DE2708912A1

DE2708912A1 - Verfahren und vorrichtung zur selektiven abtrennung von lipoproteinen aus blutplasma oder -serum

Info

Publication number: DE2708912A1
Application number: DE19772708912
Authority: DE
Inventors: John Stephen Ayers; David Roderick Husbands
Original assignee: Development Finance Corp of New Zealand
Current assignee: DFC New Zealand Ltd
Priority date: 1976-03-04
Filing date: 1977-03-02
Publication date: 1977-09-08
Also published as: GB1543016A; US4096136A; GB1573512A; DE2708912C2; AU2279777A; SE7702324L; JPS52125396A; FR2343251B3; IT1115552B; FR2343251A1; NZ180199A; SE447873B; JPS6248193B2

Description

PATENTANWALTSBÜRO SCHUMANNSTR. 97 · D-4OOO DÜSSELDORF Telefon: (02 11) 68334A Telex: 08586513 cop d

PATENTANWÄLTE:
Dipl.-Ing. W. COHAUSZ Dipl.-Ing. R. KNAUF ■ Dr.-Ing., Dipl.-Wirtsch.-Ing. A. GERBER ■ Dipl.-Ing. H. B. COHAUSZ

DEVELOPMENT FINANCE CORPORATION -,_ _{März 1977} OF NEW ZEALAND
Wellington, New Zealand

Verfahren und Vorrichtung zur selektiven Abtrennung von Lipoproteinen aus Blutplasma oder -serum

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur selektiven Abtrennung von Lipoproteinen aus Blutplasma oder -serum.

Die fraktionierte Trennung der zahlreichen im Blutplasma oder -serum vorkommenden Proteinarten ist seit fast einem Jahrhundert von erheblichem Interesse. Es konnten Fortschritte erzielt werden, so daß heute einige Proteinarten, wie Fibrinogen, ^-Globuline und Albumin, mit hoher Reinheit industriell gewonnen werden können. Die Isolierung der Plasma- oder Serumproteine wird jedoch durch eine Reihe technischer Probleme behindert, von denen eines die Gegenwart nennenswerter Mengen Lipoproteine ist. Diese lassen sich nicht leicht selektiv abtrennen, jedenfalls nicht in großem Maßstab.

Es wurde beobachtet, daß erhöhte Lipoprotein-Konzentrationen im Plasma bestimmte Erkrankungen, wie Diabetes mellitus, Hypothyreodismus, schwere Proteinurie und Obstruk-

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tionsikterus, häufig als Sekundärerscheinung begleiten. Ferner wurden im Laufe des letzten Vierteljahrhunderts Daten gesammelt, die einen direkten Zusammenhang zwischen der Lipoprotein-Konzentration im plasma und Herkranzgefäßerkrankungen nahelegen.

Die Lipoproteine im Blutplasma bestehen aus drei Fraktionen: einer Fraktion von sehr niedriger Dichte, einer Fraktion von niedriger Dichte und einer Fraktion von hoher Dichte. Eine hohe Konzentration von Lipoproteinen der zweiten Fraktion wurde bei Patienten beobachtet, die an Herzkranzgefäßerkrankungen litten. Eingehendere Informationen über diesen der Erfindung zugrunde liegenden Sachverhalt können in "Blood Lipids and Lipoproteins Quantitation, Composition and Metabolism", herausgegeben von Gary J. Nelson, Verlag John Wiley & Son, Inc., USA 1972, gefunden werden. Es versteht sich, daß eine einfache Methode zur Feststellung einer derartigen Anomalität durch ein Routineverfahren bei einer jährlichen Vorsorgeuntersuchung äußerst erwünscht ist. Ein vorgewarnter Patient kann Vorbeugungsmaßnahmen, wie eine Änderung der Ernährung oder eine medikamentöse Behandlung, ergreifen, um die unerwünschte Lipoprotein-Konzentration und damit die Gefahr einer Herkranzgefäßerkrankung zu vermindern. Die bisher gebräuchlichen Methoden zur Bestimmung der relativen Konzentration der Lipoprotein-Fraktionen im Blut erfordern langwierige Fällungen und Trennungen durch Zentrifugieren, und die Trennung in Fraktionen ist alles andere als befriedigend (vgl. Journal of of Lipid Research, Bd. 11, S. 583-595,1970).

