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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Cyclodextrin-Derivate, die verwendbar
sind insbesondere für die
Einarbeitung von hydrophoben chemischen Verbindungen in ein wässriges
Medium, z.B. von pharmazeutisch aktiven Molekülen, Molekülen für die Verwendung in der Kosmetik
und Molekülen,
die als Kontrastmittel für
die medizinische Bildgebung verwendet werden. Die Erfindung betrifft
insbesondere amphiphile Cyclodextrin-Derivate, die in einem wässrigen
Medium Autoorganisations-Eigenschaften
aufweisen und in organisierte oberflächenaktive Systeme eingearbeitet
werden können
unter Bildung von gemischten Systemen.
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Diese
Einarbeitung in organisierte oberflächenaktive Systeme, wie z.B.
kleine Phospholipid-Vesikula, ist dazu bestimmt, den Transport von
hydrophoben Molekülen,
die in Cyclodextrin eingeschlossen sind, wie z.B. eines Wirkstoffs,
insbesondere auf transmembranalem, beispielsweise transdermalem
Wege, zu ermöglichen.
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Stand der
Technik
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Bei
den Cyclodextrinen oder Cyclomaltooligosacchariden handelt es sich
um Verbindungen natürlichen
Ursprungs, die durch Verkettung von 6, 7 oder 8 Glucose-Einheiten gebildet
werden, die in α-1→4-Verknüpfung miteinander
verbunden sind. Zahlreiche Arbeiten haben gezeigt, dass diese Verbindungen
mit hydrophoben Molekülen
Einschlusskomplexe bilden können
und auf diese Weise ihre Solubilisierung in wässrigen Medien ermöglichen.
Es sind bereits zahlreiche Anwendungen vorgeschlagen worden, um
aus diesem Phänomen
Nutzen zu ziehen, insbesondere auf dem pharmazeutischen Gebiet,
wie beispielsweise beschrieben von D. Duchêne in " Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins", erschienen in "Cyclodextrins and
their industrial uses",
Editions de Santé,
Paris 1987, Seiten 213–257
[1]. Pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen Cyclodextrine verwendet
werden, wurden bereits in Japan, in Italien und vor kurzem in Frankreich
auf den Markt gebracht, beispielsweise durch Pierre Fabre Médicament
für das
Produkt "Brexin®", bei dem es sich um
einen Einschlusskomplex von Piroxicam in β-Cyclodextrin handelt.
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Unter
den verwendbaren Cyclodextrinen ist das β-Cyclodextrin (das 7 Glucose-Einheiten
umfasst) unter den genannten drei Verbindungen am besten geeignet
wegen der Größe seines
Hohlraums und weil es von den dreien das billigste ist. Chemische
Modifikationen des β-Cyclodextrins
wurden ebenfalls bereits beschrieben, um es amphiphil zu machen
mit dem Ziel, es in organisierte Systeme einzuarbeiten.
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Es
wurden bereits amphiphile Cyclodextrine untersucht, die auf der
Primäroberfläche multiple
Ketten aufweisen. A. Yabe et al. haben in "Thin Solid Films, (1988), 160, Seiten
33–41
[2], das Per-(6-dodecylamino-6-desoxy)-β-cyclodextrin-Derivat für die Bildung
von stabilen Langmuir-Blodgett-Schichten beschrieben. Außerdem haben
L. Jullien et al. in "J.
Chem. Soc. Perkin Trans" 2,
1993, Seiten 1011-1022
[3], β-Cyclodextrin-Derivate
beschrieben, die aliphatische Ketten aufweisen, die in primären und
sekundären
Positionen angeordnet sind, um diese Cyclodextrin-Derivate in Phosphatidylcholin-Vesikula
einzuarbeiten. Diese Derivate sind amphiphil und können in
Vesikula eingearbeitet werden, der innere Hohlraum des Cyclodextrins
ist jedoch nicht mehr zugänglich
wegen des hohen Platzbedarfs der aliphatischen Ketten. Infolgedessen
können
diese Derivate keine hydrophoben Moleküle, insbesondere keine Wirkstoff-Moleküle, einschließen.
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Kürzlich wurde
von A. Gulik et al. in "Langmuir" (1998), 14, Seiten
1050–1057
[4], gezeigt, dass Cyclodextrine mit so genannten "Verkleidungen (Schürzen)", die auf sekundäre Hydroxylgruppen
aufgepfropfte Fettsäureketten
tragen, stabile Nanokügelchen
bilden können.
Diese molekularen Superkombinationen scheinen wegen kumulativer
Effekte der Spezifität
der Größe und des
Transports der Cyclodextrine einerseits und wegen der Organisation
in Nanoteilchen andererseits sehr vielversprechende Einkapselungs-
und Aussalzungs-Eigenschaften aufzuweisen. Es sei jedoch betont,
dass die Synthese und vor allem die Reinigung dieser Cyclodextrine
sehr schwierig bleibt und lange Reinigungssstufen erfordert, die
zu niedrigen Aus beuten führen. Es
ist klar, dass die supramolekularen Organisations-Eigenschaften
sehr stark abhängen
von der chemischen Reinheit der amphiphilen Cyclodextrin-Derivate.
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J.
Lin et al. haben in FR-A-2 736 056 [5] und in "J. Chem. Soc. Perkin Trans", 2, (1998), Seiten 2638–2646 [6],
die Synthese von Cyclodextrin-Derivaten, als "Kugeleinfang"-Moleküle bezeichnet, die eine oder
mehrere aliphatische Ketten aufweisen, die ihnen amphiphile Eigenschaften
verleihen, ohne jedoch zu dem Autoeinschluss-Phänomen der Kette(n) in dem Cyclodextrin
zu führen.
