RU2820588C2 - Способы очистки гетеродимерных полиспецифических антител - Google Patents

Способы очистки гетеродимерных полиспецифических антител Download PDF

Info

Publication number
RU2820588C2
RU2820588C2 RU2021111202A RU2021111202A RU2820588C2 RU 2820588 C2 RU2820588 C2 RU 2820588C2 RU 2021111202 A RU2021111202 A RU 2021111202A RU 2021111202 A RU2021111202 A RU 2021111202A RU 2820588 C2 RU2820588 C2 RU 2820588C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
elution buffer
binding
polyspecific
heavy chain
Prior art date
Application number
RU2021111202A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2021111202A (ru
Inventor
Бретт ЙОРГЕНСЕН
Уте Шелленбергер
Original Assignee
Тенеобио, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Тенеобио, Инк. filed Critical Тенеобио, Инк.
Publication of RU2021111202A publication Critical patent/RU2021111202A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2820588C2 publication Critical patent/RU2820588C2/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ очистки полиспецифического антитела IgG из смеси с помощью аффинной хроматографии. Способ включает иммобилизацию полиспецифического антитела IgG из смеси на первой колонке для аффинной хроматографии и эллюирование полиспецифического антитела IgG буфером для элюирования, содержащим антиагрегационную композицию для очистки полиспецифического антитела IgG из смеси, где полиспецифическое антитело IgG является антителом, состоящим только из тяжелых цепей или трехцепочечной антителоподобной молекулой. Изобретение расширяет арсенал средств очистки трехцепочечных антител или трехцепочечных антителоподобных молекул и снижает агрегацию при их очистке. 19 з.п. ф-лы, 17 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет даты подачи по предварительной заявке на патент США № 62/734566, поданной 21 сентября 2018 г., а также предварительной заявке на патент США № 62/742821, поданной 8 октября 2018 г., описания каждой из заявок полностью включены в данный документ посредством ссылки.
Перечень последовательностей
Рассматриваемая в настоящий момент заявка содержит перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 25 ноября 2019 г., называется TNO-0015-WO_SL.txt и имеет размер 11804 байта.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способам очистки гетеродимерных полиспецифических антител из раствора.
Уровень техники
Биспецифические антитела (бсАт) представляют собой важный новый класс белковых терапевтических средств. БсАт предназначены для распознавания и связывания двух разных антигенов, часто с целью перенацеливания иммунных эффекторных клеток на уничтожение раковых клеток. В настоящее время два бсАт одобрены в качестве терапевтических средств Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), а одно - Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA). Часто во время очистки гетеродимерных полиспецифических антител использование стандартной хроматографии на основе белка А для улавливания является проблематичным, отчасти из-за присутствия Fc-содержащих вариантов продукта в неочищенной смеси бсАт. Кроме того, мультимерные белки, такие как антитела, имеют более высокую тенденцию к агрегации, что способствует значительному увеличению уровней примесей. Таким образом, существует потребность в разработке способов очистки, которые эффективно удаляют специфические для продукта (агрегаты или продукты деградации) и связанные с процессом (компоненты среды, белки клетки-хозяина, ДНК, хроматографические среды, используемые для очистки, эндотоксины, вирусы и т. д.) примеси и которые позволят получить достаточное количество правильного и полного полиспецифического антитела. Существуют различные способы очистки антител, известные в данной области техники, однако до сих пор существует неудовлетворенная потребность в альтернативных хроматографических процессах, которые позволяют отделять и очищать полиспецифические антитела от агрегатов и комплексов, которые могут образовываться, например, в результате модификаций, обусловленных процессами, или условий производства.
Сущность изобретения
Аспекты изобретения включают способы очистки полиспецифического антитела IgG из смеси с помощью аффинной хроматографии, при этом способы включают: иммобилизацию полиспецифического антитела IgG из указанной смеси на первой колонке для аффинной хроматографии, обладающей специфичностью связывания с константным доменом тяжелой цепи указанного антитела IgG; и элюирование полиспецифического антитела из первой колонки для аффинной хроматографии буфером для элюирования, содержащим антиагрегационную композицию для очистки полиспецифического антитела из смеси, причем антиагрегационная композиция содержит один или более полиолов.
В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов выбраны из группы, состоящей из маннита, глицерина, сахарозы, трегалозы и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов имеют концентрацию от около 5% до около 25% мас./об. В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов содержат глицерин, имеющий концентрацию в диапазоне от около 5% до около 15% мас./об. В некоторых вариантах осуществления глицерин имеет концентрацию около 10% мас./об. В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов содержат сахарозу, имеющую концентрацию в диапазоне от около 5% до около 15% мас./об. В некоторых вариантах осуществления сахароза имеет концентрацию около 10% мас./об. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 10% мас./об. глицерина и около 10% мас./об. сахарозы.
В некоторых вариантах осуществления колонка для аффинной хроматографии содержит смолу для хроматографии на основе белка А. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования выбран из группы, состоящей из цитрата, ацетата, уксусной кислоты, 4-морфолинэтансульфоната (MES), цитрат-фосфата, сукцината и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации от около 20 мМ до около 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации около 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,2 до около 4,2. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,4 до около 3,8. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH около 3,6. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 25 мМ цитрата, около 10% глицерина и около 10% сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH около 3,6.
В некоторых вариантах осуществления колонка для аффинной хроматографии содержит смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования включает буфер, выбранный из группы, состоящей из цитрата, ацетата, уксусной кислоты, 4-морфолинэтансульфоната (MES), цитрат-фосфата, сукцината и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит уксусную кислоту в концентрации от около 45 мМ до около 55 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит уксусную кислоту в концентрации около 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,4 до около 4,4. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,8 до около 4,2. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH около 4,0. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 50 мМ уксусной кислоты, около 10% глицерина и около 10% сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH около 4,0.
Аспекты изобретения включают способы уменьшения агрегации полиспецифического антитела IgG в пуле элюирования в результате процедуры аффинной хроматографии, при этом способы включают: иммобилизацию полиспецифического антитела IgG на колонке для аффинной хроматографии на основе белка А; и элюирование полиспецифического антитела IgG из колонки для аффинной хроматографии на основе белка А буфером для элюирования, содержащим 25 мМ цитрата, 10% мас./об. глицерина и 10% мас./об. сахарозы, при этом буфер для элюирования имеет pH 3,6.
Аспекты изобретения включают способы уменьшения агрегации полиспецифического антитела IgG в пуле элюирования в результате процедуры аффинной хроматографии, при этом способы включают:
иммобилизацию полиспецифического антитела IgG на колонке для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, которая имеет аффинность связывания с доменом CH1 полиспецифического антитела IgG; и элюирование полиспецифического антитела IgG из колонки для аффинной хроматографии буфером для элюирования, содержащим 50 мМ уксусной кислоты, 10% глицерина и 10% сахарозы, при этом буфер для элюирования имеет pH 4,0.
В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело IgG содержит первую и вторую связывающие единицы. В некоторых вариантах осуществления первая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи. В некоторых вариантах осуществления вторая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления первая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, состоящего только из тяжелых цепей, а вторая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления первая связывающая единица имеет аффинность связывания с ассоциированным с опухолью антигеном. В некоторых вариантах осуществления вторая связывающая единица имеет аффинность связывания с эффекторной клеткой. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления вторая связывающая единица имеет аффинность связывания с белком CD3 на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления полиспецифическое антитело IgG представляет собой биспецифическое антитело IgG.
Данные и другие аспекты будут дополнительно объяснены в остальной части описания, включая примеры.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показана молекула бсАт в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения.
На Фиг. 2 показан неограничивающий пример бсАт. Этот изображенный вариант осуществления содержит CD3-связывающее плечо и TAA-связывающее плечо, содержащее первый и второй домен VH. В изображенном варианте осуществления первый и второй домены VH идентичны, и оба обладают аффинностью связывания с TAA. На Фиг. 3 показаны активная и неактивная формы бсАт, показанного на Фиг. 2. Активная форма представляет собой гетеродимер (панель A), в то время как неактивные формы включают гомодимер к TAA, полу-Ат, гомодимер к CD3, избыточную легкую цепь (LC) и агрегаты.
На Фиг. 4 представлен график единиц оптической плотности (AU) как функции времени для анализа методом SEC. График демонстрирует, что гетеродимер бсАт подобен по размеру гомодимеру к CD3, который содержит только CD3-связывающее плечо (изображено на Фиг. 3, панель B).
На Фиг. 5 показан анализ геля ИЭФ, демонстрирующий, что гетеродимер бсАТ, гомодимер к CD3 и гомодимер к TAA имеют разные изоэлектрические точки (pI).
На Фиг. 6 показан профиль элюирования из колонки для хроматографии на белке А при pH 3,6. Результат демонстрирует, что пик элюирования составляет 96% от общей интегрированной площади. Описаны условия нанесения, уравновешивания и элюирования.
На Фиг. 7 показан график единиц оптической плотности (AU) как функции времени для анализа методом SEC, демонстрирующий, что бсАт агрегирует после элюирования в хроматографии на основе белка A при pH 3,6. Описаны условия буфера и скорости потока.
На Фиг. 8 представлен анализ методом ДСН-ПААГ-электрофореза, подтверждающий, что фракции с высокой молекулярной массой соответствуют продукту бсАт.
На Фиг. 9 показана серия графиков, демонстрирующих, что добавки могут снижать агрегацию бсАт, элюированного в хроматографии на основе белка А. Исследуемые добавки включали маннит, глицерин, сахарозу и трегалозу в различных комбинациях.
На Фиг. 10, панели A показана активная молекула бсАт, содержащая домен CH1, а на панели B показан неактивный гомодимер к TAA.
На Фиг. 11 показан анализ методом ДСН-ПААГ-электрофорез, сравнивающий пул белка A и пул CaptureSelect CH1 (CH1-XL). Анализ демонстрирует, что гомодимер к ТАА присутствует в проточном потоке CH1-XL.
На Фиг. 12 представлено сравнение профиля улавливания и элюирования в хроматографии на основе белка A (панель A) и профиля улавливания и элюирования CH1-XL (панель B) для бсАт. Элюирование в хроматографии на основе белка А проводили при pH 3,3, тогда как элюирование CH1-XL проводили при pH 4,6.
На Фиг. 13 показан профиль улавливания и элюирования бсАт в хроматографии CH1-XL, где элюирование проводили при pH 4. Результаты демонстрируют, что бсАт элюируется эффективно, составляя 93% от интегрированной площади пика.
На Фиг. 14 представлен график единиц оптической плотности (AU) как функции времени для анализа методом SEC, демонстрирующий, что бсАт, элюированный из CH1-XL, содержит минимальные агрегаты. Пул CH1-XL имел низкое содержание ВМ (2,2%) с эффективным связыванием продукта с собранной культуральной жидкости (HCCF).
На Фиг. 15 представлена таблица, на которой показано время удержания и емкость динамического связывания смолы для хроматографии CH1-XL. Результаты демонстрируют плато емкости динамического связывания (DBC) через 4 минуты (9,3 мг/мл).
На Фиг. 16 представлена блок-схема, иллюстрирующая типовые процессы синтеза и выделения, и очистки, связанные со способом производства бсАт.
На Фиг. 17 показан анализ методом ДСН-ПААГ-электрофорезом для способа очистки бсАт.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
При практическом осуществлении настоящего изобретения применяют, если не указано иное, традиционные способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие способы подробно описаны в литературе, например, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M. J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R. I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., ed., 1994); “A Practical Guide to Molecular Cloning” (Perbal Bernard V., 1988); “Phage Display: A Laboratory Manual” (Barbas et al., 2001); Harlow, Lane and Harlow, Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol No. I, Cold Spring Harbor Laboratory (1998); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; (1988); и Uwe Gottschalk, “Process Scale Purification of Antibodies” (2017).
Когда приводится диапазон значений, следует понимать, что данное изобретение охватывает каждое промежуточное значение с точностью до десятого знака нижнего предела, если в контексте явно не указано иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона, а также любое другое указанное или промежуточное значение в таком указанном диапазоне. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны и также включены в данное изобретение с учетом любого специальным образом исключенного предела в указанном диапазоне. Если указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба этих включенных предела, также включены в данное изобретение.
Если не указано иное, остатки антител в данном документе нумеруются в соответствии с системой нумерации по Kabat (e.g., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).
Для обеспечения полного понимания настоящего изобретения в нижеследующем подробном описании изложены многочисленные конкретные детали. Однако для специалиста в данной области техники будет очевидно, что данное изобретение может применяться на практике и без одной или более указанных конкретных деталей. В других случаях общеизвестные отличительные признаки и процедуры, хорошо известные специалистам в данной области техники, не были описаны во избежание затруднения понимания изобретения.
Все приведенные в данном документе ссылки, включая патентные заявки и публикации, включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
I. Определения
Под термином «содержащий» подразумевается, что перечисленные элементы требуются для композиции/способа/набора, однако для формирования композиции/способа/набора и тому подобного в рамках формулы изобретения могут быть включены и другие элементы.
Под термином «состоящий по существу из» подразумевается ограничение рамок описанной композиции или способа указанными материалами или поэтапными действиями, не оказывающими существенного влияния на основную и новую характеристику(-и) объекта изобретения.
Под термином «состоящий из» подразумевается исключение любого элемента, поэтапного действия или ингредиента, не указанного в формуле изобретения, из композиции, способа или набора.