Es stellte sich somit die Aufgabe, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu selektiven Trennung von Lipoproteinen aus Blutplasma oder -serum zur Verfügung zu stellen, mit denen die Lipoproteine auf einfache Weise aus dem Plasma oder Serum abgetrennt und in Fraktionen aufgespalten werden können.

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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man Blutplasma oder -serum, das divalente Kationen enthält, mit einem kationischen Ionenaustauscher in Berührung bringt, der aus einer wasserunlöslichen, hydrophilen und in Wasser quellbaren Grundmasse besteht, an der chemisch SuIfat-Ionenaustauschgruppen gebunden sind, und die entweder aus

a) einem vernetzten Kohlenh/drat, einem vernetzten PoIysaccharid oder hydroxylgruppenhaltigen Derivaten davon oder vernetzter Cellulose in nativer, faseriger, mikrogranularer, mikrokristalliner oder regenerierter Form oder

b) einem vernetzten Kohlenhydrat, einem vernetzten PoIysaccharid oder hydroxylgruppenhaltigen Derivaten davon oder vernetzter Cellulose in nativer, faseriger, mikrogranularer, mikrokristalliner oder regenerierter Form, wobei eine Anzahl niedriger Hydroxyalkylgruppen mit dem Kohlenhydrat, Polysaccharid, deren Derivaten oder der Cellulose chemisch verbunden sind,

besteht, und das an den Ionenaustauscher gebundene Lipoprotein und/oder das von den Lipoproteinen befreite Blutplasma oder -serum gewinnt.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung beruht auf folgender überraschender Feststellung. Ionenaustauscher bewirken einen Austausch zwischen den am Ionenaustauscher lose gebundenen Ionen und Ionen gleichnamiger Ladung in der Lösung, die dadurch an den Ionenaustauscher gebunden und aus der Lösung isoliert werden können. Es war nun zu erwarten, daß aus einer Lösung, die verschiedene, aber gleichnamig geladene Ionen enthält, diese Ionen durch Ionenaustausch nicht selektiv abzutrennen

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sein würden. Überraschenderweise wurde jedoch festgestellt, daß kationische Ionenaustauscher mit Sulfat-Gruppen als aktiven Ionenaustauschgruppen Lipoproteine in Gegenwart aller anderen Serumproteine und Ionen zu binden vermögen, wenn sie sich im Gleichgewicht mit Lösungen befinden, die divalente Kationen, wie Magnesium-, Calcium- und Mangan-Ionen, befinden und das gleiche divalente Kation dem Serum zugesetzt wird. Die erforderliche Konzentration des Kations im Serum hängt von der Natur der sulfatierten Grundmasse des Ionenaustauschers, dem Grad der Sulfatierung, dem Kation und dem pH-Wert der Lösung ab. Vorteilhafte Werte sind eine Konzentration im Bereich von 0,5—1,0-m und ein pH-Wert zwischen 6 und 8. Weitere geeignete Parameter sind in den nachstehenden Beispielen angegeben.

Der Ionenaustauscher und Verfahren zu seiner Herstellung

werden in den deutschen Offenlegungsschrift

(Patentanmeldung vom gleichen Tage) eingehend beschrieben.

An Hand folgender Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.