Man kann daher, ausgehend von solchen Derivaten, Einschlusskomplexe
erhalten, die ein hydrophobes Molekül enthalten, und diese Komplexe können in
Phospholipid-Vesikula eingeschlossen sein. Diese Moleküle haben
sich jedoch als wenig stabil in einem physiologischen Medium, d.h.
bei pH-Werten von ≥ 7,
erwiesen und ihre Einarbeitungs-Kapazitäten in organisierte
Systeme bleiben begrenzt. Darüber
hinaus führen
diese Kugeleinfang-Moleküle
nicht zu einer spontanen Autoorganisation in einem wässrigen
Medium unter Bildung von Teilchen mit einer gut definierten Größe und Form.
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Amphiphile
Derivate von Cyclodextrinen, die durch Bindung von Fettsäuren an
primäre
oder sekundäre
Hydroxylgruppen von Glycosyl-Resten erhalten werden, sind in FR-A-2
681 868 beschrieben.
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Beschreibung der Erfindung
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind insbesondere amphiphile Cyclodextrin-Derivate,
die in einem physiologischen Medium stabil sind, hydrophobe Verbindungen
einschließen
können,
gute Einarbeitungs-Kapazitäten
in organisierte Systeme aufweisen und darüber hinaus in wässrigen
Medien Autoorganisations-Eigenschaften
besitzen.
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Das
erfindungsgemäße amphiphile
Cyclodextrin-Derivat hat die Formel:
worin
bedeuten:
- – R1 eine von einem Steroid abgeleitete Gruppe,
- – R2 eine gegebenenfalls substituierte Alkyl-
oder Arylgruppe,
- – R3 H oder R2,
- – alle
R4-Reste für OR2 stehen
oder
- – einer
der R4-Reste steht für -NHCO(CH2)mCONHR1 und die anderen
R4-Reste für OR2 stehen,
mit der Maßgabe,
dass mindestens eine Glucose-Einheit, worin R4 für OR2 steht, zwischen den beiden Glucose-Einheiten vorliegt,
die den Substituenten -NHCO-(CH2)mCONH-R1 aufweisen;
- – m
steht für
eine ganze Zahl von 1 bis 8 und
- – n
steht für
die Zahl 5, 6 oder 7.
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Es
sei daran erinnert, dass es sich bei den Steroiden um Verbindungen
handelt, die von einem polycyclischen Kern der Formel abgeleitet
sind:
worin R steht für eine lineare
oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 9 Kohlenstoffatomen
und worin der polycyclische Kern eine oder mehrere Doppelbindungen
und einen oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe CH
3, OH und O, an einem oder mehreren Kohlenstoffatomen
der Zyklen aufweisen kann.
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In
dem erfindungsgemäßen Cyclodextrin-Derivat
kann R1 stehen für eine Gruppe, die von Sterinen (Sterolen)
abgeleitet ist durch Eliminierung der Hydroxylgruppe des ersten
Zyklus, der einen Sättigungsgrad von
0 bis 6 aufweist. Es kann sich auch um Gruppen handeln, die von
Steronen abgeleitet sind. Beispielsweise kann R1 stehen
für eine
von Cholesterin abgeleitete Gruppe, z.B. für die Gruppe der Formel:
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Das
erfindungsgemäße Derivat
weist amphiphile Eigenschaften auf als Folge der Anwesenheit von
einem oder zwei Substituenten, die eine von einem Steroid abgeleitete
Gruppe tragen.
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Wenn
das Derivat zwei Substituenten dieses Typs aufweist, ist es wegen
ihres Platzbedarfs erforderlich, dass sie nicht an zwei benachbarten
Glucose-Einheiten vorliegen.
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Außerdem sind
die beiden Glucose-Einheiten, welche diese Substituenten aufweisen,
durch eine oder zwei Glucose-Einheiten, die einen Substituenten
OR2 tragen, voneinander getrennt.
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Vorzugsweise
weist das Cyclodextrin-Derivat nur einen einzigen Substituenten
dieses Typs auf, wobei alle R4-Reste für OR2 stehen.
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In
dem erfindungsgemäßen Cyclodextrin-Derivat
steht die Gruppe R2 für eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe
oder für
eine Arylgruppe, die gegebenenfalls substituiert ist. Wenn man eine
Alkylgruppe verwendet, weist diese im Allgemeinen 1 bis 4 Kohlenstoffatome
auf und sie ist vorzugsweise linear. Die Arylgruppe kann beispielsweise
die Phenylgruppe oder die Benzylgruppe sein. Die gegebenenfalls
vorhandenen Substituenten dieser Alkyl- oder Arylgruppen können beispielsweise
Halogenatome und Hydroxyl-, Carboxyl- und Amingruppen sein. Zweckmäßig steht
R2 für
die Methylgruppe.
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R3 kann ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe
sein, die mit R2 identisch oder davon verschieden ist.
Vorzugsweise steht R3 für H.
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In
der oben angegebenen Formel (I) kann die aliphatische Kette, welche
die von einem Steroid abgeleitete Gruppe mit der Glucose-Einheit
verbindet, zwischen den beiden Amidogruppen 1 bis 8 Kohlenstoffatome
aufweisen. Man erhält
gute Ergebnisse mit 2 Kohlenstoffatomen, d.h. mit m = 2.
