DE2413362C2 - Gelprodukt auf Basis von Agarose sowie Verwendung desselben für hydrophobe Entsalzungsadsorption - Google Patents

Gelprodukt auf Basis von Agarose sowie Verwendung desselben für hydrophobe Entsalzungsadsorption

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DE2413362C2
DE2413362C2 DE2413362A DE2413362A DE2413362C2 DE 2413362 C2 DE2413362 C2 DE 2413362C2 DE 2413362 A DE2413362 A DE 2413362A DE 2413362 A DE2413362 A DE 2413362A DE 2413362 C2 DE2413362 C2 DE 2413362C2
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
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    • C08B37/0039—Agar; Agarose, i.e. D-galactose, 3,6-anhydro-D-galactose, methylated, sulfated, e.g. from the red algae Gelidium and Gracilaria; Agaropectin; Derivatives thereof, e.g. Sepharose, i.e. crosslinked agarose
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction

Description

OH
-CH2-CH-CH2-O-R
wobei R ggf. mit Hydroxy, Halogen, Nitro substituiertes Alkyl, Alkenyl, Aryl, Aralkyl, Aralkoxy, Alkaryl bedeutet, wobei die Alkylgruppen von R 1 bis 20, vorzugsweise 5 bis 15, Kohlenstoffatome enthalten und die Arylgruppen Phenyl oder Naphtyl bedeuten.
2. Gelprodukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Agarose nach an sich bekannter Weise ätherartig quervernetzt ist.
3. Gelprodukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hydroxysubstituierten Alkylgruppen ^-Hydroxypropyl oder^-Hydroxybutyl bedeuten.
4. Verwendung des Gelproduktes nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Sorbens für die hydrophobe Entsalzungsadsorption zur Separation von Proteinen und Peptiden, wobei nach deren Adsorption an dem Gelprodukt die Desorption mittels Senken der Ionenstärke und/oder Abänderung des pH-Wertes und/oder Senken der Polarität des zum Eluieren verwendeten Lösungsmittels vorgenommen wird.
Die Erfindung betrifft ein Gelprodukt auf Basis von Agarose sowie die Verwendung desselben für die hydrophobe Entsalzungsadsorption.
Das Isolieren von Proteinen aus biologischem Material wie Blut, Urin, Milch und Organextrakt von Pflanzen und Tieren wird industriell und in Prüfungsanstalten nach mannigfachen Verfahren unternommen, von denen die Fällungmethode wohl die bei größeren Mengen zumeist zur Anwendung kommende ist Adsorptionsmethoden, insbesondere Chromatographie, haben dank der großen Selektivität eine stetig ansteigende Bedeutung erhalten. Man hat die Einfachheit der Fällungsmethoden mit der Selektivität der Adsorptions-Desorptionsprozesse kombinieren wollen, indem man sich bei der sowohl Mikro- als Makromaßstäben verwendbaren Methoden bediente. Anzustreben waren also Methoden, die man bei nur einigen wenigen Mikrolitern Blutserum, aber auch bei 103- oder 106mal größeren Mengen unter Beibehalten der Separationsschärfe anwenden konnte. Vorliegende Erfindung zeigt den Weg zur Durchführung derartiger Proteinfraktionierungen. Das erfindungsgemäße Gelprodukt läßt sich außerdem auch in anderen Anwendungsbereichen anstelle der Proteinechemie einsetzen.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung des Gelproduktes für die hydrophobe Entsalzungsadsorption ist eine Kombination zweier Separationsprinzipien, die einzeln bereits früher bekannt waren, vorgesehen. Das hierzu Charakteristische ist, daß die hydrophobe Adsorption durch eine hohe Salzkonzentration in der Lösung bedingt wird.
Bisher sind nur wenige Arbeiten über die hydrophobe Adsorption und Desorption von Proteinen veröffentlicht worden. Als Adsorbens wurde dabei nach der Bromcyanmethode an Agarose gekuppeltes 4-Phenylbutylamin oder e-Aminocaproyl-D-tryptophanmethylester verwendet. Ein derartiges Adsorbens enthält außer den aromatischen Kernen teils positiv geladene Aminogruppen, teils in der Agarose nativ vorkommende feste Sulfat- und Carboxylationen. Deshalb ist hier ein kombinierter Effekt der hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkung zwischen Proteinen in Lösung und dem Adsorbens zu erwarten, was sich auch herausgestellt hat. Die Adsorption wurde bisher bei niedriger lonenstärke vollzogen und die Desorption durch Erhöhen der !on?nstärk? und/odpr durch Zusatz ?in?s "olarisetionsvirrin^rndcn Medium? wie Äthvlpncrlvknl; hervorgerufen. Durch die vorgenannten, kombinierten Effekte bleibt die Separation oft unvollständig und ist schwer zu kontrollieren.
Die Entsalzungschromatographie beruht darauf, daß gewisse Stoffe, beispielsweise Aminosäuren, erhöhte Affinität zum Träger besitzen, beispielsweise Zellulose, wodurch die fraglichen Stoffe bei der Chromatographie langsamer wandern als die Lösungsmittelfront. Entsalzungschromatographie auf Filterpapier nach diesem Prinzip wurde von Tiselius, Arkiv Kemi, Mineral. Geol. 26B, No. 1, 1948 vorgenommen, hat jedoch seitdem kaum Verwendung gefunden. Das fehlende Interesse für die Entsalzungschromatographie beruht zweifellos auf der
unvollkommenen Kenntnis der Voraussetzungen für die Entsalzungsadsorption.
