 동안 항체-포함 용액에서 불순물을 제거하기 위한 여러 가지의 세척용액의 효과가 비교된다. 더 특이적으로, 세 가지 세척용액이 비교된다: pH 5.0에서 아르기닌 및 비완충 염을 포함하지 않은 첫 번째, pH 7.0에서 비완충 염은 포함하지만 아르기닌은 포함하지 않은 두 번째, pH 9.0에서 비완충 염 및 아르기닌 둘 모두를 포함하는 세 번째.
1.5 내지 2.5g/L 항체를 포함하는 정제된, 포유류 세포 배양 상층액은 아래의 표 1에 설명된 조건에 따라 심층 여과에 의해 수확되고, ALC 칼럼, 특히 단백질 A 칼럼(GE Healthcare)을 이용하여 정제된다.
단백질 A 칼럼에 대한 작동 조건
단계 완충제 CV
** 		휴지시간 * (분)
평형상태 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0 6 4
로드(load) 세포 없는 수확물 q.s. 4
세척 1 가변(표 2 참조) 3 4
세척 2 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0 3 4
용출 20mM 아세트산 4 4
CIP 0.1M NaOH 3 4
저장 20mM 아세트산/아세트산나트륨, 2% 벤질알코올, pH 5.1 4 4
*휴지시간 = 잔류시간, **: CV, 칼럼 부피(column volume)
평형상태가 된 칼럼은 정제된 수확물로 로딩되고, 아래의 표 2에 설명된 바와 같이, 세척용액 1로 첫 번째 세척되며 뒤이어 세척용액 2(20mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0)로 두 번째 세척되고, 그 후 낮은 pH에서 용출된다. 용출액은 동일한 세포주 상에서 발달된, 분석적인 ALC에 의해 그것의 항체 농도에 대해, 분석적인 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)에 의해 HMW/LMW에 대해 그리고 효소-결합 면역흡착검사(enzyme-linked immunosorbent assay)에 의해 HCP 함유량에 대해 분석된다. 첫 번째 세척을 위해 비교한 여러 가지 세척용액이 아래 표 2에서 보여진다.
첫 번째 세척을 위한 여러 가지 세척용액
용액 완충제 완충제의 약어
1 20mM 아세트산 나트륨, 6mM 아세트산 pH 5.0 W1-A5
2 20mM NaH2PO4/Na2HPO4,1000mMNaCl,pH7.0 W2-N7
3 50mM 트리스, 250mM 아르기닌-HCl, 1M NaCl, NaOH*pH9.0 W3-Arg/N9
*32% NaOH 용액으로 조절된 pH
표 2에서 보여진 세 가지의 상이한 세척용액을 이용하여 네 가지의 상이한 단일클론 항체(mAb)의 단백질 A 정제에 대한 수득률이 아래의 표 3에서 보여진다.
다양한 세척용액을 이용한 상이한 항체의 수득률
세척용액
항체 W1 -A5 W2 - N7 W3 - Arg / N9
mAb-Qg 81.2 101.3 97.8
mAb-By 86.6 96.5 97.6
mAb-Bp 95.7 92.5 95.8
mAb-Va 96.5 97.9 98.6
표 3은 W1-A5(pH 5.0에서 비완충 염 또는 아르기닌을 포함하지 않음) 또는 W2-N7(pH 7.0에서 비완충 염은 포함하지만 아르기닌은 포함하지 않음) 중 하나로 세척하는 것은 정제되는 항체에 따라 회수되는 항체의 양에서의 변동을 야기한다는 것을 나타낸다. 더 특이적으로, W1-A5로의 세척은 81 내지 96%에서 변동하는 수득률을 야기하고, W2-N7으로의 세척은 92 내지 101%에서 변동하는 수득률을 야기한다. 대조적으로, pH 9.0에서 비완충 염 및 아르기닌 둘 모두를 포함하는 W3-Arg/N9로의 세척은 정제되는 네 가지의 모든 항체에 대해 96% 이상의 고수득률을 지속적으로 야기한다.
용출액 농도(g/L에서)는 표 2에서 보여진 세 가지의 상이한 세척용액을 이용하여, 네 가지의 상이한 mAb의 단백질 A 정제 후, 아래의 표 4에서 보여진다.