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Die
erfindungsgemäßen Cyclodextrin-Derivate
können
Derivate von α-, β- oder γ-Cyclodextrin
(CD) sein. Vorzugsweise verwendet man β-Cyclodextrin-Derivate, die in
der oben angegebenen Formel (I) dem Fall entsprechen, bei dem n
= 6.
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Die
erfindungsgemäßen Cyclodextrin-Derivate
können
durch klassische Verfahren hergestellt werden, wobei man von entsprechenden
Monoazido- oder Diazido-cyclodextrin-Derivaten ausgeht.
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Für den Fall,
dass man ein Derivat der Formel (I) herstellen will, wie oben definiert,
worin R3 steht für ein Wasserstoffatom, umfasst
das Verfahren die folgenden Stufen:
- a) Reagierenlassen
eines Derivats der Formel: in der
alle R5-Reste für OH stehen oder einer der
R5-Reste für -N3 steht
und die anderen R5-Reste für OH stehen,
mit der Maßgabe,
dass mindestens eine Glucose-Einheit,
in der R5 für OH steht, zwischen den beiden
Glucose-Einheiten vorliegt, die den Substituenten N3 aufweisen,
und n für
die Zahl 5, 6 oder 7 steht, mit einem Dialkylsulfat SO4R2 2, worin R2 die oben angegebene Bedeutung hat, in einem
basischen Medium zur Herstellung des Cyclodextrin-Derivats der Formel: in der
alle R6-Reste OR2 darstellen
oder einer der R6-Reste N3 darstellt
und die anderen R6-Reste OR2 darstellen
und in der R2 und n wie oben definiert sind,
- b) Durchführung
einer Staudinger-Reaktion mit dem Derivat der Formel (V) durch Verwendung
von Triphenylphosphin und Ammoniak, um N3 in
NH2 umzuwandeln und zur Herstellung des
Derivats der Formel in der
alle R7-Reste OR2 darstellen
oder einer der R7-Reste NH2 darstellt
und die anderen R7-Reste OR2 darstellen
und in der R2 und n wie oben definiert sind,
- c) Reagierenlassen des Derivats der Formel (VI) mit einem Säureanhydrid
der Formel: in der m wie oben definiert
ist, zur Herstellung des Derivats der Formel: in der
alle R8-Reste OR2 darstellen
oder einer der R8-Reste -NHCO-(CH2)mCOOH darstellt
und die anderen R8-Reste OR2 darstellen
und worin R2, m und n wie oben definiert
sind, und
- d) Reagierenlassen des Derivats der Formel (VIII) mit einer
Verbindung der Formel NH2-R1 zur
Herstellung des Cyclodextrin-Derivats der Formel (Ii, wie oben definiert.
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Die
als Ausgangsprodukt in dem Verfahren verwendeten Monoazido- oder
Diazido-Derivate können hergestellt
werden aus dem entsprechenden Monotosyl- oder Ditosyl-cyclodextrin-Derivat durch
Einwirkenlassen von Lithiumazid in Wasser.
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In
der Stufe (a) des vorstehend beschriebenen Verfahrens lässt man
das Cyclodextrin-Derivat der Formel (IV) mit einem Dialkylsulfat
SO4R2 2 in
einer Mischung von organischen Lösungsmitteln,
wie z.B. Dimethylformamid (DMF) und Dimethylsulfoxid (DMSO), in
Volumenverhältnissen
von 50 : 50 in Gegenwart einer Base, wie z.B. Bariumoxid und Bariumhydroxid,
bei 8 °C
reagieren. Man kann das dabei erhaltene Derivat der Formel (V) abtrennen
durch Anwendung der in Beispiel 1 näher beschriebenen Verfahren.
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In
der Stufe (b) lässt
man das Derivat der Formel (V) mit Triphenylphosphin in einem organischen
Lösungsmittel,
wie z.B. DMF, reagieren, dann gibt man 20 %iges Ammoniak zu. Das
dabei erhaltene Derivat der Formel (VI) kann gereinigt werden durch
Eindampfen des Lösungsmittels,
Abtrennen des gebildeten weißen Nieder schlags
durch Filtrieren und anschließendes
Trennen durch Ionenaustauschchromatographie.
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In
der Stufe (c) lässt
man das Derivat der Formel (VI) mit dem gewünschten Säureanhydrid der Formel (VII)
in einem organischen Lösungsmittel,
z.B. in DMF, reagieren. Das dabei erhaltene Derivat der Formel (VIII) wird
nicht isoliert und diekt in dem gleichen Reaktionsmedium in die
nachfolgende Stufe (d) überführt. Dann gibt
man Peptid-Kupplungs-Reagentien, wie z.B. N,N'-Diisopropylcarbodiimid und Hydroxybenzotriazol,
zu. Das Derivat der Formel (VIII) reagiert dann mit der Verbindung
der Formel H2N-R1,
wie z.B. Cholest-5-en-3α-ylamin.
Man kann das so erhaltene Derivat der Formel I durch Eindampfen
des Lösungsmittels
von dem Reaktionsmedium abtrennen und durch Silicagel-Säulenchromatographie
reinigen.
