DE19836213A1 - Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materialien durch Zusatz von Polyolen zu einer Elutionslösung, die Erfindung betrifft weiter ein Sulfon der folgenden Formel (I) DOLLAR A CH¶2¶OHCHOHCH¶2¶SCH¶2¶CH¶2¶SO¶2¶CH¶2¶CH¶2¶SCH¶2¶CHOHCH¶2¶OH als eine in dem Verfahren verwendbare eluierende Verbindung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatographie-Materalien sowie ein neues Sulfon mit der folgenden Formel CH₂OHCHOHCH₂SCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂SCH₂CHOHCH₂OH als eine in dem Ver­ fahren verwendbare eluierende Verbindung.

Die Adsorptionschromatographie ist in verschiedenen methodischen Varianten (z. B. Ionenaustausch-, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, thiophile Chromatographie usw.) sowohl für analytische als für präparative Zwecke als Trenn- und Reinigungsverfahren seit Jahren etabliert. Ihr Prinzip besteht darin, daß aus Lösungen unter bestimmten Bedingungen Verbindungen an Chromatographiemateralien, im nachfolgenden Chromatografiematrix ge­ nannt, gebunden werden und anschließend durch Änderung der Bedingungen wieder abgelöst (eluiert) werden. Eine Trennung verschiedener Verbindungen erhält man dann, wenn aus Mischungen nur einige der enthaltenen Verbindun­ gen gebunden werden und andere nicht. Auf dieser Basis beinhaltet das Schema der Reinigung und Trennung von Verbindungen mit Hilfe der Adsorptionschroma­ tographie folgende Schritte:

• - Vorbereitung der Chromatografiematrix (z. B. Einfüllen in eine Säule oder einen anderen Träger und Äquilibrieren) und der Probe (z. B. Lösen in Puffer)
• - Auftrag der Probe
• - Waschen der Chromatografiematrix zur Entfernung aller nicht ge­ bundenen Stoffe
• - Elution der gebundenen Stoffe.

Die erfolgreiche Durchführung der Adsorptionschromatografie hängt in entschei­ dendem Maße von der Wahl der Bedingungen (pH-Wert, Salzkonzentration, Ionenspezies, Zusätze, Temperatur) ab. Diese Bedingungen entscheiden über Bindung/Nichtbindung der in der Ausgangsmischung enthaltenen Verbindungen und nachfolgende Ablösung der gebundenen Stoffe von der Chromatografiema­ trix. Besonders bei Biomolekülen (z. B. Nukleinsäuren, Proteine) müssen diese Bedingungen auf den Erhalt der komplexen Strukturen dieser Verbindungen ausgerichtet sein, d. h. Bedingungen, unter denen die Biomoleküle ihre Nativität verlieren und denaturieren, müssen vermieden werden. Im Gegenteil, es sollten günstigerweise Bedingungen zur Anwendung kommen, die einen stabilisierenden Einfluß auf die Biomolekülstrukturen haben. Die Auswahl der Bedingungen ist aber in vielen Fällen mit Problemen behaftet. So lassen sich z. B. humane IgG- Antikörper an Trägern, die mit Protein A oder Protein G ligandiert sind, binden. Die Bindung ist aber so außerordentlich fest, daß die Elution unter drastischen Bedingungen stattfinden muß. Dazu zählt z. B. starkes Ansäuern (bis pH 2), wodurch die Antikörper oft einen Aktivitätsverlust erleiden. Bei einigen "emp­ findlichen" Antikörpern versagt aus diesem Grund diese Reinigungsmethode gänzlich. Das analoge Problem findet sich bei der hydrophoben und thiophilen Chromatografie. Diese beiden adsorptiven Trennverfahren beruhen auf dem Verhalten hydrophober bzw. thiophiler Proteine, sich in Gegenwart hoher bzw. sehr hoher Salzkonztrationen an entsprechende Chromotografiematrices zu binden. Diese Bindebedingungen sind aber für einige Biomoleküle, insbesondere Proteine, so schädlich, daß sie denaturieren und sogar ausgefällt werden, so daß nach Elution dieser Moleküle unter Verwendung niedriger Salzkonzentrationen zerstörte Produkte resultieren.