여러 가지 세척용액을 이용한 상이한 항체의 용출액 농도
세척용액
항체 W1 -A5 W2 - N7 W3 - Arg / N9
mAb-Qg 17.3 17.7 28.4
mAb-By 12.6 19.8 21.0
mAb-Bp 23.5 17.2 21.2
mAb-Va 15.1 14.3 16.4
표 4는 용출액 농도가 ALC 동안에 적용된 세척 완충제에 의해 또한 영향받는다는 것을 보인다. 네 가지 mAb 중 세 가지(mAb Qg, By 및 Va)에 대해, W3-Arg/N9로의 세척은 W1-A5 또는 W2-N7으로의 세척보다도 더 높은 용출액 농도를 야기한다. 네 가지 항체에 대한 평균 용출액 농도는 W1-A5 세척(17.1g/L) 후, 가장 낮았으며, W2-N7 세척(17.3g/L)이 그 뒤를 이었고, W3-Arg/N9(21.7 g/L)로의 세척 이후 가장 높았다.
표 2에서 보여진 세 가지의 상이한 세척용액을 이용하여, 네 가지의 상이한 mAb의 단백질 A 정제 후, 용출액 내 숙주세포 단백질(HCP)의 감소는 아래의 표 5에서 보여진다. HCP의 감소는 세포 수확물에서의 값에 대하여 로그 감소 값(LRV)으로 표현된다.
여러 가지 세척 용액을 이용하여 상이한 항체에 대한 용출액 내 HCP 의 감소
세척용액
항체 W1 -A5 W2 - N7 W3 - Arg / N9
mAb-Qg 1.50 1.64 2.75
mAb-By 1.40 1.68 2.15
mAb-Bp 1.77 1.88 2.53
mAb-Va 0.94 0.99 1.33
표 5의 자료에 기초하여, 불순물 제거에 대해, 세 가지 세척 완충제 사이의 명확한 순서가 확립될 수 있다. 가장 낮은 HCP 감소는 낮은 pH에서 W1-A5 세척, 뒤이어, 염과 W2-N7 세척으로 얻어졌고, 가장 높은 제거지수는 pH 9.0(W3-Arg/N9)에서 아르기닌-NaCl 조합 완충제로 얻어졌다. 제거의 로그 순서로 나타낸, 1.4 로그의 평균은 W1-A5로, 1.55 로그의 평균은 W2-N7으로 세척 후 얻어졌고 그리고 2.2 로그의 가장 높은 제거는 W3-Arg/N9로 얻어졌다.
표 2에서 보여진 세 가지의 상이한 세척용액을 이용하여 네 가지의 상이한 mAb의 단백질 A 정제 후 용출액 내 고분자량(HMW) 종류의 수준은 아래의 표 6에서 보여진다. 용출액 내 HMW 종류의 수준은 용출액 내 전체 단백질의 퍼센트(%)로 표현된다.
여러 가지 세척용액을 이용하여 상이한 항체에 대한 용출액 내 HMW 종류의 수준
세척용액
항체 W1 -A5 W2 - N7 W3-Arg/N9
mAb-Qg 4.7 3.8 0.8
mAb-By 2.1 0.7 0.4
mAb-Bp 10.4 10 9.8
mAb-Va 4.1 2.9 1.6
표 6은 HMW 종류의 수준이 네 가지의 상이한 mAb에 대해 매우 이종의 성분으로 되어있고 그리고 HMW의 제거가 mAb-의존적이라는 것을 보인다. 전반적으로, W1-A5 세척용액은 가장 적게 유효한 세척용액이다. 더 나은 결과는 W2-N7 세척용액으로 얻어졌고, ALC 용출액에서 가장 낮은 HMW 값은 지속적으로 W3-Arg/N9 세척용액으로 얻어졌다. 세 가지 mAb(mAb Qg, By 및 Va)은 W1-A5 세척 대 W3-Arg/N9 세척을 비교하면, HMW에서 2.6 내지 5.9-배 감소로 반응하는 반면에, mAb-Bp는 겨우 약간의 감소만을 보였다.
위의 표 3-6에서 요약된 실험에 대한 발견의 요약이 아래의 표 7에서 보여진다. 어두운 열은 수확물의 조성을 나타낸다.