,Die hydrophobe Entsalzungsadsorption ist ein neues und sehr interessantes Phänomen, das sich in der Phasengrenze zwischen einer festen Substanz und der sie umgebenden Lösung abspielt. Es handelt sich hierbei anscheinend um ein mit der Kristallisation verwandtes Phänomen, wobei eine durch das Salz hervorgerufene Erhöhung der hydrophoben Anziehung zwischen den hydrophoben Bereichen der festen Phase und der gelösten Substanz (Protein) zum Ausscheiden des Letzteren an Oberfläche der Phasengrenze führt
Gemäß vorliegender Erfindung hat sich nun erwiesen, daß ein insbesondere für hydrophobe Chromatographie und Adsorption geeignetes Gelprodukt aus einer Agarose besteht, an die neutrale, nicht ionenbildende hydrophobe Gruppen über Ätherbindungen oder Esterbindungen kovalent gebunden sind, wobei die hydrophoben Gruppen folgende Bedeutungen haben:
a) unsubstituierte, halogen- oder hydroxysubstituierte Reste der Formel
CnH2n+1 — mit η = 1 bis 20;
b) Reste der Formel CnH2n-1 — mit n= 1 bis 20;
c) Reste der Formel
X/nCeHs-mCY—, XmCeHs-mCY—CZ-, XmCioH7-m—. XmCioHz-mCY— oder —CZ—,
wobei X H, CnH2p+1, vorzugsweise CH3 oder C2Hs, OCpH2d+ 1, Halogen oder NO2 bedeutet,
Y und Z O oder H2 bedeutet, und
m eine ganze Zahl von 0 bis 5, -
ρ eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind;
d) oder Reste der Formel
OH
-CH2-CH-CH2-O-R
wobei R ggf. mit Hydroxy, Halogen, Nitro substituiertes Alkyl, Alkenyl, Aryl, Aralkyl, Aralkoxy, Alkaryl bedeutet, wobei die Alkylgruppen von R 1 bis 20, vorzugsweise 5 bis 15, Kohlenstoffatome enthalten und die Arylgruppen Phenyl oder Naphtyl bedeuten.
Die Agarose kann vorteilhaft ätherartig quervernetzt sein. Die hydroxysubstituierten Alkylgruppen können /?-Hydroxypropyl oder ß- Hydroxy butyl bedeuten.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung des Gelproduktes nach einem als Sorbens für die hydrophobe Entsalzungsadsorption zur Separation von Proteinen und Peptiden, wobei nach deren Adsorption an dem Gelprodukt die Desorption mittels Senken der Ionenstärke und/oder Abänderung des pH-Wertes und/oder Senken der Polarität des zum Eluieren verwendeten Lösungsmittels vorgenommen wird.
Das erfindungsgemäße Gelprodukt adsorbiert oft Proteine bei niedriger Salzkonzentration. Das Charakteristische für dieses neutrale, keine Ionengruppen enthaltende, amphipatische (sowohl hydrophobe als hydrophile Gruppen enthaltende) Gel ist, daß die Adsorption sich allgemein bei ansteigender Salzkonzentration erhöht. Dies steht deutlich im Gegensatz zum Verhalten der anfangs genannten hydrophoben Gele, die bisher zur Separation von biologischen Makromolekülen beansprucht wurden. Diese enthalten ionogene Gruppen, ObIicherweise Aminogruppen, was zu einem gemischten Adsorptionseffekt führt und auf sowohl elektrostatischer als hydrophober Wechselwirkung beruht. Die Fraktionierung von Proteinen auf diese amphipatische Ionenaustauscher vollzieht man bei niedriger Salzkonzentration und eluiert durch Erhöhung der Salzkonzentration. Anzunehmen ist, daß man durch hohe Substitution mit Hilfe von geeigneten hydrophoben Gruppen auch mit diesen amphipatischen Ionenaustauschern eine Entsalzungsadsorption erhalten kann. Hier liegt jedoch ein deutlicher prinzipieller Unterschied zwischen diesen und der vorliegenden Erfindung vor, weil ein erfindungsgemäßes Gel keinerlei ionenaustauschende Gruppen enthält und die Adsorption sich daher bei abnehmender lonenstärke verringert. Adsorbierte Proteine können also durch Verdünnen der Salzlösung eluiert werden. Eine pH-Veränderung der Senkung der Dielektrizitätskonstante durch Einmischen einer geringer polaren Komponente in die Lösung, beispielsweise Dimethylsulfoxyd oder Äthylenglykol, kann ebenfalls eine Elution hervorrufen. Eine effektive Desorption von einem amphipatischen Ionenaustauscher ist nicht möglich, da die Ionenadsorption bei sich verringernder Salzkonzentralion zunimmt. Mit dem erfindungsgemäßen Gel hat sich die hydrophobe Entsalzungsmethode weiter ausbilden lassen.
Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Gels kann nach etlichen alternativen Methoden gearbeitet werden. Gemäß einer Methode verwendet man ein ätherartig quervernetztes Gel, das nach dem in der DE-OS 21 02 514 beschriebenen Verfahren mit Hilfe von ätherbildenden di-, tri- oder polyfunktionellen Gruppen, wie Ditrompropanol oder Bisepoxyd, hergestellt wurde. Wichtig für die Alkalistabilität ist, daß die Querbindung nicht hydrolysiert werden kann, weil die Herstellung von Derivaten meistenfalls in stark alkalischen Milieu mit alkylierenden Reagentien, wie Alkylhalogeniden, vollzogen wird.
Nach einer anderen Methode können iadungsfreie Derivate der Agarose durch Alkylierung einer iadungstreien Agarose hergestellt werden. Nach einer Methode mit Ionenaustauschern, die von Hjerten in J. Chromatogr. 61 (1971) 73—80 beschrieben wurde, und kombiniert mit einer Methode zur Desulfatisierung von Guisely in Carbonhyd. Res. 13 (1970) 247—256, ist eine gänzlich Iadungsfreie Agarose erhältlich. Diese Iadungsfreie Agarose wird in Perlenform überführt mit einem Gehalt von 0,5—12 Gew.-°/o Agarose in Wasser nach der von Hjerten in Biochim. Biophys. Acta 79 (1964) 393 beschriebenen Methode. Die erhaltenen Perlen werden als Ausgangsmaterial zur Herstellung von Agarosederivaten mit hydrophoben Gruppen verwendet.
Anzunehmen ist, daß Agarose aus einem Netzwerk zufällig orientierter, mäßig hydratisierter Fasern besteht, wobei diese durch Wasserstoffbindungen (T. C Laurent, Biochim. Biophys. Acta 136 (1967) 199 und D. A. Rees, Advan. Carboxyd. Chem. 24 (1969) 267), zusammengehalten werden. Agarosegel in Perlenform kann, ohne daß die Gelstruktur beeinflußt wird, dehydratisiert werden. Die Überführung von Gelen in dehydratisierte Form vollzieht sich durch vorsichtige Wasserentfernung, indem man Aceton zugibt, das sich vollständig mit Wasser mischt. Nachdem die Gelsuspension gründlich umgerührt wurde, läßt man sie sedimentieren, wonach die überschüssige Wasserphase abgesaugt wird. Wiederholt man dieses Verfahren etliche Male, erhält man eine wasserfreie Suspension der Agarose in Perlenform in Aceton. Vom Aceton kann man zu anderen Lösungsmitteln greifen, beispielsweise Chlorkohlenwasserstoff, indem man ein Verfahren analog dem obengenannten
to benutzt
Nachdem die Agaroseperlen in ein zur Alkylierung bzw. Acylierung geeignetes Lösungsmittel überführt worden sind, können sie nach bekannten Methoden alkyliert oder acyliert werden. Als Beispiel für derartige Methoden können Alkylierung mit einer Epoxidverbindung oder einem Alkylhalogenid, oder Acylierung mit einem Säurechlorid oder Säureanhydrid genannt werden.
Nachstehend folgen einige Beispiele zur Herstellung des erfindungsgemäßen Gels. Die Beanspruchung der Erfindung für chromatographische Zwecke wird durch Abbildungen erläutert F i g. 1 zeigt die Adsorption bei 280 nm in Eluat eines Serums, das auf einem erfindungsgemäßen Gel adsorbiert wurde, als Funktion des Eluierungsvolumens. F i g. 2 zeigt die Adsorptionskurve bei 254 nm von einem Extrakt, der aus braunen Bohnen gewonnen wurde, fraktioniert durch ein Bett des erfindungsgemäßen Gelproduktes.
In Beispiel 25 werden verschiedene Studien der Adscrptionsverhältnisse einer Serie der genannten Gele beschrieben.
Beispiel 1
200 ml entwässertes, 6%iges, mit Dibrompropanol quervernetztes Agarosegel in Form von in Wasser gequollenen Perlen mit einem Durchmesser von 30—200 μπι, wurde mit 200 ml 5 M NaOH, 50 ml Benzylchlorid und 1 g Natriumborhydrid versetzt Die Suspension wurde auf 800C erhitzt unter Umrühren und Rückflußkühlung. Nach 5 Stunden unterbrach man die Reaktion, überführte das Gelprodukt auf einen Saugtrichter und wusch mit Wasser, Äthylalkohol und Wasser.
Beispiel 2
Man versetzte 250 ml entwässertes, 6%iges, mit Epichlorhydrin quervernetztes Agarosegel mit 250 ml einer
5 M NaOH-Lösung, löste 20 g festes NaOH und setzte danach 60 ml Äthylbromid und 1 g NaBH4 zu.
Die Reaktion vollzog sich unter Stickstoff im Autoklav mit einer Dauer von 6 Stunden bei 80°C. Nach Abkühlung überführte man das Gel auf Filter und wusch mit Wasser, Alkohol und Wasser. Nach dem Trocknen quült das Gel in Äthanol auf, im Gegensatz zum ursprünglichen Agarosegel.
