SE445013B - Medel for att forebygga eller behandla infektioner hos menniskor och djur - Google Patents

Description

7905523-2: Uttrycket "infektioner" avses här att beteckna av mikro- organismer (såsom bakterier, virus, parasiter) direkt eller indirekt, t.ex. genom toxinbildning, förorsakade sjukdoms- 'tillStånd.

När den fysiologiskt fördragbara polymeren innehållande hydrofoba grupper är olöslig i vatten, är den dock med för- del svällbar i vatten. >Polymeren är baserad på polysackarider såsom dextran, agaros, cellulosa, stärkelse, xantan eller derivat av dessa. Lösliga produkter kan baseras på exempelvis dextran eller stärkelse och olösliga på exempelvis cellulosa. Vid olösliga produk- - ter kan polymeren även med speciell fördel ges formen av ett i vatten olösligt men svällbart tredimensionellt nätverk sammanhållet av bindningar av kovalent natur. Detta tredimen- sionella nätverk kanmed fördel vara erhållet genom tvär- bindning av polysackarider, exempelvis glukaner, såsom dextran, stärkelse, cellulosa, pollulan och postulan, galak- taner, såsom agaros, mannaner, arabinaner, xylaner osv., eller derivat av dessa, medelst bryggor med bidningar av, kovalent karaktär, varvid nätverket uppvisar hydrofila grup- per såsom hvdroxylgrupper.

Tvärbindningen till det praktiskt taget oändliga tredimen- sionella nätverket kan utföras genom att reagera polysacka- riderna, eller derivaten av dessa, med ett minst bifunktio~ nellt bryggbildningsmedel. 7För«erhållande av tvärbindandelbrvggor, som är bundna till polysackaridkedjorna över eterbindningàr, kan man reagera polysackariden eller polysackaridderivatet t,eà. i alkalisk vattenlösning med bryggbildningsmedel exempelvis av typen _ Y_. och X . Å , Z (II) . Z (I) 2 X . A1 där X, Y och Z vardera betecknar en haloqenatom, företrädesvis klor eller brom och A1 och A2 vardera betecknar en rak eller 790552342 grenad, med en eller flera hydroxylgrupper snbstituerad alifa- tisk, mättad kolvätekedja, som företrädesvis innehåller 3 ~ 20 kolatomer, t.ex. 3 - 10 kolatomer, och som eventuellt är bruten av en eller flera syreatomer, eller motsvarande ur föreningen (I) eller (II) genom avspjälkning av halogenväte erhâllbar epoxiförening. Som exempel på bifunktionella ämnen med formeln X . A1 . Z och motsvarande ur X . A1 .-Z genom avspjälkning av halogenväte erhâllbara epoxiföreningar må nämnas följande: Cdå 6/QH . CH2 . 0 . (CH2)n . O . CH2 . Cä\;/CH2 där n är ett heltal, exempelvis från 2 till 4, och Cdë\~/QH . CH2 . O . CH2 . CH2 . O . CH2 . CH2 . O. CH2 . 0 .

CH -/§n2 och \o en 3 ' . cnz -l/cn . cnz . o. cn . cnz . cnz . o . cn2 . cxi-'Enz o o och CH - cn . CH . o . CH -. cn ~ cn \2'O/ 2 2 \O/ 2 och _ cH2'-.cH . cnz . o . cnz . cmon) . cnz . o . cnz . cn - cnz 0/ ' \o/ eller motsvarande halogenhydriner, samt bifunktionella glyce- rolderivat av formeln X . C212 . CI-HOH) . CHZ . Z, t.ex. diklor- hydrin och dibromhydrin, eller motsvarande genom avspjälkning av halooenväte erhållbara epoxiföreningar av formeln CH2 - CH . CH2 . Z, t.ex. epiklorhydrin och epibromhydrin. \0/ Ett annat exempel på en dylik bifunktionell förening är 1,2 - 3,4-diepoxibutan med formeln CH2_- CH . CH -/pnz.

O trifunktionella bryggbildare, vilka utgörs av epoxiföreningar Exempel på svarande mot föreningar med formeln Y X . A2 . Z, är i7@@5s23+2 ¿4 CH - CH . CH 2/ 2.o.cH2.eH.cH2.o.cH2.cri-/c1¶2 o o ~ 'o éH.cH-cH 2 \0/2 Polysackariden eller polysackaridderivatet reageras med en sådan_mängd minst bifunktionellt bryggbildningsmaterial att en i vatten olöslig gel bildas, dvs. ett praktiskt taget oänd- 'ligt tredimensionellt nätverk, med de önskade egenskaperna.

