JPS58187859A - 血小板粘着能の測定方法 - Google Patents
血小板粘着能の測定方法Info
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- JPS58187859A JPS58187859A JP7080082A JP7080082A JPS58187859A JP S58187859 A JPS58187859 A JP S58187859A JP 7080082 A JP7080082 A JP 7080082A JP 7080082 A JP7080082 A JP 7080082A JP S58187859 A JPS58187859 A JP S58187859A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規で簡便迅速に行なえる血小板粘着能の測
定方法に関するものである。
定方法に関するものである。
血小板は毛細管機能を維持し、止血および凝血反応に不
可欠な要素の１つである。血管壁が傷害され血管内膜が
破れて、その下の 原線維（コラーゲン）が血流中に露
出すると、血小板はその部分に粘着し、さらに血小板相
互が凝集して血小板凝集塊を作り、出血を防止する。ま
た組織からトロンビンが浸出すると、これが凝集した血
小板に作用し、血小板は形態変化を起こして無構造とな
り、相互に融合する。この際、血小板は内在する血小板
第３因子やセトロニンなどを放出し、血漿中の内因性凝
血機序を進展せしめ、フィブリンを析出し、あるいは血
管を収縮させる。これにより血小板凝集塊はより強固と
なって凝固血栓となり、止血を完全なものにする。
可欠な要素の１つである。血管壁が傷害され血管内膜が
破れて、その下の 原線維（コラーゲン）が血流中に露
出すると、血小板はその部分に粘着し、さらに血小板相
互が凝集して血小板凝集塊を作り、出血を防止する。ま
た組織からトロンビンが浸出すると、これが凝集した血
小板に作用し、血小板は形態変化を起こして無構造とな
り、相互に融合する。この際、血小板は内在する血小板
第３因子やセトロニンなどを放出し、血漿中の内因性凝
血機序を進展せしめ、フィブリンを析出し、あるいは血
管を収縮させる。これにより血小板凝集塊はより強固と
なって凝固血栓となり、止血を完全なものにする。
このように血小板は止血において主要な役割を果してお
り、特に血小板粘着は止血機序における最初の重要な機
能である。したがって、血小板粘着能の臨床的＠義はｉ
ｌ（要であり、フオンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉ ｌ
１ｅｂｒａｎｄ ）病、血小板無力症、尿毒症、真性多
血症、原発性血小板面層、白血病などの骨髄増殖性疾患
、異常タンパク血症、全身性エリテマトーデスなどの
原理、原発性骨髄線維症、血小板貯蔵プール異常症など
の場合に血小板粘着能の低下が見られ、急性心筋梗塞、
甲伏線機能冗進症、糖尿病、血栓性静脈炎、脳血栓症な
どの場合に血小板粘着能の増加がみられる。
り、特に血小板粘着は止血機序における最初の重要な機
能である。したがって、血小板粘着能の臨床的＠義はｉ
ｌ（要であり、フオンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉ ｌ
１ｅｂｒａｎｄ ）病、血小板無力症、尿毒症、真性多
血症、原発性血小板面層、白血病などの骨髄増殖性疾患
、異常タンパク血症、全身性エリテマトーデスなどの
原理、原発性骨髄線維症、血小板貯蔵プール異常症など
の場合に血小板粘着能の低下が見られ、急性心筋梗塞、
甲伏線機能冗進症、糖尿病、血栓性静脈炎、脳血栓症な
どの場合に血小板粘着能の増加がみられる。
血小板粘着能の測定は、従来より種々な方法が考案され
ているが、これらは全て、血小板がガラスなどの異物面
に触れるとその表面に粘着するという性質を応用したも
のである。その原理は、ガラスピーズまたはガラスフィ
ルターを血液が通過する前後の血小板数の差から粘着率
を求めるものである。
ているが、これらは全て、血小板がガラスなどの異物面
に触れるとその表面に粘着するという性質を応用したも
のである。その原理は、ガラスピーズまたはガラスフィ
ルターを血液が通過する前後の血小板数の差から粘着率
を求めるものである。
ところが、血小板がガラス面に粘着するには、カルシウ
ムイオンや赤ｆｆ＋ｉ球からのアデノシン兄リン酸など
が必要であるが、血管の損傷部のコラーゲンに粘着する
にはこれらの物質は不要であり、両番は粘着の機構を異
にする。しかもカルシウムイオンやアデノシン２リン酸
は血小板の凝集を生起するので、ガラスピーズ層やガラ
スフィルターを血液が通過する際には、ガラス表面に血
小板が粘着するばかりでなく同時に凝集もみられ、凝集
した血小板も粘着したものとして計測されるので真に粘
着率を求めているとはいい難かった。そこで最近は、ガ
ラス表面への粘着を利用して測定した血小板粘着率を血