Ein weiteres Problem der Adsorptionschromatografie liegt in der Tatsache, daß sich aus komplexen Mischungen meist mehrere Substanzen an die Chromatogra­ fiematrix binden und bei der Elution auf gleiche Bedingungen ansprechen. Eine gleichzeitige Elution aller gebundenen Substanzen liefert dann erneut eine Mi­ schung, wenn auch einige Verbindungen aufgrund ihrer "Nichtbindung" abge­ trennt werden konnten. Wünschenswert ist unter solchen Verhältnissen eine selektive bzw. spezifische Ablösung einzelner Substanzen von der Chroma­ tografiematrix. Dies kann einmal durch schrittweise Änderung der Elutions­ bedingungen (Salzgradient, pH-Gradient usw.) geschehen oder durch Affinitäts­ elution, wie sie von Wilchek et al. in Meth. Enzymol. 104, S. 3-55 beschrieben worden ist. Aber auch diese Methoden haben gravierende Nachteile, da unter den einzuhaltenden Bedingungen die Biomoleküle einen Schaden erleiden und diese für nachfolgende Zwecke nicht mehr brauchbar sind.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatografiematrices zur Verfügung zu stellen, das obige Nachteile vermeidet.

Gelöst wird diese Aufgabe durch die Gegenstände der Patentansprüche.

Von den Erfindern wurde gefunden, daß die Elution von Biomolekülen von Chromatografiematrices unter Verwendung eines Elutionsmittels enthaltend mindestens ein Polyol schonend geschehen kann und die zu trennenden oder zu reinigenden Biomoleküle ohne irgendwelche Schäden zu nehmen aus dem Verfahren hervorgehen.

Unter dem Begriff "Biomolekül" sollen erfindungsgemäß Nukleinsäuren (DNA oder RNA), Peptide, Proteine (z. B. Plasmaproteine), Rezeptoren und Immunglo­ buline (Antikörper), und Peptid(Protein)-Strukturen aufweisende Substanzen, wie Viren, Mikroorganismen und Zellen, verstanden werden. Die Biomoleküle können in den verschiedensten Flüssigkeiten vorliegen. Beispiele solcher Flüssigkeiten sind Körperflüssigkeiten, wie Blut, Lymphe, Urin, Sputum und Liquor, und Überstände bzw. Lysate von Zellen und Geweben.

Als Chromtografiematrices eignen sich die dem Fachmann bekannten Chromato­ grafiematerialen, insbesondere jene Materialien, die für hydrohobe, thiophile oder Affinitätschromatografie bekannt sind. Beispielhaft seien Agarosegele (z. B. Sepharose^®), Dextrangele (z. B. Sephadex^®), Latex, Cellulose-Gelmatrices, Acryl­ amid-Gelmatrices genannt. Ganz besonders sei auf die in der Patentanmeldung DE 196 23 131.0 beschriebenen Konjugate als Chromatografiematerialien hingewiesen sowie auf thiophile Gele (T-Gele). Nach Porath (Porath, J. J. Chro­ matogr., 376 (1986), S. 331) lassen sich thiophile Gele einteilen in T-Adsorben­ tien (Thioether-sulphonyl-Liganden) und thioaromatische Adsorbentien (Liganden mit der Struktur R-SO₂-CH₂- oder R-S-CH₂-CH₂-SO₂-, wobei R eine p-elektronen­ reiche aromatische oder heteroaromatische Struktur aufweist). Das als erstes entwickelte T-Gel entstand durch Kopplung von Mercaptoethanol an Divinylsul­ fon-aktivierte Agarose. Damit weist es die Struktur Agarose-O-CH₂CH₂-SO₂- CH₂CH₂-S-CH₂CH₂OH auf. An dieses Gel binden sich in Gegenwart hoher Salz­ konzentrationen bestimmte Proteine, die entsprechend diesem Verhalten als thiophil bezeichnet werden. Eine Ablösung gebundener Proteine vom T-Gel wird durch die Erniedrigung der Salzkonzentration bewirkt.

Die Chromatografiematerialien können auch aktiviert sein, z. B. durch Cyan­ bromid-Aktivierung (CnBr-Aktivierung) oder NHS-Aktivierung. In einer bevor­ zugten Ausführungsform kann das Chromatografiematerial auch daran gebunde­ ne Spacer/Linker enthalten. Diese Spacer sind bevorzugt aliphatische oder cyclische Kohlenwasserstoffe. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe können gerade oder verzweigte Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decylgruppen sein. Bei den cyclischen Kohlenwasserstoff­ gruppen sind Phenyl-, Benzyl-, Cyclohexylgruppen zu nennen. Bevorzugt sind - CH₂-CH₂-SO₂-CH₂-CH₂- oder -CH₂-CH₂-.