Fackmannen kan genom förförsök lätt utpröva lämpliga inbör- des mängder för olika polysackarider och.polysackaridderivat oeh bryggbildningsmedel. Även-andra bryggbildningsmedel kan ifrâgakomma¿ Tvärbindningsreaktionen leder (förutom till bryggslagningen) ofta även till införande av enkelt.bundna substituenter (t. ek. monoetrar) från brygqbildningsmedlet, dvs. endast den ena reaktiva gruppen i det minst bifunktionella bryggbild~ _ningsmedlet har reagerat med en hydroxylgrupp i en polysacka- ridkedja under det att den (eller de) andra reaktiva gruppen , i bryggbildningsmedlet exempelvis i stället har reagerat med t.ex. vatten till bildning av t.ex. hydroxylgrupper osv. Den polymera produkten uppvisar därför oftast även enkelbundna substituenter härrörande från bryggbildningsmedlet; t.ex. -0 . CH2 . CH(OH) . CHZOH när bryggbildningsmedlet är epiklor- hydrin och -0 . CH2 - CH(OH) . CH2. O . (CHZX4 . O . CH2 .

CH(OH) . CHZOH när bryggbildningsmedlet är 1,4-butandiol- diglycideter.

Polymeren kan även_utgöras'av en kombination av två polymer- 'q material.

Till det polymera, olösliga eller lösliga grundskelettet är "hydrofoba grupper bundna, företrädesvis med bindningar av kø- valent natur. Antalet hydrofoba grupper och arten av dessa grupper anpassas så att önskad hydrofiobicitet och därmed önskad effekt på mikroorganismerna erhålles, varvid även hänsyn .--., ._......,......-... .._._ > _ ._.._,.. ..-..._-...._..-. . ._ _......._._.,...., .... 7905523-2 tages till antalet och arten av ev. närvarande hydrofila grupper. Sålunda är det möjligt att uppnå jämförbara effek- tre med exempelvis medel innehållande ett stort antal lägre alkylgrupper som hydrofob substituent som med medel uppvisan- de ett mindre antal högre alkylgrupper som hydrofob substi- tuent. Lämplig substitutionsgrad för varje substituent resp. kombination av substituenter kan i varje enskilt fall enkelt fastställas genom några enkla förförsök omfattande undersök- ning av bakteriers bindning till medel med varierande substi- tutionsgrad., De hydrofoba grupperna är placerade i grenar till polymerens grundskelett. Härvid kan grupperna vara bundna direkt till qrundskelettet med kol-kol-bindningar med kan även vara bund- na till detta över en bryggbildande länk, t.ex. en eter-, ester- eller amidbrygga eller med fördel över en längre brygg- bildande länk, varigenom de kommer att befinna sig på något avstånd från det polymera grundskelettet.

Som hydrofoba grupper väljes med fördel kolvätekedjor, vilka kan vara raka, grenade eller ringslutna, mättade eller omät- tade och vilka innehåller minst 6 kolatomer. Antalet kolato- mer kan vara högt¿ Av praktiska skäl väljes dock i allmänhet högst 30, t.ex. högst 20 kolatomer. Kolvätekedjorna kan even- tuellt även uppvisa hydrofoba substituenter såsom halogen- atomer, företrädesvis klor eller brom, eller alkoxigrupper med företrädesvis högst 4 kolatomer men kan även som substi- tuenter uppvisa en eller flera hydroxylgrupper eller andra hydrofila grupper, varvid placeringen och antalet av dessa dock väljes så, att den substituerade kolvätegruppens i huvud- sak bydrofoba karaktär ej går förlorad. Kolvätekedjorna kan eventuellt även vara brutna av en eller flera syre- eller svavelatomer. Med fördel väljes hydrofoba grupper innehållan- de minst 6, såsom minst 8, med enkel- eller dubbelbindningar förenade kolatomer, vilka endast bär väteatomer.

Exempel på hydrofoba grupper i det polymera materialet är i emfighet med det ovanstående grupper med den allmänna formeln 79nß52z~2 d *6 -(CHå)n . CH3, där n är ett heltal, som är minst 5. n kan vara ett stort tal men är i allmänhet högst 29, t.ex. högst 19l Alkylgruppen kan exempelvis med fördel vara oktyl eller dodekyl. Ytterligare exempel på hydrofoba grupper i uppfin- ningens anda är grenade alkylgrupper, cykloalkylgrupper, exem- pelvis cyklohexyl, cykloalkylalkylgrupper, fenyl, fenylalkyl- grupper, varvid ringarna i de cykliska grupperna eventuellt kan vara substituerade med en eller flera hydrofoba atomer eller grupper, t.ex. en halogenatom, såsom klor, eller en alkylengrupp eller en alkylgrupp, såsom metyl eller etyl, _eller en alkoxigrupp.

