CN101511859A - TGF-β超家族的蛋白质和肽用于纯化和治疗方法的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了采用TGF－β超家族成员和基于所述成员蛋白质的肽片断来纯化包含成员蛋白质的溶液的用途，和作为治疗剂的用途。

Description

TGF-β超家族的蛋白质和肽用于纯化和治疗方法的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年6月2日递交的美国临时专利申请号60/810,798的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及TGF-β超家族的肽和蛋白质及其突变体的用途。
发明背景
细胞生长、分化和功能的天然调控因子为治疗干预提供了重要的药物、临床和实验工具、以及靶标。多种这样的调控因子已显示对基础的细胞分化和发育途径有着深远影响。转化生长因子β(TGF-β)超家族是多功能蛋白质的大家族，所述多功能蛋白质调控多种细胞功能，包括细胞增殖、迁移、分化和凋亡。基本成员TGF-β，已显示在从胚胎模式形成到成体组织的细胞生长调控中起多种作用。TGF-β通过信号传导级联最终激活和/或抑制特定基因集合来行使其生物功能。其它TGF-β超家族成员包括TGF-β家族、生长分化因子(GDF)、激活素、抑制素、骨形态发生蛋白(BMP)和其它相关的配体。BMP介导的信号传导对于多种正常过程包括骨骼的生长以及神经系统、眼和器官如肾的功能均很重要。BMP在不同生物环境中有不同的生物活性，包括对软骨、骨胳和结缔组织的诱导作用，以及在肾、牙齿、肠、皮肤和毛发发育中的作用。
BMP可在实验室中制备，但是纯化这些物质便利方法很少，纯化方法的研发常常特别耗时，纯化过程有时需要长达6个月的时间来研发。因此期望有更有效的方法来纯化BMP和TGF-β超家族的其它成员。
定义
如在本文和随附的权利要求书中所使用的那样，除非上下文中另有清楚表明，否则单数形式“一个/一种”和“所述”包括复数含义。因此，例如提到“一个/一种细胞”包括多个/多种这样的细胞，提到“一个/一种抗体”指一个/一种或多个/多种抗体和本领域技术人员公知的其等同物，等等。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”和“寡核苷酸”指DNA和RNA中的一串核苷酸碱基(也称“核苷酸”)，意指具有两个或多个核苷酸的任意链。多核苷酸可为嵌合混合物或衍生物或其修饰形式，可为单链或双链。寡核苷酸可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架上被修饰，例如用以改善分子的稳定性、杂交参数等。反义寡核苷酸可包含修饰的碱基部分，其选自包括但不限于下列物质的组：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖Q核苷(β-D-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2--二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖Q核苷(β-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-巯基胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。核苷酸序列通常携带遗传信息，包括细胞机器用来制造蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链基因组DNA和cDNA、RNA、任何合成和基因改造的(genetically manipulated)多核苷酸、有义多核苷酸和反义多核苷酸两者。这包括单链和双链分子，即DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA杂合体，碱基和氨基酸骨架缀合形成的“蛋白质核酸”(PNA)。这还包括包含修饰碱基的核酸，例如硫尿嘧啶、硫鸟嘌呤和氟尿嘧啶，或包含糖或脂的核酸。
本发明的实施方案所使用的多核苷酸可用本领域已知的标准方法合成，例如通过使用DNA自动合成仪(如由商业途径购自生物技术公司(Biosearch)、应用生物系统公司(Applied Biosystems)等)合成。作为例子，硫代磷酸寡核苷酸可用Stein等人，Nucl.Acids Res.，16，3209，(1988)的方法合成，甲基膦酸酯寡核苷酸可通过使用可控多孔玻璃聚合物支持物(controlled pore glass polymer support)(Sarin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7448-7451，(1988)制备，等等。已研发出许多方法将反义DNA或RNA递送至细胞内，例如可直接将反义分子注射进入组织位点，或可全身给药设计为靶向期望细胞的经修饰的反义分子(反义分子与肽或抗体连接，所述肽或抗体与靶细胞表面表达的受体或抗原特异性结合)。可选地，RNA分子可通过体外和体内转录编码反义RNA分子的DNA序列产生。这样的DNA序列可掺入多种载体中，其中载体并入适合的RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子。可选地，取决于所使用的启动子组成型或诱导型合成反义RNA的反义cDNA构建体可稳定地引入细胞系中。但是，细胞内的反义分子通常难以达到足以抑制内源mRNA翻译的浓度。因此优选使用重组DNA构建体的方法，其中反义寡核苷酸处于强启动子的控制下。使用这样的构建体转染患者体中的靶细胞，能转录足量的单链RNA，与内源靶基因转录物形成互补碱基对，从而防止靶基因mRNA的翻译。例如，可体内引入载体，从而被细胞摄入，指导反义RNA的转录。只要能够转录以产生期望的反义RNA，这样的载体可以保持游离或整合在染色体中。这样的载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可为质粒、病毒、或本领域已知的用于在哺乳动物细胞中复制和表达的其它载体。编码反义RNA的序列可使用本领域已知在哺乳动物优选人细胞中起作用的任何启动子进行表达。这样启动子可为诱导型或组成型。这样的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，Nature，290，304-310，(1981))、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)3’长末端重复中包含的启动子(Yamamoto等人，Cell，22，787-797，(1980))、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，1441-1445，(1981))、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，Nature296，39-42，(1982))等。可使用任何类型的质粒、粘粒、酵母人工染色体或病毒载体，来制备能直接引入组织位点的重组DNA构建体。可选地，可使用选择性感染期望组织的病毒载体，在这种情况下，给药可以通过另一途径实现(例如，全身给药)。
多核苷酸可以侧接天然调控(表达控制)序列，或可以与异源序列相连，包括启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其它核糖体结合位点序列、增强子、反应元件、抑制基因、信号序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、5’-和3’-非编码区等。还可用本领域已知的许多方法修饰核酸。这样的修饰的非限制性例子包括甲基化、加帽(“caps”)、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、以及核苷酸间修饰例如，不带电的核苷酸间键合(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等)和带电的核苷酸间键合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。多核苷酸可包含一个或多个另外的共价连接的部分，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚左旋赖氨酸等)、嵌合剂(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如，金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂。多核苷酸可通过形成甲基磷酸三酯或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酰胺酯连接而衍生。此外，本文的多核苷酸还可用能够提供可直接或间接检测的信号的标记修饰。例示性标记包括放射性同位素、荧光分子、生物素等。
如本领域公知的那样，“同一性”或“相似性”是通过序列对比测定的、两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。本领域中，同一性还指由这样的序列串之间的匹配测定的、多肽序列之间的相关程度。同一性和相似性均可由已知方法容易地计算，如在下列文献中描述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，学术出版社，1987；Computer Analysis of Sequence Data，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，Humana出版社，新泽西，1994和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编，斯托克顿出版社(M Stockton Press)，纽约，1991。通常用来测定序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM JApplied Math.，48：1073(1988)公开的方法。测定同一性和相似性的方法编码在公众可得的计算机程序中。测定两个序列之间同一性和相似性的优选计算机程序包括但不限于，GCG程序包，Devereux，J.等人，Nucleic AcidsResearch，12(1)，387(1984))，BLASTP，BLASTN，和FASTA Atschul，S.F.等人，J Molec.Biol.，215，403(1990))。