Используемый в данном документе термин «связывающая единица» относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере одну последовательность вариабельного домена (VH), которая связывается со связывающей мишенью, с последовательностью ассоциированного вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела или без нее. В некоторых вариантах осуществления связывающая единица содержит один домен VH антитела, содержащего только тяжелые цепи. В других вариантах осуществления связывающая единица содержит домен VH и домен VL.
«Очищенное» антитело (например, биспецифическое антитело) означает, что чистота антитела была увеличена, так что антитело присутствует в более чистой форме, чем оно находится в его естественной среде и/или при первоначальном синтезе, и/или увеличении количества в лабораторных условиях. Чистота является понятием относительным и не обязательно означает абсолютную чистоту. Термины «очистка» или «разделение», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к увеличению степени чистоты желаемой молекулы (такой как полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело) из композиции или образца, содержащего желаемую молекулу и одну или более примесей. Как правило, степень чистоты желаемой молекулы повышается путем удаления (полностью или частично) по меньшей мере одной примеси из композиции.
Антитела, которые можно очистить способами по изобретению, включают полиспецифические антитела. Полиспецифические антитела имеют более чем одну специфичность связывания. Термин «мультиспецифический» или «полиспецифический», в частности, включает «биспецифический» и «триспецифический», а также независимые специфические аффинности связывания более высокого порядка, такие как полиэпитопная специфичность более высокого порядка, а также четырехвалентные антитела и фрагменты антител. «Полиспецифические» антитела, в частности, включают антитела, содержащие комбинацию различных связывающих компонентов, а также антитела, содержащие более чем один и тот же связывающий компонент. Термины «полиспецифическое антитело», «полиспецифическое антитело, содержащее только тяжелые цепи», «полиспецифическое антитело, состоящее только из тяжелых цепей» и «полиспецифическое антитело UniAb™» используются в данном документе в самом широком смысле и охватывают все антитела с более чем одной специфичностью связывания. В неограничивающем примере полиспецифические антитела, очищенные согласно настоящему изобретению, конкретно включают антитела, иммуноспецифически связывающиеся с белком CD3, таким как CD3 человека, и белком BCMA, таким как BCMA человека.
Используемый в данном документе термин «агрегаты» относится к белковым агрегатам, например, гомодимерам. Он включает мультимеры (такие как димеры, тетрамеры или агрегаты более высокого порядка) полиспецифических антител и/или их субъединиц, подлежащих очистке, и может приводить, например, к высокомолекулярным агрегатам.
Используемый в данном документе термин «антиагрегационная композиция» относится к композиции, которая снижает нежелательную ассоциацию двух или более белков, например, полиспецифических антител или их субъединиц. В некоторых вариантах осуществления антиагрегационная композиция содержит один или более полиолов.
«Полиол» представляет собой вещество с несколькими гидроксильными группами и включает сахара (восстанавливающие и невосстанавливающие сахара), сахарные спирты и сахарные кислоты. Неограничивающие примеры полиолов включают маннит, глицерин, сахарозу, трегалозу и сорбит.
«Плотность нанесения» относится к количеству, например, в граммах, композиции, которую приводят в контакт с объемом материала для хроматографии, например, в литрах. В некоторых примерах плотность нанесения выражается в г/л.
«Образец» относится к небольшой части большего количества материала. Как правило, тестирование в соответствии с описанными в данном документе способом проводят на образце. Образец, как правило, получают из «смеси», которая содержит препарат рекомбинантного полипептида, полученный, например, из культивируемых линий клеток, экспрессирующих рекомбинантный полипептид, также называемых в данном документе «клеточными линиями продукта», или из культивируемых клеток-хозяев. Образец может быть получен из смеси, содержащей, например, но не ограничиваясь этим, собранную культуральную жидкость, из пула в процессе на определенной стадии способа очистки или из конечного очищенного продукта. Образец также может включать разбавители, буферы, детергенты и загрязняющие вещества, дебрис и т.п., которые обнаруживаются смешанными с желаемой молекулой (например, полиспецифическим антителом, например, биспецифическим антителом).
В контексте данного документа «клетки-хозяева» не содержат гены для экспрессии представляющих интерес рекомбинантных полипептидов или продуктов, а скорее служат в качестве хозяина-реципиента для таких генов, которые будут введены, например, путем трансфекции.
Термин «продукт», описанный в данном документе, означает вещество, подлежащее очистке при помощи способов по настоящему изобретению; например, полипептид (например, полиспецифическое антитело).
Термины «антитело, содержащее только тяжелые цепи», «антитело, состоящее из тяжелых цепей» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся в самом широком смысле к антителам, в которых отсутствует легкая цепь обычного антитела. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, описаны, например, в WO 2018/119215, описание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одного антигенного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одиночной детерминанты на антигене. Моноклональные антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным в Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, а также могут быть получены при помощи методов получения рекомбинантных белков (см., например, патент США № 4816567).
Используемый в данном документе термин «интактная цепь антитела» представляет собой цепь, содержащую полноразмерную вариабельную область и полноразмерную константную область (Fc). Интактное «стандартное» антитело содержит интактную легкую цепь и интактную тяжелую цепь, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, шарнир, CH2 и CH3 для секретируемого IgG. Интактное антитело может иметь одну или более «эффекторных функций», которые относятся к той биологической активности, которая присуща константной области Fc (области Fc с нативной последовательностью или Fc-области с вариантной аминокислотной последовательностью) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплементзависимую цитотоксичность; связывание с Fc-рецептором; антителозависимую клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ); фагоцитоз; и снижение количества рецепторов клеточной поверхности. Варианты константной области включают те, которые изменяют эффекторный профиль, связывание с Fc-рецепторами и т.п.
В зависимости от аминокислотной последовательности Fc (константного домена) их тяжелых цепей антитела и различные антигенсвязывающие белки из класса IgG могут быть определены в разные подклассы. Класс антител IgG можно дополнительно разделить на четыре «подкласса» (изотипа), например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Константные домены Fc, которые соответствуют классу антител IgG, могут обозначаться как γ (гамма). Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Формы Ig включают шарнирные модификации или бесшарнирные формы (Roux et al (1998) J. Immunol. 161:4083-4090; Lund et al (2000) Eur. J. Biochem. 267:7246-7256; US 2005/0048572; US 2004/0229310). Легкие цепи антител от любого вида позвоночных можно отнести к одному из двух типов, называемых κ и λ, на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов. Способы в соответствии с вариантами осуществления изобретения можно использовать с антителами IgG любого подкласса, то есть IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, включая их вариантные последовательности (дополнительно описанные в данном документе).
«Функциональная область Fc» обладает «эффекторной функцией» Fc-области с нативной последовательностью. Неограничивающие примеры эффекторных функций включают связывание C1q; КЗЦ; связывание с Fc-рецептором; АЗКЦ; АЗКФ; снижение количества рецепторов на поверхности клетки (например, В-клеточного рецептора) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило, требуют, чтобы область Fc взаимодействовала с рецептором, например, рецепторами FcγRI; FcγRIIA; FcγRIIB1; FcγRIIB2; FcγRIIIA; FcγRIIIB и рецептором FcRn с низкой аффинностью; и могут быть оценены с помощью различных анализов, известных в данной области техники. «Мертвый» или «подвергнутый сайленсингу» Fc представляет собой Fc, который был мутирован для сохранения активности в отношении, например, продления периода полужизни в сыворотке, но который не активирует высокоаффинный Fc-рецептор или который имеет сниженную аффинность к Fc-рецептору.
«Область Fc с нативной последовательностью» содержит аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности области Fc, встречающейся в природе. Человеческие области Fc с нативной последовательностью включают, например, область Fc человеческого IgG1 с нативной последовательностью (не-A- и A-аллотипы); область Fc человеческого IgG2 с нативной последовательностью; область Fc человеческого IgG3 с нативной последовательностью; и область Fc человеческого IgG4 с нативной последовательностью, а также их природные варианты.
«Вариант области Fc» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от последовательности области Fc с нативной последовательностью в силу по меньшей мере одной модификации аминокислоты, предпочтительно одной или более аминокислотных замен. Предпочтительно вариант области Fc имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с областью Fc с нативной последовательностью или с областью Fc исходного полипептида, например, от около одной до около десяти аминокислотных замен, и предпочтительно от около одной до около пяти аминокислотных замен в области Fc с нативной последовательностью или в области Fc исходного полипептида. Вариант области Fc в данном документе предпочтительно будет обладать по меньшей мере около 80% гомологией с областью Fc с нативной последовательностью и/или с областью Fc исходного полипептида, и наиболее предпочтительно по меньшей мере около 90% гомологии с ними, более предпочтительно по меньшей мере около 95 % гомологии с ним.
Варианты последовательностей Fc могут содержать три аминокислотные замены в области CH2 для снижения связывания FcγRI в положениях 234, 235, и 237 согласно индексу EU 234, 235 и 237 (см. Duncan et al., (1988) Nature 332:563). Две аминокислотные замены в сайте связывания комплемента C1q в положениях 330 и 331 согласно индексу EU снижают фиксацию комплемента (см. Tao et al., J. Exp. Med. 178:661 (1993) и Canfield and Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 (1991)). Замена на остатки человеческого IgG1 или IgG2 в положениях 233-236 и остатки IgG4 в положениях 327, 330 и 331 значительно снижает АЗКЦ и КЗЦ (см., например, Armour KL. et al., 1999 Eur J Immunol. 29(8):2613-24; и Shields RL. et al., 2001. J Biol Chem. 276(9):6591-604). Аминокислотная последовательность человеческого IgG1 (UniProtKB № P01857) представлена в данном документе как SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность человеческого IgG4 (UniProtKB № P01861) представлена в данном документе как SEQ ID NO: 4. Подвергнутый сайленсингу IgG1 описан, например, в Boesch, A.W., et al., «Highly parallel characterization of IgG Fc binding interactions». MAbs, 2014. 6(4): p. 915-27, описание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Возможны и другие варианты Fc, включая, без ограничения, вариант, в котором удалена область, способная образовывать дисульфидную связь, или в котором удалены определенные аминокислотные остатки на N-конце нативного Fc, или остаток метионина добавлен к нему. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одна или более Fc-частей связывающего соединения могут содержать одну или более мутаций в шарнирной области для устранения дисульфидной связи. В еще одном варианте шарнирная область Fc может быть удалена полностью. В еще одном варианте связывающее соединение может содержать вариант Fc.
Кроме того, вариант Fc может быть сконструирован для удаления или существенного снижения эффекторных функций путем замены (мутации), удаления или добавления аминокислотных остатков для осуществления связывания комплемента или связывания Fc-рецептора. Например, без ограничения, делеция может происходить в сайте связывания комплемента, таком как сайт связывания C1q. Способы получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина описаны в международных патентных публикациях №№ WO 97/34631 и WO 96/32478. Кроме того, Fc-домен может быть модифицирован фосфорилированием, сульфированием, ацилированием, гликозилированием, метилированием, фарнезилированием, ацетилированием, амидированием и т.п.
Fc может иметь форму, имеющую нативные углеводные цепи, увеличенные углеводные цепи по сравнению с нативной формой или уменьшенные углеводные цепи по сравнению с нативной формой, или может быть в агликозилированной или дегликозилированной форме. Увеличение, уменьшение, удаление или другая модификация углеводных цепей может быть достигнута способами, общепринятыми в данной области техники, такими как химический метод, ферментативный метод или путем экспрессии в линии продуцирующих клеток, полученной с помощью генной инженерии. Такие линии клеток могут включать микроорганизмы, например, Pichia Pastoris, и линии клеток млекопитающих, например, клетки СНО, которые естественным образом экспрессируют гликозилирующие ферменты. Кроме того, микроорганизмы или клетки могут быть сконструированы для экспрессии ферментов гликозилирования или могут быть лишены способности экспрессировать ферменты гликозилирования (см., например, Hamilton, et al., Science, 313:1441 (2006); Kanda, et al, J. Biotechnology, 130:300 (2007); Kitagawa, et al., J. Biol. Chem., 269 (27): 17872 (1994); Ujita-Lee et al., J. Biol. Chem., 264 (23): 13848 (1989); Imai-Nishiya, et al, BMC Biotechnology 7:84 (2007); и WO 07/055916). В качестве одного примера клетки, сконструированной для изменения активности сиалирования, ген альфа-2,6-сиалилтрансферазы 1 был сконструирован в клетках яичника китайского хомячка и в клетках sf9. Таким образом, антитела, экспрессируемые этими сконструированными клетками, сиалилируются продуктом экзогенного гена. Дополнительный способ получения молекул Fc, имеющих модифицированное количество углеводных остатков по сравнению с множеством нативных молекул, включает разделение указанного множества молекул на гликозилированные и негликозилированные фракции, например, с использованием аффинной хроматографии на лектине (см., например, WO 07/117505). Было показано, что присутствие определенных групп гликозилирования изменяет функцию иммуноглобулинов. Например, удаление углеводных цепей из молекулы Fc приводит к резкому снижению аффинности связывания с частью C1q первого компонента комплемента C1 и снижению или потере антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) или комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ), тем самым не вызывая ненужных иммунных ответов in vivo. Дополнительные важные модификации включают сиалирование и фукозилирование: присутствие сиаловой кислоты в IgG коррелирует с противовоспалительной активностью (см., например, Kaneko, et al, Science 313: 760 (2006)), тогда как удаление фукозы из IgG приводит к усилению активности АЗЦК (см., например, Shoj-Hosaka, et al, J. Biochem., 140:777 (2006)).