<표 7>
네 가지 mAb 에 대한 세 가지 ALC 세척 용액의 비교
Figure 112012047676300-pct00001
농도 = 용출액 농도; HCP = 숙주세포 단백질; HMW = 고분자량 종류; LRV = 로그 감소 값; NA = 해당사항 없음(not applicable)
실시예 2 : 여러 가지 아르기닌/ 염 세척용액의 비교
이 실시예에서, 친화성 액체 크로마토그래피(ALC) 동안 불순물을 제거하기 위해, 상이한 pH 값에서 비완충 염 및/또는 아르기닌의 상이한 양을 포함하는 추가적인 세척용액의 효과가 비교된다. 이 실시예에서 이용된 크로마토그래피 조건이 아래의 표 8에서 같이 제시된다.
단백질 A 칼럼에 대한 작동 조건
단계 완충제 CV ** 휴지시간 * (분)
평형상태 1 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0 3 4
평형상태 2 세척 완충제 1과 동일 3 4
로드(load) 세포 없는 수확물 q.s. 4
세척 1 가변(표 9 참조) 6 4
세척 2 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7.0 3 4
용출 50mM 아세트산 5 4
CIP 0.1M NaOH 3 4
저장 20mM 아세트산/아세트산나트륨, 2% 벤질알코올, pH 5.1 5 4
*휴지시간 = 잔류시간, **: CV, 칼럼 부피(column volume)
이 실시예에서 비교된 세척용액은 아래의 표 9에서 제시된다:
첫 번째 세척을 위한 추가적인 여러 가지 세척용액
용액 완충제 완충제의 약어
1 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, pH 7.0 W2-N7
2 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 150mM NaCl, pH 7.0 W4-0.15M N7
3 250mM 아르기닌-HCl, ~18*mM 트리스-HCl, pH 8.0 W5-Arg8
4 ~18*mM 트리스-HCl, 250mM 아르기닌-HCl, 1M NaCl, pH 8.0 W6-Arg/N8
*정확한 농도는 측정되지 않았다(1M 트리스 염기[(하이드록시메틸)아미노메탄]는 pH를 조절하기 위해 이용되었다
표 9에서 보여진 네 가지 세척용액은 염기성 pH(W6-Arg/N8)에서 아르기닌과 비완충 염의 조합을 포함한 용액에 pH 8.0(W5-Arg8)에서 아르기닌을 단독으로 포함한 세척용액의 비교뿐만 아니라 고 비완충염 세척용액(W2-N7, 1M NaCl를 포함)에 저 비완충 염 세척용액(W4-0.15M N7, 150mM NaCl를 포함)의 직접적인 비교를 허용한다.
고 염분 단독 세척(W2-N7)과 아르기닌 단독 세척(W5-Arg8)의 조합뿐만 아니라, 표 9에서 보여진 네 가지의 상이한 세척용액을 이용하여, 수득률, 용출액 내 HMW 종류의 퍼센트, 및 mAb-By의 정제에 대한 HCP(LRV로 표현)에서의 감소가 아래의 표 10에서 보여진다.
여러 가지 세척용액을 이용한 mAb - By 에 대한 정제 값
세척용액
정제 값 W4 -0.15M N7 W2 - N7 LW * W5 - Arg8 W5 - Arg8 , W2 - N7 W6 - Arg / N8
수득률(%) 98.4 100 99.3 97.4 97.9
HMW(%) 1.6 0.9 0.5 0.3 0.3
HCP(LRV) 1.81 2.19 2.35 2.57 2.7
*LW = 세척은 칼럼 부피 6 대신 칼럼 부피 12에 대해 수행되었다.
표 10은 모든 세척조건에 대해 항체의 수득률이 97% 이상으로 남아있다는 것을 보인다. 게다가, HMW 및 HCP 둘 모두와 같은 불순물의 제거를 위한 가장 유효한 세척용액은 염기성 pH에서 아르기닌 및 고 비완충 염 둘 모두를 포함한 세척용액(W6-Arg/N8) 또는 염기성 pH에서 아르기닌(W5-Arg8) 및 고 비완충 염(W2-N7)을 포함한 세척용액의 조합된 용도이다.