Beispiel 3
25 ml mit Epichlorhydrin quervernetztes und desulfatiertes 6%iges Agarosegel wurde mit 25 ml 5 M NaOH, 10 ml Allylbromid und 50 mg Natriumborhydrid vermischt Man hielt die Suspension 3 Stunden bei 80°C und Rückflußkühlung und überführte sie danach auf Filter, wusch sie mit Wasser, Äthylalkohol und letztlich Wasser.
6 g des Gels haben 1,2 ml einer Bromlösung mit 10 ml Br2/250 ml entfärbt Nach der Elementaranalyse enthielt das trockene Ge! 393% Br.
Beispiel 4
280 ml 6%iges Agarosegel wurden mit 100 ml 2 M NaOH-Lösung, 25 ml Epichlorhydrin und 0,5 g Natriumborhydrid versetzt und eine Stunde auf 500C erhitzt Danach wurden 25 mg 2,6-Dimethoxyphenol, 60 ml 2 M NaOH-Lösung zugesetzt und weiter erhitzt Nach 2 Stunden wurden weitere 14 ml Epichlorhydrin und 60 ml
2 M NaOH zugesetzt und nach nochmals 2 Stunden brach man die Reaktion ab. Das Gel wurde mit Äthylalkohol und Wasser gewaschen.
Hydrophobe Adsorbentien, die in gewisser Hinsicht an die erfindungsgemäßen Produkte erinnern, sind in der Literatur beschrieben worden. Die Kupplung zum Polymer nimmt dort allerdings einen anderen Verlauf. Beispielsweise sind aliphatische und aromatische Amine an Agarose, Sepharose®, gekuppelt worden. Derartige Adsorbentien zeigen bei normalen Ionenstärken hydrophobe Adsorption und sogar Entsalzungsadsorption, obwohl dies noch nicht vorgeführt worden ist, Zvi Er-el et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 49 (1972) 383, Yon, Biochemical Journal 126 (1972) 765. Diese Adsorbentien unterscheiden sich allerdings von den erfindungsgemäßen durch den Gehalt an ionenadsorbierenden Gruppen wie Imidocarbonat in der Querbindung und als Glied zu den hydrophoben Liganden, wodurch man einen gemischten Adsorptionseffekt erhält Außerdem lösen sich diese Gele in starkem Alkali auf.
Beispiel 5
50 g aus Wasser abfiltrierte Sepharose® 6B wurden in 50 ml 5 M NaOH mit einem Gehalt an 0,5 g NaBH4 in einem Reaktionsgefäß suspendiert (Sepharose® ist ein eingetragenes Warenzeichen für Agarosegel in Perlenform von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden). Man setzte der Suspension 12 ml Propylchlorid hinzu.
wonach man das Gemisch 5 Stunden bei 70°C reagieren ließ. Das Produkt wurde mit Wasser, Äthanol und Wasser auf neutrales pH gewaschen.
Beispiel 6
Man wiederholte Beispiel 5 mit 12,5 ml Butylbromid anstatt Propylchlorid und ließ das Gemisch 5 Stunden bei 95° C reagieren.
Beispiel 7
200 g mit 2,3-Dibrompropan-l-ol quervernetzte, desulfatierte Sepharose® 6B wurden in 200 ml 5 M NaOH, 1 g NaBH4 enthaltend, suspendiert. Der Suspension wurden 50 ml Hexylbromid zugesetzt und danach das Gemisch 35 Stunden bei 100aC umgesetzt. Man wusch das Produkt mit Wasser, Äthanol, Wasser. Nach der Reaktion nahm das Gel in Wasser ein Volumen von ca. 100 ml ein.
Beispiel 8
150 ml quervernetzte und desulfatierte Agarose in Form von sphärischen Perlen (45—250 μΐη groß), wurden in einem Rundkolben, in 150 ml 5 M NaOH, 1 g NaBH* enthaltend, suspendiert. 40 ml Vinylidenchlorid wurden der Suspension zugesetzt. Man ließ das Gemisch 4 Stunden bei +8O0C im Autoklaven und Stickgasatmosphäre reagieren. Das Gel wurde mit Wasser, Äthanol, Wasser gewaschen. Nach vollständiger Bromierung in CCl4 enthielt das Produkt 1,55% Br.
Beispiel 9
6 g des Gelproduktes nach Beispiel 3 wurde zunächst in Aceton gelöst und dann in eine Suspension in 20 ml Tetrachloräthan überführt. Man addierte Brom durch tropfenweisen Zusatz einer Lösung von 40 ml Bn pro 1000 ml Tetrachloräthan. 1,2 ml der Bromlösung wurden für die vollständige Addition zur Doppelbindung aufgebraucht, was durch das aussetzende Entfärben der Bromlösung beobachtet werden konnte. Gemäß der Elementaranalyse enthielt das trockene Gel 39,8 Gew.-% Brom.
Beispiel 10
Man löste 0,25 g NaBH4 in 50 ml 5 M NaOH. Dies wurde 50 g mit Epichlorhydrin quervernetzter, desulfatierter Sepharose® 6B in einem Rundkolben zugesetzt. Der Kolben wurde mit Rückflußkühlung ausgestattet und das Gemisch danach mit 12 ml Propylenoxyd 3 Stunden bei + 30° C und anschließend noch 2 Stunden bei + 65° C umgesetzt. Das Produkt wurde mit Wasser, Äthanol und Wasser gewaschen.