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Für den Fall,
dass man ein Derivat der Formel (I) herstellen will, wie vorstehend
definiert, wobei R3 steht für R2, umfasst das Verfahren die gleichen Stufen
wie vorstehend angegeben, jedoch in der Stufe (a) führt man
eine Alkylierung aller OH-Gruppen
mit einem Iodalkan durch. In diesem Fall werden die folgenden Stufen durchgeführt:
- a) Reagierenlassen eines Derivats der Formel: in der
alle Reste R5 für OH stehen oder einer der
Reste R5 für -N3 steht
und die übrigen
R5-Reste für OH stehen, mit der Maßgabe, dass
zwischen den beiden Glucose- Einheiten,
die den Substituenten N3 tragen, mindestens
eine Glucose-Einheit mit R5 = OH vorliegt,
n für die
Zahl 5, 6 oder 7 steht, mit einem Iodalkan der Formel IR2, worin R2 die oben
angegebene Bedeutung hat, in Gegenwart von NaH unter Bildung des Cyclodextrin-Derivats
der Formel: worin
alle Reste R6 für OR2 stehen
oder einer der Reste R6 für N3 steht und die anderen R6-Reste
für OR2 stehen und worin R2 und
n wie oben definiert sind,
- b) Durchführung
einer Staudinger-Reaktion mit dem Derivat der Formel (IX) durch
Verwendung von Triphenylphosphin und Ammoniak, um N3 in
NH2 umzuwandeln unter Bildung des Derivats
der Formel: in der
alle Reste R7 für OR2 stehen
oder einer der Reste R7 für NH2 steht und die anderen R7-Reste
für OR2 stehen und R2 und
n wie oben definiert sind,
- c) Reagierenlassen des Derivats der Formel (X) mit einem Säureanhydrid
der Formel: worin m wie oben definiert
ist, unter Bildung des Derivats der Formel: worin
alle Reste R7 für OR2 stehen
oder einer der Reste R7 für -NHCO-(CH2)mCOOH steht und
die übrigen R7-Reste für
OR2 stehen, und R2,
m und n wie oben definiert sind, und
- d) Reagierenlassen des Derivats der Formel (XI) mit einer Verbindung
der Formel NH2-R1 unter
Bildung des Cyclodextrin-Derivats der oben definierten Formel (I).
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung sind außerdem die Einschlusskomplexe
des Cyclodextrin-Derivats der Formel (I) mit einer hydrophoben Verbindung,
um diese hydrophobe Verbindung in einem wässrigen Medium zu solubilisieren.
Die hydrophoben chemischen Verbindungen, die in wässrigen
Medien mittels dieser Cyclodextrin-Derivate (I) solubilisiert werden
können,
können
solche unterschiedlichen Typs sein. Als Beispiele für derartige
Verbindungen können
genannt werden kosmetische Produkte, Vitamine, pharmazeutisch aktive
Moleküle
und Moleküle,
die als Kontrastmittel für
die medizinische Bildgebung verwendet werden können, wie z.B. die von Uekama
und Irie in "Chemical
Review" (1998),
98, Seiten 2045–2076
[7], beschriebenen Verbindungen.
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Die
erfindungsgemäße hydrophobe
chemische Verbindung ist vorzugsweise ein pharmazeutisch aktives
Molekül.
Als Beispiele für
solche Moleküle
können
genannt werden die Steroide, beispielsweise das Prednisolon, die
Neurotrope, beispielsweise das Dothiepin, die Bakteriostatika, beispielsweise
das Chloramphenikol, die Vitamine, beispielsweise Vitamin A, die
Gefäßwand-Tonika,
beispielsweise Escu lin, und die Kontrastmittel für die medizinische Bildgebung,
beispielsweise die 16-Iodo-3-methylhexadecansäure.
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Diese
Einschlusskomplexe können
nach klassischen Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch
Zugabe einer Lösung
der hydrophoben Verbindung in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z.B.
in Aceton, zu einer Lösung
oder Suspension des verwendeten Cyclodextrins der Formel (I).
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Die
Cyclodextrin-Derivate der Formel Formel (I) haben die Eigenschaft,
sich in einem wässrigen
Medium spontan zu autoorganisieren unter Bildung von Nanoteilchen
mit einem mittleren Radius von 25 bis 30 Å (2,5–3,0 nm), die vollständig kugelförmig sind.
Die mittlere Anzahl der Monomeren beträgt 24 Moleküle der Cyclodextrin-Derivate
pro Nanoteilchen.
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Außerdem betrifft
die Erfindung auch eine wässrige
Lösung
von Nanoteilchen aus einem Cyclodextrin-Derivat der Formel (I) allein
oder in Form eines Einschlusskomplexes mit einer hydrophoben Verbindung.
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Diese
Lösung
von Nanoteilchen kann hergestellt werden, indem man eine wässrige Lösung des
Cyclodextrin-Derivats oder eines Einschlusskomplexes dieses Derivats
herstellt, die eine Konzentration an Derivat oder Komplex aufweist,
die höher
ist als die kritische Micellen-Konzentration des Derivats.
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Die
Autoorganisation der amphiphilen Cyclodextrine zu Nanoteilchen in
einem wässrigen
Medium erlaubt die Sicherstellung des Transports eines hydrophoben
Moleküls,
wie z.B. eines Wirkstoffes, insbesondere auf transmembranalem oder
parenteralem Wege.
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Die
erfindungsgemäßen Cyclodextrin-Derivate
sind besonders vorteilhaft, weil sie in organisierte Systeme von
oberflächenaktiven
Agentien (Tensiden) eingearbeitet werden können, wie z.B. in kleine Phospholipid-Vesikula
oder Micellen. Diese Einarbeitung dient dazu, die Solubilisierung
von organisierten Systemen zu ermöglichen, um den Transport von
Wirkstoffen, die in dem Cyclodextrin-Derivat eingeschlossen sind,
zu gewährleisten.