상당한 생리학적인 세척용액, W4-0.15M N7로의 세척은 칼럼 상에 로딩된 개시 물질과 비교하여 HCP를 64-배(1.81 로그) 감소시킨다. 대조적으로, pH 8(W6-Arg/N8)에서 비완충 염-아르기닌 조합으로의 세척은 498-배(2.7 로그)만큼의 감소를 야기한다.
HMW의 감소는 유사한 경향을 따른다. pH 7.0에서 20mM 인산 나트륨, 150mM NaCl을 포함한 세척용액(W4-0.15M N7)으로의 세척은 용출액에서 1.6% HMW를 야기하고, 반면에, 비완충 염-아르기닌 조합(W6-Arg/N8)으로의 세척은 이 값을 5-배 이상 감소시킨다.
실시예 3 : 세척용액 내에서 염기성 pH 와 생리학적 pH 의 비교
이 실시예에서, HCP 및 HMW의 제거에서 세척용액의 매개변수로서 pH의 분석이 수행되고, 이 분석은 염기성 pH 조건의 우세를 보여준다. 실시예 2의 표 8에서 제시한 조건을 이용한 친화성 액체 크로마토그래피(ALC)는 HMW 및 HCP의 약간 상이한 수준으로 mAb-Va의 세포 수확물에서 수행된다.
이 실시예서 비교된 세척용액은 아래의 표 11에서 제시된다:
첫 번째 세척( mAb - Va 으로)을 위한 여러 가지 pH 값을 갖는 세척용액
용액 완충제 완충제의 약어
1 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, pH 7.0 W2-N7
2 13.2mM NaH2PO4, 250mM 아르기닌 HCl, 1M NaCl, pH 7.0 W6-Arg/N7
3 ~298mM *트리스, 250mM 아르기닌-HCl, 1M NaCl, pH 8.9 W3b-Arg/N8.9
*NaOH 부재는 pH 조절을 위해 이용되었다.
표 11에서 보여진 세 가지의 상이한 세척용액을 이용한, 수득률, 용출액 내 HMW 종류의 퍼센트, 및 mAb-Va의 정제에 대한 HCP(LRV로 표현)에서의 감소가 아래의 표 12에서 보여진다.
mAb - Va 에 대한 정제 값에서 생리학적 pH 와 염기성 pH 의 비교
세척용액
정제 값 W2-N7 W6-Arg/N7 W3b-Arg/N8.9
수득률(%) 100.5 99.4 99
HMW(%) 2.4 1.6 1.4
HCP(LRV) 0.87 1.48 1.61
고 비완충 염 단독 세척용액, W2-N7은 대략 생리학적 pH 7.0(W6-Arg/N7 세척용액) 및 염기성 pH 8.9(W3b-Arg/N8.9 세척용액)에서 아르기닌/비완충 염 조합의 HCP/HMW 제거능력을 확립하기 위한 기준 조절세척으로서 작용한다. 적지만 주목할 만한 1.6 내지 1.4%의 HMW 수준의 감소는 낮은 pH(pH 7.0)과 비교하여 높은 pH(pH 8.9)에서 관찰된다. 더 분명한 것은 HCP 제거에서의 효과이다. 여기서, 낮은 pH 세척(pH 7.0)은 HCP를 1.48 로그 감소시키고, 반면에 높은 pH 세척(pH 8.9)은 값을 1.61 로그 감소시키는데, 이것은 불순물 제거 능력에서 높은 pH 세척의 우세를 강조한다.
실시예 4 : 아르기닌/ 염 세척용액과 다른 세척용액의 비교
이 실시예에서, Tween 80, 아르기닌 이외의 아미노산 또는 고농도의 트리스를 포함한 다른 세척용액은 아르기닌/비완충 염 세척용액과 비교되었다. 이 실시예에서, HCP 및 HMW의 제거에서 세척용액의 매개변수로서 pH의 분석이 수행되고, 이 분석은 염기성 pH 조건의 우세를 보여준다. 실시예 1의 표 1에서 제시한 조건을 이용한 친화성 액체 크로마토그래피(ALC)는 HMW 및 HCP의 약간 상이한 수준으로 mAb-Va의 세포 수확물에서 수행된다.
