DE69417261T2 - VERWENDUNG VON MONO-3,6-ANHYDROCYCLODEXTRINEN ZUM AUFLöSEN EINER HYDROPHOBISCHEN VERBINDUNG UND PRüFEN DER REINHEIT EINES ENANTIOMERS UND VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung hat die Verwendung von Cyclodextrinderivaten zur Löslichmachung hydrophober chemischer Verbindungen, insbesondere pharmazeutisch aktiver Moleküle, in einem wäßrigen Medium durch Einschluß dieser Moleküle in das Cyclodextrinderivat zum Gegenstand.
• Die Cyclodextrine oder Cyclomalto-oligosaccharide sind Verbindungen natürlichen Ursprungs, gebildet durch Verknüpfung von 6, 7 oder 8 α-1,4-förmig verbundenen Glucoseeinheiten. Zahlreiche Arbeiten zeigten, daß diese Cyclodextrine in der Lage sind, Einschlußkomplexe mit hydrophoben Molekülen zu bilden, und damit die Löslichmachung dieser Moleküle in wäßrigen Medien erlauben. Zahlreiche Anwendungen wurden vorgeschlagen, um aus dieser Erscheinung Nutzen zu ziehen, insbesondere auf pharmazeutischem Gebiet, wie von D. Duchêne in dem Werk mit dem Titel: "Cyclodextrins and their industrial uses", Kap. 6, S. 213 bis 257, Editions de Santé, 1987, beschrieben. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Cyclodextrine benutzen, wurden außerdem in Japan, Italien und zuletzt in Frankreich auf den Markt gebracht, beispielsweise von Pierre Fabre Médicament das Brexin®, das ein Einschlußkomplex des Piroxicams in β-Cyclodextrin ist.
• Unter den verwendbaren Cyclodextrinen ist β-Cyclodextrin, welches 7 Glucoseeinheiten enthält, das in Hinblick auf die Größe seines Hohlraums am besten geeignete und das billigste der drei, doch macht seine Verwendung gewisse Probleme, denn es ist weniger gut löslich als die anderen Cyclodextrine und besitzt hämolytischen Charakter.
• So wurde erwogen, die Eigenschaften des β-Cyclodextrins zu verbessern, indem man es chemisch modifiziert, um es besser geeignet zu machen. Mehrere Lösungen wurden erwogen und führ ten zu der Verwendung von Methylderivaten oder von Hydroxyalkylderivaten.
• Die Methylderivate sind viel besser löslich als das ursprüngliche Cyclodextrin, und sie besitzen gute Eigenschaften der Löslichmachung hydrophober organischer Verbindungen, insbesondere im Fall des 2,6-Dimethyl-β-cyclodextrins. Nichtsdestoweniger sind diese Methylderivate, abgesehen davon, daß sie schwierig im reinen Zustand zu erhalten sind, auf Grund ihres sehr stark hämolytischen Charakters unbrauchbar für pharmazeutische Anwendungen, insbesondere für die injizierbaren Formen.
• Die besonders von Janssen entwickelten Hydroxyalkylderivate, beispielsweise die Hydroxypropyl-cyclodextrine, weisen eine sehr hohe Löslichkeit in Wasser auf und sind wenig hämolytisch. Allerdings bleibt ihre Benutzung aufgrund ihrer extremen chemischen Heterogenität schwierig. Ferner können die Substitutionen durch Wirkung einer sterischen Behinderung die Bildung von Einschlußkomplexen einschränken, so daß mit diesen Derivaten noch keine pharmazeutische Anwendung ausgearbeitet wurde.
• Die vorliegende Erfindung hat genau die Verwendung anderer Cyclodextrinderivate für die Löslichmachung hydrophober chemischer Verbindungen zum Gegenstand, die es erlaubt, diesen Nachteilen abzuhelfen. Sie betrifft ebenso ein neues Verfahren zur Herstellung dieser Cyclodextrinderivate, das, ohne mühsam auszuführende Reinigungsschritte zu erfordern, zu sehr reinen Produkten führt.
• Nach der Erfindung besteht das Verfahren zur Löslichmachung einer hydrophoben chemischen Verbindung in einem wäßrigen Medium darin, die hydrophobe chemische Verbindung mit einem Mono-3,6-anhydro-cyclodextrin der Formel:
• worin n gleich 5, 6 oder 7 ist, zu kombinieren, um mit diesem einen in Wasser löslichen Einschlußkomplex zu bilden.
• Die Verwendung des der vorgenannten Formel entsprechenden Monoanhydroderivats eines Cyclodextrins in diesem Verfahren weist den Vorteil auf, in verschiedenen Verabreichungsformen die Löslichkeit, die Stabilität und die Bioverfügbarkeit der hydrophoben Verbindung, insbesondere wenn es sich um pharmazeutisch aktive Moleküle handelt, zu verbessern.