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Außerdem betrifft
die Erfindung ein organisiertes System von oberflächenaktiven
Agentien (Tensiden), das ein erfindungsgemäßes Cyclodextrin-Derivat oder
einen erfindungsgemäßen Einschlusskomplex
dieses Derivats umfasst. Die oberflächenaktiven Agentien (Tenside),
die solche organisierten Systeme bilden können, können solche unterschiedlichen
Typs sein. Als Beispiele dafür
können
genannt werden die Phospholipide der nachstehend angegebenen allgemeinen
Formel:
worin
R
5 steht für CH
3-(CH
2)
p-CO, wobei p für eine ganze
Zahl von 6 bis 18 steht. Diese Phospholipide können unilamellare kleine Vesikula
bilden. Dies ist insbesondere der Fall bei Dimyristoylphosphatidylcholin
(DMPC), das der oben angegebenen Formel mit p = 12 entspricht.
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Um
das erfindungsgemäße Cyclodextrin-Derivat
oder einen erfindungsgemäßen Einschlusskomplex dieses
Derivats in das organisierte System von oberflächenaktiven Agentien (Tensiden)
einzuarbeiten, kann man vorher kleine DMPC-Vesikula herstellen durch
Ultraschall-Behandlung und anschließende Zugabe des Cyclodextrin-Derivats
oder des Einschlusskomplexes zu der wässrigen Lösung. Das dabei erhaltene gemischte
System wird dann in Wasser vollständig löslich, wobei man eine klare
Lösung
erhält.
Das in diesem Fall erhaltene gemischte System ist eine gemischte
Micelle mit einem mittleren Radius von 60 Å (6,0 nm).
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Die
Erfindung betrifft außerdem
eine wässrige
Lösung,
die in gelöster
Form enthält
ein gemischtes System, das hergestellt worden ist aus Vesikula von
Phospholipiden oder Membran-Proteinen und mindestens einem Cyclodextrin-Derivat
oder mindestens einem Einschlusskomplex des Cyclodextrin-Derivats
gemäß der vorliegenden
Erfindung.
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Derartige
Lösungen
sind interessant (vorteilhaft), weil sie den Transport von hydrophoben
Molekülen, beispielsweise
eines Wirkstoffes, auf transmembranalem oder parenteralem Wege gewährleisten,
für physikalische
oder kosmetische Anwendungen.
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Weitere
Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der Lektüre der nachfolgenden
Beispiele, welche die Erfindung lediglich erläutern, ohne sie jedoch darauf
zu beschränken,
unter Bezugnahme auf die beiliegenden 1 bis 5 hervor.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 erläutert ein
Versuchsneutronen-Diffusionsspektrum einer wässrigen Lösung von Nanoteilchen des in
Beispiel 1 erhaltenen erfindungsgemäßen Cyclodextrin-Derivats in
logarithmischem Maßstab
mit drei theoretischen Diffusions-Kurven von kugelförmigen Micellen, zylindrischen
Micellen und Doppelschicht-Micellen.
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2 erläutert das
Aussehen verschiedener Mischungen von Cyclodextrin und Phospholipid.
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3, 4 und 5 erläutern jeweils
die kernmagnetischen 31P-Resonanzspektren,
die erhalten wurden ausgehend von der Probe a (3),
der Probe b (5) und der Probe d (4)
des Beispiels 3.
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Die 6 erläutert das
Versuchsneutronen-Diffusionsspektrum einer Mischung von DMPC und
Cyclodextrin-Derivat (Probe d), die in Beispiel 3 erhalten wurde,
in logarithmischem Maßstab
mit drei theoretischen Diffusionskurven von kugelförmigen Micellen,
zylindrischen Micellen und Doppelschicht-Micellen.
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Die 7 erläutert Versuchsneutronen-Diffusionsspektrum
von Mischungen der 16-Iodo-3-methylhexadecansäure und des Cyclodextrin-Derivats
des Beispiels 1 (Molverhältnis
1/1 und 0,5/1) sowie das Neutronen-Diffusionsspektrum des Cyclodextrin-Derivats
des Beispiels 1 allein in logarithmischem Maßstab mit der theoretischen
Diffusionskurve nur von Nanoteilchen.
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Detaillierte Beschreibung
von Ausführungsformen
der Erfindung
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Beispiel 1
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(Synthese von Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
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Diese
Verbindung ist ein Derivat der Formel (I), in der R1 steht
für die
Gruppe der Formel (III), R2 steht für die Methylgruppe,
R3 steht für N, alle Reste R4 stehen
für OCH3, m steht für die Zahl 2 und n steht für die Zahl
6.
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a) Herstellung von Mono-6-azido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6"",6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
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In
einem Kolben löst
man 2 g (1,7 mmol) Mono-6-azido-6-desoxy-cyclomaltoheptaose (hergestellt
beispielsweise nach dem in "Tetrahedron
Lett." (1993), 34,
Seiten 2457–2460
[8], und in "J.
Chem. Soc. Perkin Trans",
2 (1995), Seiten 723–730)
[9], beschriebenen Versuchsprotokoll) in 15 mL wasserfreiem Dimethylsulfoxid.
Diese Lösung
wird mit 15 mL wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) versetzt. Anschließend gibt
man in einer Stickstoffatmosphäre
und unter lebhaftem Rühren
3,8 g (~ 12 mmol) Bariumhydroxidoctahydrat und 3,6 g (~ 24 mmol)
Bariumoxid zu. Nach dem Homogenisieren des Mediums gibt man 8 mL
Dimethylsulfat (~84 mmol) zu und lässt unter lebhaftem Rühren in
einer Stickstoffatmosphäre
30 h lang bei 8 °C
stehen. Die Suspension mit einem milchartigen Aussehen wird anschließend mit
5 mL 20 %igem Ammoniak versetzt und 3 h lang bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Man lässt
in einem Kühlschrank über Nacht
absitzen. Nach dem Einengen der überstehenden
Flüssigkeit
unter vermindertem Druck wird der feste Rückstand mit 100 mL Dichlormethan
und dann noch zweimal mit 50 mL Dichlormethan wieder aufgenommen.