“同源”指两种聚合物(即多肽分子或核酸分子)之间的序列相似性程度。本文中所指的同源性百分比数字反映两种聚合物之间的最大可能同源性，即两种聚合物以具有最多数量的匹配(同源)位置进行比对时的同源性百分比。
术语“同源性百分比”指多肽之间氨基酸的序列同一性程度。任意两种多肽之间的同源性是在任一序列中给定位置匹配的氨基酸总数的直接函数，例如，如果任一序列中氨基酸总数的一半相同，则认为两个序列显示50％同源性。
术语“片断”、“类似物”和“衍生物”指多肽时，指的是可能保留了与原始多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。因此，类似物可包括前体蛋白，能通过切割前体蛋白部分而活化，产生活性成熟多肽。多肽的片断、类似物或衍生物可为：其中一个或多个氨基酸被保守或非保守氨基酸残基所取代，这样的氨基酸残基可由遗传密码编码或不由遗传密码编码；或其中一个或多个氨基酸残基包括取代基；或其中多肽与化合物如聚乙二醇融合，以延长多肽的半衰期；或其中另外的氨基酸与多肽融合，如信号肽或序列如多聚组氨酸标签，用于纯化多肽或前体蛋白。认为这样的片断、类似物或衍生物落入本发明的范围内。
术语“多肽”指氨基酸聚合物，不考虑聚合物的长度；因此，“肽”、“寡肽”和“蛋白质”涵盖在多肽的定义中，在本文中可互换使用。尽管作为具体实施方案可能包括或排除这些多肽的化学或表达后修饰，但此术语并不指定或排除本发明多肽的化学或表达后修饰。因此，例如，术语多肽清楚地涵盖对多肽的修饰，包括共价附着糖基、乙酰基、磷酸基、脂基等。此外，具有这些修饰的多肽可能被指定为个别种类，包括在本发明中或排除在其外。天然或其它化学修饰，如上述例子中所列举的那些，可发生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。应意识到相同类型的修饰可在给定多肽的数个位点以同样或变化的程度出现。同样，给定多肽可包含多种类型的修饰。多肽可以分枝，例如由于泛素化作用分枝；多肽可为环状，有分枝或没有分枝。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附着黄素、共价附着血红素部分、共价附着核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着脂或脂衍生物、共价附着磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化作用、糖基化、形成糖基化磷脂酰肌醇锚点(GPI anchor)、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的在蛋白质上添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化(参见例如，proteins—structure and molecular properties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company出版公司，纽约(1993)；posttranslational covalent modification of proteins，b.c.Johnson编，学术出版社，纽约，第1-12页，1983；Seifter等人，Meth Enzymol 182：626-646，1990；Rattan等人，Ann NY Acad Sci 663：48-62，1992)。涵盖在该定义中的还有包含氨基酸的一种或多种类似物的多肽(包括例如，非天然存在的氨基酸、仅在不相关的生物系统中天然存在的氨基酸、来自哺乳动物系统的修饰的氨基酸、多种氨基酸的立体异构体等)，具有取代的连接的多肽，以及具有其它本领域已知的、天然存在和非天然存在的修饰的多肽。术语“多肽”还可与术语“蛋白”或“肽”交换使用。
术语“指状结构-1肽类似物”指与TGF-β超家族成员的指状结构-1区部分至少75％同源的寡肽。在一些实施方案中，指状结构-1肽类似物与野生型序列至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％同源。在某些实施方案中，寡肽包括至少8个氨基酸残基，至少16个氨基酸残基，或至少24个氨基酸残基。指状结构-1肽类似物可为突变体，其中一个或多个氨基酸经改变或缺失，可包括非天然或修饰的氨基酸残基。
术语“肽”指两个或多个氨基酸的任意聚合物，其中各氨基酸通过相邻氨基酸的NH2和COOH基团之间形成的肽键(--CONH--)与一个或两个另外的氨基酸连接。在一个实施方案中，氨基酸为天然存在的氨基酸，特别是L-对映体形式的α-氨基酸。但是，肽中可包括其它氨基酸、对映体形式和氨基酸衍生物。肽包括“多肽”，其在水解时产生多于两个氨基酸。多肽可包括蛋白质，其通常包含50个或更多氨基酸。
根据本发明实施方案的多肽可以以分离形式提供，可纯化至同质性。某些情况中的多肽和多核苷酸为至少90％纯，至少95％纯，至少98％纯，或至少99％纯。
术语“多肽”指氨基酸聚合物，不考虑聚合物的长度；因此，“肽”、“寡肽”和“蛋白质”涵盖在多肽的定义中，在本文中可互换使用。尽管作为具体实施方案可能包括或排除这些多肽的化学或表达后修饰，但此术语并不指定或排除本发明多肽的化学或表达后修饰。因此，例如，术语多肽清楚地涵盖对多肽的修饰，包括共价附着糖基、乙酰基、磷酸基、脂基等。此外，具有这些修饰的多肽可能被指定为个别种类，包括在本发明中或排除在其外。天然或其它化学修饰，如上述例子中所列举的那些，可发生在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。应意识到相同类型的修饰可在给定多肽的数个位点以同样或变化的程度出现。同样，给定多肽可包含多种类型的修饰。多肽可以分枝，例如由于泛素化作用分枝；多肽可为环状，有分枝或没有分枝。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价附着黄素、共价附着血红素部分、共价附着核苷酸或核苷酸衍生物、共价附着脂或脂衍生物、共价附着磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化作用、糖基化、形成糖基化磷脂酰肌醇锚点(GPI anchor)、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的在蛋白质上添加氨基酸，如精氨酰化和泛素化。(参见例如，proteins—structure and molecular properties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company出版公司，纽约(1993)；posttranslational covalent modification of proteins，b.c.Johnson，编，学术出版社，纽约，第1-12页，1983；Seifter等人，Meth Enzymol 182：626-646，1990；Rattan等人，Ann NY Acad Sci 663：48-62，1992)。涵盖在该定义中的还有包含氨基酸的一种或多种类似物的多肽(包括例如，非天然存在的氨基酸、仅在不相关的生物系统中天然存在的氨基酸、来自哺乳动物系统的修饰的氨基酸等)，具有取代的连接的多肽，以及具有其它本领域已知的、天然存在和非天然存在的修饰的多肽。术语“多肽”还可与术语“蛋白”或“肽”交换使用。
术语“肽”指两个或多个氨基酸的任意聚合物，其中各氨基酸通过相邻氨基酸的NH2和COOH基团之间形成的肽键(--CONH--)与一个或两个另外的氨基酸连接。优选氨基酸为天然存在的氨基酸，特别是L-对映体形式的α-氨基酸。但是，肽中可包括其它氨基酸、对映体形式和氨基酸衍生物。肽包括“多肽”，其在水解时产生多于两个氨基酸。多肽可包括蛋白质，其通常包含50个或更多氨基酸。
术语“分离的”指将物质从其原始或自然环境(例如天然环境，如果其为天然存在的)中取出。因此，活体动物中具有的天然存在的多肽不是分离的，但同一多肽通过人为干预与天然系统的一些或所有共存物质分开后，则是分离的。多肽可以是组合物的一部分，而仍是分离的，因为这样的载体或组合物不是其在自然中所存在的环境的一部分。相似地，术语“基本上纯的”指通过人为干预，从其天然存在的当前化学环境中分离或取出的物质。基本上化的多肽可通过本领域众所周知的许多技术和方法中的任意技术和方法获得或制备。
术语“纯化”指增加样品中特定多肽的比活或浓度。在一个实施方案中，比活表达为样品中靶多肽的活性与总多肽浓度的比值。在另一实施方案中，比活表达为靶多肽的浓度与总多肽浓度的比值。纯化方法包括但不限于透析、离心和柱层析技术，为本领域技术人员熟知的方法。参见例如，Young等人，1997，“Production of biopharmaceutical proteins in the milkof transgenic dairy animals，”BioPharm 10(6)：34-38。
“与...缔合”：如本文中所描述的那样，当两个实体彼此“缔合”时，它们通过直接或间接的共价或非共价相互作用连接。优选缔合是共价的。期望的非共价相互作用包括氢键、范德瓦耳斯相互作用、疏水相互作用、静电相互作用等。