• Insbesondere ist die Löslichkeit dieser Derivate in Wasser beträchtlich und weit höher als die des verwandten Cyclodextrins, namentlich, was das β-Cyclodextrin betrifft. Außerdem zeigen diese Cyclodextrinderivate einen schwächeren hämolytischen Charakter als das verwandte Cyclodextrin. Darüber hinaus haben diese Cyclodextrine die Eigenschaft, unterschiedliche Affinitäten für die Isomere einer Isomerenmischung aufzuweisen und aus diesem Grund in Verfahren zur Isomerentrennung durch Chromatographie verwendet werden zu können. Sie erlauben auch, leicht eine Kontrolle der Enantiomerenreinheit auszuführen, denn die mit racemischen chiralen Verbindungen gebildeten Einschlußkomplexe zeigen bei der magnetischen Kernresonanz eine leicht zu beobachtende Trennung der charakteristischen Signale jedes Enantiomers.
• Nach der Erfindung benutzt man vorzugsweise das Monoanhydroderivat des β-Cyclodextrins, d. h. das Derivat der Formel (I) mit n = 6. Man kann allerdings auch die Derivate des α-Cyclodextrins (n = 5) oder des γ-Cyclodextrins (n = 7) benutzen.
• Die hydrophoben chemischen Verbindungen, die mit Hilfe dieser Cyclodextrine in wäßrigen Medien löslich gemacht werden können, können von verschiedener Art sein.
• Als Beispiele für derartige Verbindungen kann man kosmetische Produkte, Vitamine, pharmazeutisch aktive Moleküle wie die von D. Duchene in dem Werk mit dem Titel: "Cyclodextrins and their industrial uses", Kapitel 6, S. 213 bis 257, Editions de Santé, 1987, beschriebenen anführen.
• Vorzugsweise ist in der Erfindung die hydrophobe chemische Verbindung ein pharmazeutisch aktives Molekül.
• Als Beispiele für derartige Moleküle kann man die Steroide, beispielsweise Prednisolon, die antiepileptischen Mittel wie Carbamazepin und die Mittel zur Krebsbekämpfung anführen.
• Die in der Erfindung verwendeten Cyclodextrinderivate der Formel (I) können mit dem in Chemistry Letters, 1988, S. 543-546, beschriebenen Verfahren durch Reaktion des entsprechenden Monotosylderivats mit einer wäßrigen Lösung von Natronlauge hergestellt werden. Nach dieser Reaktion kann man das Monoanhydroderivat im reinen Zustand isolieren, wenn man forcierte Reinigungsoperationen durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie anwendet, um die Nebenprodukte und Salze zu entfernen.
• Daher verwendet man für die Herstellung dieser Derivate nach der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein einfacheres Verfahren, das erlaubt, diese Reinigungsschritte wegzulassen.
• Dieses einfachere Verfahren zur Herstellung eines Mono- 3,6-anhydro-cyclodextrins der Formel:
• worin n gleich 5, 6 oder 7 ist, besteht darin, ein Monotosylderivat eines Cyclodextrins mit der Formel:
• worin R die Tosylgruppe und n gleich 5, 6 oder 7 ist, mit Lithiumhydroxid im wäßrigen Medium reagieren zu lassen.
• Der Gebrauch von Lithiumhydroxid anstelle von Natriumhydroxid erlaubt, viel leichter das Monoanhydroderivat des Cyclodextrins zu erhalten und anschließend seine Trennung von dem Reaktionsmedium unter besseren Bedingungen auszuführen.
• Diese Trennung kann ausgeführt werden durch Ausfällung nach Ansäuern des Reaktionsmediums, und wenn man diese Schritte der Ausfällung wiederholt, kann man das Cyclodextrinderivat im reinen Zustand isolieren, ohne daß es nötig ist, ergänzende Schritte der Reinigung durch Chromatographie auszuführen.
• Die Ausfällung kann ausgeführt werden, indem man das wäßrige Medium nach Ansäuerung in ein organisches Lösungsmittel wie Aceton gibt und anschließend den gebildeten Niederschlag durch Zentrifugation abtrennt. Es gelingt so, die in dem organischen Lösungsmittel löslichen Sulfonsäurederivate sowie die Salze gänzlich zu entfernen, denn Lithiumchlorid ist in einem organischen Lösungsmittel wie Aceton löslich.
• Die Erfindung betrifft ebenso die Einschlußkomplexe eines der vorgenannten Formel (I) entsprechenden Mono-3,6-anhydrocyclodextrins mit einer hydrophoben chemischen Verbindung, insbesondere mit einem pharmazeutisch aktiven Molekül.
• Dieser Einschlußkomplex kann mit klassischen Verfahren, beispielsweise durch Zugabe einer Lösung der hydrophoben Verbindung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, etwa Aceton, zu einer Lösung oder zu einer Suspension des benutzten Mono-3,6-anhydro-cyclodextrins hergestellt werden. Man kann anschließend den so gebildeten Einschlußkomplex durch Gefriertrocknung isolieren.