小板停滞率と呼ぶ傾向にある。
ムイオンや赤ｆｆ＋ｉ球からのアデノシン兄リン酸など
が必要であるが、血管の損傷部のコラーゲンに粘着する
にはこれらの物質は不要であり、両番は粘着の機構を異
にする。しかもカルシウムイオンやアデノシン２リン酸
は血小板の凝集を生起するので、ガラスピーズ層やガラ
スフィルターを血液が通過する際には、ガラス表面に血
小板が粘着するばかりでなく同時に凝集もみられ、凝集
した血小板も粘着したものとして計測されるので真に粘
着率を求めているとはいい難かった。そこで最近は、ガ
ラス表面への粘着を利用して測定した血小板粘着率を血
小板停滞率と呼ぶ傾向にある。
また、血小板ガラス表面に粘着するにはＬ記物質のほか
にフィブリノーゲン、フォンビルブラチンド病で欠如し
ているタンパク質が必要であり、更に血小板の荷電状態
やこれらを左右する血小板のシアル酸もガーラス表面へ
の粘着に関係するといわれている このように非生理的
物質であるガラスを血小板の粘着対象物に用いることが
従来の血小板粘着能の測定方法の大きな欠点である。
にフィブリノーゲン、フォンビルブラチンド病で欠如し
ているタンパク質が必要であり、更に血小板の荷電状態
やこれらを左右する血小板のシアル酸もガーラス表面へ
の粘着に関係するといわれている このように非生理的
物質であるガラスを血小板の粘着対象物に用いることが
従来の血小板粘着能の測定方法の大きな欠点である。
更に、ガラスピーズやガラスフィルターを用いる際に以
下の如く様々な問題がある。
下の如く様々な問題がある。
マス、カラスビーズを用いる方法（カラム法）の代表的
なものはザルラマン法（ＳＡＬＺＭＡＮ、 Ｅ、 Ｗ、
：へイｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＰｌａｔｅｌｅｔａ
ｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ、Ｊ、［、ａｂ。
なものはザルラマン法（ＳＡＬＺＭＡＮ、 Ｅ、 Ｗ、
：へイｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＰｌａｔｅｌｅｔａ
ｄｈｅｓｉｖｅｎｅｓｓ、Ｊ、［、ａｂ。
Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、６２ ニア２４−７３５．１９６０
）である。これは、直径０．４７ｗＡのガラス小５Ｊ
、１り（７３３０ｖＪ）を内径２９聰のプラスチック管
に封入し、骸骨の両端にシリコン処理したナイロン網を
はめこんで作成したカラム中に、抗凝血剤を加えた採血
液５〜６罰を一定の速度（６〜１’０＋＋ｙｌ／分）で
通過させて、対照血液とガラス小球接戦後の血液の血小
板数をカウントし、その差より血小板粘着率を求めてい
る。この方法は特殊な器具類を必要とし、血６にのガラ
ス小球カラムへの通過速度を一定にするのが困嬉である
（通過法ＩＷは血小板粘着率に大きく影響する）等の欠
点がある。
）である。これは、直径０．４７ｗＡのガラス小５Ｊ
、１り（７３３０ｖＪ）を内径２９聰のプラスチック管
に封入し、骸骨の両端にシリコン処理したナイロン網を
はめこんで作成したカラム中に、抗凝血剤を加えた採血
液５〜６罰を一定の速度（６〜１’０＋＋ｙｌ／分）で
通過させて、対照血液とガラス小球接戦後の血液の血小
板数をカウントし、その差より血小板粘着率を求めてい
る。この方法は特殊な器具類を必要とし、血６にのガラ
ス小球カラムへの通過速度を一定にするのが困嬉である
（通過法ＩＷは血小板粘着率に大きく影響する）等の欠
点がある。
ガラスフィルターを用いる方法の代表的なものはＩＩＩ
中法（［ロ中隆−：血小（反機能に関する研究、特に血
小板ＦＳ ｉ’ｉ＠について、口面会誌、２０ ： ２
７０〜２８２、１９５７）である。、この方法はまず内
壁をシリコ。
中法（［ロ中隆−：血小（反機能に関する研究、特に血
小板ＦＳ ｉ’ｉ＠について、口面会誌、２０ ： ２
７０〜２８２、１９５７）である。、この方法はまず内
壁をシリコ。
ンｂｆ、 （Ｉｉ した試験管にクエン酸ナトリウムと
採血液３．０ｍｅを入れ、屍Ｋｋの（１１小板数をカウ
ントする。次に、あらかじめ濃水酸化ナトリウム、クロ
ム硫酸波で処理し、蒸留水で洗って乾燥したガラスフィ
ルター（か１騙板の厚さ３０店、直径３５ｍ＋、目の荒
さ１号）にて残りのｌ１１７！液をｌ）ｉ過し、ｉｔｉ
液を内壁をシリコ４ン塗布した別の試験管で受ける。最
後にｐ液の血小板数をカウントし、Ｉ／ｌｊ過前血手前
血小板数後血小板数の差より血小板粘着率を求める。こ
の方法も特殊な用具を必要とし、かっ血液のガラスフィ
ルター通過時間が一定せず、フィルターが古くなるとｄ
手暗間が極めて長くかかるなどの欠点がある。
採血液３．０ｍｅを入れ、屍Ｋｋの（１１小板数をカウ
ントする。次に、あらかじめ濃水酸化ナトリウム、クロ
ム硫酸波で処理し、蒸留水で洗って乾燥したガラスフィ
ルター（か１騙板の厚さ３０店、直径３５ｍ＋、目の荒