术语“分离的”指将物质从其原始或自然环境(例如天然环境，如果其为天然存在的)中取出。因此，活体动物中具有的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但同一多核苷酸或多肽通过人为干预与天然系统的一些或所有共存物质分开后，则是分离的。例如，“分离的核酸片断”是RNA或DNA的单链或双链聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片断可包含cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段，并与糖、脂、蛋白质或其它物质相结合。这样的多核苷酸可为载体的一部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，而仍是分离的，因为这样的载体或组合物不是其在自然中所存在的环境的一部分。相似地，术语“基本上纯的”指通过人为干预，从其天然存在的当前化学环境中分离或取出的物质。基本上纯的多肽可通过本领域众所周知的许多技术和方法中的任意技术和方法获得或制备。
术语“基本上纯的”和“分离的”并不旨在排除多肽与这样的物质的混合物，所述物质在自然中不与所述多肽相伴。
哺乳动物细胞系统产生的外来蛋白质的表达和回收的一般方法在例如Etcheverry，“Expression of Engineered Proteins in Mammalian CellCulture”，Protein Engineering：Principles and Practice，Cleland等人(编)，163页(Wiley-Liss出版公司，1996)中提供。回收由细菌系统产生的蛋白的标准技术在例如Grisshammer等人，“Purification of over-producedproteins from E.coli cells”，DNA Cloning 2：Expression Systems，第二版，Glover等人(编)，59-92页(牛津大学出版社1995)中提供。转化昆虫细胞和从中生产外来多肽的方法在Guarino等人，US5162222和WIPO公开号WO94/06463中公开。从杆状病毒系统中分离重组蛋白的方法还在Richardson(编)，“Baculovirus Expression Protocols”(Humana出版社，1995)中有所描述。在一个实施方案中，本发明的多肽可用杆状病毒表达系统表达(见Luckow等人，Bio/Technology，1988，6，47，“BaculovirusExpression Vectors：a Laboratory Manual”，O’Rielly等人(编)，W.H.Freeman and Company出版公司，纽约，1992，US4,879,236，其全部内容在此通过引用并入本文)。另外，MAXBACTM完整杆状病毒表达系统(英骏公司，Invitrogen)可用于例如在昆虫细胞中生产多肽。
根据本发明多种实施方案的多肽还可通过利用其特定性质进行分离。例如，固定化金属离子吸附层析法(IMAC)可用于纯化富含组氨酸的蛋白质，包括含有多聚组氨酸标签的蛋白质。简短地说，首先用二价金属离子使凝胶带电，以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。取决于所使用的金属离子，富含组氨酸的蛋白质会以不同的亲和力吸附到基质上，通过竞争洗脱、降低pH或使用强螯合剂洗脱。其它纯化方法包括用凝集素亲和层析法和离子交换层析法纯化糖基化蛋白(M.Deutscher，(编)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明另外的实施方案中，可构建目的多肽和亲和标签(例如麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域)的融合物以促进纯化。
术语“体外”指人工环境和发生在人工环境中的反应或过程。体外环境包括但不限于试管和细胞培养物。术语“体内”指天然环境(例如，动物或细胞)和发生在天然环境中的反应或过程。
术语“表型”指细胞或生物的可见特征。这样的可见特征可包括物理外观、和细胞或生物中特定生理组合物存在的水平。
术语“信号传导途径”指将胞外信号通过细胞膜传播成为胞内信号的分子。然后此信号能刺激细胞应答。参与信号传导过程的多肽分子可为受体和非受体蛋白酪氨酸激酶。
“受体”指细胞内或在细胞表面的分子结构，其特征通常为能与特定物质选择性结合。
术语“化合物”或“药剂”在本文中可互换使用，指化合物或物质的组合物，当向受试者(人或动物)给药时，其通过局部和/或全身作用诱导期望的药理和/或生理效果。
术语“受试者”指任何哺乳动物，包括人或非人受试者。非人受试者可包括实验动物、测试动物、农业动物、表演动物和宠物。受试者可为人。受试者可为家养动物，如狗、猫、母牛、山羊、绵羊、猪等，受试者可为实验动物，如小鼠、大鼠、兔、猴子等。
本文所使用的术语“小分子”用于指分子量相对低的分子，无论是天然存在或人工制造的(例如通过化学合成)。在许多实施方案中，小分子为单体，分子量少于约1500g/mol。优选小分子有生物活性，在动物、优选哺乳动物、更优选人中产生局部或全身效果。在某些优选实施方案中，小分子为药物。优选但非必要地，药物已经过适当的政府部门或机构认定其使用为安全有效。例如，美国食品和药物管理局(FDA)在美国联邦法规(C.F.R.)21条第330.5，331到361，和440到460部分列出的人用药物；美国食品和药物管理局(FDA)在美国联邦法规(C.F.R.)21条第500到589部分列出的兽医用药物，通过引用并入本文，依据本发明均认为可以使用。
发明概述
一方面，本发明为包含肽衍生的层析树脂的层析介质，其中肽与TGF-β超家族成员的蛋白质的一部分至少75％同源。该成员可为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。肽可为基本上完整的蛋白质分子。肽可与该成员的指状结构-1肽的一部分至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％同源。
另一方面，本发明为纯化包含生长因子的样品的方法，其中生长因子为TGF-β超家族成员。所述方法包括提供包含肽衍生的层析树脂的层析柱，其中肽与TGF-β超家族成员的蛋白质的一部分至少75％同源，在生长因子倾向于聚集的条件下在柱中上样样品，在生长因子倾向于溶解的条件下从柱上洗脱生长因子。其中肽不需要为生长因子的一部分。
另一方面，本发明为包含肽衍生的层析树脂的层析介质，其中肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
另一方面，本发明为处于溶剂中的骨形态发生蛋白溶液，包含预定浓度的预定骨形态发生蛋白和预定浓度的肽，其中肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。所述TGF-β超家族的成员可以、但不需要是所述预定骨形态发生蛋白。
另一方面，本发明为稳定骨形态发生蛋白溶液的方法。所述方法包括在骨形态发生蛋白溶液中加入预定浓度的肽，其中肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
另一方面，本发明为组合物，包括与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源的肽骨形态发生蛋白溶液和载体。载体可为凝胶、聚合物、脱矿骨、缝线、外科用网片、陶瓷、胶束、或上述物质的任意组合。例如，载体可包括缓冲液、胶原、胶原海绵、或基于纤维素的物质。载体可选地或可另外包括一种或多种烷基纤维素(包括羟基烷基纤维素)，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。在一些实施方案中，载体可包括聚葡糖酸酯(polyglyconate)、透明质酸、聚乳酸、聚乙二醇、海藻酸钠、聚乙二醇、聚氧乙烯氧化物(polyoxyethylene oxide)、聚羧乙烯和聚乙烯醇。肽可由以下的一种或多种物质稳定：缀合的聚丙二醇、缀合的唾液酸基、缀合的多聚唾液酸链、掺入修饰的氨基酸、掺入非天然氨基酸、链间共价键、链内共价键、链间非共价键、链内非共价键、和提呈增强子(presentationenhancer)。
另一方面，本发明为测定方法，包括将细胞群与肽相接触，其中肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源，检测肽存在与不存在的情况下相比时细胞特征的改变。所述特征可以选自：细胞周期中的阶段、基因或蛋白质的表达、可见的或可测量的表型特征、基因或蛋白质的表达水平、来自受体的信号传导。所述方法还可以包括将细胞与TGF-β超家族成员的蛋白质相接触。可以限制肽为特定构型。
另一方面，本发明为测定方法，包括将受体群与已知量的肽相接触，其中肽与TGF-β超家族成员指状结构-1肽的一部分至少75％同源，检测不与受体结合的肽量的改变。受体可以与TGF-β超家族成员的蛋白质相接触。
另一方面，本发明为组合物，包含与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源的肽，和就从动物体内排除而言增加肽体内稳定性的药剂。
另一方面，本发明为测定方法，包括将受体群与已知量的肽和小分子相接触，其中肽与TGF-β超家族成员指状结构-1肽的一部分至少75％同源，检测当小分子存在与不存在的情况下相比时，不与受体结合的肽量的改变。
附图简述
本发明参照若干附图进行说明，其中，
图1BMP-2的示意图，显示指状结构区、多个螺旋和β-折叠(改自Scheufler，等人，J.Mol.Bio.(1999)，287：103-115)。
图2根据本发明例示性实施方案的亲和层析法示意图。
图3层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-12的柱中洗脱BMP-3。