Beispiel 11
0,5 g NaBH4 wurde in 100 ml 5 M NaOH gelöst. 100 ml 5 M NaOH gelöst. 100 ml quervernetzte, desulfatierte Sepharose® 6B wurden in einem Rundkolben zugesetzt und in NaOH-Lösung suspendiert. 34 g 1-Chlormethylnaphthalen wurden zugesetzt, und das Gemisch 20 Stunden bei 95°C unter Rückfluß umgesetzt. Man wusch das Produkt mit Wasser, Alkohol, Dimethylsulfoxyd und Wasser. Nach der Reaktion nimmt das Gel in Wasser ein Volumen von 41 ml ein.
Beispiel 12
Aktivierung: 280 g Sepharose® 6B wurden in 100 ml 2 M NaOh, 0,5 g NaBH4 enthaltend, suspendiert Der Suspension wurden 28 ml Epichlorhydrin zugesetzt. Die Aktivierung wurde in einer Stunde bei +50° C vollzogen.
Kupplung: Unmittelbar anschließend an die Aktivierung wurden 25 g 2,6-Dimethoxyphenol und weitere 60 ml 2 M NaOH zugesetzt Nach weiteren 2 Stunden wurden 14 ml Epichlorhydrin und 60 ml 2 M NaOH zugesetzt, worauf man das Gemisch nochmals 2 Stunden reagieren ließ. Das Gel wurde auf Filter mit Wasser, Äthanol und Wasser gewaschen.
Beispiel 13
15 ml quervernetzte, desulfatierte Sepharose® 6B wurden 15 Stunden bei +60° C mit 15 ml 0,7 M NaOH und 1 g «-Chlor-p-NitrotoluoI umgesetzt Man wusch das gelbliche Produkt gründlich mit Wasser, Alkohol und Wasser. Das Produkt enthielt 0,42% Stickstoff.
Beispiel 14
50 ml quervernetzte, desulfatierte Sepharose® 6B wurden in 50 ml 5 M NaOH, 0,25 g NaBH4 enthaltend, suspendiert Man setzte das Gemisch mit 12 ml p-Chlorbenzylchlorid 5 Stunden bei +8O0C um. Dann wusch man das Gel mit Wasser, Äthylalkohol und Wasser. Die Elementaranalyse ergab 6,15% Chlor im Produkt Nach der Reaktion nahm das Gel in Wasser ein Volumen von 34 ml ein.
Beispiel 15
50 ml quervernetzte, desulfatierte Sepharose®6B wurden mit Pyridin auf Glasfiltertrichter gewaschen, bis das Wasser restlos aus dem Gel verdrängt war. Das Gel wurde in 50 ml Pyridin suspendiert und man setzte es 20 ml Benzoylchlorid zu. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei +650C umgesetzt, und danach mit Pyridin, Äthylalkohol und Wasser gewaschen. Das Volumen des Gels in Wasser betrug nach dem Benzoylieren etwa 20 ml.
Beispiel 16
ίο Beispiel 15 wurde wiederholt mit 20 ml 4-Chlorbenzoylchlorid anstelle von Benzoylchlorid. Nach der Umsetzung war das Gel in Wasser auf ein Volumen von 27 ml geschrumpft und enthielt 15,2% Chlor.
Beispiel 17
40 ml quervernetzte Sepharose® 6B wurden in Pyridin überführt, wonach man das Gel in 40 ml Pyridin suspendierte. Man setzte der Suspension 80 ml Essigsäureanhydrid zu und während des Abkühlens tropfenweise insgesamt 8 ml Acetylchlorid. Das Gemisch wurde daraufhin 2 Stunden bei +650C umgesetzt. Man wusch das Gel mit Pyridin, Äthanol und Wasser. Das acetylierte Gel war so geschrumpft, daß es in Wasser ein Volumen von 12 ml einnahm.
Beispiel 18
60 ml quervernetzte Sepharose® 6B wurden in Pyridin überführt und in 60 ml Buttersäureanhydrid suspendiert. Tropfenweise und unter Kühlung wurden 12 ml Buttersäurechlorid zugesetzt und das Gemisch dann 2 Stunden bei +650C umgesetzt. Man wusch mit Pyridin, Äthanol und Wasser. Nach der Substitution nahm das Gel 20 ml Wasser auf.
·'} Beispiel 19
300 ml 6%iges Agarosegel wurde via Aceton auf Filter so in Äthylendichlorid überführt, daß alles Wasser verdrängt wurde. Das Gemisch von Äthylendichlorid und Agarosegel wurde auf ein Endvolumen von 600 ml eingestellt. 6 ml 48%iges Bortrifluoridätherat wurden bei 25° C zugesetzt. Nach kräftigem Umrühren wurde mit 6 ml Oktylglycidäther aufgefüllt und man ließ die Reaktion 40 Minuten andauern. Man wusch das Gel mit 2 I Dichloräthan, 2 1 Aceton und anschließend mit 41 Wasser.