BEISPIEL 1
A. Herstellung von Hydroxypropylcellulose

20 g granulierte regenerierte Cellulose wurde mit 30 ml kalter 30%iger Natronlauge, 2 ml Epichlorhydrin (10 Volumenteile auf 100 Gewichtsteile Cellulose) und 10 ml Propylenoxid (50 Volumenteile auf 100 Gewichtsteile Cellulose) gemischt, und das Gemisch wurde kräftig gerührt, bis die Quellung der Cellulose beendet und die gesamte Flüssigkeit absorbiert war. Die feuchte pulverförmige Cellulose wurde dann in einem geschlossenen Gefäß ohne weiteres Rühren 2 Stunden auf 60 ⁰C erwärmt. Danach wurde das Reaktionsgefäß auf Raumtemperatur abgekühlt, und der Inhalt wurde

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in 500 ml Wasser gegossen. Die Hydroxypropylcellulose-Teilchen wurden auf einem Büchner-Trichter gesammelt, gründlich mit Wasser gewaschen, durch Waschen mit Methanol entwässert und durch Erwärmen auf 60 ⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Das Produkt (20 g) wurde bis zur Sulfatierung in einem Exsikkator aufbewahrt. Es hatte im Quellzustand in destilliertem Wasser ein Bettvolumen von 9,5 ml/g,

B. Herstellung von Hydroxypropylcellulosesulfat (Na -Form)

1 g trockene Hydroxypropylcellulose, 1 g Pyridin-Schwefeltrioxid und 10 ml trockenes Pyridin wurden in einen Erlenmeyerkolben gegeben, durch ein aufgesetztes Trockenrohr geschützt und 1 1/2 Stunden im Ölbad auf 80 ⁰C erwärmt. Dabei wurde der Kolben wiederholt von Hand geschüttelt. Nach beendeter Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in 200 ml deionisiertes Wasser gegossen. Das sulfatierte Produkt wurde auf einem Sinterglastrichter gesammelt und gründlich mit deionisiertem Wasser gewaschen. Zur Umwandlung der Pyridinium- in die Natriumionenform wurde es in 1-m Natriumchloridlösung mit 0,1-m Natronlauge gegen Phenolphthalein bis zu dessen Umschlagspunkt titriert, dann erneut auf dem Filter gesammelt, gewaschen und schließlich feucht bei 4 ⁰C aufbewahrt.

BEISPIEL 2 Bestimmung des Substitutionsgrades

Der Sulfatierungsgrad (2,37 mval/g) wurde aus dem Volumen (31,2 ml) der zur Verdrängung des Pyridinium-Ions aus der sulfatierten Cellulose verbrauchten 0,1-m Natronlauge unter Voraussetzung einer lOOligen Celluloseausbeute bei der Reaktion bestimmt. Die Zulässigkeit dieses Verfahrens wurde dadurch erwiesen, daß ein Doppel hergestellt und das Trockengewicht des Produktes am Ende bestimmt wurde. Die

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Ionenaustauschkapazität konnte durch Änderung der Menge des bei der Reaktion verwendeten Pyridin-Schwefeltrioxid-Komplexes im Bereich bis zu 4,0 mval/g variiert werden.

BEISPIEL 3

Anwendung sulfatierter Ionenaustauscher zur selektiven Abtrennung von Lipoproteinen

Eine Kolonne wurde mit dem nach dem Verfahren des Beispiels 1 B hergestellten Ionenaustauscher — Hydroxypropylcellulose-8-50-sulfat (1 mval/g) — gefüllt und mit einem Kolonnenvolumen einer 0,5-m Magnesiumchlorid-Lösung, die 0,01 mol Natriumhydrogencarbonat enthielt, ins Gleichgewicht gebracht. Beim Durchlaufenlassen von Serum, das im Verhältnis 1:1 mit einer 1-m Magnesiumchlorid-Lösung verdünnt und mit 0,1-m Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt worden war, wurden die Lipoproteine mit sehr niedriger Dichte (VLDL) und die Lipoproteine mit niedriger Dichte (LDL) selektiv und quantitativ abgetrennt. Andere Proteine einschließlich der Lipoproteine mit hoher Dichte (HDL) passierten die Kolonne und wurden mit einem weiteren Kolonnenvolumen der zur Gleichgewichtseinstellung verwendeten 0,5-m Magnesiumchlorid-Lösung vom pH-Wert 7,4 ausgewaschen. Die an den Ionenaustauscher gebundenen Lipoproteine (VLDL und LDL) wurden mit einer Lösung, die 0,25 mol Natriumchlorid und 0,25 mol Trinatriumcitrat enthielt und mit 1-m Salzsäure auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt worden war, eluiert. (Diese Lipoproteine können auch rasch mit einer 1-m Natriumchlorid-Lösung eluiert werden.) Durch Immunelektrophorese und Agarose-Elektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die eluierten Lipoproteine nicht mit anderen Proteinen verunreinigt waren. Ebenso wurde durch Immunelektrophorese und Agarose-Elektrophorese festgestellt, daß die Proteine, die die Kolonne passiert hatten, frei von VLDL und LDL waren.