• Diese Einschlußkomplexe können, wenn sie mit pharmazeutisch aktiven Molekülen gebildet sind, insbesondere in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die darüber hinaus einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten.
• Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen, die auf oralem oder parenteralem Wege verabreicht werden können, sind beispielsweise Lösungen, Puder, Suspensionen usw., insbesondere injizierbare Lösungen.
• Wie weiter oben angegeben, haben die mit den Mono-3,6-anhydro-cyclodextrinen der Formel (I) der Erfindung und racemischen chiralen Verbindungen gebildeten Einschlußkomplexe die interessante Eigenschaft, in der magnetischen Kernresonanz für jedes Enantiomer getrennte Signale zu haben.
• Daher hat die Erfindung ferner ein Verfahren zur Kontrolle der Reinheit eines Enantiomers einer organischen Verbindung zum Gegenstand, das darin besteht, dieses Enantiomer mit einem der vorgenannten Formel (I) entsprechenden Mono-3,6-anhydrocyclodextrin zu kombinieren, um einen Einschlußkomplex dieses Enantiomers zu bilden, und den erhaltenen Komplex einer spektrometrischen Messung durch magnetische Kernresonanz zu unterziehen, um in dem erhaltenen Spektrum die eventuelle Anwesenheit des anderen Enantiomers festzustellen.
• Die Erfindung hat ferner ein Verfahren zur Trennung von Isomeren durch Chromatographie zum Gegenstand, das darin besteht, eine Mischung dieser Isomere in einer Kolonne umlaufen zu lassen, die mit einem festen chromatographischen Träger gefüllt ist, auf welchem ein erfindungsgemäßes Mono-3,6-anhydrocyclodextrin der Formel (I) in kovalenter Weise fixiert ist, und die Isomere getrennt am Ausgang der Kolonne aufzufangen.
• Der verwendete chromatographische Träger kann aus einem unlöslichen Polymer oder aus Siliciumdioxid-Mikropartikeln gebildet sein. Die unlöslichen Polymere können insbesondere Agarose und die Polysaccharide der Sephadex®-Typen sein.
• Die chemische Pfropfung der Cyclodextrine der Erfindung auf diese chromatographischen Träger kann mit Hilfe eines Kopplungsreagens wie Epichlorhydrin ausgeführt werden, das die Kopplung zwischen einer OH-Gruppe des Cyclodextrins und einer OH-Gruppe des chromatographischen Trägers sicherstellt.
• Die Eigenschaft der Cyclodextrine der Erfindung, für jedes der Isomere eine verschiedene Affinität zu haben, erlaubt, deren gute Trennung durch Chromatographie zu erreichen. Die Isomere könne optische Isomere, Stellungsisomere oder Diastereomere sein.
• Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden besser bei der Lektüre der folgenden Beispiele hervortreten, die selbstverständlich zur Erläuterung, nicht begrenzend gegeben werden, wobei auf die beigefügten Figuren Bezug genommen wird.
• Die beigefügte Fig. 1 stellt das Kernresonanzspektrum eines Einschlußkomplexes von Mono-3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose mit einer racemischen Mischung von Dothiepin dar.
• Fig. 2 stellt einen vergrößerten Teil des Spektrums von Fig. 1 dar.
Beispiel 1: Herstellung von Mono-3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose.
• Um die Synthese gemäß dem Verfahren der Erfindung auszuführen, stellt man zunächst durch Einwirkung von p-Toluolsulfonsäurechlorid auf β-Cyclodextrin im wäßrigen Medium die Mono-6-tosyl-6-desoxy-cyclomaltoheptaose her.
• 60 g Cyclomaltoheptaose (52,8 mmol) werden in 500 ml destilliertem Wasser suspendiert. Man fügt innerhalb von 5 Minuten unter starkem Rühren mit dem Magnetrührer Tropfen für Tropfen 6,57 g (164 mmol) kaustische Soda, aufgelöst in 20 ml Wasser, hinzu. Innerhalb von 10 Minuten werden zu der erhaltenen klaren Lösung 10,08 g (52,9 mmol) p-Toluolsulfonsäurechlorid (Tosylchlorid) in 30 ml Acetonitril Tropfen für Tropfen hinzugegeben. Nach zweistündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wird der gebildete Niederschlag durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird 48 Stunden lang bei 4ºC aufbewahrt. Der Niederschlag wird durch Filtration unter Vakuum isoliert, mit 50 ml Eiswasser gewaschen und sofort in siedendem Wasser unkristallisiert. Nach einer Nacht bei 4ºC wird der Niederschlag filtriert und unter Vakuum bei 30ºC getrocknet. Man erhält so 7,5 g (12%) einer reinen Verbindung in Übereinstimmung mit den Spezifikationen.