Exempel på bryggbildande länk mellan flfllhydrofoba gruppen och det polymera grundskelettet är följande: - O . CH2 . CH(OH) . CH2 - O - eller' - O . CH2 . CH(OH) . CH(OH) . CH2 . 0 - eller - O . CH2 . (CH(OH) . CH2 . O . CH2 . CH(OHT . CH2 . O - eller - O . CH2 . CH(OH) . CH2 . O(CH2)n1 . O . CH2 . CH(OH) . CH2.0 - där-n är ett heltal t.ex. 2 till 4, eller någon annan länk' med t.ex. minst 2 eller 3 eller flera kolatomer med sådan längd, att den hydrofoba gruppen kommer att befinna sig på ett sådant avstånd från det polymera grundskelettet, att mik- - roorganismer lätt kommer åt att binda sig till den hydrofoba gruppen.

Kopplingen av en hydrofob grupp R till en polymer av ovan an- givet slag, t.ex. en polysackarid eller tvärbunden polysacka- rid, kan ske medelst för dylika polymerer sedvanliga substi- _ tueringsreaktioner. Kopplingen av den hydrofoba gruppen R till det polymera grundskelettet via t.ex. en eter-, ester- eller amidbrygga kan sålunda genomföras med hjälp av konven- tionella företrings-, förestrings- resp. amideringsreaktioner.

Sålunda kan reaktiva derivat av R exempelvis reageras med hydroxylgrupper i polymeren. Ett fördelaktigt sätt är att reagera en förening R . X1, där X1 är en epoxíhaltig,substi- - O . CH . CH -/CH2, med t.ex. hydroxylgrupper _ \\ .. , O tuent, t.ex. 2 i polymeren.

I ',-. i _ 7965523-2 1 Man kan även exempelvis reagera en hydroxylgrupphaltig polymer och en förening ROH med en bifunktionell bryggbildare av den typ, som diskuterats ovan i samband med tvärbindning av poly- mermolekylerna. Vid införandet av substituenten R kan man även mellan denna och polymerkedjorna införa en längre bryggbil¥ dande länk. u .För att erhålla en ester- eller amidbunden substituent kan ekempelvis en förening Ra. CO . X2,'där X2 är'klor eller brom, reageras med en polymer innehållande hydroxylgrupper eller _amingrupper. R . CO - kan härvid exempelvis vara palmitoyl eller stearoyl. Étt stort antal polymerer av ovan nämnda typer innehållande hydrofoba rester är tidigare kända från exmepelvis brittiska patentskriften 1-527 502 som bärarmaterial vid immunkemiska gbestämningsmetoder att utgöras in vitro. Ett antal av dessa polymerer är även kommersiellt tillgängliga. Sålunda före- kommer på tvärbunden (med glyceroleterbryggor) agaros basera- de produkter med oktyl- resp. fenylgrupper som hydrofoba substituenter på markanden (0ctyl-Sepharose:)CL-4B resp; _Pbenyl-Sepharoséâ)CL-4B från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige). Härvid är oktyl- resp. fenylgrupperna bund- na till agarosskelettet över en glyceroleterbrygga._ Enligt en utföringsform kan polymeren innehålla jonbytande grupper, såsom karboxylgrupper och/eller aminogrupper. Denna 'utföringsform väljes, när man önskar att samma polymera mate- rial skall binda icke endast de patogena bakterierna utan även från dessa härrörande toxiner eller andra metaboliter.

Medlet enligt uppfinningen kan föreligga i fast form eller some suspension eller en lösning 1 vatten. 'Suspensionen eller lösningen kan ges fysiologiskt fördràgbart pH, jonstyrka och osmolalitet på i och för sig känt sätt. Härvid kan t.ex.

NaCl tillsättes. När medlet består av eller innehåller en fy- siologiskt fördragbar polymer kan denna föreligga som formade l merisation). gnalen.

-Vsnsszs-2 kifl 8%. stycken eller företrädesvis i partikelform. Formade stycken kan erhållas genom bulkpolymerisation och kan användas för ut- värtes bruk, exempelvis för behandling av sårskador såsom lbrännsår. Vattenolösliga polymerer för oral administrering ges partikelform antingen genom att polymerisat framställda i form av större stycken (genom bulkpolymerisation) desintegreras, t.ex. genom malning, eller genom direkt framställning i form av runda partiklar genom pärlpolymerisation (dispersionspoly- Genom frakticnering, t.ex. genom siktning, kan önskade partikelstorlekar utvinnas. Partikelstorleken kan exempelvis ligga inom gränserna 0,1 - 1000 }jsåsom 1 - 300)nn.