Die Erfindung beruht nun auf der Beobachtung, daß den üblichen Elutionspuf­ fern, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind und je nach verwendeter Chromatografiematrix von diesem ausgewählt werden können, ein Polyol zu­ gesetzt werden kann, welches unter Anwendung schonenderer Elutionsbedin­ gungen als eigentlich üblich, für eine Elution der Biomoleküle von den Chromato­ grafiematrices sorgt. Es ist beispielsweise nicht mehr notwendig, den pH-Wert auf schädlich saure Werte (z. B. pH 2-3) abzusenken oder hohe bzw. niedrige Salzkontrationen anzuwenden. Dies kann so erklärt werden, daß die Polyole als "lösliche" Matrixanaloga anzusehen sind, die die zwischen Chromatografiematrix und Biomolekül sowie zwischen Spacer und Biomolekül zustandegekommene Wechselwirkung schwächen. Zu dem Polyol als "löslichem" Matrixanalogon wird dadurch von dem Biomolekül eine stärkere Wechselwirkung aufgebaut, die für die Ablösung des Biomoleküls von der Chromatografiematrix sorgt. Die Polyole stabilisieren auch die Biomolekülstrukturen, wie Faltung zu Sekundär- oder Tertiärstruktur bei Proteinen. Dies ist um so überrraschender als von Berna et al. (J. of Chromatography A 764 (1997), S. 193-200) herausgefunden worden ist, daß Polyole eine Verstärkung der Proteinbindung an hydrophobe oder thiophile Gele bewirken.

Unter Polyolen sollen erfindungsgemäß Glycerin, (Poly)Ethylenglykol, Sorbit, Saccharose, Inositol, Pentaerythrit, Trimethylolpropan, Mannit sowie Dulcit, Erythrit, Threitol und deren Derivate verstanden werden. Die Derivate können durch die dem Fachmann bekannte chemische Derivatisierung, z. B. Einführen von Halogenid- (z. B. F-, Cl-, Br-, I-) Alkyl- (Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, Butylole, Pentyl-, usw.) Acetat-, Aldehyd-, Alkoxy- oder Sulfhydrylgruppen herge­ stellt werden. Es können auch Mischungen der obigen Polyole verwendet wer­ den.

Die Menge an dem in der Elutionslösung enthaltenen Polyol beträgt 10% bis 60% (w/v) (oder 100 bis 600 g/l,). Die für den jeweiligen Zweck eingesetzte Konzentration ist abhängig von der Löslichkeit des verwendeten Polyols in dem beabsichtigten Puffer und von der Art des von der Matrix abzulösenden Proteins. Eine vollständige Ablösung von humanem IgG aus menschlichem Serum wird z. B. durch 55% Glycerin und 40% Ethylenglykol bewirkt. Viele murine monoklo­ nale Antikörper eluieren bereits bei 10-35% Glycerin. Einen gewissen Einfluß hat der Puffer, in dem die Polyole gelöst werden. Für eine Elution im sauren Bereich (z. B. pH 5) wird eine höhere Polyolkonzentration zur Elution benötigt als im alkalischen Bereich (z. B. pH 8). Die niedrigste Polyolkonzentration ist erforder­ lich, wenn es sich bei dem Polyol um ein Derivat handelt, das durch Vernetzung mit Divinylsulfon entstanden ist.

Von den Erfindern wurde ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Arbeits­ weise entdeckt. Häufig werden Proteine, insbesondere Immunglobuline, nach ihrer Aufreinigung modifiziert. Bekannte Beispiele sind hierfür die Biotinylierung, die radioaktive Markierung (z. B. ¹²⁵Jodmarkierung) oder die Kopplung mit ande­ ren Proteinen, z. B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase als Indikatorenzym. Dies sind Modifizierungen, die zur Einsetzbarkeit der Proteine, insbesondere Immunglobuline, in speziellen Immuntests (ELISA etc.) erforderlich sind. Die jeweilige Kopplungschemie stellt Anforderungen an die Lösung, in der sich das zu modifizierende Protein befindet: pH-Wert, Art und Konzentration der Puffer­ salze. Da diese Modifikationen meist an Amino- oder Sulfhydrylgruppen erfolgen, stören Polyole derartige Reaktionen nicht, und konsequenterweise, benutzt man zur Ablösung den entsprechenden Modifizierungspuffer mit Polyolzusatz, so daß das Eluat direkt, ohne aufwendige Umpufferungen in die Reaktion eingehen kann.