Die organischen Phasen werden vereinigt, 3 mal mit 20 mL einer gesättigten
Natriumchlorid-Lösung,
2 mal mit 2 ml Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet
und unter vermindertem Druck eingeengt. Das Produkt wird durch Zugabe von
100 mL n-Hexan ausgefällt,
abfiltriert, mit 100 mL n-Hexan gewaschen und unter Vakuum getrocknet.
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Man
erhält
0,80 g (0,60 mmol) Mono-6-azido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose,
die in Form eines weißen
Pulvers vorliegt.
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b) Herstellung von Mono-6-amino-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2"""6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
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Man
löst 0,75
g (0,56 mmol) der im Abschnitt (a) erhaltenen Verbindung in 30 mL
DMF. Zu dieser Lösung
tropft man unter Rühren
bei Umgebungstemperatur 0,75 g (2,86 mmol) Triphenylphosphin in
5 mL DMF zu. Das Reaktionsmedium wird 2 h lang bei Umgebungstemperatur
gehalten, auf 0 °C
abgekühlt
und mit 14 mL 20 %igem Ammoniak behandelt. Man lässt 18 h lang bei Umgebungstemperatur
unter Rühren
stehen, dann wird das Lösungsmittel
unter vermindertem Druck entfernt und der feste Rückstand
wird in 30 mL Wasser wieder aufgenommen. Das überschüssige unlösliche Triphenylphosphin und
das entsprechende Oxid werden durch Filtrieren entfernt. Die wässrige Lösung wird
unter Vakuum eingeengt und der Rückstand
wird durch Ionenaustauscherharz-Säulenchromatographie gereingit
(Lewatit® SP
1080-Harz in der H+ Form). Man erhält so 0,35
g (0,27 mmol) Mono-6-amino-6- desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methylcyclomaltoheptaose,
das in Form eines weißen
Pulvers vorliegt.
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c) Herstellung von Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2',2",2"',2"",2""',2""",6' 6",6"',6"",6"",6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
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Zu
einer Lösung
von 0,25 g (0,19 mmol) der im Abschnitt (b) erhaltenen Verbindung
in 6 mL wasserfreiem DMF gibt man unter einer Stickstoffatmosphäre und unter
Rühren
bei Umgebungstemperatur 0,019 g (0,19 mmol) Bernsteinsäureanhydrid
in 2 mL wasserfreiem DMF zu. Das Reaktionsmedium wird 5 h lang bei Umgebungstemperatur
gehalten, dann mit 0,11 mL (0,76 mmol) N,N'-Diisopropylcarbodiimid und 0,028 g
(0,19 mmol) Hydroxybenzotriazol in 2 mL wasserfreiem DMF versetzt.
Nach 30-minütigem
Rühren
bei Umgebungstemperatur gibt man 0,089 g (0,23 mmol) Cholest-5-en-3α-ylamin (hergestellt
in zwei Stufen aus Cholest-5-en-3p-ol nach den in "Tetrahedron Lett." (1977), Seiten 1977–1980 [10],
beschriebenen Versuchsprotokollen) zu. Die Reaktionsmischung wird
48 h lang bei Umgebungstemperatur unter Rühren stehen gelassen, durch
Zugabe von 0,30 mL Wasser hydrolysiert und unter vermindertem Druck
eingeengt. Der feste Rückstand wird
durch Chromatographie an einer Silicagel-Kolonne eingeengt (Silicagel
60 Fluka; Eluierungsmittel: CH2Cl2-MeOH 95 : 5, dann 9 : 1, bezogen auf das
Volumen). Man erhält
so 0,24 g Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose.
-
(71
% Ausbeute an reiner Endverbindung, ausgehend von Mono-6-amino-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose).
-
Die
Charakteristika dieser Verbindung sind die folgenden:
- – Dünnschichtchromatographie
(Siliciumdioxid-Platte von Merck) Rf = 0,50 in der Mischung CH2Cl2-MeOH (Volumenverhältnis 9:1),
entwickelt mit 10 %iger H2SO4.
- – Massenspektrometrie:
ESI-MS: m/z = 1805,95
[M+Na]+ für C86H146N2O36Na.
- – NMR1H (500 MHz, 25 °C, 7 mM Lösung in CDCl3):
Zuordnung durch COSY- und COSY-Relais-Versuche: δ = 6,49 (NH CD), 5,70 (NH Chol),
5,38 (H-6 Chol), 5,28-4,88
(H-1, OH-3 CD), 4,11 (N-3 Chol), 3,99–3,16 (H-2, H-3, H-4, H-5,
H-6, H-6', OCH3 CD), 2,60–2,48 (CH2 succ,
H-4 Chol), 2,04–0,68
(H Chol).
-
Beispiel 2
-
Herstellung von Nanoteilchen
aus Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
-
Man
stellt Nanoteilchen aus Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
her, indem man einfach eine wässrige
Lösung
dieses Cholesteryl-cyclodextrins in einer Konzentration herstellt,
die höher
ist als die kritische Micellen-Konzentration
(cmc).