图4层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-2的柱中洗脱BMP-3。
图5层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-12的柱中洗脱BMP-12。
图6层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-2的柱中洗脱BMP-12。
图7一组SEC胶的照片(A：非还原，B：还原)，显示从使用固定化BMP的反相高效液相层析HPLC柱中洗脱多种BMP。
图8层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-2突变体片断的柱中洗脱BMP-3。
图9层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-12野生型片断的柱中洗脱BMP-3。
图10层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-2突变体片断的柱中洗脱BMP-12。
图11层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-2突变体片断的柱中洗脱BMP-12。
图12层析谱(A)和SEC胶的照片(B)，显示从使用固定化BMP-2突变体片断的柱中洗脱GDF-9。
图13显示对于处于50mM Tris，pH8中的不同浓度NaCl和2-甲基-2，4-戊二醇而言，0.5mg/mL BMP-12溶液的浊度。
图14在多种条件下从缀合BMP-指状结构肽、上样BMP-12的树脂中洗脱的洗脱液的SEC胶照片。
某些优选实施方案的详细说明
在某些实施方案中，使用BMP的第一指状结构肽的一部分进行亲和层析。TGF-β超家族成员的典型二级结构是两个反平行的β-折叠被4转角α-螺旋隔开，α-螺旋与β-折叠中的链近乎垂直。两个β-折叠中的第二个具有扭曲的交叉构象。此结构通常由半胱氨酸结稳定，半胱氨酸结由多对形成链内二硫键的半胱氨酸残基形成。TGF-β超家族的一些成员通过形成二聚体或更高级别的多聚物进一步得到稳定。图1显示例示性BMP即BMP-2中的指状结构区和多个螺旋和β-折叠。对于TGF-β超家族的许多成员，β-折叠可细分为9条β链。BMP-2的其它特征，如α-2螺旋和β5a链，并不是在TGF-β超家族的所有成员中都能找到的，有些成员可能显示在BMP-2中没有的额外螺旋和β-链(Scheufler等人，J.Mol.Bio.(1999)，287：103-115)。
TGF-β超家族的例示性成员包括但不限于BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B/OP2、BMP9/GDF2、BMP10、BMP11/GDF11、BMP12/GDF7、BMP13/GDF6、BMP15、BMP16/nodal、BMP17/LeftyB、BMP18/Lefty2/TGFβ4、α抑制素、抑制素βA、抑制素βB、抑制素βC、抑制素βE/BMP14/GDF12、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3、GDF1、GDF3/Vgr-2、GDF5、GDF8、GDF9、GDF10/BMP3B、GDF15、artemin、GDNF(胶质细胞衍生的神经营养因子)、米勒管抑制物质、neuturin和persephin。尽管下文讨论的焦点是BMP，但本文的教导可应用于任何TGF-β超家族的成员。
BMP在生理pH倾向于聚集和沉淀(Ruppert等人，1996 Eur J Biochem.1996，237(1)：295-302)。在一些实施方案中，利用此倾向，将整个BMP或从其第一指状结构域衍生而来的指状结构-1肽类似物作为配体，与琼脂糖珠子相连接来制备亲和层析树脂。
层析
图2图解说明了根据本发明某些实施方案的亲和纯化的原则。BMP或指状结构-1肽类似物固定在层析介质上。例示性介质包括琼脂糖(例如，SepharoseTM)、聚苯乙烯、硅胶、右旋糖酐和丙烯酰胺。然后根据本领域技术人员已知的技术将介质灌入柱中。在利于BMP沉淀的条件下，向柱中上样含有BMP的溶液。在一个实施方案中，BMP上样至用CHO-条件介质制备的柱，CHO-条件介质包含例如100μg/ml硫酸葡聚糖或肝素，处于生理pH。在一些实施方案中，溶液还可包含1.2M NaCl。其它杂质可从柱上洗脱，而BMP保持聚集在柱上。然后在促进溶解的条件下将BMP从柱上洗脱。本领域技术人员会认识到对于固定化指状结构-1肽类似物和被纯化物质的多种组合而言，可以优化上样溶剂的离子强度和pH。
在一些实施方案中，可使用添加剂优化被纯化物质的溶解性或不溶解性。例如，在细胞表达和分泌BMP时，可在培养基中加入硫酸葡聚糖或肝素以促进溶解。在层析柱上样之前，可将条件介质调整为高离子强度以促进层析过程中有效的捕获和聚集。
例示性BMP增溶剂为本领域技术人员已知，包括但不限于乙酸、三氟乙酸、盐酸、醇、乙腈、丙二醇、甘油、吐温-80、CHAPS(3-((3-胆酰胺基丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸)、L-精氨酸、6M尿素和6M盐酸胍。本领域技术人员会认识到这些溶剂对于增溶BMP的强度不同。在某些实施方案中，用500mM精氨酸溶液或50mM乙酸洗脱BMP。
例示性BMP沉淀剂为本领域技术人员已知，包括但不限于pH高于约5的溶剂，盐溶液包括例如氯化钠、磷酸盐、铵和钠的硫酸盐、和柠檬酸盐。促进沉淀的氯化钠的浓度取决于溶液的pH。一些TGF-β蛋白会在高盐浓度低pH或相反条件的溶液中沉淀。本领域技术人员会知道对于特定蛋白质，如何优化盐浓度和pH以得到期望的沉淀特点。
BMP指状结构肽的片断可以代替完整的指状结构区使用。用于层析或下文描述的用途的具体序列可具有至少8，至少16，或至少24个氨基酸残基。所述序列可与天然蛋白质的相应区域至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，或至少95％同源。在一些实施方案中，可用丝氨酸残基代替天然序列中的半胱氨酸残基形成突变体。这能够降低琼脂糖珠子上的肽链之间的交联，交联可能会干扰BMP聚集体的成核作用。
还可以修饰肽序列以改善肽对基质的附着。例如，赖氨酸封端的肽通过形成酰胺键会容易地附着到层析珠子上。如果期望肽的天然序列不是赖氨酸封端的，可通过修饰加上赖氨酸残基。可选地或另外地，可以酰胺化肽的N端，而乙酰化C端，以确保只有肽的一个末端会附着到基质珠子上。在可选的实施方案中，可在肽和基质珠子之间插入间隔物。间隔物为肽提供额外的构象灵活性，使其能更自由地形成对于肽聚集体成核最优化的二级结构。间隔物可为简单的有机链或可为非结合的氨基酸序列。序列可为一种或两种氨基酸的寡聚物，或可以与TGFβ超家族成员蛋白质或一些其它蛋白质的非结合部分显示至少部分同源性。可选地或另外地，间隔物可具有与TGFβ超家族成员蛋白质的一部分显示部分同源性的部分、和不显示同源性的部分。在一些实施方案中，取决于游离端是C端或N端，结合肽的功效可以有所不同。如本文所描述的或根据本领域技术人员已知的其它方法，还可缺失、修饰或替换个别氨基酸。
BMP溶液稳定剂
在一些实施方案中，指状结构-1肽类似物可用于稳定处于多种可药用载体中的BMP溶液。在一些实施方案中，将BMP溶于含有特定浓度指状结构-1肽类似物的溶液。在一些实施方案中，浓度的比例为1:1，但可大于或小于此比例。不受任何特定理论束缚，认为指状结构-1肽类似物会与蛋白的第一指状结构区相竞争，防止单体或二聚体BMP的多聚化。因此，可能期望肽浓度高于蛋白质浓度，例如2:1、5:1、10:1、20:1、或30:1。
在一些实施方案中，待递送的蛋白质浓度范围为约0.01到约4mg每cc或ml载体，例如约0.05mg/cc到约1.5mg/cc。BMP的例示性载体包括下文所讨论的用于治疗组合物的物质、水凝胶形成物质、以及其它聚合物和载体，如美国专利号6,620,406中所公开的，其内容通过引用并入本文。测定法
在另一实施方案中，指状结构-1肽类似物用于生物测定法。例如，指状结构-1肽类似物可以与BMP受体相互作用，诱导BMP相关的生物应答，例如信号传导。测定法还可测定诸如细胞周期的改变、特定基因或蛋白质的表达、可见或可测量的表型改变、蛋白质水平或修饰状态的改变或其它细胞特征等应答。此应答可使用商业途径可得的测定法或筛选试验试剂盒测量。可使用指状结构-1肽类似物测试特定细胞，以简单测定细胞是否响应BMP，或识别细胞对其更敏感或更不敏感的特定BMP。例如，可通过代谢活动的改变例如，通过特定蛋白质、多核苷酸、代谢物或其它细胞成分生产的增加或减少，来识别响应指状结构-1肽类似物的细胞。在另外的实施方案中，用指状结构-1肽类似物作为BMP竞争剂。在此实施方案中，指状结构-1肽类似物和完整的BMP蛋白竞争与细胞受体的结合。例如，可测定癌细胞、细菌和疾病相关的其它细胞中特定BMP受体或其它受体的存在，所述受体与指状结构-1肽类似物的结合抑制细胞的特定功能。可选地或另外地，可用分离的受体而不是细胞实施测定法。在一些实施方案中，可以用使用已知受体的高通量筛选方法测定受体-肽相互作用。
第一指状结构肽类似物可用作BMP激动剂的例示性实施方案包括但不限于：BMP-2第一指状结构肽类似物用于治疗骨质疏松症、骨折的修复或再生和软骨再生，BMP-12第一指状结构肽类似物用于肌腱修复，BMP-9第一指状结构肽类似物用于诱导胆碱能神经元分化，以及GDF-19第一指状结构肽类似物用于治疗心力衰竭。第一指状结构肽类似物可用作BMP拮抗剂的例示性实施方案包括但不限于：BMP3的第一指状结构肽类似物用于治疗骨质疏松症、骨折和骨骼疾病，BMP15和GDF9用于避孕，GDF3用于治疗II类糖尿病、肥胖和代谢综合征，BMP4用于中枢神经系统(CNS)或周围神经组织的修复或再生，TGF-β用于治疗多种癌症和肿瘤，或GDF8用于治疗肌营养不良症、少肌症、虚弱或神经障碍。在此实施方案中，第一指状结构肽片断与完整蛋白质竞争结合受体，但随后阻止细胞或组织的应答，而完整蛋白则会促进应答。