Beispiel 20
300 ml Sepharose® 5B wurden auf Filter via Aceton in Dichloräthan überführt, so daß das Wasser restlos verdrängt wurde. Das Gemisch von Agarosegel und Dichloräthan wurde auf ein Endvolumen von 600 ml gebracht. 10 ml 48%iges Bortrifluoridätherat wurden bei 250C zugesetzt Bei kräftigem Umrühren wurde mit einer Lösung von 8,3 g Phenylglycidäther in 100 ml Dichloräthan aufgefüllt Die Reaktion dauerte eine Stunde bei Zimmertemperatur. Nach Waschen des Gels mit Aceton entahm man eine Probe zwecks Trocknen im Vakuum. Die IR-Analyse dieser Probe zeigte, daß das Gel alkyliert war, da das Spektrum die für Phenylgruppen charakteristische Frequenzen aufwies.
Beispiel 21
10 ml 4%ige Agaroseperlen in Wassersuspension wurden via Aceton in 10 ml Dichloräthan überführt, analog dem Beispiel 19.0,2 ml 48%iges Bortrifluoridätherat in Äther wurden zugesetzt. Danach wurde 03 ml 1,2-Epoxy-3-Chlorpropan unter Umrühren zugegeben. Die Reaktion dauerte 40 Minuten. Danach wusch man die Gelsuspension wiederholt mit Aceton und trocknete sie daraufhin im Vakuum.
Bei der Analyse des Chlorgehaltes erhielt man 10,60% Cl, das einer Substitution von 0,68 M i-Chlor-2-Hydroxypropyl pro wiederkehrender Einheit (Galaktose) im Agarosepolymer entspricht.
Beispiel 22
300 ml mit Dibrompropanol quervernetztes, sedimentiertes, 6%iges Agarosegel wurden nach Behandlung mit Aceton in Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPTA) überführt, analog Beispiel 17. Das Endvolumen wurde auf 400 ml eingestellt und das Gemisch wurde mit 24 g einer ölsuspension des NaH versetzt Daraufhin wurde ein Gemisch von 17,5 g p-Nitrobenzylchlorid und 100 ml HMPTA zugesetzt Man erhitzte das Gemisch auf 50° C und ließ es unter Umrühren bei dieser Temperatur 2 Stunden reagieren. Nach wiederholtem Waschen mit Äthanol, Toluol und Aceton wurde das Gel von Aceton trockengesaugt und im Vakuum getrocknet Das getrocknete Gel enthielt 1,3% Stickstoff.
Beispiel 23
Sepharose® 4B wurde auf Filter zunächst mit Aceton, dann mit Dichloräthan behandelt 25 ml von diesem Gel wurden in 30 ml Dichloräthan suspendiert 0,5 ml 48%iges Bortrifluorätherat in Äther wurden zugesetzt und
mit 500 ml Dichloräthan und 500 ml Aceton und brachte es zum Versuchsbedingungen Konz. Ionenstärke des VJV, 5
24 13 362 ,was 0,344 M des Nitrophenyl-substitutienten pro wiederkehrender (M) hinzugegebenen Salzes
V1= 1,21 ml. (M)
Beispiel 24 10
I nach 5 Stunden 1,5 g in 7,5 ml Dichloräthan gelöster p-Nitrophenylglycidäther. Die Umsetzung erfolgte während 1 Einwirkung verschiedener Salze auf die Adsorptionskapazität der Benzyl-Sepharose 6B gemäß Beispiel 1. 3 4,5 9,9
I 40 Minuten bei 25°C. I 3 4,5 9,5
i Man wusch das erhaltene Gel auf Filter I Säulenabmessungen: 3 4,5 8,25 15
I Trocknen. Das Gelprodukt enthielt 2,10% N i Säulenlänge = 1,5 cm, Gesamtvolumen 3 4,5 8,0
Il Einheit (Galaktose) im Polymer ausmacht. I Puffer: I 0,05 M Tris-HCl-Puffer pH 7,5 mit Zusatz von Zusalzen gemäß nachstehender Tabelle. 3 4,5 6,9
I 3 4,5 4,4
3 4,5 5,15 20
1,5 4,5 5,8
1,5 4,5 12,0
1,5 4,5 14,5 25
1 Die Versuche wurden als Frontanalysen mit Cytochrom C in einer Konzentration von 1 mg/ml durchgeführt. 1 3 4,0
I Durchbruchvolumen der Front= Vc. 0,5 0,5 8,7
I Resultate: 3/2 6,5 18,3
I Salz 3/2 4,5 2,12
1 0,05 0 2,7
1 0,05 0 1,47
ι 35
I NaCl
1 KCI
1 KBr
$ KF
I LiCI 40 I
$ NH4Cl B
Ip NH4-Formiat I
,*; MgCi2
i CaCl2
? BaCI2
;; Na2SO4
j Na-Trichloracetat
5 NaCI/Glycin
f.; NaCl/N.N-Dimethylformamid
■' »Reiner Tris Puffer«
i 0,05 M Phosphatpuffer
Aus der Tabelle ist die Fähigkeit der verschiedenen Salze zur hydrophoben Entsalzung ersichtlich. Dies beweist zusätzlich die potentiellen Möglichkeiten der hydrophoben Entsalzungschromatographie, da durch die Wahl des Salzes die Wechselwirkung verschiedener Proteine mit dem Gel drastisch beeinflußt wird. Dies kann ausgenutzt werden, um die Separationsfähigkeit der Gele zu erhöhen.
