KR102578087B1

KR102578087B1 - 숙주세포 갈렉틴(galectins) 및 다른 오염물(contaminant)로부터 글리코실화 단백질을 정제하는 방법

Info

Publication number: KR102578087B1
Application number: KR1020207007328A
Authority: KR
Inventors: 리사 에이 코넬-크라울리; 메간 제이. 머클루어; 로널드 오. 길레스피
Original assignee: 저스트-에보텍 바이오로직스, 아이엔씨.
Priority date: 2017-08-17
Filing date: 2018-08-17
Publication date: 2023-09-18
Also published as: WO2019036626A1; CA3067735A1; DK3668985T3; CN111344410A; US20210163528A1; CN111344410B; ES2887046T3; EP3668985A1; US11358983B2; JP7097433B2; EP3668985B1; JP2020531411A; KR20200037396A

Abstract

오염물(contaminant)로부터 글리코실화된(glycosylated) 재조합 목적 단백질(protein of interest)을 정제하는 방법이 개시되어 있으며, 이는 재조합 치료 단백질로부터 갈렉틴 및 금속 양이온과 같은 다른 숙주세포 오염물을 제거하기 위한 산업적 생산 목적에 적합하다.

Description

숙주세포 갈렉틴(galectins) 및 다른 오염물(contaminant)로부터 글리코실화 단백질을 정제하는 방법

본 발명은 오염된 숙주세포 단백질 및 금속 이온으로부터 재조합적으로 생산된 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.

재조합 치료 단백질의 산업적 생산은 엄격한 규제 표준을 충족시키기 위해 오염된 숙주세포 단백질 및 금속 이온이 목적 단백질(protein of interest)로부터 효과적으로 제거될 것을 요구한다.

글리코실화된(glycosylated) 재조합 단백질이 말단 β-갈락토실(β-galactosyl) 잔기가 풍부한 경우, 이들 갈락토사이드(galactoside) 잔기에 가역적으로 결합된 숙주세포 단백질 갈렉틴(galectins)으로부터 재조합 단백질을 정제하는 것은 중요한 문제이다.

갈렉틴(galectins)은 베타-갈락토사이드(beta-galactosides)에 특이적으로 결합할 수 있는 동물성 렉틴이다. 12개의 갈렉틴은 척추동물에서 3개의 다른 하위그룹에 속한다: 프로토타입(예: 갈렉틴-1, -2, -7, -10, -13, -14), 탠덤(tandem)-반복(예: 갈렉틴-4, -8, -9, -12) 및 키메라 갈렉틴(chimeric galectins)(예: 갈렉틴-3). 전하는 바에 따르면, 이들 갈렉틴 단백질은 숙주세포에서의 세포 상호작용 및 종양 형질전환에 관여한다(참조, 예, Cummings RD and Liu FT, Galectins, In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, Etzler ME, editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 33; Gitt, MA et al., Galectin-4 and galectin-6 are two closely related lectins expressed in mouse gastrointestinal tract, J Biol Chem. 273(5):2954-60 (1998); Bidon, N. et al., Galectin-8: a complex sub-family of galectins (Review), Int J Mol Med. 8(3):245-50 (2001); Hadari, YR et al., Galectin-8. A new rat lectin, related to galectin-4, J Biol Chem. 270(7):3447-53 (1995); Sato, M. et al., Functional analysis of the carbohydrate recognition domains and a linker peptide of galectin-9 as to eosinophil chemoattractant activity, Glycobiology 12(3):191-97 (2002); Yang, RY et al., Cell cycle regulation by galectin-12, a new member of the galectin superfamily, J Biol Chem. 276(23):20252-60 (2001); Ramaswamy, S et al., Structural basis of multivalent galactose-based dendrimer recognition by human galectin-7, FEBS J. 2015 Jan;282(2):372-87 (2015); Patnaik, SK et al., Complex N-glycans are the major ligands for galectin-1, -3, and -8 on Chinese hamster ovary cells, Glycobiology 16(4):305-17 (2006)).

갈렉틴-3은 분자량(MW)이 약 30kDa이고 β-갈락토사이드(β-galactosides)의 특이적 결합을 가능하게 하는 약 130개 아미노산의 탄수화물-인식-결합 도메인(carbohydrate-recognition-binding domain, CRD)을 함유한다. 갈렉틴-3이 결합하는 것으로 보고된 단백질 중에는 라미닌, 피브로넥틴, 헨신, 엘라스틴, 콜라겐 IV, 테나신-C, 테나신-R, 인테그린, α1β1, α4β7, α6β1, 및 αMβ1, VEGFR2, NG2, 및 아미노펩티다아제 N이 있다(Funasaka et al., Galectin-3 in angiogenesis and metastasis, Glycobiology 24 (10): 886-891 (2014)). 숙주세포 단백질 갈렉틴-3은 재조합적으로 생산된 인자 IX 단백질의 오염물(contaminant)인 것으로 보고되었다(Blostein et al., Galectin-3 Binding Protein Contaminates the Purification of Recombinant Factor IX, Blood 108:1038 (2006)).

애플리버셉트(aflibercept)는 전형적으로 말단 베타-갈락토실 잔기가 풍부한 또 다른 재조합 치료 단백질이다. 애플리버셉트 단백질은 2개의 주요 성분: 인간 IgG1의 Fc 부분에 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포 외 도메인으로부터의 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 결합 부분을 포함한다(참조, Papadopoulos et al., Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties, WO 00/75319 A1; US 7070959B2). 미국 식품의약국(FDA)은 2011년 11월에 애플리버셉트를 판매하는 것을 승인했으며, 유럽 의약품청(EMA)은 2012년 11월에 승인했다. 애플리버셉트는 Eylea®(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)의 상표명 하에, 안과 질환 또는 질병(예: 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO) 후 황반부종, 중심 망막 정맥 폐쇄(CRVO), 망막 분지 정맥 폐쇄(BRVO), 신생혈관성(습성) 연령-관련 황반변성(AMD), 맥락막 신생혈관으로 인한 손상된 시력, 당뇨병성 황반부종(DME), DME 환자의 당뇨망막병증(DR) 및 신생혈관 연령-관련 황반변성(AMD))의 치료에 있어서의 안과용 제제로 사용된다. 지브-애플리버셉트(ziv-aflibercept)는 Zaltrap®(Regeneron Pharmaceuticals, Inc.)의 상표명 하에, 전이성 대장암의 치료를 위한 정맥 내 주입으로서 개발되었다.

구조적으로, 애플리버셉트는 약 96.9kilo Daltons(kDa)의 단백질 분자량을 갖는 이량체 당단백질이다. 그것은 대략 115kDa의 총 분자량을 제공하기 위해 대략 15%의 글리코실화를 함유한다. 1차 서열에 의해 예측된 각각의 폴리펩티드 사슬상의 N-글리코실화로 추정되는 5개의 부위 모두는 탄수화물로 차지될 수 있고, 말단 시알산 잔기에서의 이질성을 포함하여 어느 정도의 사슬 이질성을 나타낼 수 있다. 그러나, CHO 세포에 의해 생산된 애플리버셉트는 갈렉틴-3의 결합 표적인 말단 베타-갈락토실 잔기가 풍부할 수 있다.

갈렉틴 및 금속 양이온과 같은 다른 숙주세포 오염물을 제거하기 위해 산업적 생산 목적에 적합하며 효과적이고 경제적인 재조합 단백질을 정제하는 방법은 본 발명이 제공하는 절실한 요구(desideratum)이다.

본 발명은 오염물(contaminant)로부터 글리코실화된(glycosylated) 재조합 목적 단백질(protein of interest)을 정제하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 다음을 포함한다:

(a) 글리코실화된(glycosylated) 재조합 목적 단백질(protein of interest, POI) 및 갈렉틴(galectin) 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP) 오염물을 포함하는 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액을 약 중성 pH에서 단백질 A 매트릭스(Protein A matrix) 상에 로딩하는 단계, 여기서 POI는 면역글로불린 Fc 도메인의 C_H2 및 C_H3 도메인 및 갈렉틴 숙주세포 단백질 오염물이 가역적으로 결합된 하나 이상의 말단 베타-갈락토실(beta-galactosyl) 잔기를 포함하고;

(b) POI가 결합된 단백질 A 매트릭스를 1 내지 3M의 염화칼슘을 포함하는 약 pH 6.0 내지 6.5의 완충제로 세척하는 단계;

(c) POI를 약 pH 4 미만의 시트르산 또는 시트레이트(citrate) 염을 포함하는 완충제로 단백질 A 매트릭스로부터 용리액 풀(eluant pool)로 용리시키는 단계, 및:

(i) 용리액 풀이 pH 3.3 내지 3.7의 pH 범위보다 더 염기성인 경우, 시트르산으로 용리액 풀을 pH 3.3 내지 3.7로 적정하고,

(ii) 선택적으로, 바이러스 불활성화를 위한 충분한 기간(일반적으로 30 내지 90분이지만, 바이러스 불활성화의 바이러스 패널 검증에 의해 실험적으로 필요에 따름) 동안 용리액 풀을 pH 3.3 내지 3.7로 유지하는 단계;

(d) pH 5.0 내지 5.5에서, (c)로부터 용리액 풀 내의 POI를 약 2 내지 15millisiemens(mS)의 낮은 전도도 완충제로 양이온 교환 매트릭스에 결합시키는 단계;

(e) 약 40 내지 100mS까지 점점 더 높은 전도도의 전해질 농도 구배로 POI를 양이온 교환 매트릭스로부터 CEX 용리액 풀로 용리시키는 단계; 및

(f) CEX 용리액 풀을 pH 5.0 내지 6.0의 높은 전도도 완충제에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC) 매트릭스에 로딩하고 HIC 매트릭스를 세척하는 단계. 본 발명의 방법은 β-갈락토실-결합 갈렉틴 숙주세포 단백질 오염물(들) 및 다른 원치 않는 오염물(예: 금속 양이온 오염물)로부터 POI를 분리한다.

글리코실화된 재조합 치료 단백질(예: 애플리버셉트, 알레파셉트, 에타너셉트, 아바타셉트, 벨라타셉트, rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트와 같지만 이에 제한되지 않음)은 본 발명의 방법을 사용하여 그러한 오염물로부터 산업적 규모로 정제될 수 있다.

전술한 요약은 본 발명의 모든 관점을 정의하려는 것이 아니며, 추가적인 관점은 실시예의 상세한 설명과 같은 다른 섹션에서 설명된다. 전체 문서는 통일된 개시로서 관련되도록 의도되었으며, 특징들의 조합이 이 문서의 동일한 문장, 단락 또는 섹션에서 함께 발견되지 않는 경우에도, 본 명세서에서 설명된 특징들의 모든 조합은 고려되는 것으로 이해되어야 한다.

전술한 것에 더하여, 본 발명은 추가적인 관점으로서, 상기 특정 단락에 의해 정의된 변형보다 임의의 방식으로 범위가 더 좁은 본 발명의 모든 실시예를 포함한다. 예를 들어, 속(genus)으로 기술된 본 발명의 특정 관점은, 속(genus)의 모든 구성원이 개별적으로 본 발명의 관점이라는 것을 이해되어야 한다. 또한, 속 또는 속의 구성원을 선택하는 것으로 기술된 관점은 속의 둘 이상의 구성원의 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 출원인(들)이 본 명세서에 기술된 본 발명의 전체 범위를 발명하였지만, 출원인은 다른 사람의 선행기술에 기술된 주제(subject matter)를 청구하려고 하지 않는다. 따라서, 특허청 또는 기타 단체(entity) 또는 개인에 의해 청구항의 범위에서 법정(statutory) 선행기술이 출원인의 관심을 끄는 경우, 그러한 청구항의 범위로부터 법정 선행기술 또는 법정 선행기술의 명백한 변형을 명확하게 배제하기 위해, 출원인(들)은 그러한 청구항의 주제(subject matter)를 재정의하기 위한 해당 특허법에 따른 보정권을 행사할 권리를 보유한다. 그러한 보정된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 변형은 또한 본 발명의 관점으로서 의도된다.

도 1은 NaCl 기울기 용리(gradient elution)에 걸친 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해 생성물 농도 및 HMW 수준에 대해 분석된 Fractogel^® SO₃ ^-CEX 크로마토그래피 분획으로부터의 데이터의 비교를 보여준다.
도 2는 Fractogel^® SO₃ ^-CEX 기울기 용리 분획으로부터의 데이터의 비교를 보여준다: 생성물 농도, HMW, 누적 생성물 수율 및 누적 풀 단량체(순도). 수직 점선은 90%의 수율을 달성하기 위한 수집 종료(end of collection, EOC) 목표를 나타낸다.
도 3은 개별 CEX 용리 구배 분획에서 갈렉틴-3 및 총 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP) 의 비교를 보여준다. 짧은 대시(dashes)가 있는 수평선은 CEX 로드의 총 CHO HCP 수준을 나타낸다. 긴 대시(dashes)가 있는 수평선은 CEX 풀의 총 CHO HCP 수준을 나타낸다.
도 4a는 pH 4.5에서 작동하는 Fractogel^® SO₃ ^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® SO₃ ^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 4b는 pH 5.0에서 작동하는 Fractogel^® SO₃ ^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® SO₃ ^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 4c는 pH 5.5에서 작동하는 Fractogel^® SO₃ ^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® SO₃ ^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 4d는 pH 6.0에서 작동하는 Fractogel^® SO₃ ^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® SO₃ ^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 5a는 pH 4.5에서 작동하는 Fractogel^® COO^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® COO^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 5b는 pH 5.0에서 작동하는 Fractogel^® COO^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® COO^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 5c는 pH 5.5에서 작동하는 Fractogel^® COO^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® COO^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 5d는 pH 6.0에서 작동하는 Fractogel^® COO^--충전 RoboColumn^® (Fractogel^® COO^--filled RoboColumn^®)으로부터의 개별 분획의 유사-크로마토그램(pseudo-chromatograms) 및 갈렉틴-3 농도로부터의 결과를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 사각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mg)를 나타내며, 삼각형은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 6은 CEX 수지 스크린에 대한 단계 수율 퍼센트 대 순도 퍼센트 (단량체 생성물)의 비교를 보여준다. Fractogel^® SO₃ ^-로부터의 결과는 열린 기호(open symbols)로 표시되고, Fractogel^® COO^-로부터의 결과는 막힌 기호(solid symbols)로 표시된다. 다이아몬드는 pH 4.5를 나타내고, 사각형은 pH 5.0을 나타내며, 삼각형은 pH 5.5를 나타내고, 원은 pH 6.0을 나타낸다.
도 7은 CEX 수지 스크린에 대한 단계 수율 퍼센트 대 갈렉틴-3 제거 퍼센트의 비교를 보여준다. Fractogel^® SO₃ ^-로부터의 결과는 열린 기호(open symbols)로 표시되고, Fractogel^® COO^-로부터의 결과는 막힌 기호(solid symbols)로 표시된다. 다이아몬드는 pH 4.5를 나타내고, 사각형은 pH 5.0을 나타내며, 삼각형은 pH 5.5를 나타내고, 원은 pH 6.0을 나타낸다.
도 8a는 Fractogel^® SO₃ ^- 수지에 대한 수율 퍼센트 상의 pH 및 염 수준의 효과를 나타내는 등고선 플롯을 보여준다.
도 8b는 Fractogel^® SO₃ ^- 수지에 대한 SEC에 의한 순도 퍼센트 상의 pH 및 염 수준의 효과를 나타내는 등고선 플롯을 보여준다.
도 8c는 Fractogel^® SO₃ ^- 수지에 대한 갈렉틴-3 농도(ng/mg) 상의 pH 및 염 수준의 효과를 나타내는 등고선 플롯을 보여준다.
도 9a는 Fractogel^® COO^- 수지에 대한 수율 퍼센트 상의 pH 및 염 수준의 효과를 나타내는 등고선 플롯을 보여준다.
도 9b는 Fractogel^® COO^- 수지에 대한 SEC에 의한 순도 퍼센트 상의 pH 및 염 수준의 효과를 나타내는 등고선 플롯을 보여준다.
도 9c는 Fractogel^® COO^- 수지에 대한 갈렉틴-3 농도(ng/mg) 상의 pH 및 염 수준의 효과를 나타내는 등고선 플롯을 보여준다.
도 10은 개별 Fractogel^® SO₃ ^- 용리 구배 분획에서 갈렉틴-3 수준의 비교를 보여준다. 원은 각 분획(g/L)의 단백질 농도를 나타내고, 사각형은 다중-속성 질량 분석법(multi-attribute mass spectrometry method, MAM)에 의해 각 분획의 갈렉틴-3 수준(ppm)을 나타내고, 삼각형은 ELISA에 의해 결정된 각 분획의 갈렉틴-3 수준(ppm)을 나타낸다. 로드에서 갈렉틴-3(ppm)의 수준은 작은 대시(ELISA로 측정됨) 및 큰 대시(MAM으로 측정됨)로 표시된다.
도 11a는 pH 5.0에서 소듐 아세테이트 및 NaCl로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11b는 pH 6.0에서 소듐 MES 및 NaCl로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11c는 pH 5.0에서 소듐 시트레이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11d는 pH 6.0에서 소듐 시트레이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11e는 pH 5.0에서 소듐 아세테이트 및 소듐 설페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11f는 pH 6.0에서 소듐 MES 및 소듐 설페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11g는 pH 6.0에서 소듐 포스페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 11h는 pH 7.0에서 소듐 포스페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Phenyl Sepharose^®패스트 플로우 하이 서브(Fast Flow High Sub)로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12a는 pH 5.0에서 소듐 아세테이트 및 NaCl로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12b는 pH 6.0에서 소듐 MES 및 NaCl로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12c는 pH 5.0에서 소듐 시트레이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12d는 pH 6.0에서 소듐 시트레이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12e는 pH 5.0에서 소듐 아세테이트 및 소듐 설페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12f는 pH 6.0에서 소듐 MES 및 소듐 설페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12g는 pH 6.0에서 소듐 포스페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 12h는 pH 7.0에서 소듐 포스페이트로 구동되는 RoboColumn^®의 Toyopearl^® 부틸(Butyl) 650M로부터의 개별 분획에서의 유사-크로마토그램, 염 농도 및 갈렉틴-3 농도를 보여준다. 다이아몬드는 생성물 농도(g/L)를 나타내고, 실선은 염 농도를 나타내며, 원은 갈렉틴-3 농도(ng/mL)를 나타낸다.
도 13은 상이한 워시(Wash) 2 완충제를 갖는 RoboColumn^® 스크린으로부터의 단백질 A(Protein A) 용리액 풀의 철 수준을 나타낸다.
도 14는 도시된 바와 같이 더 높은 시트레이트 농도를 함유하는 워시(Wash) 2 완충제를 갖는 RoboColumn^® 스크린으로부터의 단백질 A(Protein A) 용리액 풀의 철 수준을 나타낸다.
도 15는 생성물에서 철 농도에 대한 용리 및 낮은 pH 유지에 대한 시트레이트의 영향을 분석하기 위한 단백질 A(Protein A) 낮은 pH 바이러스 불활성화 실험의 도식 표현을 보여준다.
도 16은 단백질 A 워시 2 완충제(Protein A Wash 2 buffer), 단백질 A 용리 완충제 및 낮은 pH 바이러스 불활성화 적정제로서 시트레이트를 평가하는 RoboColumn^® 스크린으로부터의 CEX 용리액 풀의 철 수준을 예시한다. 흰색 막대는 철이 감지되지 않았음을 나타낸다.
도 17은 가속된 안정성을 위해 30℃에서 유지된 고 철분(high iron) 및 저 철분(low iron) 샘플 각각에서 시간에 따른 고 분자량(HMW) 수준의 비교를 보여준다.
도 18은 제제화된 고 철분(high iron) 샘플(공정 1)과 저 철분(low iron) 샘플(공정 2)의 시각적 비교를 보여준다.
도 19는 CHO 갈렉틴-3 및 철로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질을 정제하는 데 사용된 본 발명의 방법의 예시적인 실시예의 개략적인 흐름도를 보여준다.
도 20은 ICP-MS에 의해 정량화된 물 및 완충제 샘플 중 철의 농도(㎍/L)를 보여준다.
도 21은 ICP-MS에 의해 정량화된 물 및 완충제 샘플 중 구리의 농도(㎍/L)를 보여준다.
도 22는 ICP-MS에 의해 정량화된 물 및 완충제 샘플 중 아연의 농도(㎍/L)를 보여준다.
도 23은 물 세척(water flush) 및 시트레이트 완충제 세척(citrate buffer flush)로부터 규조토(DE) 깊이 필터 분획에서 관찰된 철의 농도(㎍/L)를 보여준다.
도 24는 물 세척(water flush) 및 시트레이트 완충제 세척(citrate buffer flush)로부터 규조토(DE) 깊이 필터 분획에서 관찰된 구리의 농도(㎍/L)를 보여준다.
도 25는 물 세척(water flush) 및 시트레이트 완충제 세척(citrate buffer flush)로부터 규조토(DE) 깊이 필터 분획에서 관찰된 아연의 농도(㎍/L)를 보여준다.
도 26은 본원의 실시예 5에 기재된 바와 같이, 깊이 필터에서 규조토를 통한 평형 완충제(EQ) 또는 시트레이트 완충제 세척(citrate buffer flush)와 단백질 A 친화성 크로마토그래피 및 CEX 크로마토그래피 단계, 선택적인 심층 여과 단계 사이에 혼합된 실험적 서열의 도식 표현이다.
도 27은 상이한 단백질 A 용리 및 깊이 필터 세척(depth filter flush) 조건을 갖는 단백질 A, 깊이 필터 및 CEX 풀에서 관찰된 철의 수준(ppm)을 보여준다.
도 28은 상이한 단백질 A 용리 및 깊이 필터 세척(depth filter flush) 조건을 갖는 단백질 A, 깊이 필터 및 CEX 풀에서 관찰된 구리의 수준(ppm)을 보여준다.
도 29는 상이한 단백질 A 용리 및 깊이 필터 세척(depth filter flush) 조건을 갖는 단백질 A, 깊이 필터 및 CEX 풀에서 관찰된 아연의 수준(ppm)을 보여준다.