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Die HDL-Fraktion kann ebenfalls in der Kolonne festgehalten werden, wenn ein höher substituierter Ionenaustauscher, z. B. ein solcher von 5 mval/g, verwendet wird, doch ist dies nicht immer notwendig, da es in der Regel die Lipoproteine mit sehr niedriger und niedriger Dichte sind, die Störungen bei der Fraktionierung der Serumproteine verursachen. Die Durchflußgeschwindigkeit des Serums durch die Ionenaustauschkolonne war so hoch, daß die Lipoproteine aus 5 ml Serum innerhalb von 15 Minuten abgetrennnt werden konnten. Auch größere Kolonnen mit immer noch guten Durchflußeigenschaften können verwendet werden. Dies steht in ganz überraschendem Gegensatz zu früher angewendeten Methoden zur selektiven Abtrennung der Lipoprotein-Komponenten aus Serum. Mit dem beschriebenen Ionenaustauscher kann eine rasche und quantitative Abtrennung erzielt werden.

Falls daher das beschriebene Verfahren zuerst angewendet wird, kann es die Isolierung der anderen Serumproteine erleichtern. Beispielsweise können bei der Herstellung von IgG aus Serum alle anderen Proteine an einer Säule aus QAE-Sephadex absorbiert werden, während das IgG durch die Säule glatt hindurchläuft (Protides of the biological fluids — Proceedings of the 18th Colloquium, S. 511—515, 1969). Das Volumen des auf die Säule gegebenen Serums darf jedoch 75% des Säulenvolumens nicht übersteigen, da sonst die Lipoproteine mit sehr niedriger und niedriger Dichte die Säule durchbrechen und das IgG verunreinigen. Durch vorherige Abtrennung dieser Lipoproteine in einer Kolonne mit sulfatiertem Ionenaustauscher und anschließender Herstellung des IgG nach dem in der vorstehend angegebenen Quelle beschriebenen Verfahren kann man bis zu dreimal so viel Serum auf die QAE-Sephadex-Säule geben, ohne daß eine Verunreinigung des isolierten IgG eintritt.

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BEISPIEL 4 Prüfung von Blutproben auf erhöhten Lipoprotein-Gehalt

Von normalen Personen wurden morgens in nüchternem Zustand Blutproben entnommen, und das daraus erhaltene Serum wurde innerhalb von drei oder vier Tagen verarbeitet.

Zur Bestimmung des Cholesterins wurde ein aliquoter Teil von 500 μΐ des Kolonnenablaufs mit 3 ml alkoholischer Kalilauge (12 ml 50%iger Kalilauge + 88 ml Äthanol) 30 Minuten bei 50 ⁰C zur Reaktion gebracht. Danach wurden 1,5 ml Hexan und 0,5 ml Wasser zugesetzt, und es wurde eine Probe von 1000 μΐ der organischen Schicht abgenommen und zur Trockene gedampft. Die extrahierte Cholesterin-Probe wurde mit . 1 ml Lieberman-Burchard-Reagenz (20 ml Essigsäureanhydrid + 1 ml Schwefelsäure + 10 ml Essigsäure) versetzt, und nach 30 Minuten wurde die optische Dichte der Lösung in einer 1-ml-Küvette bei 620 nm bestimmt. An Hand einer unter gleichen Bedingungen aufgenommenen Eichkurve wurde der Cholesterin-Gehalt berechnet. Bei Anwendung dieser Methode genügte eine Serumprobe von 50 μΐ zur Bestimmung des Serumcholesterins.