肽结合可以用放射性受体测定法更直接地测量或测定，其中样品中的标记的肽和未标记的BMP竞争与特定细胞或受体的结合，或以相反形式进行。可以用125I、35S、32P或其它适合的放射性同位素进行标记。当指状结构-1肽类似物的结合增加时，则降低能够结合的BMP的量。而后将受体-BMP复合物从游离配体中分离出来，例如通过洗涤(在粘附细胞系的情况下)，速滤或离心(在粘附细胞系或受体与固相支持物结合的情况下)，或用抗体、聚乙二醇或其它沉淀剂沉淀受体-配体复合物后过滤或离心(在可溶性受体的情况下)。与由已知浓度的标记配体制成的标准曲线相比较，能够准确定量样品中肽或蛋白质的浓度。然后通常通过γ计数，并与已知的标准比较，来定量复合物中标记配体的量。这些方法在文献中有所描述，使用的是其它受体(M.Williams，Med.Res.Rev.，11：147-184(1991)；M.Higuchi和B.B.Aggarwal，Anal Biochem.，204：53-58(1992)；M.J.Cain，R.K.Garlick和P.M.Sweetman，J.Cardiovasc.Pharm.，17：S150-S151(1991)；各通过引用并入本文)，可容易地改变以适合本系统。定量肽或BMP的其它方法包括4,857,456中描述的放射性免疫测定和ELISA。
可选地或另外地，一旦特定指状结构-1肽类似物得到鉴定，可进一步优化，通过替换个别氨基酸以稳定特定的二级结构、防止形成链间半胱氨酸-半胱氨酸连接、或与细胞受体形成更好匹配。可以用计算机模型或用生物技术鉴定这样的突变。例如，蛋白质诱变的例示性方法可在Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.)，第二版(冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社)(1990)中找到。在这样的实施方案中，可期望将肽或优化的肽作为BMP模拟物用作治疗剂。在其它实施方案中，可以化学修饰个别氨基酸残基或肽，例如，通过糖基化或聚乙二醇衍生修饰。
在另一实施方案中，指状结构-1肽类似物直接与完整BMP蛋白相互作用。例如，可通过用指状结构-1肽类似物阻止蛋白质的同二聚化或异二聚化测定BMP蛋白。在此实施方案中，可期望修饰指状结构-1肽类似物，使其可以被细胞内在化，二聚化通常发生在此。可选地或另外地，可使用肽正向调节BMP蛋白的二聚化。指状结构-1肽类似物和BMP蛋白的相互作用可以用上述任何技术测定。另外，可使用蛋白质大小的测定法例如，非变性凝胶电泳、质谱法或凝胶过滤层析法，来表征指状结构-1肽类似物的影响。在一些实施方案中，通过防止BMP的正当功能，指状结构-1肽类似物可作为BMP拮抗剂用作治疗剂。
在另一实施方案中，指状结构-1肽类似物可用于筛选鉴定正或负调节BMP-BMP或BMP-受体相互作用的物质，例如小分子。例示性受体包括但不限于：丝氨酸/苏氨酸激酶受体，例如，ACVR1/ALK2、ACVR1B/ALK4、ACVR1C/ALK7、ACVR2/ACTRII、ACVR2B/ACTRIIB、ACVRL1/ALK1、BMPR1A/ALK3、BMPR1B/ALK6、BMPR2/T-ALK、TGFβRl/ALK5和TGFβR2，和共受体如RGMa、RGMb/DRAGON、RGMc/HFE2、TGFβR3、Cripto、Cryptic和内皮因子。例如，可使用高通量测定法鉴定BMP的小分子抑制剂。可实施与荧光共振能量转移(FRET)测定法相似的无细胞测定法，其中的筛选检测的是对BMP-肽相互作用的破坏。例如，BMP或指状结构-1肽类似物中的任一可用供体分子修饰，而另一个用受体分子修饰。
在另一实施方案中，可修饰指状结构-1肽类似物以限制其为特定构型，从而保持给定的二级结构。例如，用半胱氨酸替换指状结构-1肽类似物中的特定氨基酸，会形成二硫键，稳定特定构象。可选地或另外地，半胱氨酸可加在指状结构-1肽类似物的N端和C端末尾，以限制肽或稳定特定构象。在一些实施方案中，可期望解折叠野生型或突变型指状结构-1肽类似物，再令其以另外的构型重折叠。例如，指状结构-1肽类似物可以用离液剂溶解变性。将指状结构-1肽类似物从离液剂中分离，使其能够以热力学有利的构型重折叠。当蛋白质的一级氨基酸序列中有半胱氨酸残基时，可期望在允许正确形成二硫键的环境中完成重折叠(例如，氧化还原系统)。Kohno，Meth.Enzym.，185：187-195(1990)中公开了重折叠的一般方法。还可使用伴侣蛋白介导折叠。
治疗组合物
鉴定为具有治疗潜力的指状结构-1肽类似物可以用缓冲溶液的形式施用于组织。例示性缓冲溶液为这样的组合物，除了肽还包括：约1.0到约10.0％(w/v)甘氨酸，约0.1到约5.0％(w/v)糖例如蔗糖，约1到约20mM谷氨酸盐酸盐，和任选的约0.01到约0.1％非离子型表面活性剂，如聚山梨醇酯80或吐温。例示性溶液为约1％到约20％w/v纤维质载体/缓冲液。如果期望的话可加入盐。
更多粘性材料也可用作载体。这样的材料可包括具有粘性和极性的可药用材料，从而当其与指状结构-1肽类似物组合时，形成对于组织位点而言具有适当操作特性的组合物。例如，相较于用于骨折部位的材料，可期望在牙周部位使用粘度相对较低(但仍不倾向流动)的材料。在肽中加入载体使得指状结构-1肽类似物能在疾病或病变部位停留足够长的时间，令指状结构-1肽类似物能通过上调或下调多种代谢活动而对局部细胞起作用。载体还可使得指状结构-1肽类似物能在一定时间间隔后从病变、缺陷或疾病部位释放。
用于肽的给药的例示性载体家族为多孔颗粒聚合物，在美国专利号5,171,579中有详细说明，其全部内容通过引用并入本文。可用于本发明的可选载体为成骨蛋白、多孔颗粒聚合物和另一多价螯合剂或载体物质如纤维质材料的制剂。可用作载体或多价螯合剂的其它材料包括羧甲基纤维素、透明质酸、海藻酸钠、聚乙二醇、聚氧乙烯氧化物(polyoxyethylene oxide)、聚羧乙烯和聚乙烯醇。这些组合物在公布的PCT申请WO 93/00050中有所说明，其全部内容在此通过引用并入本文。多价螯合剂存在的浓度可为约1到约10％(w/v植入物)。当使用多孔颗粒聚合物作为载体时，多孔颗粒聚合物/纤维质多价螯合剂可任选地进一步与作为稀释剂的水性甘油组合，例如甘油浓度约10到约80％(v/v)，多价螯合剂/液体溶液：多孔微粒聚合物的例示性比例为约0.1到约0.9(v/v)。
另一例示性载体家族是胶原物质。适合的胶原物质包括CollastatTM和HelistatTM胶原海绵(Integra LifeSciences公司，平原市(Plainsboro)，新泽西州)。适合用于本发明的其它胶原物质在美国专利号5,206,028；美国专利号5,024,841；美国专利号5,256,418中有所说明。胶原载体可为海绵形式。可通过在期望体积和浓度的肽中将海绵浸泡适当时间，在给药前将胶原海绵负载上肽。胶原海绵可以约10％到约150％v/v[ml蛋白质/cc干海绵]的范围浸湿负载上肽，例如约10到约60％v/v。可选地，肽可在生产过程中吸附到胶原海绵中。这种情况下，可在生产过程中将肽加入胶原海绵，冻干以形成整体产品。加入肽的比例可为约10到约150％v/v，例如约60到约80％v/v的范围。
另一例示性载体家族为基于纤维素的物质，如烷基纤维素(包括羟基烷基纤维素)，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素，例如羧甲基纤维素(CMC)的阳离子盐。可改变这些物质和本文说明的任何其它聚合物载体的交联和分子量，以调整包封肽的递送速率并在体内稳定肽。
在纤维质载体的情况下，载体可为水合的纤维质粘性凝胶形式。纤维质物质的粘度可通过机械方法增加，如高速搅拌一段适当时间，而后高压灭菌。肽和纤维质载体可处于适当缓冲液的溶液中。例示性缓冲液为这样的组合物，包含约1.0到约10.0％(w/v)甘氨酸，约0.1到约5.0％(w/v)糖，优选蔗糖，约1到约20mM谷氨酸盐酸盐，任选约0.01到约0.1％非离子型表面活性剂如聚山梨醇酯80。例示性溶液为约1％到约20％w/v纤维质载体/缓冲液。如果期望，可加入盐。与粘性凝胶载体组合的肽的量可在约0.05到约1.5mg的范围，例如约0.1到约1.0mg/cm3需要的植入物质。
根据多种实施方案，可以适合用作指状结构-1肽类似物载体的其它物质包括但不限于脱矿骨、聚葡糖酸酯、透明质酸、外科用网片或缝线、温度敏感的聚合物、矿物质和陶瓷，如磷酸钙类、羟基磷灰石等，以及这些物质的组合。其它可能的载体包括用于可注射的BMP制剂的载体。适合可注射制剂的载体包括例如，可溶性胶原、透明质酸、聚乳酸/聚乙二醇和聚合物。
用于此实施方案中的指状结构-1肽类似物可以只是与载体和完整蛋白质组合，或可以固定在载体上。例如，可以用标准聚合物化学技术将胺封端的肽附着到羧化的载体上。在另一例子中，肽可以为羧基-NHS封端，附着到胺化的聚合物上。可选地或另外地，肽可为生物素化的，与已用抗生蛋白链菌素功能化的载体配位。
指状结构-1肽类似物可选的载体包括胶束。例如，可用Gref等人，Science，1994，263：1600-1603描述的双乳化法将治疗组合物包封在胶束中，随后可用本文描述的任何技术或本领域技术人员已知的任何其它递送技术对受试者施用。在一些实施方案中，胶束表面可包括靶向剂。靶向剂可共价附着在胶束上，或可通过配体-受体相互作用(例如，生物素-抗生蛋白链菌素)或静电相互作用保留在胶束上。例示性靶向剂包括抗体和抗体片断、核酸配体(例如适体)、寡核苷酸、寡肽、多糖、低密度脂蛋白(LDL)、叶酸、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、人免疫缺陷病毒(HIV)的gpl20包膜蛋白、糖类、多糖、酶受体配体、唾液酸、糖蛋白、脂、小分子、生物活性剂、生物分子、免疫反应片断如Fab、Fab’或F(ab’)2片断等。