-
Die
cmc des Cyclodextrins des Beispiels 1 wurde bestimmt durch Messung
der Oberflächenspannung. Der
cmc-Wert liegt bei 9.10–6 mol/L.
-
Der
mittlere hydrodynamische Durchmesser der Nanoteilchen wurde durch
quasi-elastische Licht-Diffusion bestimmt. Der Wert des mittleren
Durchmessers (DM), errechnet nach der Stokes-Einstein-Annäherung auf
der Basis des Modells der vollkommenen Kugeln ohne Wechselwirkung
beträgt,
0,6 nm (60 A). Die Analyse durch statische Licht-Diffusion von wässrigen
Lösungen
von Nanoteilchen mit unterschiedlichen Konzentrationen (2,5 .10–3,
5 .10–3 und
10–2 mol/L)
ergibt eine mittlere Masse der Aggregate von 43 000 g/mol, dies
entspricht im Mittel 24 Monomeren pro Nanoteilchen.
-
Die
Analyse durch statistische Licht-Diffusion mit wässrigen Lösungen von Nanoteilchen bei
unterschiedlichen Konzentrationen (2,5 . 103,
5 .10–3 und
10–2 mol/L)
ergibt eine mittlere Masse der Aggregate von 43 000 g/mol, dies
entspricht im Mittel 24 Monomeren pro Nanoteilchen.
-
Die
vollkommen kugelförmige
Gestalt sowie die Größe der Nanoteilchen
wurden durch Neutronen-Diffusion bestätigt. Das, ausgehend von einer
Lösung
von 10–2 mol/L
des Cyclodextrin-Derivats des Beispiels 1, in D2O
erhaltene Diffusionsspektrum ist in der 1 dargestellt
(Spektrum 1).
-
In
der 1 sind auch die theoretischen Spektren, die Kugeln
simulieren (Spektrum 2), die Zylinder simulieren (Spektrum 3) oder
Lamellen simulieren (Spektrum 4), dargestellt, die erhaltenen wurden,
ausgehend von dem Cyclodextrin-Derivat
des Beispiels 1 in einer Konzentration von 10–2 mol/L
in D2O. Die Überlage rung des Spektrums 2,
das die Kugeln simuliert, mit dem experimentellen Spektrum 1 beweist
die kugelförmige
Gestalt der Cholesterylcyclodextrin-Aggregate. Diese Aggregate sind
auf der Oberfläche
von Hohlräumen
von Cyclodextrinen angeordnet, die für den Einschluss von hydrophoben
aktiven Molekülen
verfügbar sind,
wobei das Herz aus Cholesterin-Gruppen besteht. Das theoretische
Spektrum, welches die Kugeln simuliert, ergibt einen mittleren Durchmesser
von 0,5 nm (50 Å)
und eine mittlere Anzahl von Monomeren pro Nanoteilchen von 24.
-
Beispiel 3
-
Herstellung von gemischten
Systemen aus Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
und Di-myristoyl-phosphatidylcholin (DMPC)
-
Man
stellt eine wässrige
Suspension mit 15.10–3 mol/L DMPC entweder
in der Form von multilamellaren Vesikula mit großer Teilchengröße (MLVs),
oder in der Form von unilamellaren Vesikula mit geringer Teilchengröße (SUVs)
her, indem man die Herstellungsprotokolle anwendet, die beispielsweise
in "Liposomes: a practical
approach", R.R.C.
New Ed., IRL Press, Oxford University Press, 1990 [11], beschrieben
sind. Zu der Suspension von MLVs oder SUVs von DMPC gibt man das
Cyclodextrin des Beispiels 1 in der Weise zu, dass die Endkonzentration
des Cyclodextrins in der wässrigen
Cyclodextrin/DMPC-Mischung 0,5.10–3 oder
2,5.10–3 mol/L
entspricht.
-
Die 2 erläutert das
Aussehen der verschiedenen Mischungen nach 12 h bei 25 °C. In dem
Reagensglas a handelt es sich um eine wässrige Suspension von unilamellaren
Vesikula von 15 mM DMPC. Die Reagensgläser c und d entsprechen den
Mischungen DMPC/Cyclodextrin: 15.10–3/0,5.10–3 bzw. 15.10–3/2,5.10–3 mol/L.
-
Das
Reagensglas b stellt ein "Vergleichs-Reagensglas" dar, das der Mischung
DMPC/Heptakis(2,6-di-O-methyl)cyclomaltoheptaose (15.10–3/2,5.10–3 mol/L,
entsprechend einer Mischung von DMPC mit einem Cyclodextrin, das
keinen Steroid-Substituenten
enthält,
entspricht.
-
Die
verschiedenen Mischungen werden durch 31P-NMR-Spektroskopie
bei 81 MHz untersucht.
-
Die 3 stellt
das dem Reagensglas a entsprechende Spektrum dar (nur DMPC);
-
die 4 stellt
das dem Reagensglas d entsprechende Spektrum dar (Mischung DMPC/Cyclodextrin: 15.10–3/2,5.10–3 mol/L);
-
die 5 stellt
das dem Reagensglas b entsprechende Spektrum dar (Mischung DMPC/Cyclodextrin des
Standes der Technik).
-
Das
Vorliegen von unilamellaren kleinen Vesikula aus DMPC in dem Reagensglas
a wird in dem Spektrum der 3 bestätigt durch
die Anwesenheit von zwei sehr feinen Peaks bei 0 ppm, die den innerhalb
und außerhalb
der Vesikula angeordneten Phosphoratome entsprechen.