Wie bereits oben ausgeführt, kann das Polyol jedem bekannten Elutionspuffer zugefügt werden. Es ist erfindungsgemäß aber auch möglich eine wäßrige Lösung eines Polyols ohne weiteren Pufferzusatz zu verwenden.

In diesem Zusammenhang wurde von den Erfindern eine neue Verbindung entwickelt, mit der Biomoleküle auf sehr schonende Weise von Chromatografie­ matrices abgelöst werden können. Dabei handelt es sich um ein Sulfon mit folgender Formel

CH₂OHCHOHCH₂SCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂SCH₂CHOHCH₂OH (I).

Diese Verbindung erhält man durch Umsetzung von Mercaptoglycerin mit Divi­ nylsulfon wie im nachfolgenden Beispiel näher beschrieben ist.

Die Erfindung wird näher durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben:

Beispiel 1 Ablösung von T-Gelen Divinylsulfon-Aktivierung

40 g Sepharose 4B-CL werden mit Wasser gewaschen, auf einer Glasfritte im Wassserstrahlvakuum trockengesaugt und in 100 ml 0,5 M Soda resuspendiert. Unter Rühren werden der Suspension 4 ml Divinylsulfon zugegeben. Die Suspen­ sion wird anschließend bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Das Gel wird danach auf einer Glasfritte gesammelt und intensiv mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral ist. Dieses Vinylsulfon-aktivierte Gel wird in Wasser re­ suspendiert und bei 4°C aufbewahrt.

Ligandierung

Zur Kopplung mit Mercaptoethanol werden 2 g der Vinylsulfon-aktivierten Sepharose mit 0,5 M Soda vorgewaschen und mit 150 µMol Mercaptoethanol, gelöst in 2 ml 0,5 M Soda, resuspendiert. Die Suspension wird 7 Stunden geschüttelt bei Raumtemperatur und anschließend das Gel auf einer Glasfritte gesammelt, mit Wassser gewaschen und in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 resuspendiert. Das erhaltene T-Gel wird ggf. bei 4°C gelagert, wobei der Suspension dann 0,1% Natriumazid zugesetzt wird.

Chromatographie

1 g des T-Gels wird in eine Chromatographiesäule eingefüllt und mit 25 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, supplementiert mit 0,5 M Natriumsulfat ( = Äquilibrie­ rungspuffer) äquilibriert. 1 ml Humanserum (vorher dialysiert über 24 Std. gegen den Äquilibrierungspuffer und durch Zentrifugation bei 15.000 g von Partikeln befreit) wird anschließend auf die Säule aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden durch Spülen der Säule mit 20 ml Äquilibrierungspuffer entfernt.

Ablösung der gebundenen Proteine

Die Säule wird mit 25 mM Phosphatpuffer, supplementiert mit 0,5 M Natrium­ sulfat und 40% Glycerin, gespült. Dabei werden 11,5 mg Protein eluiert. Über 90% der eluierten Proteine sind Immunglobuline. Anschließend wird die Säule mit 25% Phosphatpuffer (ohne Zusätze) gewaschen. Dabei werden nur noch Spuren von Protein eluiert, so daß die stattgefundene Elution als im wesentli­ chen vollständig anzusehen ist.

Beispiel 2 Ablösung von MECH-Gel (1)

Bei dem MECH-Gel handelt es sich um 3-(2-Mercaptoethyl)chinazolin- 2,4(14,34)dion gekoppelt an Agarose. Ein solches Gel-Konjugat ist Gegenstand der Patentanmeldung DE 196 23 131.0.

Divinylsulfon-Aktivierung

40 g Sepharose 4B-CL werden mit Wasser gewaschen, auf einer Glasfritte im Wassserstrahlvakuum trockengesaugt und in 100 ml 0,5 M Soda resuspendiert. Unter Rühren werden der Suspension 4 ml Divinylsulfon zugegeben. Die Suspen­ sion wird anschließend bei Raumtemperatur 2 Stunden lang geschüttelt. Das Gel wird danach auf einer Glasfritte gesammelt und intensiv mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat neutral ist. Diese Vinylsulfon-aktivierte Gel wird in Wasser re­ suspendiert und bei 4°C aufbewahrt.