이 실시예서 비교된 세척용액은 아래의 표 13에서 제시된다:
첫 번째 세척을 위한 여러 가지 성분을 갖는 세척용액
용액 완충제 완충제의 약어
1 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, pH 7.0 W2-N7
2 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, pH 7.0 W2-N7 LW*
3 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, 0.1%(w/v) Tween 80, pH 7.0 W7-N7-T80
4 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, 0.1M 글리신, 트리스** W8-N7-0.1 M G
5 500mM 트리스, pH 8.9 W9-0.5 M Tris 8.9 LW*
6 289mM 트리스, 250mM dkfmrlsls-HCl, 1M NaCl, pH 8.9 W3b-Arg/N8.9
*LW = 세척은 칼럼 부피 6 대신 칼럼 부피 12에 대해 수행되었다. **pH는 1M 고정용액으로 조절하였다. 농도는 측정되지 않았다.
표 13에서 보여진 여섯 가지의 상이한 세척용액을 이용한, 수득률, 용출액 내 HMW 종류의 퍼센트, 및 mAb-By의 정제에 대한 HCP(LRV로 표현)에서의 감소가 아래의 표 14에서 보여진다.
mAb - Va 에 대한 정제 값에서 세척용액 성분의 비교
세척용액
정제 값 W2 - N7 W2 - N7 LW * W7 - N7 - T80 W8 - N7 -0.1 M G W9 -0.5 M Tris 8.9 LW * W3b - Arg / N8 .9
수득률(%) 100.5 100.9 99 98.7 98.1 99
HMW(%) 2.4 2.3 2.5 3.1 3 1.4
HCP(LRV) 0.87 1.42 1.34 1.24 1.07 1.61
*LW = 세척은 칼럼 부피 6 대신 칼럼 부피 12에 대해 수행되었다.
표 14는 높은 pH(W3b-Arg/N8.9)에서 아르기닌/비완충 염 세척용액이, 고 비완충 염 단독(W3b-Arg/N8.9), Tween 80(W7--N7-T80), 글리신과 같은 다른 아미노산(W8-N7-0.1 MG) 또는 고농도의 트리스(W9-0.5M Tris 8.9 LW)를 포함한 다른 세척용액과 비교하여, HMW 및 HCP 둘 모두를 제거하는데 가장 유효한 세척용액이라는 것을 보인다.
실시예 5 : 낮은 pH 및 높은 pH 에서의 염 단독과 높은 pH 에서의 아르기닌/ 비 완충 염 세척용액의 비교
이 실시예에서, 높은 pH에서 아르기닌/비완충 염 세척용액의 효과는 높은 pH 및 낮은 pH에서 비완충 염 용액과 비교되었다. 특이적으로, 다음의 조건이 평가 및 비교되었다: (1) 낮은 pH(가령, 7.0)에서 비완충 염 세척용액, (2) 높은 pH(가령, 9.0)에서 비완충 염 세척용액, 및 (3) 높은 pH(가령, 9.0)에서 아르기닌과의 조합으로 비완충 염 세척용액. 게다가, HMW, LMW 및 HCP의 제거에서 아르기닌의 효과는 분석되고, 그리고 염기성 pH 조건에서 아르기닌과의 조합으로 비완충 염 세척용액의 이용이 특히 유효하고 이롭다는 것을 나타낸다. 이 실시예에서 비교된 세척용액은 아래의 표 15에서 제시된다.
첫 번째 세척을 위한 여러 가지 성분을 갖는 세척용액
용액 완충제 완충제의 약어
1 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, pH 7.0 W2-N7
2 20mM NaH2PO4/Na2HPO4, 1000mM NaCl, NaOH, pH 9.0* W10-N9
3 50mM 트리스, 250mM 아르기닌-HCl, 1M NaCl, NaOH, pH 9.0* W3b-Arg/N9
*, pH는 NaOH의 32% 고정액으로 9.0로 조절한다.
실시예 1에서, 표 1에 제시된 조건을 이용한 친화성 액체 크로마토그래피(ALC)는 아래의 표 16에서 상술된 바와 같이, 최소의 변화로 HMW 및 HCP의 상이한 수준을 이용하여, mAb-By의 세포 수확물에서 수행된다.