さ１号）にて残りのｌ１１７！液をｌ）ｉ過し、ｉｔｉ
液を内壁をシリコ４ン塗布した別の試験管で受ける。最
後にｐ液の血小板数をカウントし、Ｉ／ｌｊ過前血手前
血小板数後血小板数の差より血小板粘着率を求める。こ
の方法も特殊な用具を必要とし、かっ血液のガラスフィ
ルター通過時間が一定せず、フィルターが古くなるとｄ
手暗間が極めて長くかかるなどの欠点がある。
上述したようなこれらの方法における最大の問題点を是
正するために非生理的物質であるガラスを用いず、コラ
ーゲンを用いる方法がベンスーザンら（Ｌ、 Ｂｒａｓ
ｓ、０． Ｆａｉｌｅ ａｎｄ Ｈ，Ｂ、 Ｂｅｎ５ｕ
ｓａｎ ：１）ｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｃｏｌｌａｇｅｎｉ
ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎｃｏ Ｉ ｌａｇｅｎ
／ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ、 Ｊ、 Ｌａｂ、 ＣＩ ｉ
ｎ、 Ｍｅｄ、 ５２５．１９７６）および積出ら（斉
藤佑尚、今田光昭、稲口ＪＯ，二：血小板の粘着と凝集
、タンパク質核酸酵素ｖｎ１２４１４９７．１９７９
）により試みられている。これらの方法はコラーゲン／
セファローズビーズを封入したカラムを用いているため
、道具および操作上の問題点は従来の方法と同じであり
、カラムへの血液のつまり等の問題もある。またペンス
ーザンらの方法は放射性同位元４；（”Ｃ，）を用いる
問題点を有している。したがってこれらの欠点のため、
両方法とも日常の臨床検査への応用は全く試みられてい
ない。
正するために非生理的物質であるガラスを用いず、コラ
ーゲンを用いる方法がベンスーザンら（Ｌ、 Ｂｒａｓ
ｓ、０． Ｆａｉｌｅ ａｎｄ Ｈ，Ｂ、 Ｂｅｎ５ｕ
ｓａｎ ：１）ｉｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｃｏｌｌａｇｅｎｉ
ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｙ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｎｃｏ Ｉ ｌａｇｅｎ
／ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ、 Ｊ、 Ｌａｂ、 ＣＩ ｉ
ｎ、 Ｍｅｄ、 ５２５．１９７６）および積出ら（斉
藤佑尚、今田光昭、稲口ＪＯ，二：血小板の粘着と凝集
、タンパク質核酸酵素ｖｎ１２４１４９７．１９７９
）により試みられている。これらの方法はコラーゲン／
セファローズビーズを封入したカラムを用いているため
、道具および操作上の問題点は従来の方法と同じであり
、カラムへの血液のつまり等の問題もある。またペンス
ーザンらの方法は放射性同位元４；（”Ｃ，）を用いる
問題点を有している。したがってこれらの欠点のため、
両方法とも日常の臨床検査への応用は全く試みられてい
ない。
Ｉ−述の如く状況にかんがみ、本発明は血管壁のｇｒ：
、’ Ｉｔ；ｊ線維であるコラーゲンを用いて未熟練者
でも容鴇て確実迅速、「Ｌつ特別な用具を用いずに実施
できる血小板粘着能の測定法を提供することを目的とす
る。
、’ Ｉｔ；ｊ線維であるコラーゲンを用いて未熟練者
でも容鴇て確実迅速、「Ｌつ特別な用具を用いずに実施
できる血小板粘着能の測定法を提供することを目的とす
る。
この目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を重
ねた結果、多糖類から作られたビーズ状ゲルにコラーゲ
ンを固定化して作製された担体を血液試料（全血または
多血小板血漿）と混和させて、この担体に試料中の血小
板を粘着させ、粘着しなかった血小板量ともとの試料中
の血小板量を夫々計測して両者の差を求め、血小板粘着
能を測定する方法を見い出した。
ねた結果、多糖類から作られたビーズ状ゲルにコラーゲ
ンを固定化して作製された担体を血液試料（全血または
多血小板血漿）と混和させて、この担体に試料中の血小
板を粘着させ、粘着しなかった血小板量ともとの試料中
の血小板量を夫々計測して両者の差を求め、血小板粘着
能を測定する方法を見い出した。
この方法によれば従来技術の欠点であるカラムを用いる
ことなしに生体内の生理状況を正確に反映しうるコラー
ゲンへの血小板粘着能を測定することが可能である。ま
た、本発明による方法においては試料が多血小板血漿の
場合、血小板数の計測が血小板計数器によらなくても多
血小板血漿の光透過度又は吸光度を測定するだけでよく
、熟練した技術行が特殊な器具を用いて採血し史に高価
で取扱が困難な精密機器（血小板カウンター）を用いて
血小板計数を行なうことも不要になる。
ことなしに生体内の生理状況を正確に反映しうるコラー
ゲンへの血小板粘着能を測定することが可能である。ま
た、本発明による方法においては試料が多血小板血漿の