Gel-Elektrophorese

Eine Polyacrylamid-Scheibengel-Elektrophorese wurde wie folgt ausgeführt.

Das Trenn-Gel enthielt 3,751 Acrylamid (pH-Wert 8,9), während das obere Gel 2,5% Acrylamid (pH-Wert 6,7) enthielt. Das Probe-Gel wurde nicht verwendet; die mit Sudanschwarz B angefärbten Proben wurden in einer 30%igen Sucrose-Lösung direkt auf das konzentrierende Gel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit einer 1%igen Lösung von Amidoschwarz in 7%iger Essigsäure nachgefärbt.

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Die Ergebnisse der Testmethode werden an Hand der Zeichnung erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein Diagramm des Cholesterin-Gehaltes der aus dem sulfatierten Ionenaustauscher des nachstehenden Beispiels 5 eluierten Proteinfraktionen;

Fig. 2 das Elektrophoresebild der aus dem sulfatierten Ionenaustauscher des nachstehenden Beispiels 5 eluierten drei Spitzen-Proteine, bei dem das rechte Gel P eines jeden Paares auf Protein, das linke Gel L auf Lipid angefärbt worden war;

Fig. 3 das Schlierenbild einer analytischen Ultrazentrifugierbehandlung eines HDL CP₂) enthaltenden Spitzen-Proteins;

Fig. 4 ein Diagramm des Cholesterin-Gehaltes der aus dem sulfatierten Ionenaustauscher des nachstehenden Beispiels 6 eluierten Proteinfraktionen (dieser Ionenaustauscher war nicht so hoch sulfatiert wie derjenige des Beispiels 5, Fig. 1);

Fig. 5a Darstellungen der Ionenaustauschkapazität für und 5b _{HDL>
VLDL bzw<
LDL in} Abhängigkeit von dem SuI-fatierungsgrad des Ionenaustauschers (Beispiel 7).

BEISPIEL 5

Ein aus Hydroxypropylcellulose hergestellter sulfatierter Ionenaustauscher mit einem Sulfat-Gehalt von 3,7 mval/g wurde in eine Kolonne (1 cm 0 χ 8 cm Höhe) gefüllt und mit ml einer 0,5-m MgCl₂-Lösung ins Gleichgewicht gebracht. Sodann wurden 2 ml Humanserum auf 0,5-m Magnesiumchlorid gebracht und auf die Kolonne gegeben, die dann mit 25 ml einer

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0,5-m MgCl₂-Lösung und danach mit 10 ml einer 0,05-m MgCl₂-Lösung gewaschen wurde. Bei der Aufgabe der Probe auf die Kolonne wurde der halbdurchsichtige Ionenaustauscher undurchsichtig. Dies war, wie später festgestellt wurde, auf die Bindung von VLDL und LDL zurückzuführen. Das gebundene Protein wurde mit einem linearen Gradienten eluiert, der aus 60 ml einer 0,1-m NaCl-Lösung und 60 ml einer 1-m NaCl-Lösung bestand. Fünf 1-ml-Fraktionen wurden gesammelt. Aus jedem Röhrchen wurde eine 500-ul-Probe entnommen, und zur Prüfung auf Lipoproteine wurde der Cholesterin-Gehalt bestimmt (Fig. 1) .

Das nicht gebundene Protein, Peak 1 (P*), enthielt kein Cholesterin. Die Proteine der Peaks 2 und 3 enthielten beide Cholesterin. Auf Grund des höheren Protein/Cholesterin-Verhältnisses beim Peak 2 (im Vergleich zum Peak 3) ist anzunehmen, daß Peak 2 das HDL darstellt. Die das Protein der Peaks 1, 2 und 3 enthaltenden Lösungen wurden durch Vakuumdialyse gegen eine 0,02-m Lösung von Tris/HCl mit einem pH-Wert von 7,7 konzentriert und nach dem Anfärben mit Sudanschwarz B einer Acrylamid-Gel-Elektrophorese unterworfen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele zur Sichtbarmachung der Nichtlipoprotein-Banden mit Amidoschwarz nachgefärbt (Fig. 2).