Enligt en annan aspekt av uppfinningen innehåller medlet enligt uppfinningen även en eller flera andra terapeutiskt ak- tiva substanser. Speciella fördelar uppnås'härvid, om som_ annan terapeutiskt aktiv substans användes-en sådan som dämpar tarmmotoriken, när medlet är avsett för infektioner i tarmka- Dbseringen av medlet enligt uppfinningen väljes beroende av infektionens_art och lókalisation så att en tillräcklig effekt uppnås. p Medlet enligt uppfinningen kan i olika former användas för att förebygga och behandla varierande.typer¿av infektioner såsom tarminfektioner, genitala infektioner, infektioner i ¿ munhåla och luftvägar och hudinfektioner. p __ "' ' _ När medlet enligt uppfiningen föreliggek ' form (företrädesvis i form av vattenolösliga partiklar)'är det lämpligt för att förebygga och behandla utvärtes infektioner och infektioner 1 kroppshåligheter med yttre utförselgângar, iqvattenolöslig speciellt mag-tarm-kanelen, Närfledlef êflliqt uppfinningen föreligger i vattenlöslig form kan .det förutom för ovannämnda användningsområden även användas parenteralt, varvid en i kroppen nedbrytningsbar eller utsönd- ringsbar fysiologiskt fördragbar polymer väljes. Exempel på dylikt användningsområde är vid urinvägsinfektioner, varvid polymeren direkt eller efter partiell nedbrytning i kroppen utsöndras med urinen och i urinvägarna utövar den önskade effekten. 9 1 7905523-2 Medlet enligt uppfinningen är speciellt lämpligt för att förebygga och behandla infektioner förorsakade av patogena mikroorganismer, som i sitt ytskikt har så kallade pili el- ler andra ytstrukturer, som uppvisar hvdrofob interaktion.

Ett viktigt användningsområde för medlet enligt uppfinningen är därför för förebyggande och behandling av diarrëer för- orsakade av endo- och/eller entero-toxinbildande patogena Escherichia coli stammar. Andra ekempel är patogena strep- -tokocker, som exempelvis förorsakar halsfluss, och patogena stafylokocker, som orsakar hud- och sårinfektioner.

Uppfinningen kommer i det följande att illustreras med ett antal utföringsexempel.

Exempel 1 Sex dagar gamla kaniner från samma kull behandlades med' en dos (109 st) enterotoxinbildande E. coli med CFA/1 pilus antigen. Hälften av kullen fick därutöver 5 ml av sedimen- terad partikelmassa av med palmitoylgrupper substituerad och med glyceroleterbryggor tvärbunden agaros. Substitutions- graden av palmitoylgrupper räknat per monosackaridenhet var 0,13. All behandling given per os. Efter 3 dagar isolerades djuren i tvâ timmar i separata burar. Vid en påföljande in- spektion befanns samliga fyra kaniner_som behandlats med bakterier plus gelpartiklar med hydrofoba grupper vara utan tecken på diarré. I motsats till detta befanns tre av de fyra djuren, som behandlats med enbart bakterier ha diarré, som tecken på tarminfektion.

Med palmitoylgrupper substituerad och med glyceroleterbryg- gor tvärbunden agaros framställdes på följande sätt: J Med glyceroleterbryggor tvärbunden agaros i pärlform (4 % agaros) med en partikelstorlek av 60 - 140f;m i svällt till- stånd (Sepharose CL-4B från Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sverige) fick sedimentera från vatten till att ge en gelvolym av 300 ml. Gelen överfördes till ett glasfilter 200 79oss23-2 ~ 0 10 och avvattnades genom tvättning med aceton och sedan 1,2- dikloretan (DCE) (omkring 1 l av vardera). Gelen späddes sedan med DCE till att ge en totalvolym av 450 ml. Pyridin _(4,8 ml) tillsattes följt av palmitoylklorid (17,7 ml) i «ncE'(9o ml) över 1 h. Efter omrörning i 2 h vid 6o°c tvät- tades gelen med DCE (ca 300 ml), aceton (ca 1 1) och slut- ligen vatten.