場合、血小板数の計測が血小板計数器によらなくても多
血小板血漿の光透過度又は吸光度を測定するだけでよく
、熟練した技術行が特殊な器具を用いて採血し史に高価
で取扱が困難な精密機器（血小板カウンター）を用いて
血小板計数を行なうことも不要になる。
さらに、血液試料（全血又は多血小板血漿）にキレート
剤を加えてカルシウムイオンを捕集すると血小板の凝集
が抑えられて正確に血小板粘着能が測定できることを見
い出した。したがって、本発明の方法を用いれば特殊な
装置や器具を用いずに誰でもが迅速、簡易、且つ正確に
しかも微鍬の試料を用いて血小板粘着能を測定すること
がｏＪ能となり、従来技術の諸欠点を完全に是正するこ
とができる。
剤を加えてカルシウムイオンを捕集すると血小板の凝集
が抑えられて正確に血小板粘着能が測定できることを見
い出した。したがって、本発明の方法を用いれば特殊な
装置や器具を用いずに誰でもが迅速、簡易、且つ正確に
しかも微鍬の試料を用いて血小板粘着能を測定すること
がｏＪ能となり、従来技術の諸欠点を完全に是正するこ
とができる。
以下、本発明の測定″１′Ｊ（理および測定力ｒＬにつ
いて詳しく説明する。【１１１小板は多糖類に対してほ
とんど粘着を起こさないので、多糖類ゲル表面によく知
られているタンパク質類の固定化技術を用いてコラーゲ
ンを固定化するへ血小板は血管損傷部のコラーゲンに対
して粘着を示すので、同様な粘着が多糖類ゲル表面に固
定化したコラーゲンに対して生じる。つまり、例えば緩
衝液中１と浮遊させたコラーゲン固定化多ｉＩｌ！ｉ類
ゲル中に血液試４を添加し混和すると、数分以内に血小
板粘着が完了する。次にこの反応糸を静置すると血小板
を粘着したコラーゲン固定化多糖類ゲルは沈降し、上１
−の血液試料中に含まれる粘着しなかった血小板量を計
測し、もとの反応前の血液試料中の血小板量も計測し、
以下の式にて皿小板粘着率％を求める。
いて詳しく説明する。【１１１小板は多糖類に対してほ
とんど粘着を起こさないので、多糖類ゲル表面によく知
られているタンパク質類の固定化技術を用いてコラーゲ
ンを固定化するへ血小板は血管損傷部のコラーゲンに対
して粘着を示すので、同様な粘着が多糖類ゲル表面に固
定化したコラーゲンに対して生じる。つまり、例えば緩
衝液中１と浮遊させたコラーゲン固定化多ｉＩｌ！ｉ類
ゲル中に血液試４を添加し混和すると、数分以内に血小
板粘着が完了する。次にこの反応糸を静置すると血小板
を粘着したコラーゲン固定化多糖類ゲルは沈降し、上１
−の血液試料中に含まれる粘着しなかった血小板量を計
測し、もとの反応前の血液試料中の血小板量も計測し、
以下の式にて皿小板粘着率％を求める。
このとき血小板の１（Ｊ４を抑えるため反応液にカルシ
ウムイオンを捕集するためのキレートｎすを１１１１え
ておくとより正確な粘着率の測定が口Ｊ能である５、ま
た、試料を多血小板血漿にすると、血つ中の血小板数は
吸光度に比例するので粘着沈降後の）二澄および反応前
の血漿の吸光度を６ｔｌ定するたけで血小板量を測定す
ることが可能であり、より簡使に粘着率を測定すること
ができる。
ウムイオンを捕集するためのキレートｎすを１１１１え
ておくとより正確な粘着率の測定が口Ｊ能である５、ま
た、試料を多血小板血漿にすると、血つ中の血小板数は
吸光度に比例するので粘着沈降後の）二澄および反応前
の血漿の吸光度を６ｔｌ定するたけで血小板量を測定す
ることが可能であり、より簡使に粘着率を測定すること
ができる。
本発明の方法において使用される材１は、多糖類ゲル、
コラーゲン、キレート剤、レー山液である。
コラーゲン、キレート剤、レー山液である。
多糖類モでニブ苓丹ゲルはセルローズ、アガロース、テ
キストランを原料としたものが好適であり、具体的には
セファデックス、セファアクリル、セファロース（いず
れもファルマシアファインケミカル社の商品名）などが
挙げられる。コラーゲンは牛、馬、ウサギ等の動物の皮
値、血管、麿などより抽出されたものであれば（ｇＪで
もよく、またメチル化やサクシニル化等の化学修飾した
ものでもよいが、好適な例として牛又は馬の軒より抽出
したコラーゲンが挙げられる。次にキレ−トｉすとして
は、試料中のカルシウムイオンを捕集するものであれば
伺んでもよく、好適な例と（て）、１ｌＴＡｉ工チレン
ジアミン四酢酸）やＥＧＴＡ Ｃエチレングリコールビ
ス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、 Ｎ。
キストランを原料としたものが好適であり、具体的には
セファデックス、セファアクリル、セファロース（いず
れもファルマシアファインケミカル社の商品名）などが
挙げられる。コラーゲンは牛、馬、ウサギ等の動物の皮
値、血管、麿などより抽出されたものであれば（ｇＪで
もよく、またメチル化やサクシニル化等の化学修飾した
ものでもよいが、好適な例として牛又は馬の軒より抽出
したコラーゲンが挙げられる。次にキレ−トｉすとして
は、試料中のカルシウムイオンを捕集するものであれば