본 명세서에서 사용된 섹션 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

정의

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되는 의미를 가진다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수형은 복수를 포함하고 복수형은 단수를 포함한다. 따라서, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "단백질(a protein)"에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함하고; "세포(a cell)"에 대한 언급은 다수의 세포 집단을 포함한다.

본 발명은 오염물로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질(protein of interest)을 정제하는 방법에 관한 것이다. 글리코실화된 재조합 목적 단백질은 면역글로불린 Fc 도메인의 하나 이상의 C_H2 및 C_H3 도메인 및 하나 이상의 말단 베타-갈락토실 잔기를 포함한다. 이러한 글리코실화된 재조합 단백질의 예는 애플리버셉트(aflibercept)이며, 이는 상업적으로 Eylea^®로도 알려져 있다. 애플리버셉트는 전형적으로 재조합 DNA 발현 기술에 의해 가장 편리하게 생산되는 애플리버셉트 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 2개의 동일한 융합 폴리펩티드 사슬의 어셈블리이다. 애플리버셉트 아미노산 서열은 다음과 같다:

SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSP N ITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDS

RKGFIIS N ATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKL

VL N CTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQ

GLYTCAASSGLMTKK N STFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR

TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY N STYRVVSVLTVLHQDWLN

GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPS

DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH

YTQKSLSLSPG//서열번호 1

이황화(Disulfide) 브릿지는 서열번호 1의 다음 아미노산 위치에서 시스테인 잔기 사이에 예상된다(상기 서열번호 1에 나타낸 밑줄 친 시스테인(C) 잔기):

30-79 (사슬내)

124-185 (사슬내)

211-211 (사슬내)

214-214 (사슬내)

246-306 (사슬내)

352-410 (사슬내).

애플리버셉트의 2개의 융합 폴리펩티드 사슬은 서열번호 1의 아미노산 211 및 214 위치에서 이황화 결합에 의해 공유적으로 연결된다. 융합 단백질은 서열번호 1의 36, 68, 123, 196 및 282 위치에서 아스파라긴 잔기에서 공유적으로 연결된 N-글리칸(배양 조건에 따라 말단 베타-갈락토실 잔기를 가질 수 있음)과 전형적으로 글리코실화된다(상기 서열번호 1에 나타낸 볼드체/이탤릭체인 아스파라긴(N) 잔기). 본 발명의 범위 내의 "애플리버셉트(aflibercept)"는 또한 융합 폴리펩티드 사슬 중 하나, 둘 또는 둘 다 아닌 것이 추가의 카르복시-말단 라이신(K) 잔기를 갖는 아미노산 서열번호 1을 갖는 실시예를 포함한다.

다른 글리코실화된 재조합 목적 단백질(proteins of interest)(또는 "POI")은 애플리버셉트, 알레파셉트, 에타너셉트, 아바타셉트, 벨라타셉트, rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트 및 다양한 치료 펩티바디를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

글리코실화된 재조합 목적 단백질은 본 발명의 방법에 의한 추가의 프로세싱을 위해 초기에 배치 또는 관류(연속 유동 바이오프로세싱) 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액에 포함된다(예를 들어, 하나 이상의 정용여과 및/또는 한외여과 및/또는 바이러스 여과 후). 필요하다면, 본 발명의 방법의 단계를 적용하기 전 또는 후에 추가의 정제 단계를 글리코실화된 재조합 목적 단백질의 제조에 적용할 수 있다. 예를 들어, POI는 예를 들어, 정용여과, 한외여과, 수산화인회석(hydroxylapatite) 크로마토그래피, 양이온 교환(CEX) 또는 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피, 또는 친화성 리간드로서 목적 또는 단백질 A 또는 단백질 G의 항원을 사용하는 친화성 크로마토그래피를 사용하여, 적절한 경우 하나 이상의 단계에 의해 정제될 수 있다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄에 기초한 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 정제하는 데 사용될 수 있다(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 권장된다(Guss et al, EMBO J. 5: 15671575 (1986)). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 대부분 아가로스지만, 다른 매트릭스도 이용 가능하다. 제어된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정적인 매트릭스는 아가로스로 달성할 수 있는 것보다 빠른 유속과 짧은 처리 시간을 허용한다. 단백질이 C_H3 도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)는 정제에 유용하다. 에탄올 침전, 역상(Reverse Phase) HPLC, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산 암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 회수할 단백질에 따라 가능한 옵션이다.

오염물로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질을 정제하기 위한 본 발명의 방법은 글리코실화된 재조합 목적 단백질(POI)을 포함하는 배치 또는 관류 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액을 약 중성 pH에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피 매트릭스(즉, 단백질 A 매트릭스)에 로딩하는 단계를 포함한다. "단백질 A(Protein A)"는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 박테리아의 세포벽에서 원래 발견된 대략 42kDa의 표면 단백질이고; 단백질 A는 S. 아우레우스(S. aureus)의 스파(spa) 유전자에 의해 인코딩되고, S. 아우레우스(S. aureus)에서의 그의 발현은 DNA 토폴로지, 세포 삼투질 및 ArlS-ArlR이라는 2-성분 시스템에 의해 제어된다(참조, Fournier, B., and Klier, A, Protein A gene expression is regulated by DNA supercoiling which is modified by the ArlS-ArlR two-component system of Staphylococcus aureus, Microbiology 150:3807-19 (2004)). 단백질 A(스파 유전자 생성물)는 면역글로불린에 결합하는 능력 때문에 생화학 연구 및 산업에서 유용하다. 단백질 A는 3-나선 다발로 접히는 5개의 상동성 Ig-결합 도메인으로 구성된다. 각각의 도메인은 많은 포유동물 종으로부터의 단백질, 가장 현저히 IgGs에 결합할 수 있다. 단백질 A에 대한 1차 결합 부위가 C_H2 및 C_H3 도메인 사이의 Fc 영역에 있다는 것이 결정학적 정제를 통해 밝혀졌다(Deisenhofer, J., Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of Protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution, Biochemistry 20 (9): 2361-70 (1981)). 또한, 단백질 A는 인간 VH3 유전자 패밀리로부터의 IgG F(ab')₂ 단편을 함유하는 인간 IgG 분자에 결합한다(참조, Sasso EH, Silverman GJ, Mannik M, Human IgA and IgG F(ab') ₂ that bind to staphylococcal Protein A belong to the VHIII subgroup, Journal of Immunology. 147 (6): 1877-83 (1991)). 단백질 A는 면역학, 생물학적 연구 및 산업적 응용에 사용하기 위해 일반적으로 산업적 발효에서 생산 및 정제된다. 천연 (또는 선천적인) 단백질 A는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 배양될 수 있고 상기 기재된 5개의 상동성 항체 결합 영역 및 세포벽 부착을 위한 C-말단 영역을 함유한다. 대장균(Escherichia coli)에서 전형적으로 생산되는 단백질 A의 재조합 버전은 또한 본 발명의 목적에 유용하다. 본 발명에 사용하기 위해, 단백질 A 매트릭스는 다양한 실시예에서 상업적으로 수득될 수 있다(예: Staphylococcus aureus로부터, Sigma Aldrich로부터 Protein A-Sepharose^®; GE Healthcare Life Sciences로부터 MabSelect^TM Protein A, MabSelect SuRe^® Protein A, MabSelect SuRe^® LX, 및 Protein A Sepharose^® FF; EMD Millipore로부터 Eshmuno^®A Protein A; Tosoh Bioscience로부터 Toyopearl^® AF-rProtein A; Thermo Fisher Scientific로부터 POROS^® Protein A; Repligen로부터 CaptivA^®단백질 A 친화성 수지(Protein A affinity resin)). 단백질 A의 재조합 버전은 일반적으로 5개의 상동성 항체 결합 도메인을 함유하지만, 본 발명의 목적상 기질, 예를 들어 수지(아가로스와 같지만, 이에 제한되지는 않음)에 대한 공유 결합을 용이하게 하기 위해 구조의 다른 부분에서 달라질 수 있다. 단백질의 정제에 유용한 컬럼에 단백질 A 매트릭스를 배치하거나 포장할 수 있다. 또한, 단백질 A 매트릭스에서 본 발명에 유용한 것은 산업적 응용에 대한 특성을 개선하기 위해 변형된 단일 도메인의 다량체 (전형적으로 사량체, 오량체 또는 육량체)인 단백질 A의 조작된 버전이다.

용어 "매트릭스(matrix)" 내에는 본 발명의 방법의 목적을 위해 관련 크로마토그래피 리간드(예: 단백질 A 또는 다른 친화성 크로마토그래피 리간드, 하전된 모이어티 또는 소수성 모이어티 등)를 갖는 수지, 비드, 나노입자, 나노섬유, 하이드로겔, 막 및 단일체 또는 임의의 다른 물리적 매트릭스가 포함된다.

글리코실화된 재조합 목적 단백질을 함유하는 배치 숙주세포 배양 또는 관류 (연속 유동 바이오프로세싱) 숙주세포 배양, 상등액 또는 여과액은 또한 글리코실화된 재조합 목적 단백질(POI)의 하나 이상의 말단 베타-갈락토실 잔기에 가역적으로 결합된 갈렉틴 숙주세포 오염물을 함유한다. 용어 "갈렉틴(galectin)"은 일반적으로 가용성 형태로 발생하는 β-갈락토시드-결합 렉틴을 의미한다. 다양한 갈 렉틴은 다양한 동물 세포 유형에 의해 발현되고 그들의 탄수화물-인식 도메인(CRD)의 아미노산 서열에 의해 구별될 수 있다. 3개의 하위군이 있다: (i) 호모이량체를 형성하기 위해 연관될 수 있는 단일 CRD를 함유하는 원형 갈렉틴; (ii) 단일 CRD 및 프롤린, 글리신 및 티로신 잔기가 풍부한 큰 아미노-말단 도메인을 갖는 것을 특징으로 하는 키메라 갈렉틴(예: 갈렉틴-3); 및 (iii) 2 개 이상의 CRD가 단일 폴리펩티드 내에서 발생하고, 전형적으로 5 내지 50 개 이상의 아미노산 잔기 길이 범위의 작은 펩티드 연결 도메인(small peptide link domain)에 의해 공유적으로 가교되거나 연결된, 탠덤(tandem)-반복 갈렉틴. 또한, 많은 갈렉틴 전사체는 상이한 이소형을 생성하기 위해 차등적으로 스플라이싱될 수 있다. 갈렉틴의 예는 일렉트로렉틴 및 다양한 S-타입(설프하이드릴-의존적) 갈렉틴을 포함한다. 일부 예는 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-4, 갈렉틴-6, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8, 갈렉틴-9, 갈렉틴-10, 갈렉틴-12, 갈렉틴-13, 및 갈렉틴-14를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다(참조, 예, Cummings RD and Liu FT, Galectins, In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, Etzler ME, editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 33; Gitt, MA et al., Galectin-4 and galectin-6 are two closely related lectins expressed in mouse gastrointestinal tract, J Biol Chem. 273(5):2954-60 (1998); Bidon, N. et al., Galectin-8: a complex sub-family of galectins (Review), Int J Mol Med. 8(3):245-50 (2001); Hadari, YR et al., Galectin-8. A new rat lectin, related to galectin-4, J Biol Chem. 270(7):3447-53 (1995); Sato, M. et al., Functional analysis of the carbohydrate recognition domains and a linker peptide of galectin-9 as to eosinophil chemoattractant activity, Glycobiology 12(3):191-97 (2002); Yang, RY et al., Cell cycle regulation by galectin-12, a new member of the galectin superfamily, J Biol Chem. 276(23):20252-60 (2001); Ramaswamy, S et al., Structural basis of multivalent galactose-based dendrimer recognition by human galectin-7, FEBS J. 2015 Jan;282(2):372-87 (2015); Patnaik, SK et al., Complex N-glycans are the major ligands for galectin-1, -3, and -8 on Chinese hamster ovary cells, Glycobiology 16(4):305-17 (2006)).

"갈렉틴-3(galectin-3)"은 예컨대 햄스터 또는 햄스터-유래 세포, 마우스 또는 마우스-유래 세포, 또는 인간 또는 인간-유래 세포와 같지만 이에 제한되지 않는 포유동물 세포의 β-갈락토시드-결합 단백질이다. 이 숙주세포 렉틴은 포유동물 종의 세포에 널리 분포되어 있다(참조, 예, Mehul, B. et al., J. Biol. Chem. 269, 18250-18258 (1994); Mehul, B. et al., Cross-linking of galectin 3, a galactose-binding protein of mammalian cells, by tissue-type transglutaminase, FEBS Lett 360:160-164 (1995); Reljic, R. et al., Mouse monoclonal IgA binds to the galectin-3/Mac-2 lectin from mouse macrophage cell lines, Immunology Letters, 93:1, 51 (2004); Henrick, K. et al., Evidence for subsites in the galectins involved in sugar binding at the nonreducing end of the central galactose of oligosaccharide ligands: sequence analysis, homology modeling and mutagenesis studies of hamster galectin-3, Glycobiology 8(1):45-57 (1998); Dumic et al., Galectin-3: An open-ended story, Biochimica and Biophysica Acta 1760:616-635 (2006)).

용어 "오염물(contaminant)" 또는 "불순물(impurity)"은 임의의 외래 또는 불쾌한(objectionable) 분자 또는 이온, 특히 DNA, RNA 또는 정제되는 재조합 단백질의 샘플에서 존재하는 정제되는 재조합 목적 단백질 이외의 단백질과 같은 생물학적 거대 분자를 지칭한다. 오염물은 예를 들어 정제되는 재조합 단백질을 분비하는 숙주세포로부터의 다른 단백질(예: 오염된 갈렉틴 숙주세포 단백질(예: 갈렉틴-3)), 또는 금속 양이온(예: 알루미늄 양이온(예: Al(III)), 바륨 양이온, 칼슘 양이온, 코발트 양이온(예: Co(II)), 구리 양이온, 철 양이온(예: Fe(II) 또는 Fe(III)), 아연 양이온, 마그네슘 양이온, 망간 양이온, 수은 양이온, 니켈 양이온 및/또는 스트론튬 양이온)을 포함한다. 단백질의 자연 환경 또는 배지의 오염 성분은 단백질에 대한 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성(예: 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물) 용질을 포함할 수 있다. 전형적으로, "단리된 단백질(isolated protein)"은 주어진 샘플의 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 25% 이상 또는 약 50% 이상을 구성한다. 일부 실시예에서, 목적 단백질(예: 애플리버셉트 융합 단백질)은 (1) 단백질의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과, 또는 (2) 환원 또는 비환원 조건하에서 착색제(예: 쿠마시(Coomassie) 청색 또는 은색 착색제)를 임의로 사용하여 SDS-PAGE에 의한 균질성 또는 다른 적절한 기술로 정제될 것이다. 단리된 재조합 단백질은 재조합 세포 내의 인 시추(in situ)를 포함한다. 그러나, 전형적으로, 단리된 목적 단백질(예: 애플리버셉트)은 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. 순도 및 불순물 수준은 CE-SDS, HCP ELISA, 갈렉틴(Galectin) ELISA, 다중-속성 질량 분석법(MAM), 질량 분석법에 의한 금속 분석 및/또는 DNA에 대한 QPCR을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 분석법을 사용하여 평가된다.

본 발명의 방법을 수행하는 과정에서 단백질 안정성을 측정하기 위한 다양한 분석 기술은 당업계에서 이용 가능하고 검토된다(예: Wang, W. (1999), Instability, stabilization and formulation of liquid protein pharmaceuticals, Int. J. Pharm. 185:129-188). 선택된 온도에서 선택된 시간동안 안정성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 제제가 실제로 2 내지 8℃에서 정말로 저장되는 경우, 일반적으로 제제는 30℃에서 적어도 1개월 동안, 또는 40℃에서 적어도 일주일 동안 및/또는 2 내지 8℃에서 적어도 2년 동안 안정해야 한다. 신속한 스크리닝을 위해, 단백질을 함유하는 용액 또는 제제는 30 내지 40℃에서 2주 내지 1개월 동안 유지될 수 있으며, 이때 단백질 안정성이 측정된다. 정상 보관 온도(30 내지 40℃보다 높은 이 보관은 보다 일반적인 냉장 온도 보관에서 더 오랜 기간 동안 발생하는 현상을 시뮬레이션하기 위한 것으로"가속 안정성(accelerated stability)"이라고 한다.

단백질의 "안정한(stable)" 용액 또는 제제는 단백질(예: 재조합 애플리버셉트 단백질)의 정제 및/또는 가공(예: 한외여과, 정용여과, 또는 기타 여과 단계, 크로마토그래피 단계, 낮은 pH 바이러스 불활성화, 바이알 충전, 수송 및/또는 저장)시 그의 물리적 안정성 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 본질적으로 유지하는 것이다. 함께, 특정 물리적 조건(예: 온도 및 pH) 하에서 특정 용액 또는 제제에서 목적 단백질의 물리적, 화학적 및 생물학적 안정성은 단백질의 "안정성(stability)"을 포함한다. 예를 들어, 영하의 온도에 저장된 단백질은 화학적, 물리적 또는 생물학적 활성에 큰 변화가 없을 것으로 예상되는 반면, 40℃에 저장된 단백질은 단백질 저장 시간에 따른 변화의 정도에 따라 물리적, 화학적 및 생물학적 활성에 변화가 있을 것으로 예상된다. 단백질 제제의 구성은 또한 변화 속도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 응집체 제제는 단백질 농도가 높을수록 더 높은 응집 속도로 단백질 농도에 의해 크게 영향을 받는다. 부형제는 또한 예를 들어, 일부 단백질에 대한 응집 속도를 증가시키는 염의 첨가와 함께 약물 제품의 안정성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 수크로스와 같은 다른 부형제는 저장 동안 응집 속도를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 불안정성은 또한 변형 유형 및 pH 의존성에 따라 더 높거나 낮은 분해 속도를 야기하는 pH에 의해 크게 영향을 받는다.