Das Material des Peaks 2 zeigte eine einzelne Bande, die sowohl von Lipid- als auch Protein-Farbstoff angefärbt wurde und deren Beweglichkeit derjenigen des HDL entsprach. Das Material des Peaks 3 ergab zwei Protein-Banden, die beide mit Lipid-Farbstoff reagierten und deren Beweglichkeit derjenigen des LDL und VLDL entsprach. Das Material des Peaks 1 enthielt die normalen Serumproteine mit Ausnahme der Lipoprotein-Komponenten.

Bei der Dialyse des Peak-2-Materials gegen eine 0,02-m Tris/HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,7, die U NaCl

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- ys -

enthielt, und nachfolgender Ultrazentrifugierung wurde eine einzige symmetrische Grenze beobachtet (Fig. 3). Der S-Q -Wert dieser Grenze (4,6 S) entsprach derjenigen des HDL (4,9 S).

BEISPIEL 6

Wie vorstehend beschrieben, wurde eine chromatographische Trennung, jedoch mit einem weniger hoch sulfatierten Ionenaustauscher (0,5 mval/g) ausgeführt. Nur das Material eines Lipoprotein-Peaks wurde an die Säule gebunden (Fig. 4).

Die Gel-Elektrophorese des Materials des Peaks für nicht gebundenes Protein ergab, daß es neben den Nichtlipoproteinen HDL enthielt. Die Elektrophorese zeigte ferner, daß das gebundene Material des einzigen Peaks nur aus LDL und VLDL bestand.

BEISPIEL 7

Mit Hilfe einer auf dem vorstehend beschriebenen Verfahren basierenden Methode wurden 10 ml Serum auf einer Säule von 1 cn |i und 15 cm Höhe (0,5 mval/g) in zwei Fraktionen getrennt. Das nicht gebundene Protein (andere Serumproteine als VLDL und LDL) wurde mit einer MgCl₂-Lösung durchgewaschen, während die gebundene Fraktion (LDL und VLDL) mit einer 1-m NaCl-Lösung eluiert wurde.

Zur Bestimmung des Einflusses des Sulfatierungsgrades auf die Bindung des HDL sowie des LDL/VLDL wurde eine Reihe von acht Ionenaustauschern mit Kapazitäten zwischen 0,1 und 3,75 mval/g hergestellt. Diese acht Ionenaustauscher und eine Probe von SP-Sephadex (2,75 mval/g) wurden in Kolonnen aus Pasteur-Pipetten gefüllt, mit einer 0,5-m MgCl,-Lösung ins Gleichgewicht gebracht und auf die gleiche Höhe eingestellt (Kolonnenvolumen 1,6 ml).

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Die LDL/VLDL-Probe wurde, wie vorstehend beschrieben, hergestellt, gegen normale Salzlösung dialysiert und dann auf 0,5-m MgCl₂ gebracht. Auf jede der neun Kolonnen wurde ein Oberschuß (etwa das Zweifache der Sättigungsmenge) dieser Lösung aufgegeben. Zur Entfernung von allem nicht gebundenen LDL und VLDL wurden die Säulen mit 20 ml 0,5-m MgCl₂-Lösung gewaschen- Das gebundene LDL und VLDL wurde sodann mit 6 ml 1-m NaCl-Lösung eluiert. Die optische Dichte dieser Lösung bei 280 nm wurde als Maß für LDL- und VLDL-Bindungskapazität des Ionenaustauschers benutzt.