伺んでもよく、好適な例と（て）、１ｌＴＡｉ工チレン
ジアミン四酢酸）やＥＧＴＡ Ｃエチレングリコールビ
ス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、 Ｎ。
Ｎ、Ｎ−四酢酸〕が挙げられる。これらキレート剤は血
液の抗凝固作用をもっているので、試料採取において坑
凝固剤として兼用するこきができる。
液の抗凝固作用をもっているので、試料採取において坑
凝固剤として兼用するこきができる。
緩衝剤は、コラーゲン゛司定化多糖類Ｈゲルを浮遊させ
るもので場合によってはキレート剤の溶媒としても作用
するが不可欠のものではない。
るもので場合によってはキレート剤の溶媒としても作用
するが不可欠のものではない。
例えば％［水や生理食塩水を用いてもよいが、血小板粘
着反応のＰｆ（条件を一定にし、血小板が形態異常を８
さないようにするために中性の等張緩衝剤を用いるのが
好ましく、具体的な例としてＰＨ７付近のトリス緩衝液
が挙げられる。
着反応のＰｆ（条件を一定にし、血小板が形態異常を８
さないようにするために中性の等張緩衝剤を用いるのが
好ましく、具体的な例としてＰＨ７付近のトリス緩衝液
が挙げられる。
本発明の方法における多糖類ゲルへのコラーゲンの固定
化法は、一般に用いられる酵素や抗体などのタンパク質
の固定化法のいずれでもかまわないが共有結合法と呼ば
れる方法がよく、持にエフセンら（Ｒ，Ａｘｅｎ、 Ｊ
、 ｐｏｒａｔｈ ａｎｄ Ｓ、 Ｅｒｕｂａｃｋ、
Ｎａｔｕｒｅ。
化法は、一般に用いられる酵素や抗体などのタンパク質
の固定化法のいずれでもかまわないが共有結合法と呼ば
れる方法がよく、持にエフセンら（Ｒ，Ａｘｅｎ、 Ｊ
、 ｐｏｒａｔｈ ａｎｄ Ｓ、 Ｅｒｕｂａｃｋ、
Ｎａｔｕｒｅ。
２１４ ： １３０２．１９６７ ）によって開発され
た臭化シアンで多糖類を活性化する方法が、非常に緩和
な条件下にコラーゲンとの結合反応を起こさせることが
できるため好適である。
た臭化シアンで多糖類を活性化する方法が、非常に緩和
な条件下にコラーゲンとの結合反応を起こさせることが
できるため好適である。
次に本発明による測定法の好適な条件等について詳述す
る。多糖類ゲルはビーズ状のものが好ましく、その径は
１０〜１０００ ／／ ｍがよく生前１こ３０−２ｆＸ
） ／７ ｍのものが最必である。固定化されたコラー
ゲンの菫は、多糖類ゲル１２当り０．０５〜１００〜の
範囲で使用が可能であるが、特に０１〜（）５町がよい
。緩衝液中に浮遊させるコラーゲン固定化多糖類ゲルは
、緩衝液１ ｍｌ当り５ ｍｇ〜２５〜が好適である。
る。多糖類ゲルはビーズ状のものが好ましく、その径は
１０〜１０００ ／／ ｍがよく生前１こ３０−２ｆＸ
） ／７ ｍのものが最必である。固定化されたコラー
ゲンの菫は、多糖類ゲル１２当り０．０５〜１００〜の
範囲で使用が可能であるが、特に０１〜（）５町がよい
。緩衝液中に浮遊させるコラーゲン固定化多糖類ゲルは
、緩衝液１ ｍｌ当り５ ｍｇ〜２５〜が好適である。
測定に際しては細長いプラスチック容器またはシリコン
塗布ガラス容器に、コラーゲン固定化多糖類ビーズ状ゲ
ルの緩衝液中ｔ！メ遊Ｐ２１．（ａ）と血肢試＊１わ）
を入れ、マグネチックスターラので１〜３分間ｒｅ拌す
る。（ａ）対（ｂ）の比率は試料が全面の場合、１８対
０１〜０５容、多血小板血漿の場合１容対０．０５〜０
２容程度が好適である。
塗布ガラス容器に、コラーゲン固定化多糖類ビーズ状ゲ
ルの緩衝液中ｔ！メ遊Ｐ２１．（ａ）と血肢試＊１わ）
を入れ、マグネチックスターラので１〜３分間ｒｅ拌す
る。（ａ）対（ｂ）の比率は試料が全面の場合、１８対
０１〜０５容、多血小板血漿の場合１容対０．０５〜０
２容程度が好適である。
陳拌後しばらく静置して、上澄液中の血小板粘着しなか
った血小板）を計数し、同様にもとの血液試料中の血小
板も計数し血小板粘着率を算出Ｊる。血小板の計数は用
手法または血小板カウンターをＩ］いて行なう。
った血小板）を計数し、同様にもとの血液試料中の血小
板も計数し血小板粘着率を算出Ｊる。血小板の計数は用
手法または血小板カウンターをＩ］いて行なう。
一方、試料が多血小板血漿の場合光学的測定が可能であ
る。例えば＋’＋ｉｌ記上澄液の吸光度Ａ＋と、もとの
多血小板血漿を前記（ａ）から膨潤したコラーゲン固定
化多糖類ビーズ状ゲルの体積を除いた分啜の１２ Ｖｍ
液で希釈したものの吸光度Ａ□を夫々測定し、次式によ
って血小板粘着率を求める。
る。例えば＋’＋ｉｌ記上澄液の吸光度Ａ＋と、もとの
多血小板血漿を前記（ａ）から膨潤したコラーゲン固定
化多糖類ビーズ状ゲルの体積を除いた分啜の１２ Ｖｍ
液で希釈したものの吸光度Ａ□を夫々測定し、次式によ
って血小板粘着率を求める。
これは本発明各の実験の結果得られた「血小板数と吸光
度がｉｆｆｆｆ比的比例関係る」という事を利用したも
のである（第１図参照）。ただ血漿中の血小板数は同一
人の場合血漿の吸光度と一定の比例関係が成立するが、