단백질이 색 및/또는 선명도의 육안 검사시, 또는 UV 광 산란 또는 크기 배제 크로마토그래피, 또는 다른 적합한 방법에 의해 측정된 바와 같이, 2차 및/또는 3차 구조(즉, 본질적인 구조), 또는 응집 및/또는 침전 및/또는 변성에 대한 최소한의 변화 징후를 나타내는 경우, 단백질은 "물리적 안정성을 유지한다(retains its physical stability)". 단백질의 물리적 불안정성, 즉 물리적 안정성의 상실은 올리고머화에 의해 이량체 및 고차 응집체, 비가시적(subvisible) 및 가시적 입자 형성 및 침전을 초래할 수 있다. 물리적 분해 정도는 목적 분해제(degradant of interest)의 유형에 따라 다양한 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 이량체 및 고차 가용성 응집체는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정량화될 수 있는 반면, 비가시적(subvisible) 입자는 광 산란, 광 차단 또는 다른 적합한 기술을 사용하여 정량화될 수 있다. 일 실시예에서, 단백질의 안정성은 낮은 백분율의 분해된(예: 단편화됨) 및/또는 응집된 단백질을 갖는 용액 중 애플리버셉트 단량체 단백질의 백분율에 따라 결정된다.

주어진 시간에서의 화학적 안정성이 공유 결합이 이루어지거나 끊어지지 않아서 단백질 성분의 1차 구조가 변화시킨 경우, 단백질은 제약 제제에서 "그의 화학적 안정성을 유지한다(retains its chemical stability)". 1차 구조의 변화는 단백질의 2차 및/또는 3차 및/또는 4차 구조의 변형을 초래할 수 있고, 응집체의 형성 또는 이미 형성된 응집체의 반전을 초래할 수 있다. 전형적인 화학적 변형은 이성질화, 탈아미드화, N-말단 고리화, 백본 가수분해, 메티오닌 산화, 트립토판 산화, 히스티딘 산화, 베타-제거, 이황화 형성, 이황화 스크램블링, 이황화 절단 및 D-아미노산 형성을 포함하는 1차 구조의 변화를 야기하는 기타 변화를 포함할 수 있다. 화학적 불안정성, 즉 화학적 안정성의 손실은 이온-교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 포커싱, 펩티드 다이제스트 분석 및 여러 유형의 질량 분석 기술을 포함한 다양한 기술에 의해 조사될 수 있다. 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변형된 형태를 검출하고 정량함으로써 평가할 수 있다. 화학적 변형은 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC), SDS-PAGE 및/또는 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화/비행 시간 질량 분석법(MALDI/TOF MS)을 사용하여 평가될 수 있는 크기 변형(예: 클리핑)을 수반할 수 있다. 다른 유형의 화학적 변형은 이온-교환 크로마토그래피, 모세관 등전점 포커싱 또는 펩티드 맵핑과 같지만 이에 제한되지 않는 전하-기반 방법에 의해 평가될 수 있는 전하 변형(예: 탈아미드화의 결과로 발생)을 포함한다.

물리적 및/또는 화학적 안정성의 상실은 변형 및 변형되는 단백질에 따라 목적 생물학적 활성의 증가 또는 감소로서 생물학적 활성의 변화를 초래할 수 있다. 주어진 시간에 단백질의 생물학적 활성이 제약 제제가 제조될 때 나타난 생물학적 활성의 약 30% 내에 있는 경우, 단백질은 제약 제제에서 "그의 생물학적 활성을 유지한다(retains its biological activity)". 활성이 시작 값의 70% 미만인 경우, 활성이 감소된 것으로 간주된다. 생물학적 분석은 리간드 결합, 효능, 세포 증식 또는 그의 생체약제(biopharmaceutical) 활성의 다른 대용의 측정과 같은 생체 내 및 시험관 내 기반 분석 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 애플리버셉트의 생물학적 활성은 ELISA에 의한 태반 성장 인자(PlGF)에의 결합 또는 VEGFA-의존 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 증식의 억제와 같은 시험관 내 리간드 결합 분석을 사용하여 추정될 수 있다.

본 발명의 목적을 위한 재조합 목적 단백질(예: 애플리버셉트, 알레파셉트, 에타너셉트, 아바타셉트, 벨라타셉트, rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트)은 전형적으로 재조합 발현 기술에 의해 생산된다. 용어 "재조합(recombinant)"은 물질(예: 핵산 또는 폴리펩티드)이 인간의 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로(즉, 비천연적으로) 변형되었음을 나타낸다. 변형은 그의 자연 환경 또는 상태 내에서 또는 그로부터 제거된 물질에 대해 수행될 수 있다. 예를 들어, "재조합 핵산(recombinant nucleic acid)"은 예를 들어 클로닝, DNA 셔플링 또는 다른 잘 알려진 분자생물학적 절차 동안 핵산을 재조합함으로써 만들어진 것이다. 이러한 분자생물학적 절차의 예는 Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)에서 찾을 수 있다. "재조합 DNA 분자(recombinant DNA molecule)"는 이러한 분자생물학적 기술에 의해 함께 결합된 DNA 단편으로 구성된다. 본원에서 사용된 용어 "재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "재조합 폴리펩티드(recombinant polypeptide)"는 재조합 DNA 분자를 사용하여 발현되는 단백질 분자를 지칭한다. "재조합 숙주세포(recombinant host cell)"는 재조합 핵산을 함유 및/또는 발현하는 세포이다. 예를 들어, 애플리버셉트 융합 단백질의 발현에 유용한 재조합 DNA 분자가 Papadopoulos et al., Modified Chimeric Polypeptides with Improved Pharmacokinetic Properties, US 7,070,959 B2; 및 WO 00/75319 A1 에 기재되어 있다.

폴리펩티드, 핵산, 숙주세포 등과 같은 생물학적 물질과 관련하여 본 명세서에서 발생하는 용어 "자연적 발생(naturally occurring)"은 자연에서 발견되는 물질을 지칭한다.

용어 "조절 서열(control sequence)" 또는 "조절 신호(control signal)"는 특정 숙주세포에서 그것이 연결되는(ligated) 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 줄 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 의존할 수 있다. 특정 실시예에서, 원핵생물에 대한 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 진핵생물에 대한 조절 서열은 전사 인자, 전사 인핸서 서열 또는 요소, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열에 대한 하나 또는 복수의 인식 부위를 포함하는 프로모터를 포함할 수 있다. 조절 서열은 리더 서열 및/또는 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 및 인핸서는 전사에 관여하는 세포 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 짧은 DNA 어레이로 구성된다(Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987)). 프로모터 및 인핸서 요소는 효모, 곤충 및 포유동물 세포 및 바이러스의 유전자를 포함하는 다양한 진핵생물 공급원으로부터 단리되었다(유사한 조절 요소(즉, 프로모터)는 또한 원핵생물에서 발견됨). 특정 프로모터 및 인핸서의 선택은 목적 단백질을 발현시키기 위해 어떤 세포 유형이 사용될 것인지에 달려있다. 일부 진핵생물 프로모터 및 인핸서는 광범위한 숙주 범위를 갖는 반면, 다른 진핵생물은 세포 유형의 제한된 서브세트(subset)에서 기능한다(검토를 위해 Voss, et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 (1986) and Maniatis, et al., Science 236:1237 (1987) 참조).

"프로모터(promoter)"는 RNA 폴리머라제가 결합하여 하나 이상의 하류 구조 유전자에 의해 메신저 RNA의 전사를 개시하는 부위를 포함하는 DNA의 영역이다. 프로모터는 유전자의 전사 시작 부위 근처, 동일한 가닥상 및 DNA의 상류(센스 가닥의 5'영역을 향하여)에 위치한다. 프로모터는 전형적으로 약 100 내지 1000bp의 길이이다.

"인핸서(enhancer)"는 유전자의 전사를 활성화시키기 위해 하나 이상의 활성화제 단백질(전사 인자)과 결합될 수있는 짧은(50 내지 1500bp) DNA 영역이다.

본원에서 사용된 용어 "작동 가능한 조합(in operable combination)", "작동 가능한 순서(in operable order)" 및 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 주어진 유전자의 전사 및/또는 원하는 단백질 분자의 합성을 지시할 수 있는 핵산 분자가 생산되는 방식으로 핵산 서열의 연결을 지칭한다. 상기 용어는 또한 기능 단백질이 생산되는 방식으로 아미노산 서열의 연결을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된(operably linked)" 벡터의 조절 서열은 이에 연결되어 단백질 코딩 서열의 발현이 조절 서열의 전사 활성에 적합한 조건 하에서 달성된다.

"폴리펩티드(polypeptide)" 및 "단백질(protein)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 펩티드 결합을 통해 공유 결합된 2개 이상의 아미노산의 분자 사슬을 포함한다. 이 용어는 생성물의 특정 길이를 지칭하지 않는다. 따라서, "펩티드(peptides)" 및 "올리고펩티드(oligopeptides)"는 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 상기 용어는 폴리펩티드의 번역 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 단백질 단편, 유사체, 돌연변이 또는 변이 단백질, 융합 단백질 등이 폴리펩티드의 의미 내에 포함된다. 상기 용어는 또한 공지된 단백질 공학 기술을 사용하여 재조합적으로 발현될 수 있는 하나 이상의 아미노산 유사체 또는 비표준(non-canonical) 또는 비천연 아미노산이 포함된 분자를 포함한다. 또한, 융합 단백질은 잘 알려진 유기 화학 기술에 의해 본원에 기술된 바와 같이 유도될 수 있다.

폴리펩티드(예: 융합 단백질, 면역글로불린 또는 항체)의 "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 폴리펩티드 서열에 관한 아미노산 서열에 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함한다. 변이체는 융합 단백질을 포함한다.

용어 "융합 단백질(fusion protein)", 예를 들어 애플리버셉트 융합 단백질은 단백질이 하나 이상의 모(parental) 단백질 또는 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 성분을 포함하는 것을 나타낸다. 전형적으로, 융합 단백질은 하나의 단백질로부터 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상이한 단백질로부터 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열과 프레임으로 부착되고, 링커에 의해 임의로 분리되는 "융합 유전자(fusion gene)"로부터 발현된다. 이어서, 융합 유전자는 재조합 숙주세포에 의해 단일 단백질로서 발현될 수 있다.

"분비된(secreted)" 단백질은 분비 신호 펩티드 서열의 결과로서 소포체(ER), 분비 소포 또는 세포 외 공간으로 향할 수 있는 단백질 및 신호 서열을 필수적으로 포함하지 않고 세포 외로 방출된 단백질을 지칭한다. 분비된 단백질이 세포 외 공간으로 방출되면, 분비된 단백질은 "성숙한(mature)" 단백질을 생산하기 위해 세포 외 프로세싱을 겪을 수 있다. 세포 외 공간으로의 방출은 세포외배출(exocytosis) 및 단백질 분해 절단(proteolytic cleavage)을 포함한 많은 매커니즘에 의해 발생할 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 애플리버셉트 융합 목적 단백질은 분비 단백질로서 숙주세포에 의해 합성될 수 있으며, 이어서 세포 외 공간 및/또는 배지로부터 추가로 정제될 수 있다.

숙주세포에서 재조합 DNA 기술에 의해 생산된 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 "가용성(soluble)"은 수용액에 존재하는 단백질이고; 단백질이 트윈-아르기닌 신호 아미노산 서열을 함유하는 경우, 가용성 단백질은 그람 음성 박테리아 숙주에서 주변 세포질 공간으로 배출되거나, 분비할 수 있는 진핵생물 숙주세포 또는 적절한 유전자(예: 킬(kil) 유전자)를 보유하는 박테리아 숙주에 의해 배양 배지로 분비된다. 따라서, 가용성 단백질은 숙주세포 내부의 봉입체(inclusion body)에서 발견되지 않는 단백질이다. 대안적으로, 맥락에 따라, 가용성 단백질은 생리적 조건 하에서 목적 수성 완충제(이러한 완충제는 요소, 구아니디늄 히드로클로라이드(guanidinium hydrochloride) 또는 리튬 퍼클로레이트와 같은 세척제 또는 카오트로픽제(chaotropic agent)를 함유하지 않음)에 다른 단백질 없이 현탁될 때, 상당한 양의 불용성 응집체를 형성하지 않고(즉, 총 단백질의 10% 미만, 전형적으로는 약 5% 미만의 응집체 형성), 세포막에 통합되어 있지 않거나, 시험관 내에서, 용해되거나, 생리적 조건 하에서 수성 완충제에 용해될 수 있는 단백질이다. 반대로, 불용성 단백질은 숙주세포에서 세포질 과립(봉입체라고 함) 내부에 변성된 형태로 존재하거나, 문맥에 따라 불용성 단백질은 생리적 조건 하에서 목적 수성 완충제(이러한 완충제는 요소, 구아니디늄 히드로클로라이드(guanidinium hydrochloride) 또는 리튬 퍼클로레이트와 같은 세척제 또는 카오트로픽제(chaotropic agent)를 함유하지 않음)에 다른 단백질 없이 (생리적으로 호환되는 온도에서) 현탁될 때, 세포질 막, 미토콘드리아 막, 엽록체 막, 소포체 막 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포막에 존재하거나 생리적 조건 하에 시험관 내 수성 완충제에서 상당량의 불용성 응집체를 형성한다(즉, 총 단백질의 약 10% 이상으로 응집체를 형성함).

용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)" 또는 "핵산(nucleic acid)"은 2개 이상의 뉴클레오티드 잔기를 함유하는 단일 가닥 및 이중 가닥 뉴클레오티드 중합체 둘 다를 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 잔기는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 형태의 뉴클레오티드 유형일 수 있다. 상기 변형은 브로모리딘 및 이노신 유도체와 같은 염기 변형, 2', 3'-디데옥시리보스와 같은 리보스 변형, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로닐라데이트 및 포스포로아미데이트와 같은 뉴클레오티드 간 연결 변형을 포함한다.

용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 200개 이하의 뉴클레오티드 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일부 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 10 내지 60개의 염기이다. 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40개의 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 돌연변이 유전자의 구축에 사용하기 위한 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 검출 분석을 위한 방사성 표지, 형광 표지, 합텐(hapten) 또는 항원 표지를 포함하는 표지를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드 서열(polynucleotide sequence)" 또는 "뉴클레오티드 서열(nucleotide sequence)" 또는 "핵산 서열(nucleic acid sequence)"은 올리고뉴클레오티드, DNA 및 RNA, 핵산 또는 문맥에 따라 뉴클레오티드 잔기의 1차 서열을 나타내는 문자열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에서의 뉴클레오티드 잔기의 1차 서열이다. 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열로부터, 주어진 핵산 또는 상보적 폴리뉴클레오티드 서열이 결정될 수 있다. 단일 또는 이중 가닥일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 게놈 또는 합성 기점의 DNA 또는 RNA가 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 논의된 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 말단은 5' 말단이고; 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 지칭한다. 초기 RNA 전사체의 5'에서 3'으로 첨가의 방향은 전사 방향으로 지칭되고; 5'에서 RNA 전사체의 5' 말단으로의 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상의 서열 영역은 "상류 서열(upstream sequences)"로 지칭되고; 3'에서 RNA 전사체의 3' 말단으로의 RNA 전사체와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥상의 서열 영역은 "하류 서열(downstream sequences)"로 지칭된다.

본원에서 사용된 "단리된 핵산 분자(isolated nucleic acid molecule)" 또는 "단리된 핵산 서열(isolated nucleic acid sequence)"은 (1) 통상적으로 핵산의 천연 공급원과 관련되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인되고 분리되거나, (2) 목적 핵산의 서열이 결정될 수 있도록 배경(background) 핵산으로부터 클로닝, 증폭, 태그 또는 달리 구별되는 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 그것이 자연에서 발견되는 형태 또는 환경(setting) 이외의 것이다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 예를 들어 핵산 분자가 천연 세포와 다른 염색체 위치에 있는 면역글로불린(예: 항체)을 통상적으로 발현하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함한다.

본원에서 사용된 용어 "핵산 분자 인코딩(nucleic acid molecule encoding)", "DNA 서열 인코딩(DNA sequence encoding)" 및 "DNA 인코딩(DNA encoding)"은 데옥시리보핵산 가닥을 따르는 데옥시리보 뉴클레오티드의 순서 또는 서열을 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 mRNA 사슬을 따라 리보뉴클레오티드의 순서를 결정하고, 또한 폴리펩티드 (단백질) 사슬을 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서 DNA 서열은 RNA 서열 및 아미노산 서열을 코딩한다.

용어 "유전자(gene)"는 생물학적 기능과 관련된 임의의 핵산을 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다. 유전자는 전형적으로 코딩 서열 및/또는 이러한 코딩 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. "유전자"라는 용어는 특정 게놈 또는 재조합 서열뿐만 아니라 이 서열에 의해 인코딩된 cDNA 또는 mRNA에도 적용된다. 유전자는 또한 예를 들어 다른 단백질에 대한 인식 서열을 형성하는 비-발현 핵산 단편을 포함한다. 전사 인자와 같은 조절 단백질이 결합하는 전사 조절 요소를 포함하는 비-발현 조절 서열은 인접한 또는 근처 서열의 전사를 초래한다.

"유전자의 발현(expression of a gene)" 또는 "핵산의 발현(expression of a nucleic acid)"은 DNA의 RNA로의 전사(선택적으로 RNA의 변형, 예를 들어 스플라이싱을 포함), RNA의 폴리펩티드로의 번역(뒤따르는 폴리펩티드의 번역 후 변형을 가능하면 포함), 또는 문맥에 의해 지시된 바와 같이, 전사 및 번역 둘 다를 의미한다.

발현 카세트는 재조합 발현 기술의 전형적인 특징이다. 발현 카세트는 목적 단백질을 인코딩하는 유전자(예: 애플리버셉트 융합 단백질 서열을 인코딩하는 유전자)를 포함한다. 진핵생물 "발현 카세트(expression cassette)"는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 세포에서 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터의 일부를 지칭한다. 이것은 진핵 세포에서 작동 가능한 mRNA 전사를 위한 프로모터, 목적 단백질(들)을 인코딩하는 하나 이상의 유전자 및 mRNA 종결 및 프로세싱 신호를 포함한다. 발현 카세트는 코딩 서열 중에서 선택 마커로서 유용한 유전자를 유용하게 포함할 수 있다. 발현에서 카세트 프로모터는 5'를 외인성 목적 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결되고; 폴리아데닐화 부위는 3 '을 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된다. 발현 카세트가 작동 가능한 한 다른 적합한 조절 서열이 또한 포함될 수 있다. 오픈 리딩 프레임은 하나 이상의 목적 단백질에 대한 코딩 서열을 임의로 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "코딩 영역(coding region)" 또는 "코딩 서열(coding sequence)"은 구조 유전자와 관련하여 사용될 때 mRNA 분자의 번역의 결과로서 초기 폴리펩티드에서 발견된 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 코딩 영역은 진핵생물에서 5'측 상의 개시자 메티오닌을 인코딩하는 뉴클레오티드 삼중항 "ATG"에 의해 및 3'측 상의 정지 코돈(즉, TAA, TAG, TGA)을 지정하는 3개의 삼중항 중 하나에 의해 제한된다.

재조합 발현 기술은 전형적으로 발현 카세트를 포함하는 재조합 발현 벡터의 용도를 포함한다.

용어 "벡터(vector)"는 단백질 코딩 정보를 숙주세포 내로 전달하기 위해 사용되는 임의의 분자 또는 실체(예: 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "발현 벡터(expression vector)" 또는 "발현 구조물(expression construct)"은 특정 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 원하는 코딩 서열 및 적절한 핵산 조절 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자를 지칭한다. 발현 벡터는 전사, 번역에 영향을 미치거나 조절하는 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 인트론이 존재하는 경우, 이에 작동 가능하게 연결된 코딩 영역의 RNA 스플라이싱에 영향을 미친다. 원핵생물에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 프로모터, 선택적으로 작동자 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능하면 다른 서열을 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 종결 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다. 분비 신호 펩티드 서열은 또한 선택적으로 목적 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 벡터에 의해 인코딩될 수 있어서, 원하는 경우, 발현된 폴리펩티드가 재조합 숙주세포에 의해 분비되어, 목적 폴리펩티드를 세포로부터 보다 용이하게 단리될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다(예, Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences, U.S. Pat. No. 5,302,697; Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, U.S. Pat. No. 6,022,952 및 U.S. Pat. No. 6,335,178; Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, U.S. Pat. No. 7,029,909; Ruben et al., 27 human secreted proteins, US 2003/0104400 A1). 다중-서브유닛 목적 단백질의 발현을 위해, 각각의 상이한 서브유닛 단량체에 대한 코딩 서열을 함유하는 적합한 수 및 비율의 개별 발현 벡터(separate expression vectors)는 숙주세포를 형질전환시키는 데 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 단일 발현 벡터는 목적 단백질의 상이한 서브유닛을 발현시키는 데 사용될 수 있다.