Nach erneuter Gleichgewichtseinstellung der Ionenaustauscher wurde die das HDL und die Nichtlipoproteine enthaltende Serumfraktion in gleicher Weise auf die Säulen gegeben, d. h. die Ionenaustauscher wurden mit HDL gesättigt,, und das gebundene HDL wurde mit 6 ml 1-m NaCl-Lösung eluiert. Figur 5a zeigt die Ionenaustauscher-Kapazität für HDL und Figur 5b diejenige für LDL/VLDL in Abhängigkeit vom Grad der Sulfatierung. Wie ersichtlich, wird unterhalb 1 mval/g kein HDL gebunden. Oberhalb dieses Wertes jedoch nimmt die HDL-Bindung linear mit dem Grad der Sulfatierung zu. Die LDL/VLDL-Bindung andererseits nimmt zwischen 0 und 1 mval/g rasch zu und wird bei einem Sulfatierungsgrad oberhalb 1 mval/g von diesem nahezu unabhängig. Diese Ergebnisse erklären, warum der bei dem ersten Versuch verwendete Ionenaustauscher (3,7 mval/g) sowohl HDL als auch LDL und VLDL band, während.der bei dem zweiten Versuch benutzte Ionenaustauscher (0,5 mval/g) nur LDL und VLDL band. Ferner ist zu erkennen, daß SP-Sephadex (Fig. 5b) unter diesen Bedingungen keinerlei Protein zu binden vermochte.

Die Ergebnisse der Kapazitätsmessungen an ausgewählten sulfatierten Ionenaustauschern nach dem beschriebenen Verfahren sind in nachstehender Tabelle wiedergegeben.

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TABELLE

Sulfatierte Ionenaustauscher Grundmasse

Lipoprotein-Kapazität mg Cholesterin/g

Mikrogranulare Cellulose	10-50*	2,24	25
It Il	10-00	2,11	18
Il Il	50-00	2,06	2
Regenerierte Cellulose	8-50*	2,11	7,5
Il It	10-00	niedrig	nicht bestimmt
Il It	50-00	2,32	0,6
Il Il	100-00	1,53	0,2
Vernetztes Dextran	LH-20**	2,65	2,2
Il Il	G-25**	2,38	0,7

Vernetzte Agarose

5,2

* Die Ziffern geben den Vernetzungs- und Hydroxypropylierungsgrad in Volumenteilen umgesetztes Epichlorhydrin bzw. Fropylenoxid je 100 Gewichtsteile Cellulose an.

** Handelsbezeichnung.

Das Verfahren wurde mit Serum wiederholt, aus dem die Lipoproteine mit niedriger Dichte durch Ultrazentrifugieren entfernt worden waren. Dadurch wurde ein Maß für die HDL-Bindungskapazität der Ionenaustauscher erhalten, da andere Serumproteine unter diesen Bedingungen nicht gebunden werden.

Aus den Versuchsergebnissen ist zu erkennen, daß die Lipoproteine sich wirkungsvoll dadurch trennen lassen, daß man das Serum nacheinander durch zwei Kolonnen gibt, die mit dem Ionenaustauscher gefüllt sind, wobei jedoch der Gehalt des Ionenaustauschers an Sulfat-Gruppen in der

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ersten Kolonne geringer als derjenige des Ionenaustauschers in der zweiten Kolonne ist. An dem Ionenaustauscher in der ersten Kolonne werden dann nur das VLDL und LDL gebunden, während der Ionenaustauscher in der zweiten Kolonne das HDL absorbiert.

Außer Cellulose in ihren verschiedenen Formen können auch andere Kohlenhydrate bzw. Polysaccharide als Grundmasse für den Ionenaustauscher verwendet werden. Besonders geeignet sind Agar-Agar, Agarose, Dextran und ähnliche Stoffe. Vernetztes Hydroxypropyldextran und vernetzte Agarose sind im Handel erhältlich.