その比例関係は若干個人差が認められる。しかし本発明
においては血漿の吸光度Ａ１、んが同一人のものを用い
て測定するので、【二記血小板粘着率の測定に対しては
Ｌ記問題は誤差装置とはならない。
度がｉｆｆｆｆ比的比例関係る」という事を利用したも
のである（第１図参照）。ただ血漿中の血小板数は同一
人の場合血漿の吸光度と一定の比例関係が成立するが、
その比例関係は若干個人差が認められる。しかし本発明
においては血漿の吸光度Ａ１、んが同一人のものを用い
て測定するので、【二記血小板粘着率の測定に対しては
Ｌ記問題は誤差装置とはならない。
次に本発明を実施例により史に詳しく説明するが、これ
ら実施例によって本発明の技術的範囲は何ら制限される
ものではない。
ら実施例によって本発明の技術的範囲は何ら制限される
ものではない。
実施例１ コラーゲンの固定化
（材料）
コラーゲン：牛の鍵より抽出したコラーゲンの酢酸酸性
ｌｉｔ！濁液（１００μ？ ／＊ｌ ）多糖類Ｈゲル：
セファロース４Ｂ（ファルマシアファインケミカルルズ
社製、アガロースを主１戊分とする６０〜１４０７１ｍ
の径を何すビーズ状ゲル） その他：市販の特級試薬 （固定化） セファロース４Ｂを精製水でよく洗い、その２０１（セ
ファロースの実質重ｆｉ ７５０ ｍのを承り、４θ戻
化シアン水溶液１５０＋＋Ｊに加え、室温でかきＵぜな
がらｌ規定水酸化ナトリウムをＰＨＩＩに達するまでビ
ユレットで加える。ｌ規定水酸化ナトリウムの消費が止
った時を終点とする。この反応液をガラスフィルターで
υ１過し、精製水１００ｍ１で５ ［ｉ！ｌ、ＰＨ８５
炭酸１１ ｉｔｊ液で２回洗い活ｔ＋化セファ【」 −
スをしＩた。
ｌｉｔ！濁液（１００μ？ ／＊ｌ ）多糖類Ｈゲル：
セファロース４Ｂ（ファルマシアファインケミカルルズ
社製、アガロースを主１戊分とする６０〜１４０７１ｍ
の径を何すビーズ状ゲル） その他：市販の特級試薬 （固定化） セファロース４Ｂを精製水でよく洗い、その２０１（セ
ファロースの実質重ｆｉ ７５０ ｍのを承り、４θ戻
化シアン水溶液１５０＋＋Ｊに加え、室温でかきＵぜな
がらｌ規定水酸化ナトリウムをＰＨＩＩに達するまでビ
ユレットで加える。ｌ規定水酸化ナトリウムの消費が止
った時を終点とする。この反応液をガラスフィルターで
υ１過し、精製水１００ｍ１で５ ［ｉ！ｌ、ＰＨ８５
炭酸１１ ｉｔｊ液で２回洗い活ｔ＋化セファ【」 −
スをしＩた。
冷却したＰＨ８，５炭酸鞍＃Ｊ液６０ｒｒｔｌに冷却し
たコラーゲンＩＱ ＠Ｈ１００／７ ？ ／ｍｌの４０
ｄをビユレットでゆっくり加える。この故に１）［１
述の活性化セファロースをすべて加え、氷水中で６時間
、さらに室温に戻し１６時間おだやかにかきまぜて反し
ｉ；させた。
たコラーゲンＩＱ ＠Ｈ１００／７ ？ ／ｍｌの４０
ｄをビユレットでゆっくり加える。この故に１）［１
述の活性化セファロースをすべて加え、氷水中で６時間
、さらに室温に戻し１６時間おだやかにかきまぜて反し
ｉ；させた。
反応況合物をガラスフィルターで１過し、ＰＨ８，５炭
酸緩衝液１００ｍ／！で５回洗い、この緩衝液中で冷ｒ
！１７に保存し、使用前にＰＩＩ ７．４ ト！Ｊス援
衛液でよく洗う。これでコラーゲン：セファロースカ約
２＝７５０（重敏比）のコラーゲン固定化セファロース
が約７５０ｆｆ＋４得られた。
酸緩衝液１００ｍ／！で５回洗い、この緩衝液中で冷ｒ
！１７に保存し、使用前にＰＩＩ ７．４ ト！Ｊス援
衛液でよく洗う。これでコラーゲン：セファロースカ約
２＝７５０（重敏比）のコラーゲン固定化セファロース
が約７５０ｆｆ＋４得られた。
実施例２ 試料が全面の場合の測定
（材料）
コラーゲン固定化セファロース／緩衝Ｍ ：コラー／７
’ン固定化セファロース（コラーゲン：セファロース＝
２ ： ７５０ ） １２５ｍ１をＰＨ７，４）リス
ｍｉ液（３，３ｍＭ−Ｅ ＤＴＡ含有）１．ｏｍｇに浮
遊させたもの、試料二全血９容に６０ｍＭ ＥＤＴＡ１
容を混和したもの、。
’ン固定化セファロース（コラーゲン：セファロース＝
２ ： ７５０ ） １２５ｍ１をＰＨ７，４）リス
ｍｉ液（３，３ｍＭ−Ｅ ＤＴＡ含有）１．ｏｍｇに浮
遊させたもの、試料二全血９容に６０ｍＭ ＥＤＴＡ１
容を混和したもの、。
（測定操作）
平底の１２メプラスチツク製容器にコラーゲン固定化セ
ファロ−スフ５０ｐｅ、および試料２５０７１Ｊを加え
、マグネチツクスターラで２分間撹拌した後、コラーゲ
ン固定化セファロースを０１過し、ｉ７ｊＭをよく振り
まぜ、東亜医用電子株製ＰＬ−１００型血小板カウンタ
ーで血小板数を計数した。
ファロ−スフ５０ｐｅ、および試料２５０７１Ｊを加え
、マグネチツクスターラで２分間撹拌した後、コラーゲ
ン固定化セファロースを０１過し、ｉ７ｊＭをよく振り
まぜ、東亜医用電子株製ＰＬ−１００型血小板カウンタ
ーで血小板数を計数した。
試料２ＳＯｐｌを５００７ｚｌ！（コラーゲンｆｉ’、
ｌ定化セファロース／緩衝液７５０μｇからに潤したコ
ラーゲン＋、！！＋定化／セファロース２５０μｅを引