可修饰用作治疗剂的肽，以提高体内稳定性、延长循环时间、降低从身体中排除的速率。例如，肽可用聚烷撑二醇链如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)功能化或与其组合。这样的聚合物链的最佳分子量可以用本领域技术人员已知的技术最优化。可选地或另外地，肽可以与唾液酸基或多唾液酸链缀合。还可以通过用较小的化学基团如甲基、硫酸根等化学修饰氨基酸残基来修饰肽。还可以用非天然氨基酸如D-立体异构体或β-残基替换个别的氨基酸残基。在一些实施方案中，可用链间或链内共价或非共价键稳定肽。可以通过给肽加上适当氨基酸残基，或通过用适当的化学基团如硫醇、氢键供体和受体等修饰肽中的氨基酸，来促进这些连接。肽还可与作为提呈增强子的天然或合成蛋白质的全长蛋白质或片断缔合或融合(例如，在N端或C端或内部)。例示性蛋白质为本领域技术人员已知，包括牛血清白蛋白。
处于适当缓冲液中或与上述那些适当载体组合的指状结构-1肽类似物，可直接应用于组织和/或需要组织修复的位点。例如，可将肽物理施用于组织，通过喷雾或药浴(dipping)、或用刷子、或其它适当涂药器，如用注射器注射。可选地或另外地，肽可直接施用于需要组织修复的位点。
在一些实施方案中，根据本发明实施方案治疗组合物可直接施用于受试者，或可先依据任何可用的递送路径配制，路径包括但不限于肠胃外(例如静脉内)、真皮内、皮下、口服、鼻腔、支气管、眼、经皮(局部)、经粘膜、直肠和阴道。本发明的药物组合物可包括由哺乳动物细胞系表达的纯化的多肽或蛋白质、和递送剂(即上述阳离子聚合物、肽分子运载蛋白、表面活性剂等)，与可药用载体组合使用。本文使用的用语“可药用载体”包括溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，与药物施用相容。组合物中也可掺入增补的活性化合物。
药物组合物配制为与其预期的给药路径相容。用于肠胃外、真皮内或皮下施用的溶液或悬液可包括下列成分：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节张度的药剂如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱调节pH，如盐酸或氢氧化钠。肠胃外制剂可包装在安瓿瓶、一次性注射器、或玻璃或塑料制的多剂量小瓶中。
适合可注射用途的药物组合物通常包括无菌水性溶液(当为水溶性时)或分散液和无菌粉剂，用于临时制备无菌可注射溶液或分散液。对于静脉内给药，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、聚氧乙烯蓖麻油(CremophorELTM，巴斯夫公司(BASF)、帕西波尼市(Parsippany)，新泽西)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况中，组合物应为无菌，且应具有易于注射的流动性。例示性药物制剂在生产和储存条件下是稳定的，并在抗微生物如细菌和真菌污染作用的条件下保存。一般而言，相应载体可为溶剂分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、及其适当的混合物。例如通过使用包衣如卵磷脂、在分散的情况下通过保持所需的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂，能够保持适当的流动性。微生物作用的预防能通过多种抗菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟苯甲酸类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，期望组合物中包括等渗剂例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过在组合物中包含延缓吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，能延长可注射组合物的吸收。
无菌可注射溶液的制备可在适当溶剂中掺入所需量的纯化多肽或蛋白质，依需要加入上列一种或多种成分，然后过滤除菌。通常，分散液的制备是在包含基本分散介质和所需的其它上列成分的无菌介质中，掺入由哺乳动物细胞系表达的纯化的多肽或蛋白质。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况中，例示性制备方法为真空干燥和冷冻干燥，由先前经过无菌过滤的溶液产生具有活性成分和任何其它期望的成分的粉剂。
口服组合物可包括惰性稀释剂或可食用载体。为口服治疗给药目的，纯化的多肽或蛋白质可与赋形剂掺在一起，以片剂、锭剂或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。口服组合物还可用流质载体制备，用作漱口药。可包括药物相容的粘合剂和/或佐剂物质作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可包含任何下列成分或性质相似的化合物：粘合剂如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂如二氧化硅胶体；甜味剂如蔗糖或糖精；或调味剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味料。口服递送的制剂最好可掺入改善其在胃肠道中的稳定性和/或增强吸收的药剂。
对于吸入给药，本发明的组合物包含由哺乳动物细胞系表达的纯化的多肽或蛋白质和递送剂，优选从压力容器、或包含适宜推进物如气体如二氧化碳的分配器或喷雾器中以气雾剂的形式递送。本发明考虑用鼻腔喷雾、吸入器、或其它直接递送方式对上呼吸道和/或下呼吸道递送组合物。鼻腔内给药对抗流感病毒的DNA疫苗已显示诱导CD8T细胞应答，表明当以此路径递送时，至少呼吸道中的一些细胞能够吸收DNA，本发明的递送剂会增强细胞吸收。根据本发明某些实施方案，组合物包含由哺乳动物细胞系表达的纯化的多肽和递送剂，配制为大的多孔颗粒用于气雾剂给药。使用美国专利公开号20030235536中公开的技术(其内容通过引用并入本文)，可增强根据本发明实施方案组合物经上皮的吸收。
通过经粘膜或经皮方法也能够进行全身给药。对于经粘膜或经皮给药，制剂中使用适于待穿透屏障的穿透剂。这样的穿透剂通常为本领域已知，例如对于经粘膜给药而言包括去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜给药能通过使用鼻腔喷雾或栓剂完成。对于经皮给药，纯化的多肽或蛋白质和递送剂如本领域所公知的那样配制成为软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
对于直肠递送，还可以用栓剂(例如与常规栓剂基质一起制备，如可可脂和甘油酯)或保留灌肠剂形式制备组合物。
在一个实施方案中，组合物与防止多肽或蛋白质从体内快速消除的药剂组合使用，如控释制剂，包括植入物和微囊递送系统。所述药剂还可作为组合物的载体。可使用生物可降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样制剂的方法对本领域技术人员显而易见。材料还可以由商业途径购自阿尔扎公司(Alza Corporation)和诺华制药有限公司(Nova pharmaceuticals，Inc.)。脂质体悬液(包括脂质体，以针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞)也可以用作可药用载体。这些可依据本领域技术人员已知的例如美国专利号4,522,811中描述的方法制备。
为方便给药，做到剂量统一，最好以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物。此处使用的剂量单位形式，指物理上分离的单位，适合待治疗受试者的单位剂量；每单位包含经计算能产生期望疗效的、预定量的活性多肽或蛋白质，以及必需的药物载体。
根据本发明实施方案的多肽或蛋白质可以按需要以多种间隔延续不同时期给药。技术人员会意识到某些因素能影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的整体健康和/或年龄，以及存在的其它疾病。通常，用本文描述的多肽或蛋白质治疗受试者可以包括单次治疗，或者在许多情况下可以包括系列治疗。此外应理解适当的剂量可以取决于多肽或蛋白质的效能，可以任选地根据特定接受者进行调整，例如给药渐增的剂量直到实现预选的期望反应为止。应理解特异于任何特定动物受试者的剂量水平可以取决于许多因素，包括所用的具体多肽或蛋白质的活性，受试者的年龄、体重、整体健康、性别和饮食，给药时间，给药路径，排泄速率，任何药物组合，以及表达或活性待调节的程度。
本发明包括本发明组合物在治疗非人动物中的用途。因此，给药的剂量和方法可以根据已知的兽医药理学和医学原理进行选择。指导方针可见例如Adams，R.(编)，Veterinary Pharmacology and Therapeutics，第8版，爱荷华州立大学出版社；ISBN：0813817439；2001。
本发明的药物组合物可以与给药说明一起装在容器、包裹或分配器中。
实施例
实施例1
以约20mg:4mL的比例将BMP-12固定的在NHS活化的琼脂糖珠子上，得到的介质与水或中性盐缓冲液组合制备柱。将用1.2M NaCl增强的CHO条件介质装入柱中。在一些情况下，介质在装柱之前就BMP而言进行预浓缩。用15CV(柱体积)处于40mM Na2HPO4，pH7.2中的1.2MNaCl洗涤柱，而后用处于20mM Tris，pH7.5中的0.5M精氨酸/0.5MNaCl(15CV)和低盐洗剂(50mM乙酸铵pH7，15CV)洗涤。再用5CV梯度达50mM，pH3的乙酸洗脱柱，而后用15CV追加液洗脱。最后，用5CV的6M盐酸胍(GuHCl)乙酸溶液洗脱柱。
BMP-3被层析介质有效捕获，并被乙酸洗脱(图3A)。用HPLC分析洗脱液。如图3B中可见，前肽片断与成熟蛋白质共纯化，在胍峰中还见到痕量成熟BMP-3。
实施例2