재조합 발현 기술은 재조합 발현 벡터를 포함하는 포유동물 숙주세포를 전형적으로 포함한다.

용어 "숙주세포(host cell)"는 핵산으로 형질전환되거나 형질전환될 수 있는 세포를 의미하며, 이에 의해 목적 유전자 또는 코딩 서열을 발현한다. 상기 용어는 목적 유전자(gene of interest)가 존재하는 한, 자손이 형태학에서 또는 원래의 모세포와의 유전적 구성에서 동일한지의 여부에 상관없이, 모세포의 자손을 포함한다. 임의의 다수의 이용 가능하고 잘 알려진 숙주세포는 재조합 애플리버셉트 융합 단백질을 생산하기 위해 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. 특정 숙주의 선택은 기술 분야에 의해 인식되는 다수의 요인에 의존한다. 이들은 예를 들어, 선택된 발현 벡터와의 호환성(compatibility), DNA 분자에 의해 인코딩된 펩티드의 독성, 형질전환 속도, 펩티드의 회복 용이성, 발현 특성, 생체-안전성 및 비용을 포함한다. 이들 요인의 균형은 모든 숙주가 특정 DNA 서열의 발현에 똑같이 효과적일 수는 없다는 것을 이해해야 한다. 이들 일반적인 지침 내에서, 배양에서 유용한 미생물 숙주세포는 박테리아(예: 대장균 (Escherichia coli sp.)), 효모(예: 사카로미세스(Saccharomyces)) 및 다른 곰팡이 세포, 조류 또는 조류 유사 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물(인간 포함) 세포(예: CHO 세포 및 HEK-293 세포)를 포함한다. 또한, 변형은 DNA 수준에서도 가능하다. 펩티드-인코딩 DNA 서열은 선택된 숙주세포와 보다 호환적인 코돈으로 변경될 수 있다. E. coli의 경우, 최적화된 코돈이 당업계에 알려져 있다. 코돈은 제한 부위를 제거하기 위해 또는 선택된 숙주세포에서 DNA의 프로세싱을 도울 수 있는 침묵 제한 부위를 포함하기 위해 치환될 수 있다. 다음으로, 형질전환된 숙주를 배양 및 정제한다. 숙주세포는 통상적인 발효 조건(예: 배치 모드 또는 연속 관류 모드) 하에서 배양되어, 원하는 화합물이 발현될 수 있다. 이러한 발효 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.

유용한 포유동물 숙주세포주의 예는 CHO-K1 세포(예: ATCC CCL61), DXB-11, DG-44, 및 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese hamster ovary cells); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CVl 라인(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포(Graham et al, J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CVl ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(human cervical carcinoma cells)(HELA, ATCC CCL 2); 개(canine) 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포암(hepatoma) 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather et al., Annals N.Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포 또는 FS4 세포; 또는 포유동물 골수종 세포이다.

"세포(cell)", "세포주(cell line)" 및 "세포 배양(cell culture)"은 종종 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에서 이러한 모든 명칭은 세포 자손을 포함한다. 예를 들어, CHO 세포로부터 "유래된(derived)" 세포는 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cell)의 세포 자손이며, 이는 임의의 수의 세대에 의해 원래의 1차 세포 모체로부터 제거될 수 있고, 또한 형질전환체(transformant) 자손 세포를 포함할 수 있다. 형질전환체(transformant) 및 형질전환된 세포는 1차 대상 세포 및 전달 수에 관계없이 이로부터 유래된 배양물을 포함한다. 고의적(deliberate)이거나 우연의(inadvertent) 돌연변이로 인해 모든 자손이 DNA 함량에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있다는 것이 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다.

숙주세포는 폴리펩티드(표적 결합 단백질 포함)의 생산을 위해 상기-기재된 핵산 또는 벡터로 형질전환 또는 형질감염되고, 프로모터의 유도, 형질전환체의 선택 또는 원하는 서열을 인코딩하는 유전자의 증폭에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양된다. 또한, 선택적 마커에 의해 분리된 전사 단위의 다중 카피를 갖는 신규한 벡터 및 형질감염된 세포주는 특히 항체와 같은 폴리펩티드의 발현에 유용하다.

용어 "형질감염(transfection)"은 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 의미하고, 외인성 DNA가 세포막 내부에 도입될 때 세포는 "형질 감염(transfected)"되었다. 다수의 형질감염 기술이 당업계에 잘 알려져 있으며 본원에 개시되어 있다(참조, 예, Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197). 이러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 모이어티를 적합한 숙주세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.

용어 "형질전환(transformation)"은 세포의 유전적 특성의 변화를 지칭하고, 세포가 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변형되었을 때 세포는 형질전환되었다. 예를 들어, 세포는 형질감염, 형질도입 또는 다른 기술을 통해 새로운 유전 물질을 도입함으로써 본래 상태로부터 유전적으로 변형된 곳에서 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입 후, 형질전환 DNA(transforming DNA)는 세포의 염색체에 물리적으로 통합함으로써 세포의 그것과 재조합될 수 있거나, 복제되지 않고 에피솜 요소(episomal element)로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수 있다. 형질전환 DNA(transforming DNA)가 세포의 분열과 함께 복제될 때 세포는 "안정적으로 형질전환된(stably transformed)" 것으로 여겨진다.

본 발명에서 글리코실화된 재조합 목적 단백질 또는 POI(예: 재조합 애플리버셉트 융합 폴리펩티드)를 생산하는데 사용되는 숙주세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. Ham's F10(Sigma), Minimal Essential Medium((MEM), Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM), Sigma)과 같은 상업적으로 이용 가능한 배지는 숙주세포 배양에 적합하다. 또한, Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Patent Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO90103430; WO 87/00195; 또는 U.S. Patent Re. No. 30,985에 기술된 임의의 배지는 숙주세포의 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예: 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염(예: 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충제(예: HEPES), 뉴클레오티드(예: 아데노신 및 티미딘), 항생제(예: Gentamycin™ 약물), 미량 원소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨) 및 포도당 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있어서, 배지에 또는 세포상에서의 생리적 조건이 숙주세포에 의해 목적 단백질의 발현을 촉진할 수 있으며, 임의의 다른 필요한 보충제는 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예컨대 온도(필수적으로는 아니지만 전형적으로, 약 37℃), pH(필수적으로는 아니지만 전형적으로, 약 pH 6.5 내지 7.5), 산소화 등은 목적 단백질의 발현을 위해 선택된 숙주세포와 함께 이전에 사용된 것들이고, 당업자에게 명백할 것이다. 배양 배지는 태아 소 혈청(FBS)과 같은 적합한 양의 혈청을 포함할 수 있거나, 바람직하게는 숙주세포는 무 혈청 배지에서의 배양에 적합할 수 있다. 일부 실시예에서, 수성 배지는 액체이므로, 숙주세포는 액체 배지 내의 세포 현탁액에서 배양된다. 숙주세포는 배치 세포 배양 또는 연속 (관류) 세포 배양 시스템에서 유용하게 성장될 수 있다.

다른 실시예에서, 포유동물 숙주세포는 예를 들어 한천 또는 아가로스를 함유하는 고체 또는 반고체 수성 배지에서 배양되어 세포가 접착하고 접착층을 형성하는 배지 또는 기질 표면을 형성할 수 있다.

숙주세포를 배양할 때, 재조합 폴리펩티드는 세포 내, 주변 세포질 공간에서 생산되거나, 배지로 직접 분비될 수 있다. 애플리버셉트와 같은 폴리펩티드가 세포 내에서 생산되는 경우, 제1단계로서, 숙주세포 또는 용해된 단편인 미립자 파편(particulate debris)은 예를 들어 원심분리, 심층 여과(depth filtration) 또는 한외여과에 의해 제거된다.

배양 완충제 또는 다른 결합/반응 분석 시약과 관련하여 "생리적 조건 하에서(under physiological conditions)"는 비공유 결합 반응과 같은 생화학적 반응이 일어나도록 하는 온도, pH 및 이온 강도 조건 하에서의 배양을 의미한다. 전형적으로, 온도는 실온 또는 최대 약 37℃의 주위 온도에서 및 pH 6.5 내지 7.5에서이다.

물질의 조성물의 "생리적으로 허용 가능한 염(physiologically acceptable salt)", 예를 들어, 목적 단백질(예: 융합 단백질 또는 항체와 같은 면역글로불린) 또는 임의의 다른 목적 단백질의 염은 임의의 염 또는 약학적으로 허용 가능한 것으로 알려져 있거나 나중에 발견된 염을 의미한다. 약학적으로 허용 가능한 염의 일부 비-제한적인 예는 아세테이트; 트리플루오로아세테이트; 히드로클로라이드 및 히드로브로마이드와 같은 히드로할라이드; 설페이트; 시트레이트; 말레이트; 타르트레이트; 글리콜레이트; 글루코네이트; 숙시네이트; 메실레이트; 베실레이트; 펜타갈로일글루코스(PentaGalloylGlucose, PGG) 및 에피갈로카테킨 갈레이트(epigallocatechin gallate, EGCG)와 같은 갈산 에스터의 염(갈산은 3,4,5 트리히드록시벤조산으로도 알려져 있음), 콜레스테릴 설페이트(cholesteryl sulfate)의 염, 파모에이트(pamoate), 탄네이트(tannate) 및 옥살레이트 염이다.

"반응 혼합물(reaction mixture)"은 생리적 배양 조건 하에서 시험관 내 목적하는 생화학적 반응, 예를 들어 공유 또는 비공유 결합 반응이 일어나도록 허용하는 데 필요한 모든 시약 및 인자를 함유하는 수성 혼합물이다.

폴리뉴클레오티드의 "도메인(domain)" 또는 "영역(region)"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)은 완전한 폴리뉴클레오티드(complete polynucleotide)까지 및 완전한 폴리뉴클레오티드(complete polynucleotide)를 포함하는 전체 폴리뉴클레오티드(entire polynucleotide)의 임의의 부분이지만, 전형적으로는 완전한 폴리뉴클레오티드(complete polynucleotide) 미만을 포함한다. 도메인은 폴리뉴클레오티드 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 접히거나(예: DNA 헤어핀 접힘) 및/또는 코딩 영역 또는 조절 영역과 같은 특정 생물학적, 생화학적, 또는 구조적 기능 또는 위치와 관련될 수 있다.

단백질의 "도메인(domain)" 또는 "영역(region)"(본원에서 상호교환적으로 사용됨)은 완전한 단백질(complete protein)까지 및 완전한 단백질(complete protein)을 포함하는 전체 단백질(entire protein)의 임의의 부분이지만, 전형적으로는 완전한 단백질(complete protein) 미만을 포함한다. 도메인은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 접히거나 및/또는 특정 생물학적, 생화학적, 또는 구조적 기능 또는 위치(예: 리간드 결합 도메인, 또는 사이토졸(cytosolic), 막관통(transmembrane) 또는 세포 외 도메인)와 관련될 수 있다.

애플리버셉트 융합 단백질과 같지만 이에 제한되지 않는 재조합 목적 단백질의 정량화는 종종 단백질 생산 또는 단백질 정제 단계 수율 (또는 애플리버셉트 또는 다른 치료적 목적 단백질을 함유하는 약물 물질 또는 약물 제품의 로트 방출 분석)을 추적하는데 유용하거나 필요하다. 따라서 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 단일클론 항체는 이러한 목적에 유용할 수 있다.

용어 "항체(antibody)" 또는 상호교환적으로 "Ab"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 완전 조립된 항체, 단일클론 항체(인간, 인간화 또는 키메라 항체 포함), 다클론 항체, 다중특이적 항체(예: 이중특이적 항체) 및 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예: Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 단일 사슬 항체, 다이아바디(diabodies))을 포함하고, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 상기의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 화학적으로 유도체화된 항체를 포함하는 온전한 분자 및/또는 단편의 다량체 또는 응집체가 고려된다. IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함한 임의의 이소타입 클래스 또는 서브클래스의 항체 또는 임의의 알로타입(allotype)이 고려된다. 상이한 이소타입은 상이한 이펙터 기능을 가질 수 있고; 예를 들어, IgG1 및 IgG3 이소타입은 항체-의존 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 활성을 가질 수 있다.

"단리된(isolated)" 단백질(예: 애플리버셉트 융합 단백질 또는 다른 재조합 목적 단백질)은 천연 환경 또는 그것이 생산 세포에 의해 분비된 배양 배지의 하나 이상의 성분으로부터 확인되고 분리된 것이다. 일부 실시예에서, 단리된 단백질은 치료, 진단, 예방, 연구 또는 다른 용도를 방해할 수 있는 천연 또는 배양 배지 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다른 오염물이 실질적으로 없다.

분자를 단백질 A 또는 단백질 A 매트릭스에 "결합하는(to bind)" 또는 "결합하는(binding)"이라는 용어는 적절한 조건(예: pH 및 선택된 염/완충제 조성물) 하에서 분자를 단백질 A에 노출시키는 것을 의미하므로, 분자는 관련될 수 있는 친화성의 물리적 매커니즘에 관계없이, 이들 조건 하에서 단백질 A에 대한 결합 친화성에 의해 단백질 A 매트릭스(예: 단백질 A 수지)안에 또는 상에 가역적으로 고정화된다(참조, 예, Jendeberg, L. et al., The Mechanism of Binding Staphylococcal Protein A to Immunoglobin G Does Not Involve Helix Unwinding, Biochemistry 35(1): 22-31 (1996); Nelson, J.T. et al., Mechanism of Immobilized Protein A Binding to Immunoglobulin G on Nanosensor Array Surfaces, Anal. Chem., 87(16):8186-8193 (2015)).

분자를 이온 교환 매트릭스(예: CEX 수지와 같은 CEX 매트릭스)에 "결합하는(to bind)" 또는 "결합하는(binding)"이라는 용어는 적절한 조건(예: pH 및 선택된 염/완충제 조성물) 하에서 분자를 이온 교환 매트릭스에 노출시키는 것을 의미하므로, 분자는 분자 및 하전된 그룹 또는 이온 교환 매트릭스의 하전된 그룹(즉, 하전된 리간드) 사이의 이온 상호작용에 의해 이온 교환 매트릭스 안에 또는 상에 가역적으로 고정화된다.

용어 "완충제(buffer)" 또는 "완충 용액(buffered solution)"은 컨쥬게이트 산-염기 범위의 작용에 의해 pH의 변화에 저항하는 용액을 지칭한다. 약 pH 4 내지 약 pH 6.5의 범위에서 pH를 제어하는 유용한 완충제의 예는 아세테이트, MES, 시트레이트, 트리스, 비스-트리스, 히스티딘, 아르기닌, 숙시네이트, 시트레이트, 글루타메이트 및 락테이트, 또는 이들의 둘 이상의 조합 또는 다른 무기산 또는 유기산 완충제를 포함하고; 인산염은 유용한 완충제의 또 다른 예이다. 나트륨, 암모늄 및 칼륨 양이온을 함유하는 염은 종종 완충 용액을 만드는 데 사용된다.

용어 "로딩 완충제(loading buffer)" 또는 "평형 완충제(equilibrium buffer)"는 경우에 따라 단백질 제제를 단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스(예: CEX 매트릭스 또는 AEX 매트릭스), 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스 상에 로딩하기 위해, 단백질 제제(예: 배치 또는 관류 배양 상등액 또는 여과액, 또는 목적 단백질을 함유하는 용리액 풀)와 혼합된 완충제, 및 염 또는 염들을 지칭한다. 이 완충제는 또한 로딩 전에 매트릭스를 평형화하고, 단백질을 로딩한 후 세척하는 데 사용된다.

용어 "세척 완충제(wash buffer)"는 본원에서 단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스(예: CEX 매트릭스 또는 AEX 매트릭스) 또는 소수성 상호작용 크로마토 그래피(HIC) 매트릭스를 통과하는 완충제를 지칭하기 위해 사용되며, 경우에 따라, 단백질 제제의 로딩 후 및 용리 전 또는 목적 단백질의 통과 후일 수 있다. 세척 완충제는 원하는 단백질의 실질적인 용리없이 하나 이상의 오염물을 제거하는 역할을 하거나 비-결합 단백질을 세척하는 데 사용될 수 있다.

용어 "용리 완충제(elution buffer)" 또는 "용리액(eluant)"은 매트릭스에 가역적으로 결합된 목적 단백질(POI)을 용리시키는 데 사용되는 완충제를 지칭한다. 본원에서 사용된 용어 "용액(solution)"은 물을 포함하는 완충 용액 또는 비-완충 용액을 지칭한다.

용어 "용리 풀(elution pool)" 또는 "용리액 풀(eluant pool)"은 매트릭스로부터 용리된 물질을 의미하며, 이 물질은 재조합 목적 단백질을 포함한다.

용어 "로딩(loading)"은 단백질 A 매트릭스, 또는 이온 교환 매트릭스(예: CEX 매트릭스) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스와 관련하여 단백질 제제(예: 배치 또는 관류 배양 상등액 또는 여과액, 또는 목적 단백질을 함유하는 용리액 풀)를 단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스, 또는 HIC 매트릭스 상으로 로딩하는 것을 의미한다.

용어 "세척(washing)"은 단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스(예: CEX 매트릭스) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스와 관련하여 경우에 따라 단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스 또는 HIC 매트릭스를 통해 또는 그 위에 적절한 완충제를 통과시키는 것을 의미한다.

오염물로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질을 정제하기 위한 본 발명의 방법은 1 내지 3M의 염화칼슘을 포함하는 약 pH 6.0 내지 6.5의 완충제로 POI가 가역적으로 결합된 단백질 A 매트릭스를 세척하는 것을 포함한다. 보다 바람직하게는, 세척 완충제 중 염화칼슘의 농도는 2 내지 2.7M의 염화칼슘, 예를 들어 약 2.0M, 약 2.1M, 약 2.2M, 약 2.3M, 약 2.4M, 약 2.5M, 약 2.6M, 또는 약 2.7M의 염화칼슘이다.

단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스(예: CEX 매트릭스)로부터 분자(예: 원하는 재조합 단백질 또는 오염물)를 "용리하는(eluting)"이라는 용어는 전형적으로 용리 완충제를 단백질 A 매트릭스 또는 이온 교환 매트릭스에 통과시킴으로써 이러한 물질로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다.

단백질 정제와 관련하여 사용되는 용어 "분리된(separate)" 또는 "단리된(isolate)"은 원하는 단백질 및 제2단백질 둘 다 또는 다른 오염물 또는 불순물을 포함하는 혼합물에서 제2단백질 또는 다른 오염물 또는 불순물로부터 원하는 단백질의 분리를 지칭하므로, 원하는 단백질의 분자의 적어도 대부분은 제2단백질의 분자의 적어도 대부분 또는 다른 오염물 또는 불순물을 포함하는 혼합물의 부분으로부터 제거된다.

재조합 목적 단백질(즉, "POI") 및 하나 이상의 오염물을 포함하는 조성물 또는 용액으로부터 원하는 단백질을 "정제(purify)" 또는 "정제하는(purifying)"이라는 용어는 조성물 또는 용액으로부터 하나 이상의 오염물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 조성물 또는 용액에서 원하는 재조합 단백질의 순도의 정도를 증가시키는 것을 의미한다.

용어 "치료적 생물학적 생성물(therapeutic biologic product)"는 인간의 질병 또는 질환의 예방, 치료 또는 치유에 적용 가능한 단백질을 의미한다. 치료적 생물학적 생성물의 예는 단일클론 항체, 천연 단백질(예: 수용체, 리간드, 호르몬, 효소 또는 사이토카인)의 재조합 형태, 융합 단백질, 펩티바디 및/또는 단량체 도메인 결합 단백질(예: LDL 수용체 A-도메인, 트롬보스폰딘 도메인, 티로글로불린 도메인, 트레포일/PD 도메인, VEGF 결합 도메인, EGF 도메인, 아나토 도메인, 노치/LNR 도메인, DSL 도메인, 인테그린 베타 도메인 및 Ca-EGF 도메인으로부터 선택된 도메인에 기초함)을 포함한다.