Beispiel 25
Nachstehende Tabelle veranschaulicht Versuche, die mit der Frontanalyse von Cyt C nach Beispiel 24 ausgeführt wurden. Die Bedeutung von pH und Ionenstärke geht aus der Tabelle hervor. Die Kapazitätswerte bei den verschiedenen Bedingungen wurden mit Ve/V, angegeben. Bei pH 7 wurde 0,05 M Phosphatpuffer und bei pH 3 0,1 M Formiatpuffer verwendet Beispiel No. bezeichnet die Nummer des Beispiels, in dem das Herstellungsverfahren für das Gel angegeben wird.
I Beispiel Substituent Kapazität (V1SVO (pH 7,0) 0,92 Molarität 1,06 NaCl 0,73 (pH 3,0) 0,72
No. Molarität NaCl 3 0,95 0 1 3
0 1 1,1 0,88 2,2
I Kontrolle 1.4 2,3 18
1 (Agarose) 5,2 25
2 Äthyl 38
P 5 Propyl 0,82 40
3 Allyl
i 6 Butyl
7 Hexyl
5 1 Substituem 24 13 0,90 NaCl 362 Molarität 3 NaCI (pH 3,0)
14 1,12 1 0 6,2 1 3
(Fortsetzung) 13 Kapazität (V</VJ 1,6 20 55
Beispiel ίο 11 Benzyl Molarität 4,5 (pH 7,0) 40
Να 17 p-Chlorbenzyl 0 0,54 3 1,95 14 33
18 p-Nitrobenzyl 11,6 10 41,2
15 Methylnaphthyl 30 0,72 4,8 31 80
16 Acetyl 30 43
is 10 Butyryl 10,7 80
19 Benzoyl 0,72 51
20 p-Chlorbenzoyl 0,82
Hydroxypropyl 19
Oktylglycidäther 2,0
Phenylglycidäther
20 25 30 35 40 45 50
60 65
Beispiel 26
Quervernetzte benzylierte Agarose gemäß Beispiel 1 wurde in eine Säule mit Abmessungen 1,4 χ 8 cm gepackt. Man glich das Gel mit 0,1 M Formiatpuffer, 3 M NaCI enthaltend, aus. 11 Urinkonzentrat wurde auf pH 3,0 gebracht und durch die benzylierte Agarose gepumpt Beim Eluieren mit verschiedenen Lösungen erhielt man eine Separation in verschiedenen Fraktionen des im Urinkonzentrat vorhandenen Proteins.
Beispiel 27
Benzylierte Sepharose· gemäß Beispiel 1 wurde in eine Säule von 4,6 cm Länge auf 3,7 ml Volumen gepackt. Die Säule wurde ausgeglichen mit 0,0514 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,2, 5 M NaCl enthaltend. Danach wurde Molke in die Säule gepumpt, der 5 M NaQ zugesetzt wurde und deren pH auf 6,2 eingestellt worden war. Insgesamt pumpte man 75 ml ein. Danach wusch man die Säule mit den im Chromatogramm genannten Lösungen. Der Proteingehalt in den verschiedenen Fraktionen wurde mit der Folinmethode durch Messen der Lichtabsorbtion bei 750 nm gemessen.
Beispiel 28
2,1 ml Benzyl-Sepharose® 6B gemäß Beispiel 1 wurde in eine Chromatographiesäule zu einer Gelsäule von 2,6 cm Länge gepackt Man glich das Gel mit Acetatpuffer, pH 3,0, 0,35 M NaCl enthaltend, aus. In die Chromatographiesäule wurde eine Probe eines Rinder-Pankreas Extraktes eingeführt, gelöst in 200 ml 0,05 M Acetat/Salzsäure-Puffer pH 3,0, 035 M NaCl enthaltend. Man eluierte die Säule und sammelte verschiedene Fraktionen ein. Als Maß des Proteingehaltes derselben wurde die Absorbtion bei 280 nm gemessen. Die Elutionsgipfel wurden mit Elektrophorese im Polyacrylamidgel analysiert
Beispiel 29
Quervernetzte benzylierte Agarose gemäß Beispiel 1 wurde in ein 1,0 χ 19,6 cm Bett im 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 M NaCl enthaltend, gepackt Eine Frontchromatographie wurde nach Beispiel 28 durchgeführt, wobei man die Cytochromfront bei einem Effluentvolumen das 1,7 gesamte Bettvolumen entsprach, erhielt.
Man wusch das Bett mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,0, enthaltend 3 M Natriumchlorid, und eine 0,1 %ige Cytochrom-C-Lösung in dieser Salzlösung wurde wie oben auf das Bett eingeführt Die Cytochrom-C-Front brach bei einem Effluentvolumen, 83 des totalen Bettvolumens entsprechend, hindurch.