В альтернативных вариантах осуществления связывающие соединения, очищенные согласно изобретению, могут иметь последовательность Fc с усиленными эффекторными функциями, например, за счет увеличения их способности связывания с FcγRIIIA и увеличения активности АЗКЦ. Например, фукоза, присоединенная к N-связанному гликану в N-297 Fc, стерически препятствует взаимодействию Fc с FcγRIIIA, а удаление фукозы с помощью гликоинженерии может увеличить связывание с FcγRIIIA, что приводит к более чем 50-кратному увеличению активности АЗКЦ по сравнению с контролями IgG1 дикого типа. Белковая инженерия за счет аминокислотных мутаций в Fc-части IgG1 позволяет получить множество вариантов, которые увеличивают аффинность связывания Fc с FcγRIIIA. Примечательно, что тройной аланиновый мутант S298A/E333A/K334A демонстрирует 2-кратное увеличение связывания с FcγRIIIA и функции АЗКЦ. Варианты S239D/I332E (2X) и S239D/I332E/A330L (3X) обладают значительным повышением аффинности связывания с FcγRIIIA и увеличением способности АЗКЦ in vitro и in vivo. Другие варианты Fc, идентифицированные при помощи дрожжевого дисплея, также продемонстрировали улучшенное связывание с FcγRIIIA и усиленное уничтожение опухолевых клеток в мышиных моделях ксенотрансплантата. См., например, Liu et al. (2014) JBC 289(6):3571-90, специально включенный в данный документ посредством ссылки.
Термин «антитело, содержащее область Fc» относится к антителу, которое содержит область Fc. С-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с системой нумерации EU) области Fc может быть удален, например, во время очистки антитела или путем конструирования рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело. Соответственно, антитело, имеющее область Fc согласно данному изобретению, может включать антитело с или без K447.
Были разработаны различные способы получения поливалентных искусственных антител путем рекомбинантного слияния вариабельных доменов двух или более антител. В некоторых вариантах осуществления первый и второй антигенсвязывающий домен на полипептиде соединены полипептидным линкером. Одним неограничивающим примером такого полипептидного линкера является GS-линкер, имеющий аминокислотную последовательность из четырех остатков глицина, за которыми следует один остаток серина, и в котором последовательность повторяется n раз, где n представляет собой целое число от 1 до около 10, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 (SEQ ID NO: 8). Неограничивающие примеры таких линкеров включают GGGGS (SEQ ID NO: 1) (n= 1) и GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 2) (n=2). Также можно использовать другие подходящие линкеры, которые описаны, например, в Chen et al., Adv Drug Deliv Rev. 2013 October 15; 65(10): 1357-69, описание которого полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Термин «биспецифическая трехцепочечная антителоподобная молекула» или «ТСА» используется в данном документе для обозначения антителоподобных молекул, содержащих, состоящих по существу или состоящих из трех полипептидных субъединиц, две из которых содержат, состоят по существу из или состоят из одной тяжелой и одной легкой цепи моноклонального антитела, или функциональных антигенсвязывающих фрагментов таких цепей антитела, содержащих антигенсвязывающую область и по меньшей мере один домен СН. Данная пара тяжелая цепь/легкая цепь обладает специфичностью связывания для первого антигена. Третья полипептидная субъединица содержит, состоит по существу или состоит из антитела, содержащего только тяжелые цепи, содержащего Fc-часть, содержащую домены СН2 и/или СН3, и/или СН4, в отсутствие домена СН1, и антигенсвязывающий домен, который связывает эпитоп второго антигена или другой эпитоп первого антигена, причем такой связывающий домен получен из или имеет идентичность последовательности с вариабельной областью тяжелой или легкой цепи антитела. Части такой вариабельной области могут кодироваться сегментами гена VH и/или VL, сегментами гена D и JH, или сегментами гена JL. Вариабельные области могут кодироваться перегруппированными сегментами генов VHDJH, VLDJH, VHJL, или VLJL.
В соединении, связывающем ТСА, используется «антитело, содержащее только тяжелые цепи», или «антитело, состояшие только из тяжелых цепей», или «полипептид, содержащий только тяжелые цепи», которые, как используется в данном документе, означают одноцепочечное антитело, содержащее константные области тяжелой цепи CH2 и/или CH3, и/или CH4, но без домена CH1. В одном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и доменов CH2, и CH3. В другом варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена CH2. В дополнительном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, состоит из антигенсвязывающего домена, по меньшей мере части шарнирной области и домена CH3. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, у которых домен СН2 и/или СН3 укорочен, также включены в данный документ. В дополнительном варианте осуществления тяжелая цепь состоит из антигенсвязывающего домена и по меньшей мере одного домена СН (СН1, СН2, СН3 или СН4), но без шарнирной области. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, может быть в форме димера, в котором две тяжелые цепи связаны дисульфидной связью, другие в противном случае ковалентно или нековалентно связаны друг с другом, и может необязательно включать асимметричную границу взаимодействия между одним или более доменами CH, чтобы облегчить правильное спаривание между полипептидными цепями. Антитело, содержащее только тяжелые цепи, подлежащее очистке в соответствии с вариантами осуществления изобретения, принадлежит к классу IgG. В конкретном варианте осуществления антитело, содержащее только тяжелые цепи, относится к подклассам IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, в частности к подтипу IgG1 или подтипу IgG4, включая их варианты (дополнительно описанные в данном документе).
«Эпитоп» представляет собой сайт на поверхности молекулы антигена, с которым связывается антигенсвязывающая область связывающего соединения. Как правило, антиген имеет несколько или много разных эпитопов и реагирует со многими различными связывающими соединениями (например, со многими различными антителами). Термин, в частности, включает линейные эпитопы и конформационные эпитопы.
Используемый в данном документе термин «валентный» относится к определенному количеству сайтов связывания в молекуле антитела или связывающем соединении.
«Поливалентное» связывающее соединение имеет два или более сайта связывания. Таким образом, термины «двухвалентный», «трехвалентный» и «четырехвалентный» относятся к наличию двух сайтов связывания, трех сайтов связывания и четырех сайтов связывания, соответственно. Таким образом, биспецифическое антитело, очищенное при помощи способа согласно изобретению, является по меньшей мере двухвалентным и может быть трехвалентным, четырехвалентным или иным образом поливалентным. Известно большое разнообразие способов и конфигураций белка и используется для получения биспецифических моноклональных антител (бсмкАт), триспецифических антител и тому подобного.
Используемый в данном документе термин «эффекторная клетка» относится к иммунной клетке, которая участвует в эффекторной фазе иммунного ответа, в отличие от когнитивной и активационной фаз иммунного ответа. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические Fc-рецепторы и выполняют специфические иммунные функции. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка, такая как естественная клетка-киллер, способна индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). Например, моноциты и макрофаги, которые экспрессируют FcR, участвуют в специфическом уничтожении клеток-мишеней и презентации антигенов другим компонентам иммунной системы или связывании с клетками, которые презентуют антигены. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень или клетку-мишень.
«Эффекторные клетки человека» представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют рецепторы, такие как Т-клеточные рецепторы или FcR, и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, такие клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и осуществляют эффекторную функцию АЗКЦ. Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ, включают, естественные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы; причем NK-клетки являются предпочтительными. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника, например, из крови или МКПК, как описано в данном документе.
Термин «иммунная клетка» используется в данном документе в самом широком смысле, включая, без ограничения, клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например, лимфоциты (такие как В-клетки и Т-клетки, включая цитолитические Т-клетки (ЦТЛ)), клетки-киллеры, естественные клетки-киллеры (NK), макрофаги, моноциты, эозинофилы, полиморфно-ядерные клетки, такие как нейтрофилы, гранулоциты, тучные клетки и базофилы.
«Эффекторные функции» антитела относятся к той биологической активности, которая относится к области Fc (области Fc с нативной последовательностью или области Fc с вариантной аминокислотной последовательностью) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность АЗКЦ (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов поверхности клетки. (например, B-клеточный рецептор, BCR) и т.д.
«Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» и «АЗКЦ» соответствуют опосредованной клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на целевой клетке и, таким образом, приводят к лизису клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие АЗКЦ, естественные клетки-киллеры, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках приведена в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для оценки АЗКЦ-активности представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ АЗКЦ in vitro, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, пригодные для такого анализа, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные клетки-киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнения, АЗКЦ-активность молекулы, представляющей интерес, можно оценить in vivo, например, в животной модели, например, согласно описанию в публикации Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).
«Комплементзависимая цитотоксичность» или «КЗЦ» относится к способности молекулы лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с распознаваемым антигеном. Для оценки активации комплемента, может быть выполнен анализ КЗЦ, например, как описано в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).
Термины «лечение, «лечить» и тому подобное используются в данном документе для обозначения достижения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптомов и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного явления, связанного с этим заболеванием. В контексте данного документа термин «лечение» охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, и включает в себя: (а) предотвращение появления заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого это заболевание еще не диагностировано; (b) ингибирование заболевания, т. е. прекращение его развития; или (c) облегчение заболевания, т. е. регрессию заболевания. Терапевтическое средство можно вводить до, во время или после начала заболевания или травмы. Лечение текущего заболевания, при котором лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы пациента, представляет особый интерес. Такое лечение желательно проводить до полной потери функции в пораженных тканях. Терапия у субъекта может быть проведена во время симптоматической стадии заболевания, и в некоторых случаях после симптоматической стадии заболевания.
Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения млекопитающего, которого оценивают на предмет лечения и/или которое подвергается лечению. В одном варианте осуществления млекопитающее является человеком. Термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» охватывают, без ограничения, индивидуумов, имеющих злокачественное новообразование, и/или индивидуумов с аутоиммунными заболеваниями, и т.п. Субъектами могут быть люди, но также могут быть и другие млекопитающие, в частности те млекопитающие, которые могут быть использованы в качестве лабораторных моделей заболеваний человека, например, мышь, крыса и т.д.
Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента, чтобы быть эффективным, и который не содержит каких-либо дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться состав. Такие составы являются стерильными. «Фармацевтически приемлемые эксципиенты» (носители, адьюванты) являются таковыми, которые резонно могут вводиться субъекту-млекопитающему и обеспечивать эффективную дозу используемого активного ингредиента.
«Стерильный» состав является асептическим или свободным от, или практически не содержит любых живых микроорганизмов и их спор. «Замороженный» состав представляет собой состав при температуре ниже 0°C.
«Стабильный» состав представляет собой состав, в котором белок в нем по существу сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. Предпочтительно, состав практически полностью сохраняет свою физическую или химическую стабильность, а также свою биологическую активность. Период хранения в общем выбран на основании срока годности состава. Разнообразные техники для измерения стабильности белка известны в данной области техники и рассмотрены, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301. Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90) (1993), например. Стабильность может быть измерена при выбранной температуре для выбранного периода времени. Стабильность может быть оценена качественно и/или количественно различными способами, включая оценку образования агрегатов (например, с использованием эксклюзионной хроматографии, путем измерения мутности и/или путем визуального контроля); путем оценки неоднородности заряда с помощью катионообменной хроматографии, изоэлектрического фокусирования изображения (icIEF) или электрофореза в капиллярной зоне; анализа N-концевой или C-концевой последовательности; масс-спектрометрического анализа; анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для сравнения восстановленного и интактного антитела; анализа пептидной карты (например, триптический или LYS-C); оценки биологической активности или антигенсвязывающей функции антитела; и т.п. Нестабильность может включать в себя одно или более из: агрегации, дезамидирования (например, дезамидирования Asn), окисления (например, окисления Met), изомеризации (например, изомеризаци Asp), отсечения/гидролиза/фрагментации (например, фрагментации шарнирной области), образования сукцинимида, неспаренного цистеина(-ов), удлинения N-конца, обработки C-конца, различий гликозилирования, и т.п.
II. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способы очистки полиспецифических антител
Часто во время очистки гетеродимерных полиспецифических антител, включая, например, биспецифические антитела (бсАт), использование хроматографии на основе белка А для улавливания является проблематичным из-за присутствия нежелательных Fc-содержащих вариантов продукта (например, нежелательных гомодимерных соединений) в неочищенной смеси бсАт. Кроме того, мультимерные белки, такие как антитела, имеют более высокую тенденцию к агрегации, что способствует значительному увеличению уровней примесей. Поэтому при разработке способа производства бсАт требуются альтернативные способы аффинной хроматографии для улавливания. В данном документе обсуждаются свойства и рабочие характеристики эффективности типовых процессов для хроматографии на основе белка А, а также альтернативные способы улавливания.
Способы в соответствии с вариантами осуществления изобретения включают очистку полиспецифического антитела из смеси с использованием процедуры аффинной хроматографии, включающие приведение в контакт первой колонки для аффинной хроматографии со смесью, иммобилизацию полиспецифического антитела на первой колонке для аффинной хроматографии, приведение в контакт с первой колонкой для аффинной хроматографии с буфером для элюирования, причем буфер для элюирования содержит антиагрегационную композицию, и элюирование полиспецифического антитела из первой колонки для аффинной хроматографии для очистки полиспецифического антитела из смеси.