용어 "펩티바디(peptibody)"는 항체 C_H1, CL, VH, 및 VL 도메인 및 Fab and F(ab)₂을 제외하고 항체 Fc 도메인(즉, 적어도 C_H2 및 C_H3 항체 도메인)을 포함하는 융합 단백질 분자를 지칭하며, 상기 Fc 도메인은 하나 이상의 펩티드, 바람직하게는 약리학적으로 활성인 펩티드에 부착된다. 펩티바디의 생산은 PCT 공보 WO00/24782에 일반적으로 기재되어 있다.

용어 "양이온 교환 매트릭스(cation exchange matrix)" 또는 "CEX 매트릭스(CEX matrix)"는 음으로 하전되고 고체상을 통과하거나 통과하는 수용액에서 양이온과의 교환을 위한 자유 양이온을 갖는 고체상을 지칭한다. 음전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 고체상에 부착시킴으로써(예: 공유 연결에 의함) 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 전하는 고체상의 고유 특성일 수 있다(예: 전체 음전하를 갖는 실리카의 경우와 같음). 양이온 교환("CEX") 매트릭스(예: CEX 수지)는 단백질의 정제에 유용한 컬럼에 위치되거나 패킹될 수 있다. CEX는 단백질 고 분자량(HMW) 종뿐만 아니라 숙주세포 단백질, DNA 및 잔류 단백질 A를 제거하는 효과적인 단계이다(Zeid, et al., (2008). Biotechnology and Bioengineering 102, 971-976; Yigzaw, Y., et al., (2009), Current Pharmaceutical Biotechnology 10, 421-426; Gagnon, P., Purification tools for monoclonal antibodies. 1996: Validated Biosystems, Inc.; Stein, A., and Kiesewetter, A. (2007). Journal of Chromatography B 848, 151-158; Staby, A., et al., (2006), Journal of Chromatography 1118, 168-179). 일반적으로, CEX는 단백질이 표적 분자의 pI 미만인 pH에서 낮은 전도도 조건하에 CEX 매트릭스(예: CEX 수지)에 결합되는 바인드-및-용리 모드(bind-and-elute mode, BEM)에서 작동된다. 결합된 단백질의 용리는 전도도를 증가시키고 및/또는 pH 이동을 유도함으로써 전형적으로 달성된다. 이는 선형 구배 또는 미리 결정된 조건으로의 단계 용리에 걸쳐 수행될 수 있다. 불순물, 특히 HMW 종은 종종 mAb 생성물보다 더 밀접하게 결합하며 용리 조건 및 풀 수집 기준을 조정하여 원하는 주요 분획으로부터 분리될 수 있다(Yigzaw, Y., et al., (2009) supra; Gagnon, P., et al., (1996) supra; Pabst, T. M., et al., (2009) Journal of Chromatography 1216, 7950-7956). 상업적으로 이용 가능한 유용한 CEX 매트릭스의 예는 EMD Millipore로부터 Fractogel^® COO^-, Fractogel^® SO₃ ^-, 또는 Eshmuno^® S; GE Healthcare Life Sciences로부터 SP Sepharose^® FF 또는 Capto^TM S; 및 Thermo Fisher Scientific로부터 POROS^® XS; Tosoh Bioscience로부터 Toyopearl^® Sulfate-650-F를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

용어 "음이온 교환 매트릭스(anion exchange matrix)" 또는 "AEX 매트릭스(AEX matrix)"는 양으로 하전되고 고체상을 통과하거나 통과하는 수용액에서 음이온과의 교환을 위한 자유 음이온을 갖는 고체상을 지칭한다. 전하는 하나 이상의 양으로 하전된 리간드를 고체상에 부착시킴으로써(예: 공유 연결) 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 전하는 고체상의 고유 특성일 수 있다. 음이온 교환("AEX") 매트릭스(예: AEX 수지)는 단백질의 정제에 유용한 컬럼에 위치되거나 패킹될 수 있다.

용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피 매트릭스(hydrophobic interaction chromatography matrix)" 또는 "HIC 매트릭스(HIC matrix)"는 물질의 표면 소수성에 기초하여 물질과 차별적으로 상호작용하는 고체상 물질 또는 매트릭스를 지칭한다(참조, 예, Queiroz, J.A. et al., Hydrophobic interaction chromatography of proteins, J. Biotechnol. 87(2):143-59 (2001); Chen, J. et al., Comparison of standard and new generation hydrophobic interaction chromatography resins in the monoclonal antibody purification process, Journal of Chromatography A 1177(2): 272-81 (2008)). 다양한 적합한 HIC 매트릭스는 상업적으로 이용 가능한, 예를 들어, Bio-Rad로부터 Macro-Prep^®t-Butyl과 같은 Macro-Prep^® HIC resins; Tosoh Bioscience로부터 Toyopearl^® Butyl, Toyopearl^® Butyl 650M, Toyopearl^® Hexyl, Toyopearl^® Hexyl 650C 또는 Toyopearl^® Phenyl; EMD Millipore로부터 Fractogel^®EMD phenyl 650; 및 GE Healthcare Life Sciences로부터 Phenyl Sepharose^® Fast Flow High Sub 또는 Phenyl Sepharose^® Fast Flow Low Sub이다. HIC 모이어티를 포함하는 멀티-모달 수지는 또한 본 발명의 방법을 실시하는 데 유용한 HIC 매트릭스일 수 있다. HIC 매트릭스(예: HIC 수지)는 단백질의 정제에 유용한 컬럼에 위치되거나 패킹될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생한 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 표적 결합 단백질인 단일클론 항체는 상이한 에피토프에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 개별 항원 부위 또는 에피토프에 대해 지시되는 고도로 특이적인 결합제이다. 단일클론 항체의 비제한적 예는 뮤린, 토끼, 랫트, 치킨, 키메라, 인간화 또는 인간 항체, 완전 조립된 항체, 다중특이적 항체(이중특이적 항체 포함), 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(Fab, Fab', F(ab)₂, Fv, 단일 사슬 항체, 다이아바디(diabodies) 포함), 맥시바디, 나노바디 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 상기 CDRs을 포함하는 재조합 펩티드 또는 그의 변이체 또는 유도체를 포함한다.

개질제(modifier) "단일클론(monoclonal)"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)에 의해 처음 기술된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다(참조, 예, U.S. Pat. No. 4,816,567). "단일클론 항체(monoclonal antibodies)"는 또한 예를 들어 Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"은 각각 경쇄(LC)에 공유적으로 연결된 2개의 이량체화된 중쇄(HC)를 포함하는 완전한 항체; 단일의 이량체화되지 않은 면역글로불린 중쇄 및 공유적으로 연결된 경쇄(HC+LC), 또는 키메라 면역글로불린(경쇄+중쇄)-Fc 이종삼량체(소위 "반구체(hemibody)")를 포함한다. "면역글로불린"은 단백질이지만, 반드시 표적 결합 단백질일 필요는 없다.

"항체(antibody)"에서, 각각의 사량체는 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 약 220개 아미노산(약 25kDa)의 하나의 "경(light)"쇄 및 약 440개 아미노산(약 50 내지 70kDa)의 하나의 "중(heavy)"쇄를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 "가변(variable)"("V") 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 가변 영역은 상이한 항체들 사이에서 다르다. 불변 영역은 상이한 항체들 사이에서 동일하다. 각각의 중쇄 또는 경쇄의 가변 영역 내에, 표적 결합 단백질인 항체의 경우에 항원에 대한 항체의 특이성을 결정하는 것을 돕는 3개의 초가변 하위영역(hypervariable subregions)이 존재한다. 초가변 영역 사이의 가변 도메인 잔기를 프레임워크 잔기라하며, 일반적으로 상이한 항체 중에서 다소 상동성이다. 면역글로불린은 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 부류에 배정될 수 있다. 인간 경쇄는 카파(

) 및 람다() 경쇄로 분류된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 10개 이상의 아미노산의 "D"영역을 또한 포함하는 중쇄와 약 12개 이상의 아미노산의 "J"영역에 의해 연결된다. 일반적으로 참조, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). "항체(antibody)"는 또한 재조합적으로 제조된 항체, 및 글리코실화되거나 글리코실화가 결여된 항체를 포함한다.

용어 "경쇄(light chain)" 또는 "면역글로불린 경쇄(immunoglobulin light chain)"는 전장의(full-length) 경쇄 및 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장의(full-length) 경쇄는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다.

용어 "중쇄(heavy chain)" 또는 "면역글로불린 중쇄(immunoglobulin heavy chain)"는 전장의 중쇄 및 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장의 중쇄는 가변 영역 도메인, V_H 및 3개의 불변 영역 도메인, C_H1, C_H2, 및 C_H3을 포함한다. V_H 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에 있고, C_H 도메인은 카르복실-말단에 있으며, C_H3은 폴리펩티드의 카르복시-말단에 가장 가깝다. 중쇄는 뮤(μ), 델타(δ), 감마(γ), 알파(α) 및 엡실론(ε)으로 분류되며, 항체의 이소 타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위유형 포함), IgA(IgA1 및 IgA2 하위유형 포함), IgM 및 IgE를 포함한 모든 이소타입일 수 있다. 이들 중 몇몇은 서브클래스 또는 이소타입(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)으로 더 나뉠 수 있다. 상이한 IgG 이소타입은 항체-의존 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 및 보체-의존 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)과 같은 상이한 이펙터 기능 (Fc 영역에 의해 매개됨)을 가질 수 있다. ADCC에서, 항체의 Fc 영역은 천연 킬러 및 대식세포와 같은 면역 이펙터 세포의 표면상의 Fc 수용체(Fc.gamma.Rs)에 결합하여, 표적 세포의 식균작용 또는 용해를 초래한다. CDC에서, 항체는 세포 표면에서 보체 캐스케이드를 유발함으로써 표적화된 세포를 사멸시킨다.

"Fc 영역(Fc region)", 또는 본원에서 상호교환적으로 사용되는 "Fc 도메인(Fc domain)" 또는 "면역글로불린 Fc 도메인(immunoglobulin Fc domain)"은 2개의 중쇄 단편을 함유하며, 이는 전체 항체에서 항체의 C_H1 및 C_H2 도메인을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합 및 C_H3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.

용어 "살바지 수용체 결합 에피토프(salvage receptor binding epitope)"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 IgG 분자(예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

항체의 구조 및 생성에 대한 상세한 설명은 Roth, D. B., and Craig, N. L., Cell, 94:411-414 (1998)를 참조하며, 그 전문은 본원에서 참조로 포함된다. 간단하게, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 DNA를 생성하는 과정은 주로 B-세포의 발생에서 일어난다. 다양한 면역글로불린 유전자 단편의 재배열 및 결합 전에, V, D, J 및 불변(C) 유전자 단편은 일반적으로 단일 염색체에서 비교적 근접한 것으로 발견된다. B-세포-분화 동안, V, D, J (또는 경쇄 유전자의 경우에는 V 및 J만) 유전자 단편의 각각의 적절한 패밀리 구성원 중 하나는 재조합되어 중쇄 및 경쇄 면역글로불린(heavy and light immunoglobulin) 유전자의 기능적으로 재배열된 가변 영역을 형성한다. 이 유전자 단편 재배열 과정은 순차적인 것으로 보인다. 먼저, 중쇄 D-J 조인트가 만들어진 다음, 중쇄 V-DJ 조인트와 경쇄 V-J 조인트가 이어진다. V, D 및 J 단편의 재배열에 추가하여, 경쇄의 V 및 J 단편이 결합되고 중쇄의 D 및 J 단편이 결합된 위치에서 가변 재조합에 의해 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 1차 레퍼토리에서 추가적인 다양성이 생성된다. 경쇄에서의 이러한 변이는 전형적으로 V 유전자 단편의 마지막 코돈 및 J 단편의 첫번째 코돈 내에서 발생한다. 결합에서 유사한 부정확은 D와 J_H 단편 사이의 중쇄 염색체에서 발생하고 10개 뉴클레오티드 이상으로 확장될 수 있다. 또한, 몇몇 뉴클레오티드는 D 및 J_H 사이 및 게놈 DNA에 의해 인코딩되지 않은 V_H 및 D 유전자 단편 사이에 삽입될 수 있다. 이들 뉴클레오티드의 첨가는 N-영역 다양성으로 알려져 있다. 가변 영역 유전자 단편에서 이러한 재배열의 순 효과 및 이러한 결합 동안 발생할 수 있는 가변 재조합은 1차 항체 레퍼토리의 생산이다.

용어 "초가변(hypervariable)" 영역은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 초가변 영역은 상보성 결정 영역 또는 CDR로부터의 아미노산 잔기[즉, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에 기술된 바와 같이 경쇄 가변 도메인에서 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 잔기 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3) 잔기]를 포함한다. 단일 CDR조차도 모든 CDRs을 함유하는 전체 항원 결합 부위보다 낮은 친화도로 항원을 인식하고 결합할 수 있다. "프레임워크(framework)" 또는 "FR" 잔기는 초가변 영역 잔기 이외의 가변 영역 잔기이다.

초가변 "루프(loop)"로부터의 잔기의 대안적인 정의는 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)에 경쇄 가변 도메인에서 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 잔기 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3) 잔기로서 기재되어 있다.

용어 "표적 결합 단백질"(TBP)은 애플리버셉트, 알레파셉트, 에타너셉트, 아바타셉트, 벨라타셉트, rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트, 또는 항체의 항체 또는 면역학적 기능성 단편, 및 목적하는 표적 모이어티에 특이적으로 결합하도록 원하는 표적 결합 특성을 갖는 CDR 또는 다른 리간드 결합 모이어티로부터 유래된 서열을 함유하는 다른 재조합 단백질을 포함한다.

일반적으로, 일반적으로, 표적 결합 단백질은 유사한 결합 분석 조건 하에서 다른 관련없는 표적에 대한 친화도에 비해 그것이 표적 모이어티 또는 리간드에 대해 상당히 높은 결합 친화도를 가지며, 결과적으로 구별될 수 있는 경우, 목적의 표적 모이어티 또는 리간드에 "특이적으로 결합(specifically binds)"한다. 전형적으로, 표적 결합 단백질은 해리 상수(K_D)가 10^-8M 이하일 때 그의 표적에 "특이적으로 결합"한다고 한다. 표적 결합 단백질은 K_D가 10^-9M 이하일 때 "높은 친화도(high affinity)", 및 K_D가 10^-10M 이하일 때 "매우 높은 친화도(very high affinity)"로 표적에 특이적으로 결합한다.

용어 "동일성(identity)"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정된 바와 같이, 둘 이상의 폴리펩티드 분자 또는 둘 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "동일성 백분율(percent identity)"은 비교된 분자에서 아미노산 또는 뉴클레오티드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하고 비교되는 분자의 가장 작은 크기에 기초하여 계산된다. 이러한 계산의 경우, 정렬의 차이(있는 경우)는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")으로 해결해야 한다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩티드의 동일성을 계산하기 위해 사용될 수 있는 방법은 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; 및 Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 서열 동일성은 2개의 폴리펩티드의 아미노산 위치에서의 유사성을 비교하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드 서열은 각각의 잔기의 최적의 일치를 위해 정렬된다(하나 또는 두 서열의 전체 길이를 따라, 또는 하나 또는 두 서열의 예정된 부분을 따름). 이 프로그램은 기본 오프닝 패널티 및 기본 갭 패널티를 제공하며, PAM 250과 같은 스코어링 매트릭스[표준 스코어링 매트릭스; 참조 Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp. 3 (1978)]는 컴퓨터 프로그램과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일성 백분율은 다음과 같이 계산될 수 있다: 동일 일치의 총 갯수에 100을 곱한 다음, 두 서열을 정렬하기 위해 일치된 길이(matched span) 내에서 더 긴 서열의 길이 및 더 긴 서열에 도입된 간격 수를 합한 값으로 나눈다. 동일성 백분율을 계산함에 있어서, 비교되는 서열은 서열 사이에서 가장 큰 일치를 제공하는 방식으로 정렬된다.

GCG 프로그램 패키지는 동일성 퍼센트를 결정하는 데 사용될 수 있는 컴퓨터 프로그램이며, 이 패키지는 GAP(Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)을 포함한다. 컴퓨터 알고리즘 GAP은 서열 동일성 퍼센트가 결정될 2개의 폴리펩티드 또는 2개의 폴리뉴클레오티드를 정렬하는 데 사용된다. 서열은 각각의 아미노산 또는 뉴클레오티드(알고리즘에 의해 결정된 "일치된 길이(matched span)")의 최적 일치를 위해 정렬된다. 갭 오프닝 패널티(3배로 계산되고, 평균 대각선으로서, "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 일치에 할당된 점수 또는 숫자임) 및 갭 확장 패널티(일반적으로 갭 오프닝 패널티의 1/10배) 및 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다. 특정 실시예에서, 표준 비교 매트릭스(참조, PAM 250 비교 매트릭스에 대한 Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352; BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대한 Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919)는 또한 알고리즘에 의해 사용된다.

GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 권장 파라미터는 다음을 포함한다:

알고리즘: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;

비교 매트릭스: Henikoff et al., 1992, supra로부터의 BLOSUM 62;

갭 패널티: 12 (앤드 갭에 대한 패널티는 없음)

갭 길이 패널티: 4

유사성의 임계값: 0

2개의 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정 정렬 방식은 2개의 서열의 짧은 영역만을 매칭시킬 수 있고, 이 작은 정렬된 영역은 2개의 전장 서열 사이에 유의한 관계가 없더라도 매우 높은 서열 동일성을 가질 수 있다. 따라서, 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)은 원하는 경우 표적 폴리펩티드의 50개 이상의 인접(contiguous) 아미노산에 걸쳐있는 정렬을 초래하도록 조정될 수 있다.

용어 "변형(modification)"은 목적 단백질(예: 애플리버셉트, 알레파셉트, 에타너셉트, 아바타셉트, 벨라타셉트, rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트)과 관련하여 사용될 때 하나 이상의 아미노산 변화(치환, 삽입 또는 삭제 포함); 화학적 변형; 치료제 또는 진단제와의 접합에 의한 공유적 변형; 표지(예: 방사성원소 또는 다양한 효소로); PEG 화와 같은 공유 중합체 부착(폴리에틸렌 글리콜로의 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 당업자에게 공지된 방법에 의해, 단백질은 "엔지니어링된(engineered)" 단백질의 코딩 서열이 발현 카세트에 포함되기 전에 개선된 표적 친화도, 선택성, 안정성 및/또는 제조성을 위해 "엔지니어링(engineered)"되거나 변형될 수 있다.

용어 "유도체(derivative)"는 목적 단백질(예: 애플리버셉트, 알레파셉트, 에타너셉트, 아바타셉트, 벨라타셉트, rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트)과 관련하여 사용될 때 치료제 또는 진단제와의 접합, 표지(예: 방사성원소 또는 다양한 효소로); PEG 화와 같은 공유 중합체 부착(폴리에틸렌 글리콜로의 유도체화) 및 비-천연 아미노산의 화학적 합성에 의한 삽입 또는 치환에 의해 공유적으로 변형된 단백질을 지칭한다.

클로닝 DNA

DNA의 클로닝은 표준 기술을 사용하여 수행된다(참조, 예, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, 본원에서 참조로 포함됨). 예를 들어, cDNA 라이브러리는 폴리A+ mRNA, 바람직하게는 막-관련 mRNA의 역전사에 의해 구축될 수 있고, 라이브러리는 인간 면역글로불린 폴리펩티드 유전자 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 스크리닝된다. 그러나, 한 실시예에서, 중합효소연쇄반응(PCR)은 목적 면역글로불린 유전자 단편(예: 경쇄 또는 중쇄 가변 단편)을 인코딩하는 cDNAs(또는 전장 cDNAs의 부분)를 증폭시키는 데 사용된다. 증폭된 서열은 임의의 적합한 벡터(예: 발현 벡터, 미니유전자 벡터 또는 파지 디스플레이 벡터)로 용이하게 클로닝될 수 있다. 목적 폴리펩티드(예: 애플리버셉트 융합 폴리펩티드 서열)의 일부분의 서열을 결정할 수 있는 한 사용되는 특정 클로닝 방법은 중요하지 않다는 것을 이해할 것이다.