Ligandierung

Zur Kopplung mit MECH werden 2 g der Vinylsulfon-aktivierten Sepharose mit 0,5 M Soda vorgewaschen und mit 150 µMol MECH, gelöst in 2 ml 0,5 M Soda, resuspendiert. Die Suspension wird 7 Stunden geschüttelt bei Raumtemperatur und anschließend das Gel auf einer Glasfritte gesammelt, mit Wassser gewa­ schen und in 25 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 resuspendiert. Das erhalte­ ne T-Gel wird ggf. bei 4°C gelagert, wobei der Suspension dann 0,1% Natriu­ mazid zugesetzt wird.

Chromatographie

1 g des MECH-Gels wird in eine Chromatographiesäule eingefüllt und mit 25 mM Phosphatpuffer, pH 7,4 ( = Äquilibrierungspuffer) äquilibriert. 1 ml Humanserum (vorher dialysiert über 24 Std. gegen den Äquilibrierungspuffer und durch Zen­ trifugation bei 15.000 g von Partikeln befreit) wird anschließend auf die Säule aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden durch Spülen der Säule mit 20 ml Äquilibrierungspuffer entfernt.

Ablösung der gebundenen Proteine

Die Säule wird mit dem Äquilibrierungspuffer, dem 10 g/100 ml des erfindungs­ gemäßen Sulfons zugegeben worden waren, gespült. Es werden 10,3 mg Protein eluiert. Über 90% der eluierten Proteine sind Immunglobuline.

Beispiel 3 Herstellung des erfindungsgemäßen Sulfons mit der Formel (I)

80 mmol Mercaptoglycerin (3-Mercapto-1,2-propandiol; Fa Aldrich, Katalog # M560-7) wird mit 1 ml Triethylamin vorgelegt und unter Eiskühlung 30 Min. gerührt. Danach wird langsam 40 mmol Divinylsulfon (Fa Aldrich, Katalog # V 370-0) zugetropft. Die starke Erwärmung wird durch Eiskühlung beherrscht. Aus der viskosen Lösung scheidet sich ein weißer Niederschlag ab. Nachfolgend werden 12 ml Wasser zugegeben und weiter gerührt. Nach 4 Stunden wird der Ansatz langsam auf Raumtemperatur gebracht und mit etwas Methanol versetzt. Danach wird der Reaktionsansatz im Vakuum zur Trockne eingeengt. Der Rück­ stand wird in wenig Methanol aufgenommen und umkristallisiert. Ausbeute ca. 75%.

Analytik

weißer Feststoff, MG 334,48
Schmelzpunkt: 101-104°C

• 1. IR: 2974, 2922, 2862 CH-Valenzschw.; 1432 CH-Deformationsschw. 1314, 1148 SO₂; 3372 OH-Valenzschw.
  NMR: 2.49-2.56 (m, 2H, CH₂) 2.68-2.74 (m, 2H, CH₂) 2.84-2.90 (m, 4H, CH₂) 3.32-3.44 (m, 8H, CH₂) 3.58 (sextett, 2H, 2 × CH) 4.59 (t, 2H, 2 × CH₂OH) 4.84 (d, 2H, 2 × CHOH) 4.59 und 4.84 tauschen mit D₂O aus
  ¹³C-NMR: 23.96 (CH₂), 35.24 (CH₂), 52.59 (CH₂), 64,43 (CH₂OH), 71.41 (CHOH)

Beispiel 4 Ablösung von MECH-Gel (2)

1 g des MECH-Gels wird in eine Chromatographiesäule gefüllt und mit 25 mM Phosphatpuffer, 1 mM EDTA, pH 7,4 äquilibriert. 1 ml Humanplasma (EDTA- Blut) wird durch Zentrifugation bei 15000 × g von Partikeln befreit und auf die äquilibrierte Säule aufgetragen. Nichtgebundene Proteine werden durch Spülen der Säule mit 20 ml Äquilibrierungspuffer entfernt. In einem ersten Durchgang wird die Säule mit einem Elutionspuffer ( = Äquilibrierungspuffer, dem 40% Ethylenglykol zugesetzt wurden) gespült. Die Ablösung erfolgt solange bis das Säuleneluat proteinfrei ist. Auf diese Weise werden 11,2 mg Protein vom Gel abgelöst. Etwa 85% der mit diesem Schritt eluierten Proteine stellen Immunglo­ buline, insbesondere IgG, dar. Die Säule wird anschließend mit dem Äquilibrie­ rungspuffer zurückäquilibriert. Anschließend werden die noch auf dem Gel befindlichen Protein durch Spülen der Säule mit 10 mM Natronlauge abgelöst. Dabei werden 8,4 mg Protein eluiert. Über 90% dieses durch NaOH eluierten Proteins wird durch Fibrinogen repräsentiert.