В других аспектах изобретение относится к способам уменьшения агрегации полиспецифического антитела в пуле элюирования в результате процедуры аффинной хроматографии, включающим приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии на основе белка А со смесью, содержащей полиспецифическое антитело, иммобилизацию полиспецифического антитела на колонке для аффинной хроматографии на основе белка А, приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии на основе белка А с буфером для элюирования, при этом буфер для элюирования содержит 25 мМ цитрата, 10% мас./об. глицерина и 10% мас./об. сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH 3,6 и элюирует полиспецифическое антитело из колонки для аффинной хроматографии на основе белка А, чтобы очистить полиспецифическое антитело из смеси.
В других аспектах изобретение относится к способам уменьшения агрегации полиспецифического антитела в пуле элюирования в результате процедуры аффинной хроматографии, включающим приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, со смесью, содержащей полиспецифическое антитело, иммобилизацию полиспецифического антитела на колонке для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, с буфером для элюирования, причем буфер для элюирования содержит 50 мМ уксусной кислоты, 10% глицерина и 10% сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH 4,0, элюирование полиспецифического антитела из колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, чтобы очистить полиспецифическое антитело из смеси.
Способы по изобретению можно использовать для очистки полиспецифических антител, содержащих множество связывающих единиц. В определенных вариантах осуществления полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело, содержит первую и вторую связывающие единицы. В некоторых вариантах осуществления первая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи. В некоторых вариантах осуществления вторая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления полиспецифическое антитело содержит первую связывающую единицу, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащее только тяжелые цепи, и вторую связывающую единицу, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления полиспецифическое антитело представляет собой антитело, содержащее только тяжелые цепи. Антитела, содержащие только тяжелые цепи, описаны, например, в WO 2018/119215, описание которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
В определенных вариантах осуществления полиспецифическое антитело представляет собой биспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления бсАт представляет собой антитело типа IgG из любого подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), включая сконструированные подклассы с измененными областями Fc, которые обеспечивают сниженную или повышенную активность эффекторной функции. БсАт в соответствии с вариантами осуществления изобретения могут быть получены из любого вида. В одном аспекте бсАт имеет преимущественно человеческое происхождение. В некоторых вариантах осуществления бсАт представляет собой подтип IgG4 и направлен против ассоциированного с опухолью антигена (TAA) в комбинации с CD3 (CD3-TAA). Неограничивающие примеры бсАт в соответствии с вариантами осуществления изобретения изображены на Фиг. 1 и Фиг. 2. Неактивные и активные виды изображены на фиг. 3.
В некоторых вариантах осуществления первая связывающая единица любого из полиспецифических антител, описанных в данном документе, например, биспецифических антител, связывает ассоциированный с опухолью антиген (ТАА). Ассоциированные с опухолью антигены (TAA) относительно ограничены опухолевыми клетками, тогда как опухолеспецифические антигены (TSA) являются уникальным для опухолевых клеток. TSA и TAA, как правило, представляют собой части внутриклеточных молекул, экспрессируемых на поверхности клетки в виде части главного комплекса гистосовместимости. Неограничивающие примеры ассоциированных с опухолью антигенов включают CD38, CD19, CD22 и BCMA. В определенных вариантах осуществления вторая связывающая единица любого из описанных в данном документе полиспецифических антител связывает эффекторную клетку. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой Т-клетку. В определенных вариантах осуществления вторая связывающая единица связывает CD3.
Термин «CD3» относится к белковому мультисубъединичному комплексу CD3 человека. Белковый CD3 мультисубъединичный комплекс человека состоит из 6 отдельных полипептидных цепей. Они включают в себя цепь CD3γ (SwissProt P09693), цепь CD3δ (SwissProt P04234), две цепи CD3ε (SwissProt P07766), и одну цепь гомодимера CD3ζ (SwissProt 20963), и которая ассоциирована с α- и β-цепями Т-клеточного рецептора. Термин «CD3» включает в себя любой вариант CD3, изоформу и гомолог в других видах, которые экспрессируется естественным образом в клетках (включая Т-клетки) или может быть экспрессирован на клетках трансфицированных генами или цДНК кодирующей указанные пептиды, если не указано иное.
Используемый в данном документе термин «ВСМА» относится к антигену созревания В-клеток, также известному как ВСМА, CD269 и TNFRSF17, который является членом суперсемейства рецепторов некроза опухоли, который предпочтительно экспрессируется в дифференцированных плазматических клетках. Используемый в данном документе термин «ВСМА человека» включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи ВСМА человека (UniProt Q02223), независимо от его источника или способа получения. Таким образом, «BCMA человека» включает BCMA человека, естественно экспрессируемый клетками, и BCMA, экспрессируемый на клетках, трансфицированных геном BCMA человека.
В некоторых вариантах осуществления бсАт структурно представляет собой тример, в котором одно плечо (например, CD3-связывающее плечо) содержит полностью человеческие тяжелые и легкие цепи, а другое плечо (например, плечо к TAA), полученное с помощью технологии UniRat™, состоит из тяжелой цепи человека (с одним или более доменами VH, слитыми непосредственно с доменом CH (содержащим, например, шарнир-CH2-CH3, и лишенным домена CH1). Из-за уникальной структуры этого бсАт только гетеродимерный продукт содержит домен CH1 тяжелой цепи человека (часть CD3-связывающего плеча).
Используемый в данном документе термин «CD38» относится к однопроходному трансмембранному белку типа II с эктоферментной активностью, также известному как АДФ-рибозилциклаза/циклическая АДФ-рибозогидролаза 1. Термин «CD38» включает белок CD38 любого вида человека или животного, кроме человека, и, в частности, включает CD38 человека, а также CD38 отличных от человека млекопитающих. Используемый в данном документе термин «CD38 человека» включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD38 человека (UniProt P28907), независимо от его источника или способа получения. Таким образом, «CD38 человека» включает CD38 человека, естественно экспрессируемый клетками, и CD38, экспрессируемый на клетках, трансфицированных геном CD38 человека. Термины «антитело к CD38, содержащее только тяжелые цепи», «антитело к CD38, состоящее только из тяжелых цепей», «анти-CD38 антитело, содержащее только тяжелые цепи» и «антитело к CD38, состоящее только из тяжелых цепей» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено выше, для иммуноспецифического связывания с CD38, включая CD38 человека, как определено выше. Определение включает, без ограничения, человеческие антитела, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулин человека, включая UniRat™, продуцирующие человеческие антитела UniAb™ к CD38 как определено выше.
Термины «CD19» и «кластер дифференцировки 19» в контексте данного документа относятся к молекуле, экспрессируемой во всех фазах развития В-клеток до терминальной дифференцировки в плазматические клетки. Термин «CD19» включает белок CD19 любого вида человека или животного, кроме человека, и, в частности, включает CD19 человека, а также CD19 отличных от человека млекопитающих. Используемый в данном документе термин «CD19 человека» включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD19 человека (UniProt P15391), независимо от его источника или способа получения. Таким образом, «CD19 человека» включает CD19 человека, естественно экспрессируемый клетками, и CD19, экспрессируемый на клетках, трансфицированных геном CD19 человека.
Термины «антитело к CD19, содержащее только тяжелые цепи», «антитело к CD19, состоящее только из тяжелых цепей», «анти-CD19 антитело, содержащее только тяжелые цепи» и «антитело к CD19, состоящее только из тяжелых цепей» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено выше, для иммуноспецифического связывания с CD19, включая CD19 человека, как определено выше. Определение включает, без ограничения, человеческие антитела, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулин человека, включая UniRat™, продуцирующие человеческие антитела UniAb™ к CD19 как определено выше.
Используемые в данном документе термины «CD22» и «кластер дифференцировки-22» относятся к молекуле, принадлежащей к семейству лектинов SIGLEC, обнаруженной на поверхности зрелых В-клеток и, в меньшей степени, на некоторых незрелых В-клетках. Термин «CD22» включает белок CD22 любого вида человека или животного, кроме человека, и, в частности, включает CD22 человека, а также CD22 отличных от человека млекопитающих. Используемый в данном документе термин «CD22 человека» включает любые варианты, изоформы и видовые гомологи CD22 человека (UniProt P20273), независимо от его источника или способа получения. Таким образом, «CD22 человека» включает CD22 человека, естественно экспрессируемый клетками, и CD22, экспрессируемый на клетках, трансфицированных геном CD22 человека. Термины «антитело к CD22, содержащее только тяжелые цепи», «антитело к CD22, состоящее только из тяжелых цепей», «анти-CD22 антитело, содержащее только тяжелые цепи» и «антитело к CD22, состоящее только из тяжелых цепей» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, содержащего только тяжелые цепи, как определено выше, для иммуноспецифического связывания с CD22, включая CD22 человека, как определено выше. Определение включает, без ограничения, человеческие антитела, содержащие только тяжелые цепи, продуцируемые трансгенными животными, такими как трансгенные крысы или трансгенные мыши, экспрессирующие иммуноглобулин человека, включая UniRat™, продуцирующие человеческие антитела UniAb™ к CD22 как определено выше.
Неограничивающие примеры других биспецифических антител, которые можно очистить с использованием способов в соответствии с вариантами осуществления изобретения, включают: блинатумомаб (CD 19 x CD3, Amgen); катумаксомаб (EpCAM x CD3, Trion Pharma); эмицизумаб (фактор IXa x фактор IX, Roche, Chugai); ABT-981 (ИЛ-1-альфа x ИЛ-1-бета, AbbVie); AFM13 (CD30 x CD16a, Affimed); истиратумаб (ИФР-1R x HER3, Merrimack Pharmaceuticals); SAR156597 (ИЛ-4 x ИЛ-13s, Sanofi); MP0250 (ФРЭС x ФРГ, Molecular Partners); MCLA-128 (HER3 x HER3, Merus); MCLA-117 (CLEC12A x CD3, Merus); ALX-0761 (ИЛ-17A x ИЛ-17F, Ablynx); AMG 570 (BAFF x ICOSL, Amgen); AMG 211 (CEA x CD3, Amgen/MedImmune); AMG 330 (CD33 x CD3, Amgen); AMG 420 (BCMA x CD3, Amgen); ABT-165 (DLL x VEGF, Abb Vie); AFM11 (CD19 x CD3, Affimed); MEDI4276 (HER2 x HER2, AstraZeneca/MedImmune); JNJ-61178104 (Johnson & Johnson/Genmab (мишени не раскрыты)); JNJ-61186372 (EGFR x cMET, Johnson & Johnson/Genmab); MDG006 (CD123 x CD3, Macrogenics); MGD007 (gpA33 x CD3, Macrogenics); дувортуксизумаб (MDG011) (CD19 x CD3, Macrogenics/Johnson & Johnson); MDG009 (B7-H3 x CD3, Macrogenics); MDG010 (CD32B x CD79B, Macrogenics); REGN1979 (CD20 x CD3, Regeneron); RG7386 (FAP x DR5, Roche); RG7828 (CD20 x CD3, Roche/Genentech); RG7802 (CEA x CD3, Roche); RG7992 (FGFR1 x KLB, Roche/Genentech); XmAb14045 (CD123 x CD3, Xencor/Novartis); и JNJ-63709178 (CD123 x CD3, Johnson & Johnson/Genmab).
Смеси
Аспекты настоящего изобретения включают способы очистки полиспецифических антител из смеси, содержащей полиспецифическое антитело и одно или более загрязняющих веществ, с использованием процедуры аффинной хроматографии. Смесь обычно представляет собой смесь, полученную в результате рекомбинантной продукции полиспецифического антитела, например, из культивируемых линий клеток, экспрессирующих рекомбинантный полипептид, или из культивируемых клеток-хозяев. Образец или смесь могут быть получены, например, но не ограничиваясь этим, из собранной культуральной жидкости (HCCF), из пула в процессе на определенной стадии способа очистки или из конечного очищенного продукта. Образец также может включать разбавители, буферы, детергенты и загрязняющие вещества, дебрис и т.п., которые обнаруживаются смешанными с желаемой молекулой (например, полиспецифическим антителом, например, биспецифическим антителом).
Для рекомбинантной продукции полипептида кодирующую его нуклеиновую кислоту выделяют и вставляют в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующая полипептид, легко выделяется и секвенируется с использованием традиционных процедур (например, когда полипептид представляет собой антитело, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Доступно множество векторов. Компоненты вектора, как правило, включают, но не ограничиваются ими, один или более из следующего: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции (например, как описано в патенте США № 5534615, специально включенного в данный документ посредством ссылки).
Пригодными клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах в данном документе являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот. Пригодные для этой цели прокариоты включают эубактерии, такие как Грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, и Shigella, а также Bacilli, такие как B. subtilis и B. licheniformis, Pseudomonas, такие как P. aeruginosa, и Streptomyces. Одним из предпочтительных хозяев для клонирования E. coli является E. coli 294 (ATCC 31 446), хотя пригодны и другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), и E. coli W3110 (ATCC 27,325). Эти примеры являются скорее иллюстративными, чем ограничивающими.
Примеры пригодных линий клеток-хозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки CV1 почки обезьяны, трансформированные SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); клетки эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почек новорожденного хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки обезьяны (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки почки обезьяны (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки обезьяны (MDCK, ATCC CCL 34); клетки почки обезьяны (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки почки обезьяны (W138, ATCC CCL 75); клетки почки обезьяны (Hep G2, HB 8065); клетки почки обезьяны (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; и клетки гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют описанными выше векторами экспрессии или клонирования для продуцирования полипептидов и культивируют в традиционных питательных средах, модифицированных, при необходимости для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности.