항체 핵산의 하나의 공급원은 목적 항원으로 면역화된 동물로부터 B세포를 수득하고 이를 불멸 세포(immortal cell)에 융합시킴으로써 생산된 하이브리도마이다. 대안적으로, 핵산은 면역화된 동물의 B세포(또는 전체 비장)로부터 단리될 수 있다. 항체를 인코딩하는 또 다른 핵산 공급원은 예를 들어 파지 디스플레이 기술을 통해 생성된 그러한 핵산의 라이브러리이다. 목적 펩티드, 예를 들어 원하는 결합 특성을 갖는 가변 영역 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 패닝(panning)과 같은 표준 기술에 의해 확인될 수 있다.

DNA의 서열 분석은 표준 기술을 사용하여 수행된다(참조, 예, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Guide, Vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, and Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 본원에서 참조로 포함됨). 클로닝된 핵산의 서열을 유전자 및 cDNA의 공개된 서열과 비교함으로써, 당업자는 서열분석된 영역에 따라 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 유전자 서열 정보의 한 가지 출처는 National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD이다.

단리된 DNA는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되거나 발현 벡터에 위치될 수 있고, 이는 이후 재조합 목적 단백질을 생산하지 않는 숙주세포로 형질감염되어 재조합 숙주세포에서 단백질의 합성을 지시한다. 면역글로불린 및 다른 단백질의 재조합 생산은 당업계에 잘 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 예비서열 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 위치되는 경우 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된다는 것은 연결되는 DNA 서열이 연속적이며, 분비 리더의 경우 연속적이며 판독 단계라는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 연결(linking)은 편리한 제한 위치에서 연결(ligation)에 의해 달성된다. 그러한 부위가 존재하지 않으면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 통상적인 관례에 따라 사용된다.

많은 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 벡터 성분은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 신호 서열(예를 들어, 발현된 단백질의 직접 분비; 복제 기점, 하나 이상의 선택적 마커 유전자(예를 들어, 항생제 또는 다른 약물 내성을 부여하고, 영양요구성(auxotrophic) 결핍증을 보완하거나, 또는 배지에서 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급할 수 있음), 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열, 이들 모두는 당업계에 잘 알려져 있다.

물 및 다른 성분의 순도

본 발명에 사용되는 물 및 모든 다른 성분은 바람직하게는 관심있는 관할 구역(jurisdiction of interest)(예: United States Pharmacopeia(USP), European Pharmacopeia, Japanese Pharmacopeia, 또는 Chinese Pharmacopeia 등)에서 이러한 약학 조성물 및 약제에 필요한 적용 가능한 법적 또는 약전(pharmacopoeial) 표준을 충족하는 순도 수준이다. 예를 들어, USP에 따르면, 주사용 물(Water for Injection)은 제품 독소 함량을 조절해야 하는 비경구 및 기타 제제의 제조 및 특정 장비 및 비경구 제품-접촉 구성요소의 세척과 같은 다른 제약적 적용에서 부형제로 사용되고; 주사용 물의 생성을 위한 공급원 또는 급수의 최소한의 품질은 U.S. Environmental Protection Agency(EPA), EU, Japan, 또는 WHO에 의해 정의된 식수이다.

환자에게 투여하기 전에, 치료적 재조합 목적 단백질은 무균성(sterility), 내독소(endotoxin) 결핍 또는 바이러스 오염물 등에 관한 관심있는 관할 구역(jurisdiction of interest)의 약학 조성물 및 약제에 필요한 적용 가능한 법적 또는 약전(pharmacopoeial) 표준을 충족시켜야 한다.

완충 시스템

오염물로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질을 정제하기 위한 본 발명의 방법에 사용된 완충제(들)는 약 5 내지 100mM 농도 범위의 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법을 실시하기에 적합한 완충 시스템은 포스페이트 완충제, MES 완충제, 트리스(TRIS) 완충제, 비스-트리스(BIS-TRIS) 완충제, 히스티딘 완충제, 아르기닌 완충제, 아세테이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 시트레이트 완충제, 글루타메이트 완충제 및 락테이트 완충제로부터 선택될 수 있고; 또는 완충제는 이들 완충 시스템 중 둘 이상의 조합일 수 있다. 본 발명의 일부 유용한 실시예는 약 5mM 내지 약 20mM 범위의 완충제 농도를 갖고, 다른 실시예는 약 5 내지 약 10mM의 완충제 농도를 갖는다.

사용된 완충제는 임의로 비이온성 계면활성제를 약 0.001(w/v) 내지 약 0.1%(w/v)의 농도로 함유할 수 있다. 유용한 비이온성 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, Brij^®35(즉, 폴리에틸렌 글리콜 도데실 에테르), 폴록사머 188(즉, Pluronic F68; 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체; 폴리(에틸렌 옥사이드-코-폴리프로필렌 옥사이드)) 또는 Triton^TM X-100(즉, 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페닐-폴리에틸렌 글리콜))일 수 있다. 또한, 본 발명을 실시하기 위해 "비이온성 계면활성제"내에 알킬사카라이드 또는 알킬글리코시드가 포함된다(예, Aegis Therapeutics, LLC에 의해 상표명 ProTek^®로 판매; 참조, 예, Maggio, Stabilizing Alkylglycoside Compositions And Methods Thereof, US 8,133,863 B2).

전해질

오염물로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질을 정제하기 위한 본 발명의 방법은 단백질 A 매트릭스로부터의 POI의 용리로부터 발생하는 용리액 풀 내의 POI를 pH 5.0 내지 5.5에서 낮은 전도도 완충제로 양이온 교환 매트릭스에 결합시키는 단계를 포함한다. 이것은 전형적으로 약 2 내지 15mS의 전도도를 갖는 완충제이다. 선택적으로, 용리액 풀의 POI를 단백질 A 매트릭스에서 양이온 교환 매트릭스로 결합하기 전에, 용리액 풀은 규조토(diatomaceous earth)를 통해 심층 여과(depth filtration)될 수 있다. 바람직하게는, 선택적 심층 여과 단계에서 사용된 규조토는 약 0.1M 내지 약 1M 시트레이트(약 pH 4 내지 약 pH 6의 완충제)의 시트레이트 완충제로 세척함으로써 사용 전에 사전 조정된다. 이 사전 조정된 시트레이트 완충제 세척은 선택적인 심층 여과에 사용될 규조토로부터 일부 부착성 금속 양이온을 상당히 제거할 수 있다.

양이온 교환 매트릭스에 결합한 후, POI는 양이온 교환 매트릭스로부터 최대 약 40 내지 100mS까지 증가하는 전도도의 전해질 농도 구배(선형 또는 단계 구배)를 사용하여 CEX 용리액 풀로 용리된다. 따라서, CEX 용리에 적합한 구배 범위는 2 내지 100mS의 전도도 범위를 갖는다. 특정 POI에 따라, 유효 구배 범위는 2 내지 70mS일 수 있으며, 예를 들어, 애플리버셉트를 정제하기 위한 유용한 구배 범위는 약 15mS 내지 약 66mS의 범위에서 완충 전도도를 증가시킨다. 전도도 조정에 유용한 전해질은 염화나트륨, 염화칼륨 및 황산나트륨을 포함한다.

본 발명의 방법의 다음 단계는 CEX 용리액 풀을 pH 5.0 내지 6.0의 높은 전도도 완충제 중의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매트릭스에 로딩하고 HIC 매트릭스를 세척하는 것이다(높은 전도도 완충제(예: 일반적으로 3개 이상의 컬럼 부피)의 여러 부피로). HIC 로딩을 위한 높은 전도도는 전형적으로 약 40 내지 100mS의 전도도이다. HIC 세척 완충제는 높은 전도도 HIC 로딩 완충제와 동일한 완충제 또는 상이한 완충제일 수 있지만, pH 5.0 내지 6.0에서 동일하거나 더 큰 전도도이어야 한다. 전도도 조정에 유용한 전해질은 염화나트륨, 염화칼륨 및 황산나트륨을 포함한다.

본 발명의 예시적인 실시예

추가의 예시로서, 다음의 번호가 매겨진 실시예가 본 발명에 포함된다.

실시예 1: 다음 단계를 포함하는 오염물로부터 글리코실화된 재조합 목적 단백질을 정제하는 방법:

(a) 글리코실화된(glycosylated) 재조합 목적 단백질(protein of interest, POI) 및 갈렉틴(galectin) 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP) 오염물을 포함하는 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액을 약 중성 pH에서 단백질 A 매트릭스(Protein A matrix) 상에 로딩하는 단계, 여기서 POI는 면역글로불린 Fc 도메인의 C_H2 및 C_H3 도메인 및 갈렉틴-3(galectin-3) 오염물이 가역적으로 결합된 하나 이상의 말단 베타-갈락토실(beta-galactosyl) 잔기를 포함하고;

(ii) 선택적으로, 바이러스 불활성화를 위한 충분한 기간 동안 용리액 풀을 pH 3.3 내지 3.7로 유지하는 단계;

(d) pH 5.0 내지 5.5에서, (c)로부터 용리액 풀 내의 POI를 약 2 내지 15 mS의 낮은 전도도 완충제로 양이온 교환 매트릭스에 결합시키는 단계;

(f) CEX 용리액 풀을 pH 5.0 내지 6.0의 높은 전도도 완충제에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC) 매트릭스에 로딩하고 HIC 매트릭스를 세척하는 단계, 이로써 POI는 갈렉틴 HCP 오염물로부터 분리된다.

실시예 2: 실시예 1에 있어서, 상기 (b)에서 POI가 결합된 단백질 A 매트릭스를 세척하는 단계는 2 내지 2.7M의 염화칼슘을 포함하는 완충제로 세척하는 방법.

실시예 3: 실시예 1 내지 2에 있어서, 상기 POI는 애플리버셉트(aflibercept), 알레파셉트(alefacept), 에타너셉트(etanercept), 아바타셉트(abatacept), 벨라타셉트(belatacept), rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트(rilonacept)에서 선택되는 방법.

실시예 4: 실시예 1 내지 3에 있어서, 상기 POI는 애플리버셉트(aflibercept)인 방법.

실시예 5: 실시예 1 내지 4에 있어서, 상기 갈렉틴(galectin) HCP 오염물은 갈렉틴-3(galectin-3)인 방법.

실시예 6: 실시예 1 내지 5에 있어서, 상기 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액은 금속 양이온 오염물을 추가로 포함하고, 상기 POI는 또한 금속 양이온 오염물로부터 분리되는 방법.

실시예 7: 실시예 1 내지 6에 있어서, 상기 금속 양이온 오염물은 알루미늄, 바륨, 칼슘, 코발트, 구리, 아연, 철, 마그네슘, 망간, 수은, 니켈 및 스트론튬 양이온으로부터 선택되는 방법.

실시예 8: 실시예 1 내지 7에 있어서,상기 금속 양이온 오염물은 철 양이온인 방법.

실시예 9: 실시예 1 내지 8에 있어서, (c)로부터 용리액 풀 내의 POI를 양이온 교환 매트릭스에 결합시키기 전에, 규조토를 통한 여과를 포함하는 심층 여과(depth filtration)에 용리액 풀을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

실시예 10: 실시예 1 내지 9에 있어서, 상기 규조토는 시트레이트(citrate) 완충제로 사전-조정된(pre-conditioned) 방법.

하기 실시한 실험예는 예시적인 것이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실험예

실험예 1: 물질 및 방법

POI가 환자에게 궁극적으로 투여되도록 의도되지 않았기 때문에, 본원에 기재된 모든 실험에 사용된 물은 Milli-Q^® Integral Water Purification System (Merck)을 사용하여 정제되었다.

CHO 갈렉틴 제거 연구:

고속대량스크리닝(High throughput screening, "HTS"). 다운 스트림 HTS 연구는 Tecan Freedom EVO^® 로봇 액체 처리 시스템(Tecan US, Research Triangle Park, NC, USA)을 사용하여 수행되었다. 로봇 액체 처리 시스템은 자동화된 미세-크로마토그래피를 용이하게 하기 위해 Te-Chrom 구성요소로 구성되었다. 농축 및 혼탁도(turbidity) 측정은 통합된 마이크로 플레이트 리더에서 수행되었다. 수지는 Atoll(Weingarten, Germany)로부터 사전 포장된 450-μL RoboColumns^®로서 입수되었다; 8개의 컬럼은 실험에 따라 BEM(bind-and-elute) 모드 또는 FT(flow-through) 모드에서 병렬로 작동되었다.

단백질 A 크로마토그래피. HTS 단백질 A 세척 스크리닝 연구는 MabSelect SuRe^®단백질 A 수지(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)를 함유하는 RoboColumns^®를 사용하여 BEM에서 수행되었다. 컬럼을 평형 완충제(25mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.4)로 평형화한 후, 수거된 세포 배양액을 수지 1liter 당 약 10g으로 로딩하였다. 로딩 후, 평형 완충제("EQ")로 3-컬럼 부피("CV") 평형 세척 단계를 수행하였다. 이어서, 실험 비교를 위해 각 컬럼을 다음 세척 완충제 중 하나로 세척하였다:

25mM Tris, 480mM 락토오스 pH 7.3;

25mM MES, 2M CaCl₂ pH 6.0;

25mM MES, 2M CaCl₂ pH 6.5;

25mM Tris, 2M CaCl₂ pH 7.0,

25mM MES, 750mM 아르기닌 pH 6.0;

25mM MES, 750mM 아르기닌 pH 6.5; 또는

25mM Tris, 750mM 아르기닌 pH 7.0.

두번째 실험은 4 컬럼 부피에 대해 25mM MES, pH 6으로 완충된 염화칼슘(0.25 - 2.63M)의 농도를 증가시키면서 두 가지 조건을 세척하여 수행하였다. 이어서, 2 컬럼 부피의 EQ로 세 번째 세척을 수행하였다. 컬럼을 25mM 시트레이트 pH 3.6의 4 컬럼 부피로 96-깊이 웰 플레이트(Qiagen Sciences, Germantown, Maryland, USA)로 용리시켰다. 후속 용리 풀을 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5로 중화시켰다. 각 컬럼으로부터의 용리 풀은 CHO 갈렉틴-3 단백질 표준을 갖는 제조자에 의해 권장되는 프로토콜을 사용하여 분석 단백질 A HPLC 및 갈렉틴-3 ELISA(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)에 의해 생성물 농도에 대해 측정되었다.

CEX 크로마토그래피. HTS NaCl 용리 구배 스크린은 Fractogel^® SO₃ ^- 또는 Fractogel^® COO^- (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)를 함유하는 RoboColumns^®를 사용하여 수행되었고 20cm/hr에서 작동하였다. CEX 컬럼은 로딩 전에 목표 pH(pH 4.5 - 6.0) 및 전도도(약 3-8mS/cm)로 평형화되었다. 평형화 후, 컬럼을 15 내지 30g/L 수지로 로딩하였다. 평형 완충제로 세척 단계 후, 컬럼을 단계적으로 염화나트륨 구배로 용리시켰다. 280nm에서의 흡광도(A280)에 의한 생성물 농도 분석 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 갈렉틴-3-특이적 ELISA, 및 제조자에 의해 권장되는 프로토콜을 사용하는 CHO 숙주세포 단백질(HCP)-특이적 ELISA(Cygnus, Southport, NC)에 의한 순도를 포함한 추가 분석을 위해 용리 분획(1CV/분획)을 96-깊이 웰 플레이트(Qiagen Sciences, Germantown, USA)에 수집하였다. 개별 분획으로부터의 결과는 유사-크로마토그램을 생성하는 데 사용되었다. 각 분획으로부터의 누적 결과는 수율 및 질량 균형을 계산하는 데 사용되었다.

벤치 스케일 크로마토그래피 실험은 ktaexplorer 100 또는 ktapurifier 100 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) 액체 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. Fractogel^® SO₃ ^- (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) 및 Fractogel^® COO^-수지는 약 15-20cm의 베드 높이로 1.15cm ID 또는 3.2cm ID Vantage 컬럼(EMD Millipore, Billerica, MA, USA)에 포장되었다. 140 내지 180cm/hr에서 런을 수행하였다. CEX 컬럼은 로딩 전에 대략 6mS/cm의 전도도로 소듐 아세테이트 완충제에서 pH 5.0 또는 pH 5.5로 평형화되었다. 이어서, 컬럼을 중화된 단백질 A 용리액 풀을 대략 20 내지 30g/L 수지로 로딩하고, 평형 완충제로 세척하고, 선형 NaCl 구배로 용리시켜, NaCl 농도를 10 내지 20CVs 동안 컬럼 부피(CV) 당 50mM NaCl로 증가시켰다. 크로마토그래피 실행 동안 컬럼 유출물 pH, 전도도 및 흡광도를 모니터링하였다. 용리 단계 동안, 분획을 수집하고 A280, SEC, CHO HCP-특이적 ELISA, 및 갈렉틴-3-특이적 ELISA에 의해 생성물 농도를 측정하였다. 풀 회수 및 순도는 개별 분획으로부터 계산되었다.

HIC 크로마토그래피. HTS NaCl 구배 스크린은 Toyopearl^® Butyl 650M (Tosoh, King of Prussia, PA, USA) 및 Phenyl Sepharose^® Fast Flow High Sub (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)로 채워진 RoboColumns^®를 사용하여 수행되었다. NaCl로 조정된 중화된 단백질 A 풀을 사용하여 수지 1 리터당 25g의 생성물(g/Lr)에 컬럼을 로딩하였다. 용리 염 구배는 높은 염 농도에서 낮은 염 농도로 단계적으로 수행되었다. 스크리닝된 완충제/염 조건은 소듐 아세테이트/NaCl, 소듐 MES/NaCl, 소듐 아세테이트/소듐 설페이트, 소듐 시트레이트 및 소듐 포스페이트를 포함하였다. 모든 단계는 20cm/hr에서 수행되었다. 통과(Flow-through) 및 용리 분획은 단백질 농도(A280 및 SEC에 의함) 및 갈렉틴-3-특이적 ELISA에 의해 분석되었다.

HTS HIC 생성물 통과(flow-through) 스크린은 Toyopearl^® Butyl 650M로 포장된 RoboColumns^®를 사용하여 수행되었고 20cm/시간에서 작동하였다. 로드를 단백질 A 용리액 풀 물질로 중화시키고 70-125g/L 수지까지 1-CV 증분(increment)으로 컬럼에 적용하였다. 6-9CVs의 세척 부피는 또한 1-CV 증분으로 수행되었다. 분획을 수집하고 단백질 농도(A280) 및 갈렉틴-3-특이적 ELISA에 의해 분광학적으로 분석하였다.

벤치 스케일 수행은 25-cm 베드 높이에 의해 1.15cm 내경(ID) 내지25-cm 베드 높이에 의해 3.2-cm ID범위의 크기의 Vantage^® L 크로마토그래피 컬럼에 포장된 Toyopearl^® Butyl 650M 수지를 사용하여 180cm/시간에서 ktapurifier 100 (GE Healthcare Life Sciences)에서 수행되었다. 컬럼을 100 내지 125g/Lr로 로딩하였다. 통과(flow-through) 생성물 풀은 분획으로 수집되거나 UV 흡광도에 기초하여 수집되었다. 분획 또는 통과(flow-through) 세척/생성물 풀 샘플을 A280, SEC, CHO HCP-특이적 ELISA 및 갈렉틴-3-특이적 ELISA에 의해 단백질 농도에 대해 분석하였다.

철 제거 연구:

단백질 A 크로마토그래피. HTS 단백질 A 세척 스크린을 MabSelect SuRe^®단백질 A로 포장된 RoboColumns^®를 사용하여 수행하였고 45cm/시간으로 작동시켰다. 컬럼을 12 g/Lr에 로딩한 후, 3CVs의 EQ로 세척한 후, 2차 세척(워시 2)에서 4CVs의 상이한 완충 조건으로 세척하였다. 스크리닝된 워시 2 완충제는 다음 조건을 포함하였다:

pH 6.0에서 50mM 소듐 시트레이트;

pH 7.0에서 50mM 소듐 시트레이트;

pH 6.0에서 200mM 소듐 시트레이트;

pH 7.0에서 200mM 소듐 시트레이트;

125mM Tris, 500mM NaCl, pH 7.4;

25mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.4;

25mM Tris, 100mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.0; 또는

25M Tris, 100mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 8.0.