Beispiel 30
Das Benzylagarose-Bett gemäß Beispiel 29 wurde mit 0,1 M Natriumformiatpuffer, pH 3,0, gewaschen, wonach man ein Frontchromatogramm von 0,1% Cytochrom C in der Pufferlösung aufnahm. Man erhielt die Front bei etwa 13 Gesamtvolumen.
Danach wurde das Bett mit dem Formiatpuffer, der 3 M NaCl enthielt gewaschen und 0,1% Cytochrom in dieser Lösung wurde frontchromatographiert Man erhielt die Front bei etwa 18 Gesamtvolumen. Der Versuch beweist daß in der Pufferlösung eine gewisse Adsorption des Cytochrom C erhalten wurde, die Adsorption jedoch kräftig durch Zusatz von 3 M Natriumchlorid verstärkt wurde.
Beispiel 31
Das Bett in Beispiel 29 wurde mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,3 M NaCl enthaltend, gewaschen. Man verdünnte 10 ml dialysiertes Serum mit 40 ml Puffer/3 M NaCl und führte es auf das Bett ein, wobei man ein Frontchromatogramm erhielt Die Säule wurde mit 70 ml Puffer/3 M NaCl gewaschen, woraufhin man die Elution mit einem »negativen Salzgradient« von 3 M bis 0 M startete. Weiteres Material wurde in zwei Stufen eluiert:
24 13 3b2
1) mit 0,05 Phosphatpuffer pH 10,0 und
2) 0,01 M NaOH.
Die Absorption im Eluat wurde bei 280nm gemessen (Abb. 1). Von verschiedenen Teilen des Chromatogramms wurden Proben entnommen, s. Abbildung. Man dialysierte die Proben und untersuchte sie mit Gradi- 5 porelektrophorese. Dabei ging hervor, daß eine effektive Separation gewisser Serumkomponenten bereits mit dieser primitiven Chromatographie erhalten werden kann. Fraktion A enthält somit ^-Makroglobulixie and /?-Lipoprotein, Fraktion B und C enthalten außer Albumin diskrete Immunoglobulinkornponenten und Haptoglobulin, allerdings kommen zwischen diesen Fraktionen auch scharfe Kontraste vor, Ceruplasmin findet sich beispielsweise in C jedoch nicht in B. ι ο
Beispiel 32
Das Benzylätheragarosebett gemäß Beispiel 1 wurde mit 0,1 M Natriumformiatpuffer. pH 3,0,1 M Natriumchlorid enthaltend, gewaschen. 04 g Extrakt von braunen Bohnen (Phaseolus vulgaris), in 50 ml des Puffers 15 gelöst, wurde auf das Bett unter kontinuierlichem Messen der Transmission bei 254 nm, eingeführt Danach wusch man das Bett mit etwa 165 ml des Startpuffers, woraufhin ein Teil des Proteins mit Formiatpuffer ohne NaCl eluiert wurde. Eine unbedeutende Elution des Proteins erhielt man beim Waschen mit 0,025 M Phosphatpuffer pH 7,0, während bei der anschließenden Verdrängung mit 0,1 M NaOH eine ansehnliche Menge Substanz das Bett verließ. Die Messung von Hemagglutination und Trypsininhibitoraktivität zeigte, daß das zuerst 20 passierte Materia! keine derartige Aktivitäten enthielt. Man verteilte Lektin auf das Material an den Spitzen B und C, s. A b b. 2, mit der Hauptmenge auf Gipfel C. Trypsininhibitoren wurden nur in Gipfel B gefunden.
Beispiel 33
Das Produkt gemäß Beispiel 4 (2,6 Dimethoxyphenyl-Ätheragarose) wurde für Frontchromatogramm mit Cytocgrom C(I mg (ml)) nach Beispiel 5 in nachstehenden Lösungen verwendet. Säulenabmessungen: 0,5 χ 12,4 cm.
a) 0,05 M-Phosphatpuffer, pH = 7. Die Front war bei 0,7 Bettvolumen. 30
b) 0,1 M-Formiatpuffer, pH = 3,0/1 M NaCl. Man erhielt die Front bei 1,3 Bettvolumen.
c) 0,1 M-Formiatpuffer, pH = 3,0/1 M NaCl. Man erhielt die Front bei 5,0 Bettvolumen.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Gelprodukt auf Basis von Agarose, dadurch gekennzeichnet, daß an die Agarose neutrale nicht ionenbildende hydrophobe Gruppen Ober Ätherbindungen oder Esterbindungen kovalent gebunden
sind, wobei die hydrophoben Gruppen folgende Bedeutungen haben:
a) unsubstituierte, halogen- oder hydroxysubstituierte Reste der Formel
OH2n+1 — mit n= 1 —20;
b) Reste der Formel CnH2n-I — mit n= 1 —20;
c) Reste der Formel
X^C6H5-H,-, XmC6H5-XY-, X01C6H5-^CY-CZ-, XmC,0H7_m-, XnAoH7-^CY- oder XjnCioHy-mCY—CZ-,
wobei X H, CpH2p+1, vorzugsweise CH3 oder C2H5, OCpH2p+1, Halogen oder NO2 bedeutet,
Y und Z O oder H2 bedeutet, und
w eine ganze Zahl von 0 bis 5,
ρ eine ganze Zahl von 1 bis 10 sind;
d) oder Reste der Formel
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