• Man löst dann 100 mg vorher erhaltene 6-Tosyl-6-desoxycyclomaltoheptaose in 10 ml wäßrigem 1n LiOH. Die Auflösung erfolgt sofort. Man hält die Lösung für 15 Stunden bei 40ºC, dann säuert man sie mit 1n HCl auf einen pH von ungefähr 3 an. Danach gibt man die Lösung Tropfen für Tropfen unter Rühren zu 20 ml reinem Aceton. Es bildet sich ein glasartiger Niederschlag, den man durch Zentrifugation (6000 U/min. 10 min) isoliert und in 0,5 ml Wasser wieder auflöst. Man wiederholt diese Ausfällung, isoliert erneut den Rückstand durch Zentrifugation, löst ihn wieder in Wasser und führt dann eine Gefriertrocknung durch.
• Man bestätigt die Struktur des erhaltenen Produkts durch Protonen-Kernresonanz bei starkem Feld, und man erhält dabei spektrale Eigenschaften, die mit den in Chemistry Letters, 1988, S. 543-546, angegebenen übereinstimmen.
• Die Löslichkeit der erhaltenen Verbindung in Wasser beträgt bei 25ºC 520 g/l, d. h. nahezu das Dreißigfache der Löslichkeit des ursprünglichen Cyclodextrins, die 18 g/l beträgt. Diese Löslichkeit ist ebenfalls wenigstens doppelt so hoch wie die der α- und γ-Cyclodextrine.
• Die hämolytischen Eigenschaften dieses Derivats wurden getestet, indem man 0,4 ml einer Suspension menschlicher Erythrozyten und 4 ml einer Lösung dieses Derivats von 5 mmol/l und pH 7,4 für 30 Minuten bei 37ºC in Kontakt brachte. Unter diesen Bedingungen zeigt das Derivat 0% Hämolyse, während für β-Cyclodextrin unter den gleichen Bedingungen der Anteil der Hämolyse 50% beträgt.
• Andere Versuche zeigten die Abwesenheit von hämolytischen Eigenschaften unter extremeren Bedingungen (keine Hämolyse feststellbar bei 50 mmol/l).
Beispiel 2: Herstellung eines Einschlußkomplexes von Mono-3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose und Prednisolon.
• Prednisolon entspricht der folgenden Formel:
• und es hat eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser (0,25 mg/ml bei 25ºC, d. h. 0,7 mmol/l).
• Man löst 10 umol der in Beispiel 1 hergestellten Mono- 3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose in 1 ml reinem Wasser (apyrogenes Wasser für Injektionen) und fügt 5 umol Prednisolon in Form einer konzentrierten Lösung von 50 mmol/l in Aceton hinzu. Man entfernt das Aceton durch Durchleiten von Stickstoff und behandelt die Lösung durch Gefriertrocknung.
• Der verbleibende Rückstand, der 10 umol Cyclodextrinderivat und 5 umol Prednisolon enthält, wird in der kleinstmöglichen Menge Wasser bei 25ºC wieder aufgelöst. Dieses Minimum entspricht 50 ul Wasser, was eine maximale Löslichkeit von 100 mmol/l Prednisolon in Wasser in Gegenwart dieses Cyclodextrinderivats in einer Konzentration von 200 mmol/l anzeigt.
• β-Cyclodextrin erlaubt unter denselben Bedingungen nicht, Prednisolon besser als bis zu einem Wert von 9 mmol/l löslich zu machen.
• Man erhält also mit dem Monoanhydroderivat dieses Cyclodextrins ein deutlich besseres Ergebnis.
Beispiel 3: Herstellung eines Einschlußkomplexes von Mono-3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose mit Dothiepin in Form der racemischen Mischung.
• Dothiepin entspricht der Formel:
• Dieses Molekül ist infolge der Abwesenheit von Spiegelsymmetrie in Bezug auf die aromatische Ebene optisch aktiv, und die kommerzielle Verbindung ist ein Racemat. Man stellt den Einschlußkomplex dieser racemischen Verbindung her, indem man eine wäßrige Lösung von Dothiepin-hydrochlorid und Mono- 3,6-anhydro-cyclomaltoheptaose herstellt, die 5 mmol/l Hydrochlorid und 10 mmol/l Cyclodextrinderivat enthält. Man untersucht anschließend die Lösung durch magnetische Kernresonanzspektrometrie bei 500 MHz und 298 K. Das unter diesen Bedingungen erhaltene Spektrum ist in den beigefügten Fig. 1 und 2 dargestellt.
• In Fig. 1 ist das vollständige Spektrum dargestellt, in Fig. 2 ist in größerem Maßstab der Teil des Spektrums von Fig. 1 dargestellt, der den Signalen der beiden Enantiomere entspricht.
• In dieser Figur kann man sehen, daß eine gute Trennung der Signale der Vinyl-Protonen erfolgt, die 0,2 ppm erreicht, während diese Trennung, wenn man unter den gleichen Bedingungen β-Cyclodextrin verwendet, nur 0,03 ppm beträgt.
• So können die Cyclodextrinderivate der Erfindung als chirales Reagens verwendet werden, um den Reinheitsgrad eines Enantiomers zu überprüfen.