워시 2에 이어서 추가 3CVs의 평형화 완충제가 이어졌다. 워시 2 및 용리 분획을 상기 기재된 바와 같이 단백질 농도에 대해 분석하였다. 이들 분획은 또한 종래의 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS) 검정(assay)을 사용하여 철 수준에 대해 Brooks Analytical Laboratory (Bothell, WA, USA)에 의해 분석되었다.

벤치 스케일 단백질 A, 낮은 pH 바이러스 불활성화("VI") 및 CEX 실험. 납 단백질 A 워시 2 조건을 250cm/시간에서 MabSelect SuRe^® 단백질 A로 포장된 25cm 컬럼 높이에 의한 1.15cm ID를 사용하여 Aktapurifier 100에서 벤치 스케일로 수행하였다. 컬럼에 수확된 세포 배양액(HCCF)을 19g/L 수지로 로딩하였다. 세척 완충제의 부피를 워시 1에 대해 2CVs의 EQ, 워시 2에 대해 3CVs 및 워시 3에 대해 3CVs로 감소시켰다. 2개의 상이한 워시 2 조건을 비교하였다: EQ 완충제(25mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.4) 및 500mM 소듐 시트레이트, pH 5.5. pH 3.6에서 100mM 소듐 아세테이트 및 25mM 소듐 시트레이트의 용리 완충제를 또한 비교하였다. 용리 풀을 2개의 앨리쿼트(aliquot)로 나누었다. 하나의 앨리쿼트를 2M 시트르산을 사용하여 더 낮은 pH 3.5로 적정하고, 낮은 pH 바이러스 불활성화(VI) 작동을 시뮬레이션하기 위해 60분 동안 유지하고, 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 중화시켰다. 두 번째 앨리쿼트는 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로만 중화시켰다.

4개의 생성된 생성물 풀, 즉, 낮은 pH 유지하거나 하지 않는 소듐 아세테이트 용리 및 낮은 pH 유지하거나 하지 않는 소듐 시트레이트 용리를 Fractogel^® COO^-로 포장된 RoboColumns^®를 사용하여 HT-CEX 크로마토그래피로 정제하였다. 컬럼을 20g/Lr에 로딩하고, NaCl 용리 구배를 단계적으로 40mM NaCl/CV의 기울기에서 100mM 소듐 아세테이트(pH 5.5) 완충제에서 수행하였다. 모든 단계는 20cm/시간에서 수행되었다. 분획을 모으고 A280에 의해 단백질 농도에 대해 분석하였다. 모든 단계의 샘플을 유도 결합 플라즈마 질량 분석법(ICP-MS)으로 철에 대해 분석하였다.

실험예 2: 애플리버셉트로부터 CHO 갈렉틴-3 제거

단백질 A 크로마토그래피 세척 스크리닝 실험. HHO 스크리닝 실험은 2M CaCl₂ 또는 750mM 아르기닌 완충제를 "워시 2"로 함유한 완충제를 사용하여 수행하여 이들이 CHO 갈렉틴-3과 애플리버셉트 간의 상호작용을 방해할 수 있는지를 결정하였다. 실험은 Tecan 액체 처리기에서 8개의 MabSelect SuRe^® Protein A-packed RoboColumns^®를 사용하여 수행되었다. 컬럼 평형, 로드 후 워시 1 및 워시 3을 평형 완충제("EQ"; 25mM 트리스, 100mM NaCl, pH 7.4)를 사용하여 수행하였다. 25mM 시트레이트, pH 3.6을 사용하여 용리를 수행하고 모든 풀을 2M 트리스 염기를 사용하여 pH 5.0으로 중화시켰다. 애플리버셉트를 함유하는 수확된 세포 배양액을 로딩에 사용하였고, 모든 컬럼에 동일한 생성물 질량을 로딩하였다. 워시 2의 경우, 480mM 락토오스는 갈렉틴-3 결합에 대해 경쟁할 수 있는 베타-갈락토스 모이어티를 함유하기 때문에 양성 대조군으로 사용되었다. 평형 완충제(EQ; 25mM 트리스, 100mM NaCl, pH 7.4)를 워시 2 음성 대조군으로서 사용하였다. 락토오스-함유 완충제는 EQ와 비교하여 2로그의 갈렉틴-3을 제거할 수 있었다(하기 표 1). 2M CaCl₂ 세척은 pH 6.0 및 pH 6.5에서 현저한 생성물 손실이 관찰되지 않으면서 EQ보다 1로그의 갈렉틴-3을 제거하였다. pH 7.0에서 2M CaCl₂ 세척에 의해 상당한 양의 생성물이 제거되었으며, 이는 이 pH는 이 특정 생성물에 이상적이지 않음을 나타낸다. 아르기닌 세척은 EQ와 비교하여 0.5로그 이상의 갈렉틴-3을 약간 제거하였고, pH 6.0 및 pH 6.5에서 세척 동안 유의한 수율 손실이 관찰되었지만, pH 7.0은 아니었다.

초기 단백질 A 워시 2 스크리닝 결과. HCCF = 수확된 세포 배양액; NA = 해당 사항 없음; EQ = 평형 완충제, 즉 25mM 트리스, 100mM NaCl, pH 7.4.

조건	% 수율 손실	CHO 갈렉틴-3 (ng/ml)	CHO 갈렉틴-3 (ppm)
HCCF load	NA	137.8	156.6
EQ	3.2	124	45.8
EQ + 480 mM lactose	3.5	0.83	0.30
25 mM MES, 2 M CaCl₂ pH 6.0	8.3	12.5	5.1
25 mM MES, 2 M CaCl₂ pH 6.5	4.0	14.5	5.6
25 mM Tris, 2M CaCl₂ pH 7.0	31.9	8.2	5.0
25 mM MES, 750 mM Arginine pH 6.0	35.3	28.3	21.3
25 mM MES, 750 mM Arginine pH 6.5	17.1	56.3	23.6
25 mM Tris, 750 mM Arginine pH 7.0	4.1	60.6	23.6

효과적인 갈렉틴-3 제거가 예상될 수 있는 염화칼슘의 범위를 추정하기 위해 MabSelect SuRe^® 단백질 A-포장된 RoboColumns^®을 사용하여 상기와 같이 두 번째 라운드의 실험을 수행하였다. 워시 2 CaCl₂ 농도를 0.25M 내지 2.63M로 실험하고, pH 6.0에서 20mM MES로 완충시켰다. EQ는 음성 대조군으로 사용되었다. 결과는 하기 표 2에 제시되어 있다. 조절 조건과 관련하여, 단백질 A 단계 수율은 최대 2.40M CaCl₂와 일치하였다. 보다 높은 CaCl₂ 농도에서, 단계 수율의 감소가 관찰되었으며, 연구에 사용된 생성물(애플리버셉트)에 특이적일 수 있지만, 다른 분자에서는 반드시 관찰되지는 않을 것이다. 단계 수율과 무관하게, 수확된 세포 배양액(HCCF)과 비교할 때, 갈렉틴-3 클리어런스는 시험된 조건에 걸쳐높았다. CaCl₂ 세척이 없는 단백질 A 용리액 풀에서 갈렉틴-3 농도와 비교할 때, 0.25M CaCl₂에서 갈렉틴-3의 제거는 없었고 0.5M CaCl₂에서 갈렉틴-3의 4% 제거만 있었다. 추가의 갈렉틴-3 제거는 1.0M CaCl₂에서 완만했다(24 %). 2.0 내지 2.63M CaCl₂에서 추가의 42-52%의 갈렉틴-3 제거가 관찰되었다. 이 글리코실화된 재조합 단백질 분자의 경우, 대조군과 비교하여, 추가의 갈렉틴-3 제거는1.0M 이상의 농도에서 CaCl₂ 세척을 사용함으로써 달성될 수 있는 것으로 관찰되었다. 또한 이 실험에서 효과적인 갈렉틴-3 제거가 2.63M CaCl₂까지 일어났다. 이러한 실험 결과로부터, 보다 높은 CaCl₂ 농도(염화칼슘의 용해도에 의해 제한됨)가 갈렉틴-3 제거에 효과적일 것으로 예상할 것이다. 마찬가지로, 갈렉틴-3과 POI 사이의 상호작용에 따라, 보다 낮은 CaCl₂ 농도는 다른 글리코실화된 재조합 단백질 생성물에 유용할 수 있다. 본 발명의 방법을 실시함에 있어서, 적합한 CaCl₂ 농도의 선택은 갈렉틴 클리어런스와 목적 단백질에 대한 단계 수율의 바람직한 균형을 포함한다.

단백질 A 워시 2 CaCl₂ 스크리닝 연구의 결과. NA = 해당 사항 없음.

컬럼	CaCl₂ 농도 (mM)	수율 (%)	갈렉틴-3 농도 (ng/mg)	대조군에 비해 추가 제거 (%)
Load	NA	NA	304.8	NA
Column 1	0	82.5	14.6	NA
Column 2	0.25	90.2	15.4	없음
Column 3	0.50	88.3	14.0	4.1
Column 4	1.00	89.5	11.1	24.0
Column 5	2.00	87.6	7.0	52.0
Column 6	2.40	86.3	8.5	41.8
Column 7	2.50	65.4	8.1	44.5
Column 8	2.63	50.8	8.2	43.8

CEX 크로마토그래피 스크리닝 실험. CEX 수지에 대한 초기 실험을 벤치 스케일로 수행하여 높은 회수율을 유지하면서 특정 단백질 갈렉틴-3을 포함하는 응집된 생성물 및 CHO 숙주세포 단백질의 적절한 제거를 초래한 작동 조건을 확인하였다. 10-CV NaCl 용리 구배를 사용하는 Fractogel^®SO₃ ^-의 스크리닝 연구는 높은 수율을 달성할 수 있었지만, 고 분자량(HMW) 종의 약 90% 수율에서 완만하게(<20%) 감소한 것으로 나타났다. 도 1은 이량체, 올리고머 및 총 HMW로 중첩된 CEX 크로마토그램을 보여준다. 도 2는 계산된 용리액 풀 순도와 총 용리액 풀 HMW 함량으로 중첩된 CEX 크로마토그램을 보여준다.

이 CEX 실행이 또한 갈렉틴-3을 제거할 수 있는지를 결정하기 위해, 펩티드 맵-기반 다중-속성 방법("MAM"; Rogers, R. et al., Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics, mAbs, 7(5): 881-890 (2015))을 사용하여 용리 분획에서 갈렉틴-3 수준을 검색하고 정량화하였다(하기 표 3). 또한, 표 3은 Cygnus HCP ELISA에 의해 측정된 총 CHO 숙주세포 단백질의 농도를 보여준다. 도 3은 다양한 NaCl 용리 구배 분획에서 갈렉틴-3, 일반 숙주세포 단백질(HCP) 및 목적 생성물의 상대적인 것을 보여준다.

Fractogel^® SO₃ ^- 컬럼으로부터 용리되는 개별 분획의 분석은 POI와 함께 용리되는 소량의 HCP 및 갈렉틴-3이 있음을 보여주었다. 그러나, POI의 >80%가 용리된 후, 총 HCP 및 갈렉틴-3 둘 모두의 용리가 급격히 증가하였다. 이는 Fractogel SO₃ ^- 가 높은 회수율을 유지하면서 생성물로부터 상당한 양의 갈렉틴-3을 분리할 수 있음을 나타낸다. 또한, 갈렉틴-3의 용리 경향은 총 HCP의 용리 경향을 나타내며, 이는 생성물 로드에서 관찰된 HCP의 많은 부분이 갈렉틴-3임을 암시한다. 이것은 또한 Cygnus HCP ELISA에 의해 검출된 숙주세포 단백질(HCP) 제거가 갈렉틴-3 제거의 좋은 지표임을 암시한다.

Fractogel^® SO₃ ^-가 일부 갈렉틴-3 제거를 제공할 수 있다는 관찰에 기초하여, 개선된 갈렉틴-3 제거를 위한 CEX 작동 조건을 스크리닝하기 위해 HTS가 사용되었다. 이 연구에서 강력하고 약한 양이온 교환기 Fractogel^® SO₃ ^- 및 Fractogel^® COO^-는 각각 Tecan 액체 처리 시스템을 사용하여 RoboColumns^®에서 pH 4.5, 5.0, 5.5 및 6.0에서 스크리닝되었다. 컬럼을 30g/L 수지에 로딩하고 20CVs에 걸쳐 50mM/CV 단계적 NaCl 구배로 용리시켰다. 용리 구배의 분획을 수집하고 ELISA에 의해 생성물 농도 및 갈렉틴-3 농도에 대해 측정하였다(도 4a-d 및 도 5a-d).

Fractogel^® SO₃ ^- 및 Fractogel^® COO^- 상에서 POI 및 갈렉틴-3의 상대적인 보유의 비교는, 낮은 pH에서 갈렉틴-3이 POI 용리 피크의 꼬리 부분에서 용리되는 것을 나타내었다. pH가 Fractogel^® COO^-의 경우 pH 5.0로, Fractogel^® SO₃ ^-의 경우 pH 5.5로 증가함에 따라, 갈렉틴-3 용리는 구배 초기로 이동하여 POI 용리 피크와 겹친다. Fractogel^® COO^-의 경우, 갈렉틴-3은 pH 4.5 구배에서 POI와 약간의 분리를 보였지만, Fractogel^® SO₃ ^-과 비교하여 적당하였다.

크기 배제 크로마토그래피에 의한 생성물 회수 대 % 생성물 단량체의 비교는 도 6에 도시되어 있다. ELISA에 의한 생성물 회수 대 갈렉틴-3 제거는 도 7에 도시되어 있다.

개별 CEX 용리 구배 분획에서의 갈렉틴-3 및 총 CHO HCP 농도. HCP = 숙주세포 단백질; NA = 해당 없음; NT = 테스트되지 않음; MAM = 질량 분석법 다중-속성 방법(Rogers, R. et al., mAbs, 7(5): 881-890 (2015) 참조)

샘플	분획 숫자	Cygnus ELISA 에 의한 CHO HCP 농도 (ng/mg)	MAM에 의한 갈렉틴-3 농도(ppm)
Load	NA	1988	NT
UB/W	NA	NT	NT
B2	1	NT	NT
B1	2	NT	NT
C1	3	289	220.79
C2	4	NT	NT
C3	5	136	217.32
C4	6	NT	NT
C5	7	115	202.41
C6	8	NT	NT
C7	9	267	264.81
C8	10	NT	NT
C9	11	347	458.62
C10	12	NT	NT
C11	13	1127	969.91
C12	14	NT	NT
D12	15	NT	1762.64
D11	16	2337	NT
D10	17	NT	2040.47
D9	18	NT	NT
D8	19	NT	NT
총 풀	NA	466	NT
스트립(Strip)	NA	NT	NT

고 분자량(HMW) 종의 전체 제거는 또한 이들 실험 동안 SEC에 의해 모니터링되었으며, 두 수지 모두에 대해 높은 수율 및 높은 생성물 순도 둘 다가 달성될 수 있는 광범위한 작동 조건이 있음을 발견하였다. 100% 단계 수율에 도달함에 따라, 모든 조건 하에서 순도는 98%를 초과하지만, 예상치 못하게, 생성물 순도는 감소하였다.

공정 세트 포인트를 정의하기 위한 예측 모델을 생성하기 위해 통계 소프트웨어 패키지(JMP, SAS, version 12.1.0, 2015)를 사용하여 단계 수율, 갈렉틴-3 제거 및 CEX 풀 HMW 함량에 대해 회귀 분석을 수행하였다. SEC에 의한 수율, 갈렉틴-3 농도 및 순도에 대한 등고선 도표는 Fractogel^® SO₃ ^-의 경우 도 8a-c에, Fractogel^®COO^-의 경우 도 9a-c에 도시되어 있다. 로드 샘플에서 HMW 및 갈렉틴-3 농도는 각각 1.2% 및 13.8ng/mg였다.

예상치 않게, pH 또는 용리 NaCl 강도가 증가할 때, 강하고 약한 양이온 교환기 둘 다에 대해 단계 수율이 증가하였다. 또한, SEC에 의한 순도는 테스트된 조건 범위에서 높았다. 시험된 두 수지 모두에 대해, pH를 낮춤으로써 갈렉틴-3 제거가 개선되었다. Fractogel^® COO^-의 경우, 갈렉틴-3의 가장 좋은 제거는 pH 4.5에 있었지만, pH 5.0 이상에서는 한계 제거와 함께 작동 창(operating window)이 작았다. Fractogel^®SO₃ ^-는 pH 4.5 내지 5.5에서 관찰된 클리어런스로 갈렉틴-3 제거를 위한 더 큰 작동 창(operating window)을 가졌다. Fractogel^® SO₃ ^-의 최적 작동 pH는 낮은 pH에서 CEX를 작동시키지 않으면서 갈렉틴-3 제거를 최대화하기 위해 pH 5.0 정도인 것으로 나타났다.

CEX Robocolumn^® 스크린의 갈렉틴-3 제거 결과는 pH 5.0에서 작동되는 Fractogel® SO₃ ^-컬럼을 사용하여 벤치 스케일로 확인되었다. 벤치 스케일 컬럼의 CEX 방법은 RoboColumns^®와 유사하며 pH 5.0에서 소듐 아세테이트 완충제에 0 내지 1M NaCl의 20CV 용리 구배를 사용했다. 구배 용리의 결과는 도 10에 도시되어 있다. 로드 물질은 질량 분석 다중-속성법(MAM"; Rogers et al., Development of a quantitative mass spectrometry multi-attribute method for characterization, quality control testing and disposition of biologics, mAbs 7(5): 881-890 (2015)에 의해 57.5ng/mg의 갈렉틴-3을 함유하고, 갈렉틴-3 ELISA에 의해 5.6mg/mg을 함유하였다. 구배가 대략 500mM 나트륨 초과일 때, 용리 피크의 말단은 갈렉틴-3이 풍부해진 반면, 피크의 주요 부분은 일부 갈렉틴-3 제거를 나타냈다. CEX 풀에서 갈렉틴-3의 수준은 용리 종료시 수집되는 피크의 백분율을 증가시켜 추가로 조절할 수 있다.

HIC 크로마토그래피 스크리닝. RoboColumns^®과 HTS 스크리닝을 사용하여 갈렉틴-3 제거를 위한 2개의 HIC 수지인 Phenyl Sepharose^® Hi-Sub 및 Toyopearl^®Butyl 650M을 평가했다. 이들 수지를 pH 5.0에서 소듐 아세테이트 완충제 및 NaCl 또는 소듐 설페이트, pH 6.0에서 소듐 MES 완충제 및 NaCl 또는 소듐 설페이트, pH 5.0 및 6.0에서 소듐 시트레이트 및 pH 6.0 및 7.0에서 소듐 포스페이트로 결합 및 용리 모드로 스크리닝하였다. 단백질 A-정제된 애플리버셉트의 로드 물질은 ELISA에 의해 18ng/mg의 갈렉틴-3을 함유하고 25g/L 수지에 로딩되었다. 결합된 생성물을 고염에서 저염으로의 염 구배를 사용하여 용리시켰다. 통과(flow-through), 세척 및 용리 구배 피크의 분획을 갈렉틴-3 ELISA에 의해 분석하였다. 결과는 도 11a-h 및 도 12a-h에 도시되어 있다. 실험된 임의의 조건에서 생성물이 HIC 수지 중 하나에 단단히 결합되지 않았다. 그러나, 두 수지는 일정 수준의 갈렉틴-3을 제거하였다. 부틸 650M은 검출 가능한 갈렉틴-3을 함유하는 분획이 거의 없기 때문에, 갈렉틴-3의 가장 강력한 클리어런스를 가졌다.