Substitutionsgraden av palmitoylgrupper räknat per mono- sackaridenhet var 0,13, Exempel 2 Humana tunntarmceller, isolerade från tarmhitar, inkubera- des med samma E. coli-bakterier som i exempel 1 i närvaro av och i frånvaro av samma hydrofoba gelpartiklar som i exempel 1 vid 20°C i 0,9-procentig NaCl-lösning i vatten.

Härvid inkuberades först 0,1 ml bakteriesuspension (ca 10 bakterier) med 0,1 ml av de hydrofoba gelpartiklarna i 10 8 min varefter tillsattes 0,1 ml cellsuspension (ca 105 celler).

Per cell fastnade mindre än 5 bakterier. I analogt kontroll- -försök ntan tillsats av de hydrofoha gelpartiklarna fastna- de per cell 30 - 60 bakterier.

Exempel 3 100 g dextran (fiå = 110 000) löstes i en blandning av 1 1 formamid och 0,5 l pyridin. 25 ml kaprylsyraanhydrid till- sattes och reaktionsblandnínqen omrördes över natten, Reak- 7 tionsprodukten utfälldes med etanol och återupplöstes i wvatten och utfälldes ånyo med etanol och torkades._102 g~ erhölls. Substitutionsgraden av CH3-(CH2)6-CO-O- grupper var 0,056 räknat per anhydroglukosenhet. g av denna substans och 9 g NaCl upplöstes i destíllerat vatten till en lösningsvolym av en liter. Lösningen steril- filtrerades och fylldes på sterila 100 ml flaskor, vilka sedan_förslutas sterilt, Lösningen är lämplig för utvärtes 11 7905525-2 bruk och för behandling av kroppshåligheter med yttre ut- förselgångar.

Exempel 4 Två sterila odlingskärl med vardera 50 ml “trypticase soy broth" (från Baltimore Laboratories, Cockesville, Maryland, USA) iordningställdes. Till det ena kärlet sattes dessutom 2 g (räknat som torrsbustans) av samma partiklar av med palmitoylgrupper substituerad och med glyceroleterbryggor tvärbunden agaros som i exempel 1. Båda kärlen ympades med 106 (viable count) Staphylococcus aureus, (stam Cowan I) bakterier, varefter inkuberades vid 3700 i 5 tim. I kontroll- odlingen utan tillsats av hydrofoba partiklar hade antalet bakterier nu ökat till 4 ~ 109. I odlingen med tillsats av de hydrofoba partiklarna hade antalet bakterier ej ökat, visande att dessa partiklar hämmade tillväxten. ' Exempel 5 Två sterila odlingskärl med vardera 50 ml "proteos-peptone broth" (från Difco, Detroit, Michigan, USA) iordningsställ- des.

Till det ena kärlet sattes dessutom 250 mg partiklar (räk- nat som torrsubstans) av med CH3-(CH2)7-O-CH2-CH(OH)-CH2-0- grupper substituerad och med glyceroleterbryggor tvärbunden agaros (Octyl-Sepharos CL-4B, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige. Substitutionsgrad: 0,2 mol hydrofob sub- stituent per mol galaktosenhet. Partikelstorlek i vatten- svälld form huvudsakligen inom intervallet 30 - 170/um.) Båda kärlen ympades med 105 (viable count) Streptococcus pyogenes (grupp A, typ 12 NY 5) bakterier, varefter inkube- rades vid 37°C i 5 tim. I kontrollodlingen utan tillsats av hydrofoba partiklar hade antalet bakterier nu ökat till 109.

I odlingen med tillsats av de hydrofoba partiklarna hade antalet bakterier ej ökat nämnvärt, visande att dessa par- tiklar hämmade tillväxten.

Claims (3)

?9ns523~2i PATENTKRAV

1. Medel för att förebygga eller behandla infektioner hos människor och djur, k ä n n e t e e k n a t a v att det består av eller såsom aktiv komponent innehåller en fysio- logiskt fördragbar, i vatten olöslig eller löslig polymer, vilken utgörs av en eventuellt tvärbunden polysackarjd, vilken innehåller i grenar till polvmerens grundskelett placerade hydrofoba grupper innehållande kolvätekedjor med minst 6 kol- atomer, varvid polymeren, när den är löslig,har tillräckligt hög molekylvikt för att ej lätt penetrera cellmembran.

2. Medel enligt krav 1, k'ä n n e t e c k n a t a v att det föreligger som i vatten olösliga partiklar med en par- tikelstorlek inom gränserna 0,1 - 1000/um. _

3. Medel enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k-- n a t a v att det även innehåller en terapeutiskt aktiv substans, som dämpar tarmmotoriken och att det är avsett för att förebygga eller behandla infektioner i tarmkanalen.