단백질 A 칼럼에 대한 작동 조건
단계 완충제 CV 휴지시간 (분) ** 주석
평형상태 20mM NaH2-/Na2H-PO4, pH 7.0 5/6* 4
로드(load) 세포 없는 수확물 4 36mg/ml 레진
세척 1 표 15 참조 6 4
세척 2 EQ 3 4
용출 20mM 아세트산, pH tq** 5/4* 4 280nm에서 100-100 mAU
CIP 0.1M NaOH 4 4
저장 20mM Na-아세테이트, 2% 벤질알코올, pH 5.1 5/4* 4
*, 세척용액 W3-Arg/N9로 실행하기 위해, 6 CV는 평형상태를 위해 이용되었고, 4 CV는 용출 및 저장을 위해 이용되었다. **,휴지시간 = 잔류시간. ***, tq = tel quel (있는 그대로)
(1) SEC-파생된 항체 농도(g/L), (2) HMW 및 LMW 종류의 퍼센트, (3) ng/mg 단일클론 항체에서 표현되는 HCP 수준, 그리고 (4) ALC 용출액에서 ALC-파생된 수득률의 매개변수는 표 15에서 보여진 세 가지의 상이한 세척용액을 이용한 mAb-By의 정제에 대해 측정되었다. 그 결과는 아래의 표 17에서 보여진다.
mAb - By 에 대한 정제 값에서 세척용액 성분의 비교
세척용액 농도(g/L) HMW (%) LMW (%) HCP( ng / mg MAb ) 수득률(%)
개시물질 2.32 NA NA 370962 (100)
W2-N7 20.00/19.84* 1.3/0.9* 0.4/0.4* 9315/6783* 100.8/ND*
W10-N9 20.28/20.10* 1.2/1.0* 0.5/0.5* 8984/7884* 101.9/ND*
W3-Arg/N9 20.55 0.8 0.1 2110 100.3/ND*
*, 두 번째 값은 0.2μm 여과기를 통한 여과 후 두 번째 측정과 일치한다.
특이적으로, 표 17은 9.0의 높은 pH에서 아르기닌/비완충 염 세척용액(W3-Arg/N9)이 비완충 염 단독(W2-N7 및 W10-N9)을 포함한 다른 세척용액과 비교하여, 그들의 pH에 독립적으로 LMW 및 HCP 제거를 위해 가장 유효한 세척용액이라는 것을 보인다. 특히, 9.0의 pH에서 아르기닌/비완충 염 세척용액으로의 세척은 pH 7(W2-N7) 또는 pH 9(W10-N9)에서 비완충 염 단독으로의 세척을 비교하여, HCP를 최소한 3-배 및 LMW를 최소한 4-배 감소시켰다.
실시예 6 : 아르기닌/염 세척용액에 대한 아르기닌 및 NaCl 농도 및 pH 의 범위의 비교
이 실시예에서, 추가적인 아르기닌 및 비-완충 염 농도 및 pH 세척 조건은 친화성 액체 크로마토그래피(ALC) 동안 불순물 제거에 있어 그들의 효과를 결정하기 위해 조사된다. 이 실시예에서 비교된 세척용액은 아래의 표 18에서 제시된다:
첫 번째 세척을 위한 여러 가지 성분을 갖는 세척용액
세척용액 완충제 완충제의 약어
1 0.75M NaCl, 250mM L-아르기닌/트리스 pH 8.5* W11-Arg/N8.5
2 1.25M NaCl, 250mM L-아르기닌/트리스 pH 9.5* W12-Arg/N9.5
3 50mM 트리스, 500mM 아르기닌-HCl, 1M NaCl, NaOH, pH 9.0* W13-Arg/N9
4 10mM 트리스, 100mM 아르기닌-HCl, 1M NaCl, NaOH, pH 9.0* W14-Arg/N9**
*, 8M NaOH로 조정된 pH; **, W13-Arg/N9의 5-배 희석 및 8M NaOH로 9.0까지 pH 조절을 통해 얻은 완충제
ALC는 아래의 표 19에서 상술된 바와 같이, 최소의 변화로 HMW 및 HCP의 약간 상이한 수준을 이용하여, mAb-By(실시예 1의 표 1에서 제시된 조건 하에)의 세포 수확물에서 수행된다.