Claims (10)

1. Verfahren zum Löslichmachen einer hydrophoben chemischen Verbindung in einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht, die hydrophobe chemische Verbindung mit einem Mono-3,6-anhydro-cyclodextrin der Formel:

worin n gleich 5, 6 oder 7 ist, zu kombinieren, um mit diesem einen in Wasser löslichen Einschlußkomplex zu bilden.

2. Einschlußkomplex eines Mono-3,6-anhydro-cyclodextrins der Formel:

worin n gleich 5, 6 oder 7 ist, mit einer hydrophoben chemischen Verbindung.

3. Komplex nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n gleich 6 ist.

4. Komplex nach einem der Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophobe chemische Verbindung ein pharmazeutisch aktives Molekül ist.

5. Komplex nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch aktive Molekül Prednisolon ist.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger einen Einschlußkomplex eines Cyclodextrins nach einem der Ansprüche 2 bis 5 umfaßt.

7. Verfahren zur Kontrolle der Reinheit eines Enantiomers einer organischen Verbindung, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht, dieses Enantiomer mit einem Mono-3,6-anhydro-cyclodextrin der Formel:

worin n gleich 5, 6 oder 7 ist, zu kombinieren, um einen Einschlußkomplex dieses Enantiomers zu bilden, und den erhaltenen Komplex einer spektrometrischen Messung durch magnetische Kernresonanz zu unterziehen, um in dem erhaltenen Spektrum die eventuelle Anwesenheit des anderen Enantiomers festzustellen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß n gleich 6 ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Verbindung Dothiepin ist.

10. Verfahren zur Trennung von Isomeren durch Chromato graphie, dadurch gekennzeichnet, daß es darin besteht, eine Mischung dieser Isomere in einer Kolonne umlaufen zu lassen, die mit einem festen chromatographischen Träger gefüllt ist, auf welchem ein Mono-3,6-anhydro-cyclodextrin der Formel (I):

worin n gleich 5, 6 oder 7 ist, in kovalenter Weise fixiert ist, und die Isomeren getrennt am Ausgang der Kolonne aufzufangen.