Клетки-хозяева, используемые для получения полипептида по данному изобретению, можно культивировать в различных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят коммерчески доступные среды, такие как F10 Хэма (Sigma), минимальная питательная среда ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и среда Игла в модификации Дульбекко ((DMEM), Sigma). Кроме того, любая из питательных сред, описанных в Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), патентах США №№ 4767704; 4657866; 4927762; 4560655; или 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; или патенте США Re. 30985 можно использовать в качестве культуральной среды для клеток-хозяев. Любая из этих сред может быть при необходимости дополнена гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлорид натрия, кальция, магния и фосфата), буферами (такими как HEPES ), нуклеотиды (такие как аденозин и тимидин), антибиотики (такие как лекарственное средство GENTAMYCIN™), микроэлементы (определяемые как неорганические соединения, как правило, присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне) и глюкоза или эквивалентный источник энергии. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам в данной области техники. Условия культивирования, такие как температура, pH и тому подобное, являются теми, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и будут очевидны для обычного специалиста в данной области техники.
При использовании рекомбинантных методов полипептид можно продуцировать внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или непосредственно секретировать в среду. Если полипептид продуцируется внутриклеточно, на первом этапе частицы дебриса, либо клетки-хозяева, либо лизированные клетки (например, полученные в результате гомогенизации), удаляются, например, при помощи центрифугирования или ультрафильтрации. Когда полипептид секретируется в среду, супернатанты из таких систем экспрессии, как правило, сначала концентрируют с использованием коммерчески доступного фильтра для концентрации белка, например, устройства ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon.
В некоторых вариантах осуществления смесь полиспецифических антител подвергают обработке детергентом перед очисткой, включающей аффинную хроматографию. Затем смесь полиспецифических антител подвергают одной или более стадиям очистки, как описано в данном документе.
Аффинная хроматография
При разработке описанного в данном документе способа очистки было обнаружено, что некоторые бсАт имеют тенденцию к агрегированию при воздействии низкого pH. Таким образом, использование хроматографии на основе белка A с элюированием при низком pH было особенно проблематичным в таких случаях, что стимулировало исследование смол для аффинной хроматографии, которые могли бы служить подходящей альтернативой белку A. Несмотря на пониженные уровни агрегации, наблюдаемые при включении добавок в буфер для элюирования в хроматографии на основе белка А, как описано в данном документе, все еще наблюдали совместную очистку нежелательных гомодимерных соединений (например, гомодимерных соединений к ТАА). Кроме того, кислотная лабильность бсАт препятствует использованию типовых процессов инактивации вирусов с низким pH. Таким образом, способы в соответствии с вариантами осуществления изобретения включают типовые процессы хроматографии, в которых используются различные типы смол для аффинной хроматографии, включая, но не ограничиваясь этим, смолу для аффинной хроматографии на основе белка А. В некоторых вариантах осуществления к буферу для элюирования в хроматографии на основе белка А добавляется антиагрегационная композиция, как описано в данном документе, для уменьшения нежелательных агрегатов гомодимера в элюате.
Другие аспекты изобретения включают типовые процессы хроматографии, в которых используется аффинная хроматография, включающая смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG и которая избирательно связывает продукт гетеродимерного полиспецифического антитела относительно гомодимера тяжелой цепи в качестве технологической примеси. В некоторых вариантах осуществления смола для домен-специфической хроматографии представляет собой смолу для аффинной хроматографии CaptureSelect™. В некоторых вариантах осуществления смола для домен-специфической хроматографии представляет собой смолу для афинной хроматографии CaptureSelect™ CH1-XL.
Смолы или материалы для аффинной хроматографии позволяют удерживать антитела на носителе для хроматографии на основе аффинности. Примеры аффинной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, например, хроматографию на основе белка A, хроматографию на основе белка G, хроматографию на основе белка A/G или хроматографию на основе белка L. Примеры материала для аффинной хроматографии включают, но не ограничиваются ими, ProSep®- vA, ProSep® Ultra Plus, Protein A Sepharose® Fast Flow, Toyopearl® AF-rProtein A, MabSelect™, MabSelect SuRe™, MabSelect SuRe™ LX, KappaSelect, CaptureSelect™, CaptureSelect™ FcXL, и CaptureSelect™ CH1-XL. В некоторых вариантах осуществления материал для аффинной хроматографии предложен в форме колонки. В некоторых вариантах осуществления аффинную хроматографию проводят в «режиме связывания и элюирования» (альтернативно называемого «процессом связывания и элюирования»). «Режим связывания и элюирования» относится к методике разделения продуктов, при которой продукт (такой как полиспецифическое антитело) в образце связывает материал для аффинной хроматографии и впоследствии элюируется из материала для аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления элюирование представляет собой ступенчатое элюирование, при котором состав подвижной фазы изменяется ступенчато, в одном или более случаях во время процесса элюирования. В определенных вариантах осуществления элюирование представляет собой градиентное элюирование, при котором состав подвижной фазы непрерывно изменяется во время процесса элюирования.
Общие свойства смолы для хроматографии CH1-XL заключаются в том, что она содержит лиганд наноантитела, специфического к CH1 тяжелой цепи Ig; он распознает все четыре подкласса IgG (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4); является лигандом, иммобилизованным на агарозе размером 65 мкм; он имеет связывающую способность менее 20 мг/мл IgG; его можно использовать в условиях скорости потока от 5 до 200 см/час; устойчив к основанию (25-50 мМ NaOH) для дезинфекции; и имеется в продаже. В целях очистки бсАт смола CH1-XL связывается с биспецифическим гетеродимером, содержащим домен CH1, но не связывается с гомодимерными соединениями тяжелой цепи (например, гомодимером к TAA). Как показано на Фиг. 10, только активные соединения содержат домен CH1. Кроме того, смолу CH1-XL можно использовать в менее жестких условиях кислотного элюирования (pH 4). Эти более мягкие условия элюирования способствуют снижению агрегации антител в пуле элюирования.
«Нанесение» относится к композиции, наносимой на материал для хроматографии. Буфер для нанесения представляет собой буфер, используемый для нанесения композиции (например, композиции, содержащей полиспецифическое антитело и примесь, или композицию, содержащую плечо антитела и примесь) на материал для хроматографии (такой как любой из материалов для хроматографии, описанных в данном документе). Материал для хроматографии может быть уравновешен уравновешивающим буфером перед нанесением очищаемой композиции. Буфер для отмывки используют после нанесения композиции на материал для хроматографии. Буфер для элюирования используется для элюирования представляющего интерес полипептида из твердой фазы.
В некоторых вариантах осуществления композицию полиспецифического антитела наносят на материал для аффинной хроматографии (например, материал для хроматографии на основе белка A, материал для хроматографии CaptureSelectTM CH1-XL) при плотности нанесения полиспецифического антитела около 9 мг/мл, 10 мг/мл, 11 мг/мл, 12 мг/мл, 13 мг/мл, 14 мг/мл, 15 мг/мл, 16 мг/мл, 17 мг/мл, 18 мг/мл или 19 мг/мл. Была исследована емкость динамического связывания (DBC) смолы CH1-XL, и результаты представлены на Фиг. 15. Результаты демонстрируют, что емкость динамического связывания достигла плато через 4 минуты со значением 9,3 мг/мл. Последующие поисковые работы с использованием HCCF продемонстрировали возможность увеличения плотности нанесения до 19 мг/мл, например, около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или около 18 мг/мл. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления рассматриваемых способов стадия хроматографии CH1-XL включает плотность нанесения, которая находится в диапазоне от около 9 до около 19 мг/мл, например, около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или около 18 мг/мл.
Элюирование
Термин «элюирование, используемый в данном документе, относится к удалению или отделению продукта, например, полиспецифического антитела, из материала для хроматографии. Буфер для элюирования представляет собой буфер, используемый для элюирования полиспецифического антитела из материала для хроматографии. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования может содержать цитрат, ацетат, уксусную кислоту, 4-морфолинэтансульфонат (MES), цитрат-фосфат, сукцинат и т.п. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащей белок A, содержит цитрат в концентрации от около 5 мМ до около 50 мМ, например, около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, или около 45 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация цитрата в буфере для элюирования составляет от около 20 мМ до около 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации около 25 мМ. В определенных вариантах осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, содержит уксусную кислоту в концентрации, которая находится в диапазоне от около 5 мМ до около 60 мМ, например, около 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или 55 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация уксусной кислоты в буфере для элюирования составляет от около 45 мМ до около 55 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит уксусную кислоту в концентрации около 50 мМ.
Было обнаружено, что pH буфера для элюирования влияет на агрегацию полиспецифических антител. Таким образом, в одном варианте осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащей белок A, имеет pH в диапазоне от около 3,2 до около 4,2, например, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1 или 4,2. В определенных вариантах осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащей белок A, имеет pH в диапазоне от около 3,4 до около 3,8. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, имеет pH в диапазоне от около 3,4 до около 4,4, например, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3 или 4,4. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, имеет pH в диапазоне от 3,8 до около 4,2. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования, используемый для элюирования полиспецифических антител из колонки для аффинной хроматографии, содержащий смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, имеет pH около 4,0.
Антиагрегационная композиция
Первоначальные исследования продемонстрировали, что очистка бсАт смолой на основе белка A приводила к образованию агрегатов с высокой молекулярной масса, когда смолу на основе белка A элюировали при низком pH. Было обнаружено, что добавление к буферу для элюирования добавок снижает количество агрегатов бсАт. Таким образом, в определенных предпочтительных вариантах осуществления антиагрегационная композиция добавляется в буфер для элюирования перед элюированием полиспецифического антитела. В некоторых вариантах осуществления антиагрегационная композиция содержит один или более полиолов. Неограничивающие примеры полиолов включают маннит, глицерин, сахарозу, трегалозу и сорбит. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит антиагрегационную композицию, содержащую один или более полиолов. В определенных вариантах осуществления один или более полиолов выбраны из группы, состоящей из маннита, глицерина, сахарозы, трегалозы и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов имеют концентрацию в диапазоне от около 5% до около 25% мас./об., например, 5%, 10%, 15% или 20% мас./об. В других вариантах осуществления один или более полиолов содержат глицерин, имеющий концентрацию в диапазоне от около 5% до около 15% мас./об. В одном варианте осуществления буфер для элюирования содержит глицерин в концентрации около 10% мас./об. В других вариантах осуществления один или более полиолов содержат сахарозу, имеющую концентрацию в диапазоне от около 5% до около 15% мас./об. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит сахарозу в концентрации около 10% мас./об. В определенных вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 10% мас./об. глицерина и около 10% мас./об. сахарозы. Способы в соответствии с вариантами осуществления изобретения включают хроматографию на основе белка А с использованием буфера для элюирования, содержащего любую комбинацию добавок, описанных в данном документе, при любом значении рН, описанном в данном документе. Дополнительные способы в соответствии с вариантами осуществления изобретения включают аффинную хроматографию, включающую смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG с использованием буфера для элюирования, содержащего любую комбинацию добавок, описанных в данном документе, при любом значении pH, описанном в данном документе. В определенных вариантах осуществления аффинная хроматография, включающая смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, представляет собой смолу CaptureSelect™. В некоторых вариантах осуществления смола CaptureSelect™ представляет собой CaptureSelect™ CH1-XL.
Способ выделения и очистки
В определенных вариантах осуществления элюат после аффинной хроматографии подлежит одной или более дополнительным стадиям очистки. Например, в определенных вариантах осуществления элюат со стадии аффинной хроматографии впоследствии используют, например, в процедуре анионообменной хроматографии и/или процедуре катионообменной хроматографии.
Материал для анионообменной хроматографии представляет собой твердую фазу, которая имеет положительный заряд и содержит свободные анионы для обмена с анионами в водном растворе (таком как композиция, содержащая полиспецифическое антитело и примесь), который проходит над твердой фазой или через нее. В некоторых вариантах осуществления любого из описанных в данном документе способов анионообменный материал может представлять собой мембрану, монолит или смолу. В одном варианте осуществления анионообменный материал представляет собой смолу. В некоторых вариантах осуществления анионообменный материал может содержать первичный амин, вторичный амин, третичный амин или функциональную группу иона четвертичного аммония, функциональную группу полиамина или функциональную группу диэтиламиноаэтила. Примеры анионообменных материалов известны в данной области техники и включают, помимо прочего, Poros® HQ 50, Poros® PI 50, Poros® D, Mustang® Q, Q Sepharose® Fast Flow (QSFF), смола Accell™ Plus Quaternary Methyl Amine (QMA), Sartobind STIC®, и DEAE- Sepharose®. В некоторых вариантах осуществления анионообменная хроматография выполняется в режиме «связывание и элюирование». В некоторых вариантах осуществления анионообменная хроматография выполняется в режиме «проскока». В некоторых вариантах осуществления материал для анионообменной хроматографии предложен в форме колонки. В некоторых вариантах осуществления материал для анионообменной хроматографии включает мембрану.