단백질 A 칼럼에 대한 작동 조건(휴지시간 4분에서) +
단계 완충제 CV 주석
평형상태 20mM NaH2-/Na2H-PO4, pH 7.0 6
로드(load) 세포 없는 수확물 38mg/ml 레진
세척 1 표 18 참조 4.5*/7.5**/6***
세척 2 EQ 3
용출 50mM 아세트산, pH 3.5*/**/ ***또는 50mM 아세트산, pH 3.8****/***** 4/6*** 280mm에서 500-500mAU/cm
CIP 0.1M NaOH 4/3**** 상향류
저장 20mM Na-아세이트, 2% 벤질알코올, pH 5.1 4 상향류
*, 세척용액 W11-Arg/N8.5로 실행의 경우; **, 세척용액 W12-Arg/N9.5로 실행의 경우; ***, 1M 트리스로 조정된 pH; ****, 세척용액 W13-Arg/N9 및 W14-Arg/N9로 실행의 경우; *****, 8M NaOH로 조정된 pH. +휴지시간 = 잔류시간.
(1) SEC-파생된 항체 농도(g/L), (2) HMW 및 LMW 종류 퍼센트(%), (3) ng/mg 단일클론 항체에서 표현되는 HCP 수준, 그리고 (4) ALC 용출액에서 ALC-파생된 수득률의 매개변수는 표 18에서 보여진 두 가지의 상이한 세척용액 중 하나를 이용한 mAb-By의 정제 후 측정되었다. 이것의 결과는 아래의 표 20에서 보여진다.
mAb - By 의 정제를 위한 상이한 NaCl 농도 및 pH 수준에서 세척 완충제의 유효성(두 가지의 상이한 개시물질)
적용된 세척용액 농도(mg/ml)(SEC) HMW(%) LMW(%) HCP(ng/mg) 수득률(ALC)(%)
개시물질 2.6 NA NA 602398 (100)
W12-Arg/N9.5 27.35 2.1 0.3 4637 100.4
W11-Arg/N8.5 22.42 2.1 0.5 9922 100.2
개시물질 2.91 NA NA 311761 (100)
W13-Arg/N9 16.15 1.7 0.1 1367 98.7
W14-Arg/N9 16.31 1.7 0.1 3405 95.9
표 20에서 보여진 자료는 친화성 액체 크로마토그래피에 대한 용도를 위해, 높은 pH에서 아르기닌/비완충 염 세척용액의 유효성을 강조한다. (1) pH 8.5에서 낮은 농도의 비완충 염(0.75M NaCl) 및 아르기닌, (2) pH 9.5에서 높은 농도의 비완충 염(1.25M NaCl) 및 아르기닌 또는 (3) 낮은(예를 들어, 100mM) 또는 높은(예를 들어, 500mM) 농도의 아르기닌으로 세척은 수득률의 손상 없이, HCP의 강한 감소(평균 >2 로그 감소)를 야기한다.

Claims (16)

  1. (a) 친화성 크로마토그래피(AC) 매트릭스 상에 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질을 포함하는 혼합물을 로딩하는 단계; 및
    (b) 적어도 하나는 (i) 아르기닌 또는 아르기닌 유도체 및 (ii) 0.1-2.0M의 농도 범위의 비완충 염 둘 다를 포함하는, 하나 이상의 세척 용액으로 AC 매트릭스를 세척한 후, AC 매트릭스에서 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질을 용출하며, 여기서 세척 pH가 8.5-9.5의 범위 내에 있는 것인 단계
    를 포함하는, 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질이 결합된 AC 매트릭스를 이용하여, 정제된 항체, 항체 단편 또는 Fc 융합 단백질을 생성하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, AC 매트릭스가 단백질 A 칼럼인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세척이 AC 매트릭스에서 불순물을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기닌이 0.25M의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기닌이 아르기닌-HCl인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비완충 염이 1M의 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비완충 염이 염화나트륨(NaCl)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세척 pH가 9.0인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제3항에 있어서, 불순물이 고분자량(HMW) 종류를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제3항에 있어서, 불순물이 숙주세포 단백질(HCP)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기닌 또는 아르기닌 유도체가 0.05-0.85M의 범위 내 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 비완충 염이 0.5-2.0M의 범위 내 농도인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, AC 매트릭스가 단백질 A 칼럼, 단백질 G 칼럼, 단백질 A/G 칼럼 또는 단백질 L 칼럼인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 아르기닌 유도체가 아세틸 아르기닌, N-알파-부티로일-아르기닌, 아그마틴, 아르긴산 및 N-알파-피바로일 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
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