Der obige Befund zeigt unzweifelhaft, daß die erfindungsgemäße Ablösung selektiv erfolgt und daß Immunglobuline durch Polyole einfach eluiert werden können, wobei Fibrinogen, das eine hohe Affinität für thiophile Gele aufweist, nicht eluierbar ist. Die Reinigung von Fibrinogen ist dadurch sehr gut möglich.

Beispiel 5 Ablösung von einem CECH-Gel

Sepharose 4B-CL wird wie in Beispiel 1 mit Divinylsulfon aktiviert. 10 g Vinylsul­ fon-aktivierte Sepharose werden mit Wasser gewaschen und in 10 ml Wasser resuspendiert. Die Suspension wird mit 30 ml Dimethylformamid, in dem 200 mg Chlorethylchinazolindion (Aldrich, Kat. # 42770-5) gelöst wurden, gemischt und unter Rühren mit Stickstoff gespült. Anschließend werden unter ständiger Stickstoffeinfuhr 5 ml einer wäßrigen Natriumhydrogensulfidlösung (10 mg/ml) zugetropft. Der Ansatz wird mit Natronlauge auf pH 8,0 eingestellt und die Suspension danach 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei weiter Stickstoff eingeleitet wird. Der Ansatz wird nach Zugabe von 5 ml Glycerin in einem geschlossenen Gefäß 24 Std. geschüttelt. Das Gel wird auf einer Glas­ fritte gesammelt, mit Wasser gewaschen und bis zur Verwendung in 20% Ethanol bei 4°C gelagert.

1 ml des Gels wird in eine Chromatografiesäule gefüllt und mit PBS äquilibriert. 50 ml Überstand der Hybridomazellinie ZIM-0505 (Patent DD 293265 B5), kultiviert in Hybridomamedium S 8284 (Sigma), werden auf die Säule aufgetra­ gen und die nichtgebundenen Anteile durch Waschen der Säule mit 20 mL PBS entfernt. Der Antikörper wird anschließend mit Natriumphosphatpuffer, supp­ lementiert mit Ethylenglykol (erhalten durch Rekonstitution des Phosphatpuffers aus dem ImmunoProbe^TM Biotinylation Kit (Sigma) mit 5 m) 40% Ethylenglykol anstelle von 5 ml Wasser), von der Säule abgelöst und ohne weitere Behandlung direkt zur Biotinylierung eingesetzt. Der modfizierte Antikörper ist in Verbindung mit Avidin bzw. Streptavidin mit üblichen Techniken zur Detektion von Rubellavi­ ren im Immunoblot oder im ELISA sowie zur Bestimmung von Antikörpern (z. B nach einer Rötelninfektion beim Menschen) gegen Rubella-Viren verwendbar.

Claims (9)

1. Verfahren zur Elution von Biomolekülen von Chromatografie-Materialien bei der Adsorptionschromatografie, dadurch gekennzeichnet, daß eine zur Elution verwendete Lösung mindestens ein Polyol enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Biomoleküle Nukleinsäuren, Protei­ ne, Peptide oder Antikörper sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyol Glycerin, Sorbit, (Poly)Ethylenglykol, Saccharose, Inositol, Pentaerythrit, Trimethylolpro­ pan, Mannit sowie Dulcit, Erythrit, Threitol bzw. ein Derivat davon ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polyol in der Elu­ tionslösung in einer Menge von 10% bis 60% (w/v) enthalten ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Chromatografie- Materialien auf Agarosegelen, Dextrangelen, Latex, Cellulose-Gelmatrices oder Acrylamid-Gelmatrices basieren.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei das Polyol einem für eine Modfikationsreaktion erforderlichen Puffer zugesetzt ist und die mit diesem Elutionspuffer eluierten Moleküle direkt nach der Elution modifier­ bar sind.

7. Sulfon mit der Formel
CH₂OHCHOHCH₂SCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂SCH₂CHOHCH₂OH (I)

8. Verfahren zur Herstellung des Sulfons gemäß Anspruch 7 durch Umset­ zung von Mercaptoglycerin mit Divinylsulfon.

9. Verwendung des Sulfons nach Anspruch 7 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6.