Материал для катионообменной хроматографии представляет собой твердую фазу, которая имеет отрицательный заряд и содержит свободные анионы для обмена с катионами в водном растворе (таком как композиция, содержащая полиспецифическое антитело и примесь), который проходит над твердой фазой или через нее. В некоторых вариантах осуществления любого из описанных в данном документе способов катионообменный материал может представлять собой мембрану, монолит или смолу. В некоторых вариантах осуществления катионообменный материал представляет собой смолу. Катионообменный материал может содержать функциональную группу карбоновой кислоты или функциональную группу сульфоновой кислоты, такую как, но не ограничиваясь этим, сульфонат, карбоксильная группа, карбоксиметилсульфоновая кислота, сульфоизобутил, сульфоэтил, карбоксил, сульфопропил, сульфонил, сульфоксиэтил или ортофосфат. В некоторых вариантах осуществления вышеизложенного материал для катионообменной хроматографии представляет собой колонку для катионообменной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления вышеизложенного материал для катионообменной хроматографии представляет собой мембрану для катионообменной хроматографии. Примеры катионообменных материалов, известных в данной области техники, включают, но не ограничиваются ими, Mustang® S, Sartobind® S, S03 Monolith (например, CIM®, CIMmultus® and CIMac® S03), S Ceramic HyperD®, Poros® XS, Poros® HS 50, Poros® HS 20, sulphopropyl-Sepharose® Fast Flow (SPSFF), SP-Sepharose® XL (SPXL), CM Sepharose® Fast Flow, Capto™ S, Fractogel® EMD Se Hicap, Fractogel® EMD S03, или Fractogel® EMD COO. В некоторых вариантах осуществления катионообменную хроматографию проводят в режиме «связывание и элюирование». В некоторых вариантах осуществления катионообменную хроматографию проводят в режиме «проскока». В некоторых вариантах осуществления вышеизложенного материал для катионообменной хроматографии находится в колонке. В некоторых вариантах осуществления вышеизложенного материал для катионообменной хроматографии включает мембрану.
В некоторых вариантах осуществления элюат из анионообменной или катионообменной хроматографии подвергают хроматографии со смешанным режимом.
Хроматография в смешанном режиме представляет собой хроматографию, в которой используется среда для хроматографии со смешанным режимом, такая как, но не ограничиваясь этим, CaptoAdhere™, доступный от GE Healthcare. Такая среда содержит лиганд для хроматографии со смешанным режимом. В некоторых вариантах осуществления такой лиганд относится к лиганду, который способен обеспечивать по меньшей мере два различных, но взаимодействующих сайта, которые взаимодействуют с веществом, подлежащим связыванию. Один из этих сайтов дает перспективный тип заряд-зарядовые взаимодействия между лигандом и представляющим интерес веществом. Другой сайт, как правило, обеспечивает донорно-акцепторное взаимодействие с участием электронов и/или гидрофобные и/или гидрофильные взаимодействия. Донорно-акцепторные взаимодействия с участием электронов включают такие взаимодействия, как водородная связь, π-π, катион-π, перенос заряда, диполь-диполь, индуцированный диполь и т.д.
В определенных вариантах осуществления среда для хроматографии со смешанным режимом (MM) состоит из лигандов для хроматографии со смешанным режимом, связанных с органическим или неорганическим носителем, иногда обозначаемом как основная матрица, непосредственно или через спейсер. Носитель может быть в форме частиц, таких как по существу сферические частицы, монолит, фильтр, мембрана, поверхность, капилляры и т. д. В некоторых вариантах осуществления носитель изготавливается из природного полимера, такого как материал из сшитого углевода, такой как агароза, агар, целлюлоза, декстран, хитозан, конджак, каррагинан, геллан, альгинат и т.д. Для получения высокой адсорбционной емкости носитель может быть пористым, а лиганды затем присоединяются к внешним поверхностям, а также к поверхностям пор. Такие носители из нативного полимера могут быть приготовлены стандартными способами, такими как обратное гелеобразование суспензии (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964). Альтернативно, носитель может быть изготовлен из синтетического полимера, например, сшитых синтетических полимеров, например, стирола или производных стирола, дивинилбензола, акриламидов, сложных эфиров акрилата, сложных эфиров метакрилата, сложных виниловых эфиров, виниламидов и т. д. Такие синтетические полимеры могут быть получены в соответствии со стандартными методами, см., например, «Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization» (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988)). Пористые носители из природного или синтетического полимера также доступны из коммерческих источников, таких как GE Healthcare (Упсала, Швеция).
В определенных вариантах осуществления смола для хроматографии со смешанным режимом содержит отрицательно заряженную часть и гидрофобную часть. В одном варианте осуществления отрицательно заряженная часть представляет собой анионную карбоксилатную группу или анионную сульфогруппу для катионообменной хроматографии. Примеры таких носителей включают, но не ограничиваются, Capto Adhere® (GE Healthcare). Capto Adhere® представляет собой сильный анионообменник с мультимодальной функциональностью, который придает смоле иную селективность по сравнению с традиционными анионообменниками. Лиганд Capto Adhere® (N-бензил-N-метилэтаноламин) проявляет несколько вариантов химического взаимодействия с белками, включая ионное взаимодействие, водородную связь и гидрофобное взаимодействие. Мультимодальная функциональность смолы обеспечивает ее способностью удалять димеры и агрегаты антител, выщелачиваемый белок А, белки клетки-хозяина (HCP), комплексы антитело/HCP, остаточные примеси способа и вирусы. Смолу можно использовать в режиме проскока в контексте стадии завершающей очистки в промышленном масштабе с использованием технологических параметров, разработанных для прохождения полиспецифического антитела непосредственно через колонку при адсорбции загрязняющих веществ.
В определенных вариантах осуществления очищенное полиспецифическое связывающее соединение подвергают стадии фильтрации с целью удаления вирусов. Фильтрация с целью удаления вирусов представляет собой специальную стадию снижения количества вирусов в течение всего способа очистки. Эту стадию, как правило, выполняют после завершающей хроматографической очистки. Снижение количества вирусов может быть достигнуто за счет использования подходящих фильтров, включая, помимо прочего, Planova 20N™, 50 N или BioEx от Asahi Kasei Pharma, фильтры Viresolve™ от EMD Millipore, ViroSart CPV от Sartorius, фильтры Sartorius, фильтры Zeta Plus VR™ от CUNO, или Ultipor DV20 или фильтр DV50™ от Pall Corporation. Обычному специалисту в данной области техники будет очевидно выбрать подходящий фильтр для получения желаемой фильтрующей способности.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения используются стадии ультрафильтрации (UF) и/или диафильтрации (DF) для дальнейшей очистки и концентрирования образца антитела. Как правило, это проводят после одной или более стадий очистки, описанных в данном документе. Подробно ультрафильтрация описана в: Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996); и в: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). Предпочтительным способом фильтрации является тангенциальной поточной фильтрацией, как описано в каталоге Millipore, озаглавленном «Pharmaceutical Process Filtration Catalogue», pp. 177-202 (Bedford, Mass., 1995/96). Под ультрафильтрацией, как правило, понимают фильтрацию с использованием фильтров с размером пор, которые позволяют пропускать белок со средним размером 50 кДа (например) или меньше. Используя фильтры, имеющие такой маленький размер пор, объем образца может быть уменьшен за счет проникновения буфера для образца через фильтр, в то время как антитела задерживаются за фильтром.
Диафильтрация представляет собой способ использования ультрафильтров для удаления и обмена солей, сахаров и неводных растворителей, для отделения свободных от связанных частиц, для удаления низкомолекулярных материалов и/или для быстрого изменения ионной среды и/или pH среды. Наиболее эффективно микрочастицы удаляются при добавлении растворителя в подвергаемый ультрафильтрации раствор со скоростью, приблизительно равной скорости ультрафильтрации. Это вымывает микропримеси из раствора в постоянном объеме, эффективно очищая удерживаемые антитела. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения стадия диафильтрации используется для замены различных буферов, используемых в связи с настоящим изобретением, необязательно перед дальнейшей хроматографией или другими стадиями очистки, а также для удаления примесей от полиспецифических связывающих агентов.
Схематическая блок-схема способа производства, который может использоваться для производства бсАт в соответствии с вариантами осуществления изобретения, представлена на Фиг. 16. На блок-схеме показаны типовые процессы синтеза и выделения, и очистки. Анализ соединений бсАт, обнаруженных на каждой стадии способа очистки, представлен на Фиг. 17. Результаты демонстрируют удаление гомодимерных соединений к ТАА после стадии хроматографии CH1-XL. Общий выход для способа производства в соответствии с вариантами осуществления изобретения находится в диапазоне от около 70% до около 90%, например, около 75%, 80% или около 85%. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы очистки по настоящему изобретению приводят к общему выходу продукта полиспецифических антител по меньшей мере около 70%, около 75%, около 80%, около 85%, около 90%, около 95%.
Фармацевтические композиции
Другим аспектом настоящего изобретения является предоставление фармацевтических композиций, содержащих одно или несколько полиспецифических антител, очищенных при помощи способов по настоящему изобретению в смеси с подходящим фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители, используемые в данном документе, например, но не ограничиваются ими, адъюванты, твердые носители, вода, буферы или другие носители, используемые в данной области для хранения терапевтических компонентов или их комбинаций.
Фармацевтическую композицию полиспецифических антител, очищенных в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания белков, имеющих желаемую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), например, в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают в себя буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем около 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Фармацевтические композиции для парентерального введения предпочтительно стерильны и по существу изотоничны и произведены согласно условиям правил производства и контроля качества лекарственных средств (GMP). Фармацевтические композиции могут быть предложены в единичной дозированной форме (например, дозированной форме для единичного введения). Состав зависит от выбранного пути введения. Полиспецифические антитела, очищенные описанными в данном документе способами, можно вводить путем внутривенной инъекции или инфузии или подкожно. Для инъекционного введения полиспецифические антитела, очищенные описанными в данном документе способами, могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, чтобы уменьшить дискомфорт в месте инъекции. Раствор может содержать носители, эксципиенты или стабилизаторы как описано выше. Альтернативно, полиспецифические антитела могут быть в лиофилизированной форме для смешивания с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением.
Изделия
Полиспецифические антитела, очищенные описанными в данном документе способами, и/или составы, содержащие полипептиды, очищенные описанными в данном документе способами, могут содержаться в изделии. Промышленные изделия или «наборы», содержащие одно или более полиспецифических антител, очищенных согласно способам изобретения, полезны для лечения заболеваний и нарушений, описанных в данном документе. В одном варианте осуществления набор содержит контейнер, содержащий полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело к CD3, очищенное, как описано в данном документе. Набор может дополнительно содержать этикетку или листок-вкладыш на контейнере или связанные с ним. Термин «листок-вкладыш» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, блистерные упаковки и т.д. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может содержать одно или более полиспецифических антител, как описано в данном документе, или их состав, например, комбинированный состав из двух или более полиспецифических антител, который эффективен для лечения патологического состояния и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). На этикетке или листке-вкладыше указано то, что композиция используется для лечения патологического состояния, такого как злокачественное новообразование или иммунологическое нарушение. Альтернативно или дополнительно промышленное изделие может дополнительно содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (ВДИ), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Дополнительно могут быть включены другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.
Набор может дополнительно содержать инструкции по введению одного или более полиспецифических антител и, в случае их наличия, их комбинированного состава. Например, если набор содержит первую фармацевтическую композицию, содержащую первое полиспецифическое антитело и вторую фармацевтическую композицию, содержащую второе полиспецифическое антитело, набор может дополнительно содержать инструкции по одновременному, последовательному или раздельному введению первой и второй фармацевтических композиций пациенту, нуждающемуся в этом. Если набор состоит из двух или более композиций, то набор может содержать контейнер для содержания отдельных композиций, такой как разделенный флакон или разделенный пакет из фольги, однако отдельные композиции также могут содержаться в одном неразделенном контейнере. Набор может содержать инструкции по введению отдельных компонентов или по введению их комбинированного состава.
Способы применения
В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы очистки полиспецифического антитела из смеси с использованием процедуры аффинной хроматографии, включающие приведение в контакт первой колонки для аффинной хроматографии со смесью, иммобилизацию полиспецифического антитела на первой колонке для аффинной хроматографии, приведение в контакт с первой колонкой для аффинной хроматографии с буфером для элюирования, причем буфер для элюирования содержит антиагрегационную композицию, и элюирование полиспецифического антитела из первой колонки для аффинной хроматографии для очистки полиспецифического антитела из смеси.
В определенных вариантах осуществления антиагрегационная композиция содержит один или более полиолов. В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов выбраны из группы, состоящей из маннита, глицерина, сахарозы, трегалозы и их комбинаций. В определенных вариантах осуществления один или более полиолов имеют концентрацию от около 5% до около 25% мас./об. В некоторых вариантах осуществления один или более полиолов содержат глицерин, имеющий концентрацию в диапазоне от около 5% до около 15% мас./об. В определенных вариантах осуществления глицерин имеет концентрацию около 10% мас./об. В других вариантах осуществления один или более полиолов содержат сахарозу, имеющую концентрацию в диапазоне от около 5% до около 15% мас./об. В некоторых вариантах осуществления сахароза имеет концентрацию около 10% мас./об. В других вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 10% мас./об. глицерина и около 10% мас./об. сахарозы.
В определенных вариантах осуществления колонка для аффинной хроматографии содержит смолу для хроматографии на основе белка А. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования выбран из группы, состоящей из цитрата, ацетата, уксусной кислоты, 4-морфолинэтансульфоната (MES), цитрат-фосфата, сукцината и их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации от около 20 мМ до около 30 мМ. В других вариантах осуществления буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации около 25 мМ. В некоторых из этих вариантов осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,2 до около 4,2. В других вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,4 до около 3,8. В определенных вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH около 3,6. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 25 мМ цитрата, около 10% глицерина и около 10% сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH около 3,6.