Bei den vorstehend beschriebenen Versuchen wurden Grundmassen aus Cellulose und anderen Kohlenhydraten bzw. deren niedrigen Hydroxyalkylderivaten verwendet, die mit Epichlorhydrin vernetzt worden waren. Grundsätzlich können diese Grundmassen ganz allgemein mit Verbindungen der Formel X—R—Y vernetzt werden, in der X und Y Halogen oder Epoxid-Gruppen sind und R ein aliphatischer Rest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen ist, der mit Äther- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sein kann. Beispiele solcher Verbindungen außer Epichlorhydrin sind Dichlorhydrin, Dibrompropanol, 1,2:3,4-Diepoxybutan, Bis-Epoxypropyläther, Äthylen-bis-epoxypropyläther und 1,4-Butandiol-bis-epoxypropylather.

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Claims

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BCHUMANN8TR Θ7 · D-4OOO DÜSSELDORF

Telefon: (0211)683346 Telex: 08586513 cop d

PATENTANWÄLTE:
DipUng. W. COHAUSZ - DipL-lng. R. KNAUF - Dr.-Ing., Dipl.-Wirttch.-lng. A. GERBER - Dipl.-Ing. H. B. COHAUSZ

Patentansprüche

Verfahren zur selektiven Abtrennung von Lipoproteinen aus Blutplasma oder -serum, dadurch gekenn ze ichnet , daß man Blutplasma oder -serum, das divalente Kationen enthält, mit einem kationischen Ionenaustauscher in Berührung bringt, der aus einem wasserunlöslichen, hydrophilen und in Wasser quellbaren Grundmasse besteht, an der chemisch SuIfat-Ionenaustauschgruppen gebunden sind, und die entweder aus

a) einem vernetzten Kohlenhydrat, einem vernetzten Polysaccharid oder hydroxylgruppenhaltigen Derivaten davon oder vernetzter Cellulose in nativer, faseriger, mikrogranularer, mikrokristalliner oder regenerierter Form oder

b) einem vernetzten Kohlenhydrat, einem vernetzten Polysaccharid oder hydroxylgruppenhaltigen Derivaten davon oder vernetzter Cellulose in nativer, faseriger, mikrogranularer, mikrokristalliner oder regenerierter Form, wobei eine Anzahl niedriger Hydroxyalkylgruppen mit dem Kohlenhydrat, Polysaccharid, deren Derivaten oder der Cellulose chemisch verbunden sind,

besteht, und das an den Ionenaustauscher gebunde Lipoprotein und/oder das von den Lipoproteinen befreite Blutplasma oder -serum gewinnt.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das Blutplasma oder -serum mit dem kationischen Ionenaustauscher dadurch in Berührung bringt, daß man das Plasma oder Serum durch mindestens zwei hintereinandergeschaltete Kolonnen leitet, die mit dem Ionenaustauscher gefüllt sind, wobei jedoch der Gehalt des Ionenaustauschers an Sulfat-Gruppen in einer Kolonne geringer als derjenige des Ionenaustauschers in der anderen Kolonne ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man in der ersten Kolonne einen Ionenaustauscher mit einem solchen Gehalt an Sulfat-Gruppen verwendet, daß sowohl Lipoproteine mit niedriger als auch solche mit sehr niedriger Dichte absorbiert werden, und daß man in der zweiten Kolonne einen Ionenaustauscher mit einem solchen Gehalt an Sulfat-Gruppen verwendet, daß Lipoprotein mit hoher Dichte absorbiert wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, d a durc'h gekennzeichnet, daß man einen Ionenaustauscher verwendet, dessen Grundmasse durch eine bifunktionelle Verbindung der Formel X—R—Y vernetzt ist, worin X und Y Halogen oder Epoxid-Gruppen sind und R ein aliphatischer Rest mit 3—10 Kohlenstoffatomen ist, der mit Äther- oder Hydroxy-Gruppen substituiert sein kann.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Ionenaustauscher verwendet, dessen Grundmasse mit bis zu 5 mval Sulfat/g Ionenaustauscher sulfatiert ist.
6. Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß sie aus mindestens zwei hinter-

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einandergeschaltete Kolonnen besteht, die mit dem Ionenaustauscher gefüllt sind, wobei der Ionenaustauscher in einer Kolonne einen geringeren Gehalt an Sulfat-Gruppen als der Ionenaustauscher in der anderen Kolonne hat.

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