いた容量）の緩叫６シで希釈した液の血小板数を同様に
して計数し、両者の１直から血小板粘着率を儲出した。
ｌ定化セファロース／緩衝液７５０μｇからに潤したコ
ラーゲン＋、！！＋定化／セファロース２５０μｅを引
いた容量）の緩叫６シで希釈した液の血小板数を同様に
して計数し、両者の１直から血小板粘着率を儲出した。
（多重測定精度）
この測定法で同一試料同時多重測定（ｎ＝１５）を行っ
たところ、平均値４５．Ｉ Ｌ）０、ｗｍ偏差２．５３
’／／、変動係数５．６１％であり、良好な再現乞が
認められた。
たところ、平均値４５．Ｉ Ｌ）０、ｗｍ偏差２．５３
’／／、変動係数５．６１％であり、良好な再現乞が
認められた。
実施例３ 試料が多血小板血漿の場合の測定（材料）
コラーゲン固定化セファロース／？１２ＬＭ：コラーゲ
ン／セファロース（コラーゲン：セファロース＝ ４
： ７５０ ）の５２〜をＰＨ７，４）リス［ｉ液（３
ｍ〜ＩＥＧＴへ含有） ５．０ ｍｌに、′ｙ遊させた
もの。
ン／セファロース（コラーゲン：セファロース＝ ４
： ７５０ ）の５２〜をＰＨ７，４）リス［ｉ液（３
ｍ〜ＩＥＧＴへ含有） ５．０ ｍｌに、′ｙ遊させた
もの。
試料：血液９容に６０ｍＭ ＥＧＴＡ１容を混和したも
のを１６０ Ｇで１０分′１間遠心分離し、上１−を取
る。
のを１６０ Ｇで１０分′１間遠心分離し、上１−を取
る。
（測定操作）
ソＩＪコンコートガラス試験管にフラーゲン固定＾
化セフ ７０− ス２７００７ｚ１１！および試料３０
０１ｔｅを加え、光度計でその吸光度（Ｑ４１定波長６
５０ｎｍ）を測定した０ 試ｆ’４３００ ／７ ｅを１９５０ Ｉｔ ｌｌ （
：ｌラーゲンセファロ−ス／綾衝液２７００ ｐ ｅ
、Ｅり膨潤したコラーゲンセファロ−スフ５０μｅ を
引いた容量）の緩衝液で希釈した８にの吸光度を同様に
して測定し、両との値から血小板粘着率を算定した。
０１ｔｅを加え、光度計でその吸光度（Ｑ４１定波長６
５０ｎｍ）を測定した０ 試ｆ’４３００ ／７ ｅを１９５０ Ｉｔ ｌｌ （
：ｌラーゲンセファロ−ス／綾衝液２７００ ｐ ｅ
、Ｅり膨潤したコラーゲンセファロ−スフ５０μｅ を
引いた容量）の緩衝液で希釈した８にの吸光度を同様に
して測定し、両との値から血小板粘着率を算定した。
（健常者の平均粘着率）
この測定法で健宮名：３０例の血小板粘着率を測定した
結果、平均値５．３２・ノ、０準（ＩｌＩｌ差６５差動
５８％た０ 実施例４ 血漿の吸光度と血小板数の関係４例の血液か
ら多血小板血漿（血峨９容にｆ’ｉ０ ｍＭＥＤＴＡＩ
容を加え、１６０Ｇで１０分間遠心したのちＬｌｌ）と
乏血小板血常（血液９容に６０ｍＭ ＥＤＴＡ １容を
加え、１０００Ｇで１０分間遠心した後の上層）をとり
、それぞれ適量ずつ混合し、各４段階の血小板量を有す
血漿を合計１６種類作成し、それぞれ３００ｐ６をＰＨ
７，４）リス緩衝液１９５０ Ｉｔ ｌ テ希釈し、株
日立製作ｆｒ製２２ＯＡ分光光度計で吸光度を測定し、
またそれぞれの血小板数を東＋ｋｉ医用電子３ ＰＬ、
−１００型血小板カウンターにて８１赦した。
結果、平均値５．３２・ノ、０準（ＩｌＩｌ差６５差動
５８％た０ 実施例４ 血漿の吸光度と血小板数の関係４例の血液か
ら多血小板血漿（血峨９容にｆ’ｉ０ ｍＭＥＤＴＡＩ
容を加え、１６０Ｇで１０分間遠心したのちＬｌｌ）と
乏血小板血常（血液９容に６０ｍＭ ＥＤＴＡ １容を
加え、１０００Ｇで１０分間遠心した後の上層）をとり
、それぞれ適量ずつ混合し、各４段階の血小板量を有す
血漿を合計１６種類作成し、それぞれ３００ｐ６をＰＨ
７，４）リス緩衝液１９５０ Ｉｔ ｌ テ希釈し、株
日立製作ｆｒ製２２ＯＡ分光光度計で吸光度を測定し、
またそれぞれの血小板数を東＋ｋｉ医用電子３ ＰＬ、
−１００型血小板カウンターにて８１赦した。
Ｅ ｉ！８の各測定結果をもとにして吸光度と血小板数
の関係を示す図を作成した（第１図）。この図から吸光
度と血小板数の関係は各人心ずしも＋−ｊ Ｕではない
が、同一人では両者に直線的比例関係があることが判る
。したがって試料）が多血小板血漿である場合、吸光度
を眞疋することにより血小板粘着化、すなわち血小板粘
着化を測゛ボすることが口Ｊ能である。
の関係を示す図を作成した（第１図）。この図から吸光
度と血小板数の関係は各人心ずしも＋−ｊ Ｕではない
が、同一人では両者に直線的比例関係があることが判る
。したがって試料）が多血小板血漿である場合、吸光度
を眞疋することにより血小板粘着化、すなわち血小板粘
着化を測゛ボすることが口Ｊ能である。
以上、本賢明の好適な実施例について述べたが、本発明
の技術思想の範囲内において史に種々の変更を加えつる
。例えば、多糖類ｔ＾≠袂ゲルは血小板が粘着しない範
囲において化学修飾が可能であり、コラーゲンは血小板
が粘着する範囲においてどの動物由来でもよく、また化
学修飾を加えうる。緩衝剤は不便を承知であれば使用ぜ
ず、コラーゲン固定化多糖類縁：テ共ゲルを直接反応系
に加えてもよく、また使用する場合、そのＰＨも６５〜