В других вариантах осуществления аффинная хроматография включает смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG. В некоторых из этих вариантов осуществления буфер для элюирования содержит буфер, выбранный из группы, состоящей из цитрата, ацетата, уксусной кислоты, 4-морфолинэтансульфоната (MES), цитрат-фосфата, сукцината и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования содержит уксусную кислоту в концентрации от около 45 мМ до около 55 мМ. В определенных вариантах осуществления буфер для элюирования содержит уксусную кислоту в концентрации около 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,4 до около 4,4. В других вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH в диапазоне от около 3,8 до около 4,2. В некоторых вариантах осуществления буфер для элюирования имеет pH около 4,0. В определенных вариантах осуществления буфер для элюирования содержит около 50 мМ уксусной кислоты, около 10% глицерина и около 10% сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH около 4,0.
В других аспектах изобретение относится к способам уменьшения агрегации полиспецифического антитела в пуле элюирования в результате процедуры аффинной хроматографии, включающим приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии на основе белка А со смесью, содержащей полиспецифическое антитело, иммобилизацию полиспецифического антитела на колонке для аффинной хроматографии на основе белка А, приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии на основе белка А с буфером для элюирования, при этом буфер для элюирования содержит 25 мМ цитрата, 10% мас./об. глицерина и 10% мас./об. сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH 3,6 и элюирует полиспецифическое антитело из колонки для аффинной хроматографии на основе белка А, чтобы очистить полиспецифическое антитело из смеси.
В других аспектах изобретение относится к способам уменьшения агрегации полиспецифического антитела в пуле элюирования в результате процедуры аффинной хроматографии, включающим приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, которая связывается с доменом CH1 антитела IgG, со смесью, содержащей полиспецифическое антитело, иммобилизацию полиспецифического антитела на колонке для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, приведение в контакт колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, с буфером для элюирования, причем буфер для элюирования содержит 50 мМ уксусной кислоты, 10% глицерина и 10% сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH 4,0, элюирование полиспецифического антитела из колонки для аффинной хроматографии, содержащей смолу для домен-специфической хроматографии, чтобы очистить полиспецифическое антитело из смеси.
Во всех аспектах полиспецифическое антитело может содержать первую и вторую связывающие единицы. В некоторых вариантах осуществления одна из связывающих единиц содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи. В некоторых вариантах осуществления как первая, так и вторая связывающие единицы содержат вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи. В других вариантах осуществления одна из связывающих единиц содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В других вариантах осуществления как первая, так и вторая связывающие единицы содержат вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В других вариантах осуществления первая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи, и вторая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления первая связывающая единица имеет аффинность связывания с ассоциированным с опухолью антигеном. В определенных вариантах осуществления вторая связывающая единица имеет аффинность связывания с эффекторной клеткой. В некоторых вариантах осуществления эффекторная клетка представляет собой Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления вторая связывающая единица имеет аффинность связывания с белком CD3 на Т-клетке.
Во всех аспектах изобретения полиспецифическое антитело может представлять собой биспецифическое антитело.
Очищенное полиспецифическое антитело, как описано в данном документе, или композицию, содержащую полиспецифическое антитело и фармацевтически приемлемый носитель, затем используют для различных применений в диагностических, терапевтических или других целях, известных для таких полиспецифических антител и композиций. Например, полиспецифическое антитело можно использовать для лечения расстройства у млекопитающего путем введения млекопитающему терапевтически эффективного количества полиспецифического антитела.
Теперь, когда изобретение полностью описано, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что различные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от сущности или объема изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Очистка биспецифического антитела к CD3-BCMA
бсАт к CD3-BCMA, изображенного на Фиг. 2, очищали следующим образом. БсАт к CD3-BCMA представляет собой биспецифическое антитело и по своей структуре представляет собой тример, в котором одно плечо (например, CD3-связывающее плечо) содержит как полностью человеческие тяжелые, так и легкие κ-цепи, а другое плечо (например, плечо к BCMA), полученное при помощи технологии UniRat™, состоит из тяжелой цепи человека (с одним или более доменами VH, слитыми непосредственно с доменом CH (содержащим, например, шарнир-CH2-CH3, и лишенным домена CH1). Последовательности вариабельного домена, содержащиеся в бсАт к CD3-BCMA, показаны в таблице 1 ниже. В частности, бсАт к CD3-BCMA представляет собой полностью человеческое биспецифическое моноклональное антитело IgG4, имеющее две тяжелые цепи (HC-1 и HC-2 и одну легкую каппа-цепь(κLC) , и является кислотолабильным. Правильное соединение тяжелых цепей достигается с помощью технологии «выступы-во-впадины». Плечо к CD3 содержит HC-1 и κLC и связывает Т-клеточный рецептор CD3. Плечо к TAA или BCMA содержит только HC-2 и состоит из двух идентичных доменов VH, распознающих BCMA. Плечо к TAA является бивалентным для увеличения авидности (<1 нМ) и получено при помощи технологии UniRat™. Из-за уникальной структуры этого бсАт только гетеродимерный продукт содержит домен CH1 тяжелой цепи человека (часть CD3-связывающего плеча).
Таблица 1. Последовательности вариабельного домена бсАт к CD3-BCMA.
Вариабельный домен тяжелой цепи к CD3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Arg Leu Gly Gly Ala Tyr
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID NO: 5)
Вариабельный домен легкой цепи к CD3 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Trp
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys (SEQ ID NO: 6)
Вариабельный домен тяжелой цепи к ВСМА Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
Ser Gly Ile Arg Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Gln Gly Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu
Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Gly Ile Arg
Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Gly
Glu Asn Asp Gly Pro Phe Asp His Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
Val Ser Ser (SEQ ID NO: 7)
Анализ методом эксклюзионной хроматографии (SEC) различных соединений, изображенных на Фиг. 3 показан, что гетеродимер бсАт подобен по размеру гомодимерным соединениям HC/LC (например, гомодимерные соединения к CD3). Параметры SEC: TSKgel 10X300 мм UHPLC SEC-анализ пула MSS со скоростью потока 0,25 мл/мин; подвижная фаза: 0,1M цитрата, 0,2M аргинина, 0,5M NaCl, pH 6,2. Эти результаты показаны на Фиг. 4. Более того, анализ изоэлектрических точек (pI) этих соединений демонстрирует, что гетеродимеры и гомодимеры имеют разные pI. Эти результаты показаны на Фиг. 5. Дорожка 1 представляет собой стандарты pI для изоэлектрического фокусирования (ИЭФ). Дорожка 2 представляет собой гомодимер к CD3 (выступ-выступ), pI =8. Дорожка 3 представляет собой биспецифический IgG к CD3/BCMA, pI = 7,4-7,6. Дорожка 4 представляет собой гомодимер BCMA (впадина-впадина), pI = 6,2. Наносили 5 мкг/дорожка. Параметры ИЭФ были следующими: гель для ИЭФ, pH 3-10 (Invitrogen); краситель Instant Blue Stain (Expedeon); смесь маркеров для ИЭФ 3-10, SERVA); программа для геля при ИЭФ: 1ч при 200 В, 18 мА, 2,0 Вт; 1 ч при 200 В, 18 мА, 3,5 Вт; 30 мин при 500 В, 18 мА, 9,0 Вт.
Первоначальные исследования показали, что очистка бсАт смолой на основе белка А была эффективной, как показано на Фиг. 6, который демонстрирует, что пик элюирования составляет 90% от общей интегрированной площади. Параметры хроматографии на основе белка А были следующими: Колонка: 1 мл MabSelectTM SuReTM LX HiTrap®, GE Healthcare Life Sciences; нанесение: 50 мл HCCF с бсАт Teneo; уравновешивающий буфер / буфер для промывки: 50 мМ Tris, pH 7,0; буфер для элюирования: 25 мМ цитрата, pH 3,6; буфер для нейтрализации: 1 M Tris, pH 9,0.
Первоначальные исследования также показали, что очистка бсАт смолой на основе белка А приводит к образованию высокомолекулярных (ВМ) агрегатов, которые являются нежелательными (Фиг. 7). Анализ методом SEC продемонстрировал наличие значительных количеств агрегированных продуктов после элюирования при pH 3,6. Параметры SEC были следующими: Колонка: Superdex200i 10/30 GL; буфер: 0,1M цитрата, 0,2M аргинина, 0,5M NaCl, pH 6,2; скорость потока: 0,5 мл/мин; образец: Пул элюата бсАт Teneo с белком A; введение: 100 мкл 1,4 мг/мл; объем фракции: 1 мл.
Анализ методом ДСН-ПААГ-электрофореза подтвердил, что ВМ фракции включают продукт бсАт (фиг. 8). Дорожки А2-А5: агрегаты; дорожки A6: мономер. Параметры ДСН-ПААГ-электрофорез: 4-12% гель NuPAGE; подвижный буфер MES; нанесение 5 мкг на дорожку; Page Ruler Pre-stain; маркеры (ThermoFisher Scientific); окрашенный Кумасси гель.
Соответственно, добавки были исследованы, чтобы определить, можно ли улучшить очистку белком А за счет уменьшения количества агрегатов бсАт. С этой целью в буфер для элюирования в хроматографии на основе белка А добавляли различные количества различных полиолов. В матрице плана экспериментов (DOE) были протестированы три фактора: тип полиола, процентное содержание полиола и pH буфера для элюирования. Типами исследованных полиолов были маннит, глицерин, сахароза и трегалоза. Процентное соотношение протестированных полиолов составляло от 0% до 30%, например, 5%, 10%, 15%, 20% или 25%. pH буфера для элюирования составлял 3,4, 3,5 или 3,6. Результаты различных протестированных комбинаций показаны на Фиг. 9. Способы в соответствии с вариантами осуществления изобретения включают хроматографию на основе белка А с использованием буфера для элюирования, содержащего любую комбинацию добавок, описанных выше, при любом pH, описанном выше.
Результаты этих тестов продемонстрировали, что добавки к буферу для элюирования в хроматографии на основе белка А могут снизить агрегацию продукта бсАт. Наименьшие уровни агрегации наблюдались с буфером для элюирования, содержащим 10% глицерина и 10% сахарозы. Эта композиция буфера для элюирования была наиболее оптимальной из протестированных композиций. По существу, в одном предпочтительном варианте осуществления способ очистки бсАт включает стадию хроматографии на основе белка A, причем буфер для элюирования в хроматографии на основе белка A содержит 10% глицерина и 10% сахарозы.
Несмотря на сниженные уровни агрегации, наблюдаемые при добавлении вышеописанных добавок к буферу для элюирования в хроматографии на основе белка А, все еще наблюдали совместную очистку нежелательных гомодимерных соединений (например, гомодимерных соединений к ТАА). Кроме того, кислотная лабильность бсАт препятствует использованию типовых процессов инактивации вирусов с низким pH.
Таким образом, поиск смолы для хроматографии, которую можно было бы использовать в качестве альтернативы белку A, определялся двумя критериями: (a) способность элюировать продукт в мягких (менее кислых) условиях и (b) селективность в отношении гетеродимерного продукта по сравнению с гомодимером тяжелой цепи как технологической примеси. Capture Select TM CH1-XL, коммерчески доступная от Thermo Fisher, представляет собой смолу для аффинной хроматографии, которая специфически связывается с доменом CH1 тяжелой цепи человеческого IgG с преимуществами надежной и высококачественной матрицы для аффинной хроматографии, обеспечиваемой фрагментом антитела ламы, состоящим только из тяжелых цепей, массой 13 кДа.
Общие свойства смолы CH1-XL заключаются в том, что она содержит лиганд наноантитела, специфического к CH1 тяжелой цепи Ig; он распознает все четыре подкласса IgG (т.е. IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4); является лигандом, иммобилизованным на агарозе размером 65 мкм; он имеет связывающую способность менее 20 мг/мл IgG; его можно использовать в условиях скорости потока от 5 до 200 см/час; устойчив к основанию (25-50 мМ NaOH) для дезинфекции; и имеется в продаже. В целях очистки бсАт смола CH1-XL связывается с биспецифическим гетеродимером, содержащим домен CH1, но не связывается с гомодимерными соединениями тяжелой цепи (например, гомодимером к TAA). Как показано на Фиг. 10, только активные соединения содержат домен CH1. Кроме того, смолу CH1-XL можно использовать в менее жестких условиях кислотного элюирования (pH 4).
Исследование смолы CH1-XL продемонстрировало, что гомодимер тяжелой цепи присутствует в проточном потоке CH1-XL, что указывает на то, что, как и ожидалось, этот гомодимер не связывается со смолой (Фиг. 11). Как показано на Фиг. 11, дорожка 1 представляет собой молекулярновесовые стандарты (5 мкл). Дорожка 2 представляет собой пул белка А биспецифического IgG (2 мкг). Дорожка 3 представляет собой проточный CH1 биспецифического IgG (2 мкг). Дорожка 4 представляет собой соль для промывки CH1 (2 мкг). Дорожка 5 представляет собой NaOH для снятия с CH1 (2 мкг). Дорожка 6 представляет собой пул CH1 (2 мкг). Параметры ДСН-ПААГ-электрофорез: Нанесение белка: 2 мкг/дорожка; гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris; подвижный буфер MES; краситель InstantBlue (Expedeon); предварительно окрашенный лэддер PageRuler; условия прогона: 35 мин, 200 В, 120 мА, 25 Вт.