BMP-2如实施例1中所述固定在琼脂糖珠子上，用于测试BMP-3的负载和洗脱。如图4所示，BMP-3被高离子强度溶液有效捕获，并被乙酸洗脱。同BMP-12柱一样，前肽片断与成熟蛋白质共纯化，在胍峰中还见到痕量成熟BMP-3。
实施例3
如实施例1中所述上样BMP-12，从BMP-12亲和柱上洗脱。使用高盐溶液，BMP-12被柱有效捕获，并被乙酸和胍洗脱(图5)。BMP-12的单体和二聚体形式均被捕获。
实施例4
如实施例1和2所述上样BMP-12，从BMP2亲和柱上洗脱。使用高离子强度溶液，BMP-12被柱有效捕获，并被乙酸和胍洗脱(图6)。
实施例5
如实施例1和2所述，用BMP-12和BMP-2制备BMP亲和树脂，用于制备HPLC柱。这些柱用BMP-3和BMP-12负载投入使用。如图7所示，对于反相HPLC，BMP-12和BMP-2作为亲和配体同等有效。在一些情况下，采用尺寸排阻或反相层析技术来加强纯化。
实施例6
以5mg肽/mL树脂的比例将BMP-2指状结构1肽的突变体(SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK)与琼脂糖珠子相连。用4mL得到的树脂(1.6×2.0cm)制备柱。如实施例1所述用BMP-3负载柱并洗脱。如图8所示，使用高盐溶液，BMP-3被柱有效捕获，与前肽片断一起在乙酸中洗脱。一般而言，使用固定化肽比使用完整蛋白质的层析法获得的产物纯度更高。
实施例7
如实施例1中所述，用野生型BMP-12指状结构1肽(KELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLC)纯化BMP-3。如图9所示，使用高盐溶液，BMP-3被柱有效捕获，在乙酸中洗脱。洗脱的前肽片断比实施例6中少。一般而言，固定化的BMP-12不如BMP-2突变体有效。SDS-PAGE显示了固定化BMP-12肽的寡聚化，这可能是由于游离半胱氨酸残基的存在而导致。
实施例8
用实施例6中所述以BMP-2突变体肽制备的柱纯化BMP-12。如图10所示，使用高盐溶液，BMP-12被柱有效捕获，在乙酸中洗脱。少量BMP-12在6M GuHCl中洗脱。
实施例9
用实施例7所述以BMP-12野生型肽制备的柱纯化BMP-12。如图11所示，使用高离子强度溶液，BMP-12被柱有效捕获，在乙酸中洗脱。少量BMP-12在6M GuHCl中洗脱。
实施例10
用实施例6所述以BMP-2指状结构1肽的突变体制备的柱纯化GDF-9。如图12所示，使用高盐溶液，GDF-9被柱有效捕获，用500mM精氨酸和乙酸两者均能洗脱。还存在分子量较低的污染物。
实施例11-其余肽突变体的预测实施例。
用下列肽的一种或多种制备BMP亲和树脂：
表1：用于制备亲和树脂的例示性肽序列
 
BMP2 Fing1 WT： SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEC
BMP2 Fing1 Mut1： SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK
BMP2 Fing1 Mut2： SDVGANDWIVAPPGYHAFYCHGEC
BMP2 Fing1 Mut3： SDVGANDWIVAPPGYHAFYCHGEK
BMP2 Fing1 Mut4： SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHAEC
BMP2 Fing1 Mut5： SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHAEK
BMP2 Fing1 Mut6： SDVGANDWIVAPPGYHGFYCHGEC
BMP2 Fing1 Mut7： SDVGANDWIVAPPGYHGFYCHGEK
BMP2 Fing1 WT： LYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFY
BMP2 Fing1 Mut1： LYVDFSDVGANDWIVAPPGYHAFY
BMP2 Fing1 Mut2： LYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHGFY
BMP12 Fing1 WT： KELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLC
BMP12 Fing1 Mut1： KELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLK
BMP12 Fing1 Mut2： AELGWDDWIIAPLDYEAYHCEGLK
BMP3 Fing1 WT： ADIGWSEWIISPKSFDAYYCSGAC
 
BMP3 Mut1： ADIGWSEWIISPKSFDAYYCSGAK
实施例12
BMP溶解度筛选-使用帝肯自动移液仪(Tecan liquid-handlingrobot)混合试剂主平板，800μL×1.25浓缩液(对于各溶液而言；见表2和3)，各处于50mM Tris缓冲液pH8中。用8道移液器从主平板中转移80μL材料至一半面积的UV微孔板中，从各样品中读取A320以定义空白对照。用重复移液器(repeat-pipettor)加入20μL处于0.1％TFA中的2.5mg/mLBMP-12，以得到0.5mg/mL溶液，而后在14000rpm振荡。读取UV吸收(A320)，减去空白对照吸收以确定溶解度。用更大浓度范围的2-甲基-2，4-戊二醇(MPD)和更精细的盐浓度集合(表4)重复此方法。图13显示相对于NaCl和MPD浓度而言BMP-12溶液浊度的线图。
表2
Figure A200780027841D00371
表3
Figure A200780027841D00381
表4
Figure A200780027841D00382
实施例13
偶联亲和树脂与表5中列出的肽。将偶联的树脂和作为对照的未缀合的树脂，悬浮在25％v/v比的16％乙醇，150mM NaCl，和20mM Tris缓冲液pH7.5中(例如，25％乙醇，75％Tris缓冲液)。使用帝肯自动移液仪将各浆液的200μL小份移入96孔聚苯乙烯滤板(0.45μm亲水过滤器，沃特曼公司(Whatman)目录号770-1806)八行中的一行。在1200g离心3分钟除去液相，在过滤器上留下50μL湿树脂。然后用表6中列出的负载缓冲液平衡树脂(K为表征在特定缓冲液中蛋白质与特定树脂结合强度的系数)。在96孔板的260μL各负载缓冲液中加入40μL低分子量尺寸排阻层析(LMW SEC)溶液(BEP，在0.1％TFA中透析，浓缩至3.76mg/mL)制备BMP-12负载板，在每孔中得到0.48mg/mL蛋白质。负载树脂：从负载板中转移150μL至滤板，然后在摇床上孵育20分钟以促进结合。离心滤板，将滤液收集在96孔UV板中。滤液或流出液中的蛋白质浓度计算为(A280-A320)/1.3。然后150μL 100mM乙酸洗涤滤板，再用150μL 4M盐酸胍和50mM乙酸钠pH4.0洗涤。依上述方法测量新滤液中的蛋白质浓度。如表6所示，偶联肽747、747、748和749的树脂在负载缓冲液1-5中与BMP12以高亲和力结合。但是，对于肽750和751，在25mM MESpH6中结合强，但在具有0.1M NaCl的50mM乙酸pH3.0中结合弱，这使得结合-洗脱过程能有效进行，而无需离液剂或有机试剂。通过凝胶来电泳分析板中第四列的流出液和乙酸洗脱样品(用MES pH6负载)(图14)。
表5
 
肽名称 ID 肽
BMP2 N-trun 1S 751 Ac-SDVGWNDWIVAPPGYHAFYSHGEK
BMP2 N-trun 1 750 Ac-SDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGEK
BMP12 N-trun_1S 749 Ac-ELGWDDWIIAPLDYEAYHSEGLK
BMP5 748 Ac-RDLGWQDWIIAPEGYAAFYSDGEK
BMP2 Full 747 Ac-LYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYSHGEK
BMP2 C-trunc_2 746 Ac-LYV＊＊SDVGWNDWIVK
BMP2 N-trunc_2 745 Ac-VAPPGYHAFYSHGEK
Figure A200780027841D00401
Figure A200780027841D00411
通过考察本文公开的说明书或本发明的实施，本发明的其它实施方案对于本领域技术人员显而易见。应认为说明书和实施例仅为例示性，本发明的真正范围和精神由下文的权利要求书表明。

Claims (89)

1.层析介质，包含：
肽衍生的层析树脂，所述肽与TGF-β超家族成员蛋白质的一部分至少75％同源。
2.权利要求1所述的层析介质，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
3.权利要求1所述的层析介质，其中所述肽为基本上完整的蛋白质分子。
4.权利要求1所述的层析介质，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
5.权利要求1所述的层析介质，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少80％同源。
6.权利要求1所述的层析介质，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少85％同源。
7.权利要求1所述的层析介质，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少90％同源。
8.权利要求1所述的层析介质，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少95％同源。