두 번째 RoboColumn^® 스크린을 수행하여 가장 강력한 갈렉틴-3 제거를 갖는 부틸 650M의 최적 pH 및 염 작동 범위를 결정하였다. 갈렉틴-3이 생성물보다 수지에 더 강하게 결합하는 것으로 보이므로, 이 실험은 생성물 통과(flow-through) 모드에서 수행되었다. 2개의 상이한 수준의 NaCl을 4개의 상이한 pH에서 평가하였다. pH 5.0 및 5.5의 경우, 소듐 아세테이트를 완충제로 사용하였다. pH 6.0 및 6.5의 경우, 소듐 MES를 완충제로 사용하였다. 로드 물질은 워시(washes)와 동일한 pH 및 염 수준을 갖도록 조절되었고, 컬럼은 100g/L 수지까지 로딩되었다. 통과(flow-through)의 분획을 수집하고 증가하는 로드 수준을 나타내는 미니-풀을 갈렉틴-3에 대해 분석하였다. 추가로, 대부분의 생성물 세척을 함유하는 초기 분획 및 세척의 테일링 부분을 함유하는 후기 분획을 사용하여, 로드-후 워시를 수집하고 2개의 분획으로 분석하였다. 결과는 하기 표 4에 제시되어 있다. 결과는 부틸 650M 수지에 의한 갈렉틴-3 제거에 더 높은 염분 수준과 더 낮은 pH가 가장 좋으며, pH 5.0에서 완전한 클리어런스를 나타냈다. 갈렉틴-3의 돌파구는 더 높은 로딩 수준으로 증가하기 시작하지만, 갈렉틴 제거는 100g/L 수지 로딩에서 여전히 중요하며, 대부분 또는 모든 갈렉틴은 로드 후 세척 동안 컬럼에 결합된 상태로 유지되는 것으로 보인다.

부틸 650M 수지를 사용하는 RoboColumn^®통과(flow-through) 스크린으로부터 분획의 특정 ELISA에 의해 결정된 갈렉틴-3 수준. LOQ = 분석의 정량 한계.

통과(Flow-through) 조건	갈렉틴-3 (ng/mg)
통과(Flow-through) 조건	Load	33g/Lr	66g/Lr	100g/Lr	워시1	워시2
500 mM NaCl, pH 6.5	19.5	<LOQ	0.04	0.10	0.39	0.36
250 mM NaCl, pH 6.5	18.8	0.05	0.25	0.56	0.56	2.11
500 mM NaCl, pH 6.0	19.2	<LOQ	0.01	0.03	0.1	<LOQ
250 mM NaCl, pH 6.0	19.6	<LOQ	0.03	0.08	0.31	0.2
500 mM NaCl, pH 5.5	17.8	<LOQ	<LOQ	0.01	<LOQ	<LOQ
250 mM NaCl, pH 5.5	18.3	<LOQ	<LOQ	0.01	<LOQ	<LOQ
500 mM NaCl, pH 5.0	18.3	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ
250 mM NaCl, pH 5.0	20.4	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ

높은 처리량 통과(flow-through) 스크린으로부터의 결과는 벤치 스케일 부틸 650M 컬럼에서 확인되었다. 컬럼을 pH 5.0에서 400mM NaCl로 컨디셔닝된 CEX 풀로 로딩하였다. 125g/L 수지까지 수집된 통과(flow-through) 분획 및 로드 후 세척은 갈렉틴-3 ELISA에 의해 분석되었다(하기 표 5 참조).

부틸 650M 수지를 사용하여 벤치 스케일 통과(flowthrough) 실행(run)으로부터의 분획의 ELISA에 의한 갈렉틴-3 수준. LOQ = 분석의 정량 한계.

통과(Flow-through) 조건	갈렉틴-3 (ng/mg)
통과(Flow-through) 조건	Load	30g/Lr	60g/Lr	90g/Lr	125g/Lr	워시1	워시2
400mM NaCl, pH 5.0	7.3	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ	<LOQ

실험예 3: 철 양이온의 제거에 의한 재조합 단백질의 정제

단백질 A 크로마토그래피 스크리닝. 철을 제거하기 위한 워시 2 조건의 고 처리량 RoboColumn^® 스크린을 Tecan 액체 처리기에서 8개의 MabSelect SuRe^® 단백질 A-포장된 컬럼을 사용하여 수행했다. 컬럼을 평형화하고 철을 함유하는 수확된 세포 배양액(HCCF)으로 유사하게 로딩한 후, 평형 완충제(EQ: 25mM Tris, 100mM NaCl, pH 7.4)로 세척하였다. 이어서, 각 컬럼을 시트레이트 및 EDTA와 같은 공지된 금속 킬레이트 화합물로 이루어진 상이한 2차 워시로 세척하고, EQ를 음성 대조군으로 사용하였다. 2차 워시에 이어 EQ를 수행하고 생성물을 낮은 pH 완충제를 사용하여 용리시켰다. 용리 풀은 ICP-MS에 의해 철 정량을 위해 제출되었다(도 13). 모든 용리 풀은 상당한 양의 철을 함유하고 있으며, 최고 수준의 EQ 조건 및 200mM 시트레이트 워시 2 조건은 약 200ppm의 제거를 나타냈다. EDTA 워시 2만 약간 제거되었다.

워시 2 완충제 중 더 높은 수준의 시트레이트가 더 많은 철 제거를 제공할 수 있는지를 결정하기 위해 두 번째 RoboColumn^® 워시 스크린을 수행하였다. 결과는 도 14에 도시되어 있다. 시트레이트의 수준을 증가시키면 ICP-MS에 의해 결정된 바와 같이 상당히 많은 철 제거가 발생하였다. 흥미롭게도, pH 5.5의 더 낮은 pH 조건은 pH 6.0에 비해 철 제거가 약간 개선되었으며, 이는 더 낮은 pH가 시트레이트에 의한 철 킬레이트화를 개선할 수 있음을 나타낸다.

시트레이트 및 더 낮은 pH의 조합된 효과의 관찰은 낮은 pH 용리 단계에서 시트레이트를 사용하는 것과 바이러스 불활성화를 위한 후속하는 낮은 pH 유지의 이점을 비교하는 연구로 이어졌다(도 15의 실험 개략도 참조). 200mM 시트레이트 워시 2 또는 EQ 워시 2를 사용하여 pH 3.6에서 25mM 시트레이트 용리를 사용하여 2개의 벤치 스케일 단백질 A 실행을 수행하였다. 생성된 용리 풀의 앨리쿼트를 2개로 나누고, 각 용리 풀의 절반을 시트르산을 사용하여 1시간 바이러스 불활성화 유지를 위해 pH 3.5로 적정한 반면, 나머지 절반은 pH 5.0으로 중화시켰다. 4개의 후속 풀을 모두 CEX RoboColumns^®에서 실행하여 생성물에서 킬레이트된 철을 제거하였다. CEX 풀은 EQ 워시 2 및 소듐 아세테이트 용리를 사용하여 대조 CEX 풀과 함께 ICP-MS 분석을 위해 제출되었다(도 16 참조). 결과는 시트레이트 용리의 첨가가 생성물에 결합된 철의 양을 상당히 감소시켰음을 입증한다. 또한, 시트레이트 세척, 용리 및 낮은 pH 바이러스 불활성화의 조합은 검출 한계 미만으로 철의 제거를 초래하였다.

다음으로, 높은 철 풀(EQ 워시 2, 아세테이트 용리 및 낮은 pH VI 없음) 및 낮은 철 풀(시트레이트 워시 2, 시트레이트 용리 및 시트르산 낮은 pH VI)의 샘플을 철의 존재가 생성물 안정성에 영향을 미치는지 결정하기 위해 가속 안정성에 위치시켰다. 샘플을 40g/L의 농도에서 10mM 포스페이트, 40mM NaCl, 5%(w/v) 수크로스 및 0.03% PS-20으로 제형화하고 30

에서 유지시켰다. 2주마다 시점을 분석하고 분석 SEC에 의해 고 분자량(HMW) 종에 대해 시험하였다. 데이터는 도 17에 도시되어 있다. 고 철 샘플은 저 철 샘플과 비교하여 더 큰 HMW 증가율 및 또한 갈색을 갖는다(도 18 참조). 고 철 샘플의 색상은 브라운/옐로우 4 표준(BY4)과 동일하지만, 저 철 샘플의 색상은 브라운/옐로우 5 및 6 표준(BY5 및 BY6) 사이이다.

실험예 4: 다운스트림 공정에 걸친 갈렉틴 및 금속 양이온 제거

재조합 애플리버셉트로부터 CHO 갈렉틴-3 및 철 양이온의 제거에 의한 글리코실화된 재조합 애플리버셉트의 정제는 본 발명의 예시적인 실시예에서 조합된 상기 기술된 몇몇 기술을 통합한 3 컬럼 다운스트림 공정에 걸쳐 평가되었다. 개략적으로 공정 흐름은 도 19에 도시되어 있다.

크로마토그래피 실행을 상기 실험예 1에 기재된 바와 같이 벤치 스케일로 수행하고, 컬럼을 용량(단백질 A의 경우 19g/L 수지, CEX의 경우 30g/L 수지 및 HIC의 경우 100g/L 수지)으로 로딩하였다. 갈렉틴-3 제거를 위해, 공정은 단백질 A 단계를 위한 2M CaCl₂ 워시 2, Fractogel^® SO₃ ^-수지를 사용한 pH 5.0에서의 CEX 크로마토그래피 및 부틸 650M 수지를 사용한 HIC 단계를 포함하였다. 철 제거를 위해, 공정은 철을 생성물로부터 킬레이트시키기 위해 단백질 A에 대한 25mM 시트레이트 용리 및 바이러스 불활성화를 위한 시트르산 적정을 포함하였다. 이어서 킬레이트화 된 철을 CEX 단계에 의해 제거하였다.

결과는 갈렉틴-3이 수확된 세포 배양액(HCCF)에서 >667ppm에서 HIC 풀에서 검출할 수 없는 수준까지의 과정에 의해 효과적으로 제거됨을 입증한다(하기 표 6 참조). HIC 단계가 가장 효과적이었지만 단백질 A 및 CEX 단계도 크게 기여했다. 철은 또한 HCCF의 1022ppb에서 CEX 풀의 5ppb로 효과적으로 제거되었다.

단백질 A/VI 및 CEX 단계의 조합은 철 제거에 기여하였다. 이들 데이터는 상기 개시된 방법의 단계가 갈렉틴-3 및 철 양이온 불순물의 상당한 제거를 제공했음을 입증한다.

이들 오염물을 제거하기 위해 개발된 3-컬럼 본 발명의 방법의 실시예에 의해 정제된 생성물 풀에서의 CHO 갈렉틴-3 및 철 수준. VI = 바이러스 불활성화.

단계	ELISA 에 의한 갈렉틴-3 (ng/mg)	ELISA 에 의한 갈렉틴-3 (ppm)	ICP-MS에 의한 철 (ug/L)	ICP-MS에 의한 철 (ppb)
수확된 세포 배양액	> 596*	>677	891	1022
단백질 A VI pool	550	42	502	38
CEX pool	136	32	21	5
HIC pool	0.1	0.0	실험 안함

*단백질 A 통과 분획에서의 갈렉틴-3의 수준

실험예 5: 공정에서 다른 금속 양이온 오염물의 공급원 제거

물 및 완충제 샘플의 금속 분석. 공정에서 철 및 기타 금속 오염물의 잠재적인 공급원을 이해하기 위해, 물 및 완충제 샘플을 상기 기술한 바와 같이 ICP-MS에 의해 철, 구리 및 아연에 대해 평가하였다. 결과는 각각 도 20, 도 21 및 도 22에 도시되어 있다. 물 샘플은 검출할 수 없는 수준의 3개의 금속을 갖는 반면, 2M 시트르산 및 500mM 시트레이트 완충제는 상당한 수준의 철 오염 및 일부 구리 및 아연을 나타냈다. 시트레이트 완충제는 시트르산보다 철의 함량이 높으므로, 소듐 시트레이트 성분이 산 형태보다 금속 오염이 더 많을 수 있음을 시사한다. 시트레이트는 금속 킬레이터이기 때문에, 이러한 화학 물질의 제조 과정에서 금속 오염이 발생할 수 있다.

규조토 깊이 필터에서의 금속 오염. 규조토(DE) 깊이 필터가 금속 양이온 오염원일 수 있는지 확인하기 위해, 우리는 0.0023cm² Millipore A1HC 깊이 필터를 사용하여 필터 세척(flush) 연구를 수행했다. 필터를 30L/m²에서 물로 세척한 후 >100L/m²에서 500mM 시트레이트 pH 5.5로 세척하였다. 각각의 세척 동안 여과액의 4 내지 5개의 4-mL 분획을 수집하고 ICP-MS에 의해 철, 구리 및 아연에 대해 분석하였다. 결과는 각각 도 23, 도 24 및 도 25에 도시되어 있다. 물 세척으로, 일부 철, 구리 및 아연 양이온이 필터로부터 용리되었고, 10L/m²의 물이 필터를 통해 세척된 후 이들 금속의 수준이 기준선으로 돌아왔다. 이어서, 0.5M 시트레이트 pH 5.5로 필터를 세척하여 높은 수준의 철(>6000㎍/L)을 포함하여 3가지 금속 모두를 추가로 용리시켰다. 이들 데이터는 시트레이트 완충제가 필터로부터 추가적인 금속 양이온을 킬레이트할 수 있음을 나타낸다. ~50L/m²의 완충 후에 금속 수준이 기준선(즉, 완충제에 존재하는 금속의 수준)으로 돌아왔다. 이러한 결과는 DE가 철을 포함하여 상당한 양의 금속 양이온 오염원이 될 수 있음을 의미하며, 이는 용리 완충제 함유 시트레이트를 사용하거나 바이러스 불활성화를 위해 시트르산을 사용함으로써 단백질 A 풀에 시트레이트의 존재로 인해 악화될 수 있음을 의미한다.

상이한 단백질 A 용리 및 깊이 필터 세척 완충제를 사용한 철, 구리 및 아연 양이온 제거의 평가. 우리는 일련의 세 단계: 단백질 A 크로마토그래피, A1HC 깊이 필터를 이용한 심층 여과 및 CEX 크로마토그래피를 이용하여 목적 단백질로부터 철, 구리 및 아연 양이온을 제거하는 본 발명의 방법의 능력을 평가하였다(도 26). 실험의 일부로, 우리는 두 개의 상이한 단백질 A 용리 완충제, 100mM 아세테이트, pH 3.6 및 25mM 시트레이트, pH 3.6 및 두 개의 상이한 깊이 필터 세척 완충제, 평형(EQ) 완충제 단독(100mM 아세테이트, pH 5.0) 및 500mM 시트레이트, pH 5.5 이어서 EQ 세척의 금속 제거에 대한 영향을 테스트했다. 철, 구리 및 아연 양이온 수준을 단백질 A 용리액 풀("ProA pool"), 심층 여과를 거친 단백질 A 용리액 풀("심층 여과된 풀(depth filtered pool") 및 ICP-MS를 사용하는 CEX 용리액 풀("CEX 풀")에서 정량화하였고; 결과는 각각 도 27, 도 28 및 도 29에 도시되어 있다.

단백질 A 용리에 100mM 아세테이트 완충제를 사용하면 25mM 시트레이트 완충제 용리에 비해 단백질 A 용리액 풀에서 철 및 아연 양이온의 수준이 낮아졌으며, 구리 수준은 낮고 변하지 않았다. 풀을 깊이 필터로 여과할 때, 철의 양은 필터의 철 양이온 오염으로 인해 모든 경우에서 증가했다. 500mM 시트레이트 완충제로 사전-세척하여 깊이 필터를 사전-컨디셔닝하면 깊이 필터 풀의 철 수준이 낮아졌으며, 100mM 아세테이트 단백질 A 용리 완충제와 결합된 조건은 철 양이온의 양을 추가로 줄였다. 모든 심층 여과 조건 하에서 구리 및 아연 양이온의 수준은 낮게 유지되었다.

CEX 크로마토그래피에 의한 깊이 필터 풀에서 POI의 정제는 약 1ppm의 철을 함유하는 모든 조건에서 상당한 양의 철 양이온을 제거하였다. 아연 및 구리 양이온의 경우, 모든 조건은 깊이 필터 풀에서 관찰된 것과 유사한 낮은 수준(1-2ppm)을 가졌다. 종합하면, 이들 데이터는 시트레이트 완충제 깊이 필터 사전-컨디셔닝 세척과 결합된 100mM 아세테이트 단백질 A 용리 완충제를 사용하면 깊이 필터 풀 단계를 통해 정제 과정에서 철 양이온 오염을 크게 줄일 수 있음을 나타낸다. 아연 양이온 수준은 단백질 A 용리액 풀 단계에서 아세테이트 완충제 단백질 A 용리에 의해 감소되는 반면, 구리 양이온 수준은 모든 조건에서 낮게 유지되고 상대적으로 영향을 받지 않았다.

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Claims

다음 단계를 포함하는 오염물(contaminant)로부터 글리코실화된(glycosylated) 재조합 목적 단백질(protein of interest)을 정제하는 방법:
(a) 글리코실화된(glycosylated) 재조합 목적 단백질(protein of interest, POI); 및 갈렉틴-3(galectin-3)을 포함하는 갈렉틴(galectin) 숙주세포 단백질(host cell protein, HCP) 오염물;을 포함하는 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액을 중성 pH에서 단백질 A 매트릭스(Protein A matrix) 상에 로딩하는 단계, 여기서 POI는 면역글로불린 Fc 도메인의 C_H2 및 C_H3 도메인 및 갈렉틴-3(galectin-3)이 가역적으로 결합되는 하나 이상의 말단 베타-갈락토실(beta-galactosyl) 잔기를 포함하고;
(b) POI가 결합된 단백질 A 매트릭스를 1 내지 3M의 염화칼슘을 포함하는 pH 6.0 내지 6.5의 완충제로 세척하는 단계;
(c) POI를 pH 4 미만의 시트르산 또는 시트레이트(citrate) 염을 포함하는 완충제로 단백질 A 매트릭스로부터 용리액 풀(eluant pool)로 용리시키는 단계, 및:
(i) 용리액 풀이 pH 3.3 내지 3.7의 pH 범위보다 더 염기성인 경우, 시트르산으로 용리액 풀을 pH 3.3 내지 3.7로 적정하고,
(ii) 선택적으로, 바이러스 불활성화를 위한 충분한 기간 동안 용리액 풀을 pH 3.3 내지 3.7로 유지하는 단계;
(d) pH 5.0 내지 5.5에서, (c)로부터 용리액 풀 내의 POI를 2 내지 15 mS의 낮은 전도도 완충제로 양이온 교환 매트릭스(CEX)에 결합시키는 단계;
(e) 40 내지 100mS까지 점점 더 높은 전도도의 전해질 농도 구배로 POI를 양이온 교환 매트릭스로부터 CEX 용리액 풀로 용리시키는 단계; 및
(f) CEX 용리액 풀을 pH 5.0 내지 6.0의 높은 전도도 완충제에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography, HIC) 매트릭스에 로딩하고 HIC 매트릭스를 세척하는 단계, 이로써 POI는 갈렉틴 HCP 오염물로부터 분리됨.
제1항에 있어서, 상기 (b)에서 POI가 결합된 단백질 A 매트릭스를 세척하는 단계는 2 내지 2.7M의 염화칼슘을 포함하는 완충제로 세척하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 POI는 애플리버셉트(aflibercept), 알레파셉트(alefacept), 에타너셉트(etanercept), 아바타셉트(abatacept), 벨라타셉트(belatacept), rFVIIIFc, rFIXFc 및 릴로나셉트(rilonacept)에서 선택되는 방법.
제3항에 있어서, 상기 POI는 애플리버셉트(aflibercept)인 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 숙주세포 배양 상등액 또는 여과액은 금속 양이온 오염물(contaminant)을 추가로 포함하고, 상기 POI는 또한 금속 양이온 오염물로부터 분리되는 방법.
제6항에 있어서, 상기 금속 양이온 오염물(contaminant)은 알루미늄, 바륨, 칼슘, 코발트, 구리, 아연, 철, 마그네슘, 망간, 수은, 니켈 및 스트론튬 양이온으로부터 선택되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 금속 양이온 오염물(contaminant)은 철 양이온인 방법.
제1항에 있어서, (c)로부터 용리액 풀 내의 POI를 양이온 교환 매트릭스에 결합시키기 전에, 규조토(diatomaceous earth)를 통한 여과를 포함하는 심층 여과(depth filtration)에 용리액 풀을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 규조토(diatomaceous earth)는 시트레이트(citrate) 완충제로 사전-조정된(pre-conditioned) 방법.