Сравнение pH элюирования среды для улавливания представлено на Фиг. 12. Фиг. 12 показано, что использование смолы CH1-XL в качестве первой стадии улавливания (вместо белка A) позволяет элюировать с более высоким pH при pH 4,6 по сравнению с улавливанием и элюированием в хроматографии на основе белка A при pH 3,3. Эти более мягкие условия элюирования способствуют снижению агрегации антител в пуле элюирования. Параметры, показанные на Фиг. 12, панели А, были следующими: Колонка: 1 мл MabSelectTM SuReTM, GE Healthcare Life Sciences; нанесение: 10 мл HCCF; уравновешивающий буфер / буфер для промывки: 50 мМ Tris, pH 7,0, 50 мМ ацетата, pH 3,0; буфер для снятия: 0.1M NaOH; элюирование: градиентный реж. 10CV-100%B. Параметры, показанные на Фиг. 12, панели B: Колонка: 1мл CaptureSelect CH1-XLTM; нанесение: 10 мл HCCF; уравновешивающий буфер / буфер для промывки: 50 мМ Tris, pH 7,0, 50 мМ ацетата, pH 3,0; буфер для снятия: 0.1M NaOH; элюирование: градиентный реж. 10CV-100%B.
Элюирование бсАт из смолы CH1-XL было оптимальным при использовании буфера для элюирования, содержащего 50 мМ уксусной кислоты, 10% глицерина и 10% сахарозы, и имеющего pH 4,0. В этих условиях бсАт элюировали эффективно, при этом 93% интегрированной площади пика присутствовали в объеме пула 2CV. На Фиг. 13. параметры CaptureSelectTM были следующими: Колонка: 9 мл CaptureSelect; нанесение: 50 мл среда с бсАт; уравновешивающий буфер / буфер для промывки № 1: 50 мМ Tris, pH 7,0; уравновешивающий буфер / буфер для промывки № 2: 50 мМ Tris, 0,5 M NaCl pH 7,0; буфер для элюирования: 50 мМ уксусной кислоты, 10% глицерина, 10% сахарозы, pH 4,0; буфер для нейтрализации: 1 M Tris, pH 9,0.
Дальнейший анализ пула CH1-XL выявил минимальные агрегаты бсАт (содержание ВМ в 2,2% с эффективным связыванием продукта бсАт из HCCF). На Фиг. 14. Параметры, приведенные на Фиг. 14, были следующими: TSKgel 10x300 мм; скорость потока: 0,75 мл/мин; подвижная фаза: 0,1 M цитрата; 0,2 M аргинина, 0,5 M NaCl, pH 6,2. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления способ очистки бсАт включает стадию хроматографии CH1-XL, причем буфер для элюирования CH1-XL содержит 50 мМ уксусной кислоты, 10% глицерина и 10% сахарозы и имеет pH 4,0.
Была исследована емкость динамического связывания смолы CH1-XL, и результаты представлены на Фиг. 15. Как показано на Фиг. 15 параметры: колонка CH1-XL объемом 1 мл (0,7×2,5 см); нанесение: 5 мг/мл очищенного бсАт; время удержания: 1, 2, 4, 8 минут; промывка 10% перед элюированием; P.C.: на 280 нм пула. Результаты демонстрируют, что емкость динамического связывания достигла плато через 4 минуты со значением 9,3 мг/мл. Последующие поисковые работы с использованием HCCF продемонстрировали возможность увеличения плотности нанесения до 19 мг/мл, например, около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или около 18 мг/мл. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления рассматриваемых способов стадия хроматографии CH1-XL включает плотность нанесения, которая находится в диапазоне от около 9 до около 19 мг/мл, например, около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, или около 18 мг/мл.
Схематическая блок-схема способа производства, который может использоваться для производства бсАт в соответствии с вариантами осуществления изобретения, представлена на Фиг. 16. На блок-схеме показаны типовые процессы синтеза и выделения, и очистки. Анализ соединений бсАт, обнаруженных на каждой стадии способа очистки, представлен на Фиг. 17. Дорожка 1: молекулярновесовые стандарты; Дорожка 2: 5 мкл HCCF; дорожка 3: 5 мкл проточного CH1; дорожка 4: 2 мкг пула CH1-XL1; дорожка 5: 2-я стадия очистки - 2 мкг пула; дорожка 6: 3-я стадия очистки - 2 мкг пула; дорожка 7: молекулярновесовые стандарты; дорожка 8: 2 мкг пула CH1, восстанавливающие условия; дорожка 9: 2-я стадия очистки, восстанавливающие условия - 2 мкг пула; дорожка 10: 3-я стадия очистки, восстанавливающие условия - 2 мкг пула. Параметры были следующими: Гель NuPage 4-12% Bis-Tris; подвижный буфер MES; краситель InstantBlue(Expedeon); предварительно окрашенный лэддер Page Ruler; нанесение белка: 2 мкг на дорожку; условия прогона: 35 мин, 200 В, 120 мА, 25 Вт. Результаты демонстрируют удаление гомодимерных соединений к ТАА после стадии хроматографии CH1-XL. Общий выход для способа производства в соответствии с вариантами осуществления изобретения находится в диапазоне от около 70% до около 90%, например, около 75%, 80% или около 85%.
Пример 2. Очистка биспецифического антитела, содержащего связывающие единицы только из тяжелых цепей
Биспецифическое антитело, содержащее первую и вторую связывающие единицы, каждая из которых содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи, очищают из смеси, содержащей антитело, в соответствии со способами, описанными в данном документе. Смесь, содержащую биспецифическое антитело, приводят в контакт с первым материалом для аффинной хроматографии, таким образом иммобилизуя антитело. Антитело элюируют буфером для элюирования, содержащим антиагрегационную композицию, содержащую полиолы, как описано в данном документе, тем самым снижая агрегацию биспецифического антитела в пуле элюирования.
Пример 3. Очистка биспецифического антитела, содержащего связывающие единицы из тяжелой/легкой цепей
Биспецифическое антитело, содержащее первую и вторую связывающие единицы, каждая из которых содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела, приводят в контакт с первой колонкой для аффинной хроматографии, таким образом иммобилизуя антитело. Антитело элюируют буфером для элюирования, содержащим антиагрегационную композицию, содержащую полиолы, как описано в данном документе, тем самым снижая агрегацию биспецифического антитела в пуле элюирования.
Несмотря на то что в данном документе были показаны и описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что данные варианты осуществления приведены исключительно с целью иллюстрации. Множество вариаций, изменений и замен будут очевидны специалистам в данной области техники без отхода от объема и сущности настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, могут применяться при практическом осуществлении настоящего изобретения. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем изобретения и, что таким образом охватываются способы и структуры в пределах объема данной формулы изобретения и их эквивалентов.

Claims (23)

1. Способ очистки полиспецифического антитела IgG из смеси с помощью аффинной хроматографии, включающий:
иммобилизацию полиспецифического антитела IgG из данной смеси на первой колонке для аффинной хроматографии, содержащей смолу для хроматографии на основе белка А; и
элюирование полиспецифического IgG антитела из первой колонки для аффинной хроматографии буфером для элюирования, содержащим антиагрегационную композицию для очистки полиспецифического IgG антитела из смеси, причем буфер для элюирования имеет pH который находится в диапазоне от 3,4 до 3,8 и антиагрегационная композиция содержит один или более полиолов, выбранных из маннита, глицерина, сахарозы, трегалозы и их комбинаций, где один или более полиолов имеют концентрацию в диапазоне от 5% мас./об до 25% мас./об,
где полиспецифическое IgG антитело является антителом, состоящим только из тяжелых цепей, или трехцепочечной антителоподобной молекулой.
2. Способ по п. 1, в котором один или более полиолов включают глицерин, имеющий концентрацию в диапазоне от 5% мас./об до 15% мас./об.
3. Способ по п. 2, в котором глицерин имеет концентрацию 10% мас./об.
4. Способ по п. 1, в котором один или более полиолов включают сахарозу, имеющую концентрацию в диапазоне от 5% мас./об до 15% мас./об.
5. Способ по п. 4, в котором сахароза имеет концентрацию 10% мас./об.
6. Способ по п. 1, в которой буфер для элюирования содержит 10% мас./об. глицерина и 10% мас./об. сахарозы.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором буфер для элюирования выбран из цитрата, ацетата, уксусной кислоты, 4-морфолинметансульфоната (MES), цитрат-фосфата, сукцината и их комбинаций.
8. Способ по п. 7, в котором буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации от 20 мМ до 30 мМ.
9. Способ по п. 8, в котором буфер для элюирования содержит цитрат в концентрации 25 мМ.
10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором буфер для элюирования имеет pH 3,6.
11. Способ по п. 1, в котором буфер для элюирования содержит 25 мМ цитрата, 10% мас./об. глицерина и 10% мас./об. сахарозы, и при этом буфер для элюирования имеет pH 3,6.
12. Способ по п. 1, в котором полиспецифическое антитело IgG содержит первую связывающую единицу и вторую связывающую единицу.
13. Способ по п. 12, в котором первая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащего только тяжелые цепи.
14. Способ по п. 13, в котором вторая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела.
15. Способ по п. 14, в котором первая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела, состоящего только из тяжелых цепей, а вторая связывающая единица содержит вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела.
16. Способ по п. 12, в котором первая связывающая единица имеет аффинность связывания с ассоциированным с опухолью антигеном.
17. Способ по п. 12, в котором вторая связывающая единица имеет аффинность связывания с эффекторной клеткой.
18. Способ по п. 17, в котором эффекторная клетка представляет собой Т-клетку.
19. Способ по п. 18, в котором вторая связывающая единица имеет аффинность связывания с белком CD3 на Т-клетке.
20. Способ по п. 1, в котором полиспецифическое антитело IgG представляет собой биспецифическое антитело IgG.
RU2021111202A 2018-09-21 2019-09-20 Способы очистки гетеродимерных полиспецифических антител RU2820588C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62/734,566 2018-09-21
US62/742,821 2018-10-08

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2024115129A Division RU2024115129A (ru) 2018-09-21 2019-09-20 Способы очистки гетеродимерных полиспецифических антител

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2021111202A RU2021111202A (ru) 2022-10-21
RU2820588C2 true RU2820588C2 (ru) 2024-06-06

Family

ID=

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19836213A1 (de) * 1998-08-11 2000-02-24 Gerhard Harry Scholz Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien
RU2520838C2 (ru) * 2008-10-20 2014-06-27 Эббви Инк Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а
WO2015135884A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Richter Gedeon Nyrt. Immunoglobulin purification using pre-cleaning steps
WO2018018011A2 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Amgen Inc. Methods of purifying fc-containing proteins

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19836213A1 (de) * 1998-08-11 2000-02-24 Gerhard Harry Scholz Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien
RU2520838C2 (ru) * 2008-10-20 2014-06-27 Эббви Инк Выделение и очистка антител с использованием аффинной хроматографии на основе белка а
WO2015135884A1 (en) * 2014-03-10 2015-09-17 Richter Gedeon Nyrt. Immunoglobulin purification using pre-cleaning steps
WO2018018011A2 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Amgen Inc. Methods of purifying fc-containing proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bannas P., Hambach J., Koch-Nolte F. Nanobodies and nanobody-based human heavy chain antibodies as antitumor therapeutics //Frontiers in immunology, 2017, 8, article 1603, p. 1-13. Brinkmann U. Et al. The making of bispecific antibodies, MABS, 2017, 9(2), p. 182-212. Wan E. C. H., Yu J. Z. Analysis of sugars and sugar polyols in atmospheric aerosols by chloride attachment in liquid chromatography/negative ion electrospray mass spectrometry //Environmental science & technology, 2007, 41(7), р. 2459-2466. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210355215A1 (en) Methods for purifying heterodimeric, multispecific antibodies
KR102562519B1 (ko) IL-15/IL-15Rα FC-융합 단백질 및 PD-1 항체 단편을 포함하는 이중특이성 이종이량체 융합 단백질
JP7575100B2 (ja) 免疫細胞活性化のための二重特異性抗体
US10066018B2 (en) Antibody constant region variant
US10363496B2 (en) Method for purification of monoclonal antibodies
CA3004830A1 (en) Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
KR102618831B1 (ko) 양이온 교환 크로마토그래피 세척 완충액
TW201348247A (zh) 利用蛋白質ａ親和性層析之非人類抗體之新穎純化
JP2010516651A (ja) Ｆｃ含有タンパク質の精製のための方法
KR102578087B1 (ko) 숙주세포 갈렉틴(galectins) 및 다른 오염물(contaminant)로부터 글리코실화 단백질을 정제하는 방법
CN112313248A (zh) 纯化单体单克隆抗体的方法
US20220227867A1 (en) ICOS TARGETED HETERODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15/IL-15RA Fc-FUSION PROTEINS AND ICOS ANTIGEN BINDING DOMAINS
JP2011500757A (ja) Ｆｃ含有タンパク質の精製方法
US20210269509A1 (en) Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
JPWO2020061478A5 (ru)
RU2820588C2 (ru) Способы очистки гетеродимерных полиспецифических антител
WO2020070313A1 (en) Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd37 antibodies
WO2022239704A1 (ja) 抗体組成物の精製方法
WO2024038198A1 (en) Multi-domain binding molecules
WO2018051348A1 (en) Methods of purifying and qualifying antibodies