9.纯化包含生长因子的样品的方法，所述生长因子为TGF-β超家族成员，所述方法包括：
提供包含肽衍生的层析树脂的层析柱，所述肽与TGF-β超家族成员蛋白质的一部分至少75％同源；
在生长因子倾向于聚集的条件下在柱中装入样品；和
在生长因子倾向于溶解的条件下从柱上洗脱生长因子。
10.权利要求9所述的方法，其中所述肽不是生长因子的一部分。
11.权利要求9所述的方法，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
12.权利要求9所述的方法，其中所述肽为基本上完整的蛋白质分子。
13.权利要求9所述的方法，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
14.权利要求9所述的方法，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少80％同源。
15.权利要求9所述的方法，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少85％同源。
16.权利要求9所述的方法，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少90％同源。
17.权利要求9所述的方法，其中肽与所述成员的指状结构-1肽的一部分至少95％同源。
18.层析介质，包含：
肽衍生的层析树脂，所述肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
19.权利要求18所述的层析介质，其中肽与所述部分至少80％同源。
20.权利要求18所述的层析介质，其中肽与所述部分至少90％同源。
21.权利要求18所述的层析介质，其中肽与所述部分至少95％同源。
22.权利要求18所述的层析介质，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
23.溶剂中的骨形态发生蛋白溶液，包含：
预定浓度的预定骨形态发生蛋白；
预定浓度的肽，所述肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
24.权利要求23所述的溶液，其中所述TGF-β超家族的成员不是所述预定骨形态发生蛋白。
25.权利要求23所述的溶液，其中所述TGF-β超家族的成员是所述预定骨形态发生蛋白。
26.权利要求23所述的溶液，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
27.权利要求23所述的溶液，其中肽与所述部分至少80％同源。
28.权利要求23所述的溶液，其中肽与所述部分至少85％同源。
29.权利要求23所述的溶液，其中肽与所述部分至少90％同源。
30.权利要求23所述的溶液，其中肽与所述部分至少95％同源。
31.稳定骨形态发生蛋白溶液的方法，包括：
在骨形态发生蛋白溶液中加入预定浓度的肽，所述肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源。
32.权利要求31所述的方法，其中所述TGF-β超家族的成员不是所述预定骨形态发生蛋白。
33.权利要求31所述的方法，其中所述TGF-β超家族的成员是所述预定骨形态发生蛋白.
34.权利要求31所述的方法，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
35.权利要求31所述的方法，其中肽与所述部分至少80％同源。
36.权利要求31所述的方法，其中肽与所述部分至少85％同源。
37.权利要求31所述的方法，其中肽与所述部分至少90％同源。
38.权利要求31所述的方法，其中肽与所述部分至少95％同源。
39.组合物，包含：
与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源的肽；和
载体。
40.权利要求39所述的组合物，其中载体为溶剂、凝胶、聚合物、脱矿骨、缝线、外科用网片、陶瓷、胶束、或上述物质的任意组合。
41.权利要求39所述的组合物，其中载体为缓冲液。
42.权利要求39所述的组合物，其中载体包含胶原。
43.权利要求39所述的组合物，其中载体为胶原海绵。
44.权利要求39所述的组合物，其中载体为基于纤维素的物质。
45.权利要求39所述的组合物，其中载体包含一种或多种烷基纤维素(包括羟基烷基纤维素)，包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素。
46.权利要求39所述的组合物，其中载体包含聚葡糖酸酯、透明质酸、聚乳酸、聚乙二醇、海藻酸钠、聚乙二醇、聚氧乙烯氧化物、聚羧乙烯和聚乙烯醇。
47.权利要求39所述的组合物，其中肽由以下的一种或多种稳定：缀合的聚丙二醇、缀合的唾液酸基、缀合的多聚唾液酸链、掺入修饰的氨基酸、掺入非天然氨基酸、链间共价键、链内共价键、链间非共价键、链内非共价键、和提呈增强子(presentation enhancer)。
48.权利要求39所述的组合物，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
49.权利要求39所述的组合物，其中所述成员为BMP-2、BMP-12、BMP-9、GDF-19、BMP-3、BMP-15、GDF-9、GDF-3、BMP-4、TGF-β或GDF-8。
50.权利要求39所述的组合物，其中肽与所述部分至少80％同源。
51.权利要求39所述的组合物，其中肽与所述部分至少85％同源。
52.权利要求39所述的组合物，其中肽与所述部分至少90％同源
53.权利要求39所述的组合物，其中肽与所述部分至少95％同源。
54.组合物，包含：
与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源的肽；和
就从动物体内排除而言增加肽的体内稳定性的药剂。
55.权利要求54所述的组合物，其中所述药剂包括乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。
56.权利要求54所述的组合物，其中所述药剂为微囊递送系统或脂质体悬液。
57.权利要求54所述的组合物，其中所述药剂为聚烷撑二醇。
58.权利要求54所述的组合物，其中所述药剂共价或非共价附着在肽上，其中所述药剂选自聚烷撑二醇、唾液酸基、多唾液酸链、甲基、硫酸根、非天然氨基酸、β-残基、提呈增强子、或具有硫醇基的氨基酸残基、氢键受体或氢键供体。
59.权利要求54所述的组合物，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
60.权利要求54所述的组合物，其中所述成员为BMP-2、BMP-12、BMP-9、GDF-19、BMP-3、BMP-15、GDF-9、GDF-3、BMP-4、TGF-β或GDF-8。
61.权利要求54所述的组合物，其中肽与所述部分至少80％同源。
62.权利要求54所述的组合物，其中肽与所述部分至少85％同源。
63.权利要求54所述的组合物，其中肽与所述部分至少90％同源。
64.权利要求54所述的组合物，其中肽与所述部分至少95％同源。
65.测定方法，包括：
将细胞群与肽相接触，其中肽与TGF-β超家族成员的指状结构-1肽的一部分至少75％同源；和
检测肽存在与不存在的情况下相比时细胞特征的改变。
66.权利要求65所述的测定方法，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
67.权利要求65所述的测定方法，其中肽与所述部分至少80％同源。
68.权利要求65所述的测定方法，其中肽与所述部分至少85％同源。
69.权利要求65所述的测定方法，其中肽与所述部分至少90％同源。
70.权利要求65所述的测定方法，其中肽与所述部分至少95％同源。
71.权利要求65所述的测定方法，其中所述特征选自：细胞周期中的阶段、基因或蛋白质的表达、可见的或可测量的表型特征、基因或蛋白质的表达水平、来自受体的信号传导。
72.权利要求65所述的测定方法，还包括将细胞与TGF-β超家族成员的蛋白质相接触。
73.权利要求65所述的测定方法，其中限制肽为特定构型。
74.测定方法，包括：
将受体群与已知量的肽相接触，其中肽与TGF-β超家族成员指状结构-1肽的一部分至少75％同源；和
检测不与受体结合的肽量的改变。
75.权利要求74所述的测定方法，其中限制肽为特定构型
76.权利要求74所述的测定方法，还包括将受体与TGF-β超家族成员的蛋白质相接触。
77.权利要求74所述的测定方法，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
78.权利要求74所述的测定方法，其中肽与所述部分至少80％同源。
79.权利要求74所述的测定方法，其中肽与所述部分至少85％同源。
80.权利要求74所述的测定方法，其中肽与所述部分至少90％同源。
81.权利要求74所述的测定方法，其中肽与所述部分至少95％同源。
82.测定方法，包括：
将受体群与已知量的肽和小分子相接触，其中肽与TGF-β超家族成员指状结构-1肽的一部分至少75％同源；和
检测当小分子存在与不存在的情况下相比时，不与受体结合的肽量的改变。
83.权利要求82所述的测定方法，其中限制肽为特定构型。
84.权利要求82所述的测定方法，还包括将受体与TGF-β超家族成员的蛋白质相接触。
85.权利要求82所述的测定方法，其中所述成员为TGF-β、生长分化因子(GDF)、骨形态发生蛋白、激活素或抑制素。
86.权利要求82所述的测定方法，其中肽与所述部分至少80％同源。
87.权利要求82所述的测定方法，其中肽与所述部分至少85％同源。
88.权利要求82所述的测定方法，其中肽与所述部分至少90％同源。
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