８０の範囲でよく、（イ料も何んでも使用できる。その
他、各材料に防腐剤や安定化剤や粘着反応促進剤、制御
剤のような各種の添加物を使用することが＋ｊＪ能であ
る。
の技術思想の範囲内において史に種々の変更を加えつる
。例えば、多糖類ｔ＾≠袂ゲルは血小板が粘着しない範
囲において化学修飾が可能であり、コラーゲンは血小板
が粘着する範囲においてどの動物由来でもよく、また化
学修飾を加えうる。緩衝剤は不便を承知であれば使用ぜ
ず、コラーゲン固定化多糖類縁：テ共ゲルを直接反応系
に加えてもよく、また使用する場合、そのＰＨも６５〜
８０の範囲でよく、（イ料も何んでも使用できる。その
他、各材料に防腐剤や安定化剤や粘着反応促進剤、制御
剤のような各種の添加物を使用することが＋ｊＪ能であ
る。
以上詳述したように、本発明は特別の装置や器具を用い
ずに誰もが迅速、簡易、微量かつ正確に血小板粘着能を
測定する方法を提供するものであり、１１１１小板機能
の臨床検査としての実用上の価餉は極めて大きいもので
ある。
ずに誰もが迅速、簡易、微量かつ正確に血小板粘着能を
測定する方法を提供するものであり、１１１１小板機能
の臨床検査としての実用上の価餉は極めて大きいもので
ある。
Ｘ：ｌ）１図は本発明の実施例４における血漿の吸光１
Ｗと血小板数との関係を示す史乍曲線である。
Ｗと血小板数との関係を示す史乍曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ］ 血液試料を、多糖類から作られるゲルにコラーゲン
を固定化して作製される担体と混和して血液試料中の血
小板を該担体に粘着させ、残りの血小板針ともとの試料
中の血小板針を友々旧側して両名の差から粘着率を求め
ることを特徴とする血小板粘着能の測定方法。 ２ 血液試料として多血小板血漿を用い、光学的手段に
より血小板計測を行なうものである特許請求の範囲第１
項記載の血小板粘着能の測定方法。 ３ 血液試料中のカルシウムイオンをキレート削で捕集
して血小板凝集を抑えるものである！１．’ｌ’ ＯＦ
′Ｆ請求の範囲第１項まだは第２狽６己載の血小板粘着
能の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7080082A JPS58187859A (ja) | 1982-04-26 | 1982-04-26 | 血小板粘着能の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7080082A JPS58187859A (ja) | 1982-04-26 | 1982-04-26 | 血小板粘着能の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58187859A true JPS58187859A (ja) | 1983-11-02 |
Family
ID=13441978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7080082A Pending JPS58187859A (ja) | 1982-04-26 | 1982-04-26 | 血小板粘着能の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58187859A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0610865U (ja) * | 1992-01-09 | 1994-02-10 | アイエスケー医学書院器械株式会社 | 血小板の粘着能測定具 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52125396A (en) * | 1976-03-04 | 1977-10-21 | Dev Finance | Method of selective elimination of riboprotein from blood plasma or serum |
-
1982
- 1982-04-26 JP JP7080082A patent/JPS58187859A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52125396A (en) * | 1976-03-04 | 1977-10-21 | Dev Finance | Method of selective elimination of riboprotein from blood plasma or serum |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0610865U (ja) * | 1992-01-09 | 1994-02-10 | アイエスケー医学書院器械株式会社 | 血小板の粘着能測定具 |
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