-
Das
Spektrum der 4, das der Probe d entspricht,
die vollkommen transparent ist, vermindert sich auf einen einzigen
feinen Peak, der bei 0 ppm zentriert ist, der die Anwesenheit von
kleineren Aggregaten als die unilamellaren Vesikula des Reagensglases
a anzeigt. Das dem "Vergleichs-Reagensglas" b entsprechende
Spektrum zeigt die Bildung von größeren Vesikula als die Ausgangs-Vesikula
an. Es tritt keine Reorganisation des Mediums mit diesem Cyclodextrin
auf.
-
In
dem Reagensglas c ist die Menge an erfindungsgemäßem Cyclodextrin zu gering
im Verhältnis
zur DMPC-Menge, um zu einer transparenten Lösung wie in dem Reagensglas
d zu führen.
Man erhält
eine Biphasen-Mischung.
-
Der
mittlere hydrodynamische Durchmesser der gemischten Aggregate der
Probe d wurde durch quasi-elastische Licht-Diffusion gemessen. Der
Wert des mittleren Durchmessers (DM), errechnet nach der Stokes-Einstein-Annäherung auf
der Basis des Modells von vollkommenen Kugeln ohne Wechselwirkung,
beträgt
13 nm (130 Å).
-
Anschließend untersucht
man die Probe d durch Neutronendiffusion.
-
Die 6 erläutert das
erhaltene Diffusionsspektrum (Spektrum 5). In der 6 sind
auch die theoretischen Spektren dargestellt, die Kugeln simulieren
(Spektrum 6), Zylinder simulieren (Spektrum 7) oder Lamellen simulieren
(Spektrum 8), die, ausgehend von der Mischung DMPC/Cyclodextrin
des Beispiels 1 mit dem Verhältnis
15.10–3/2,5.10–3 mol/L,
in D2O gebildet wurden. Die Überlagerung
des Spektrums 6, welches Kugeln simuliert, mit dem experimentellen
Spektrum 5 beweist die kugelförmige
Gestalt der gemischten Aggregate DMPC/Cyclodextrin des Beispiels
1. Diese gemischten kugelförmigen
Systeme sind an der Oberfläche der
Hohlräume
von Cyclodextrinen angeordnet, die hydrophobe aktive Moleküle ein schließen können. Das theoretische
Spektrum, das die Kugeln simuliert, ergibt einen mittleren Durchmesser
von 10,8 nm (108 Å).
-
Beispiel 4
-
Herstellung
von Einschlusskomplexen der Verbindung Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2""',2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose
mit verschiedenen hydrophoben aktiven Molekülen Zu einer wässrigen
Lösung von
Nanoteilchen aus Mono-6-(cholest-5-en-3α-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2",2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose,
wie sie in Beispiel 2 erhalten wurde, gibt man einfach die hydrophobe
Verbindung entweder direkt oder gelöst in einem geeigneten organischen
Lösungsmittel,
beispielsweise in Aceton, zu, die man langsam an der freien Luft
eindampfen lässt.
-
Verschiedene
hydrophobe aktive Moleküle
wurden getestet und es wurde gezeigt, dass sie mit dem Cyclodextrin
des Beispiels 1 Einschlusskomplexe bilden können. Auf diese Weise wurde
in einem wässrigen Medium
durch Bildung eines 16-Iodo-3-methylhexadecan-Säure-Einschlusskomplexes
eine als Kontrastmittel für
die medizinische Bildgebung verwendete Fettsäure solubilisiert, die bereits
in Cyclodextrinen solubilisiert werden konnte, wie in FR-A-2 726
765 [12] beschrieben.
-
Die 7 zeigt
die Neutronen-Diffusionsspektren, die erhalten wurden mit:
- – einer
Lösung
von Nanoteilchen des Cyclodextrins von Beispiel 1 und der Fettsäure (1 :
0,5 Äq.
mol) (Spektrum 9);
- – eine
Lösung
von Nanoteilchen des Cyclodextrins des Beispiels 1 und der Fettsäure (1 :
1 Äq. mol)
(Spektrum 10); und
- – eine
Lösung
von Nanoteilchen von Cyclodextrin allein (Spektrum 11).
-
In
dieser Figur ist auch das theoretische Spektrum dargestellt (Spektrum
12), das Kugeln simuliert.
-
In
dieser Figur erkennt man, dass die Einarbeitung von Fettsäure-Molekülen in die
Nanoteilchen des Cyclodextrins des Beispiels 1 eine deutliche Modifizierung
im Bereich der Diffusionsspektren mit sich bringt. Die Intensität I (q)
ist erhöht.
Die Intensität
I (q) ist proportional zum Volumen der Nanoteilchen. Die Anwesenheit
von zusätzlichen
Molekülen
(Fettsäure-Molekülen) in
den Nanoteilchen hat den Effekt, dass der Wert für den Kontrast und somit die
Intensität
zunimmt.
-
Die
Einarbeitung der folgenden hydrophoben Verbindungen in Nanoteilchen
von Mono-6-(cholest-5-en-3c-ylamido)succinylamido-6-desoxy-2,2',2"',2"",2""',2""",6',6",6"',6"",6""',6"""-trideca-O-methyl-cyclomaltoheptaose:
- – Dothiepin
(Neurotrop),
- – Chloramphenicol
(Bakteriostatikum),
- – Vitamin
A, und
- – Esculin
(Gefäßwand-Tonikum)
wurde
ebenfalls durch Neutronendiffusion nachgewiesen.
-
Zitierte Literaturstellen
-
- [1]: D. Duchêne, "Pharmaceutical Applications
of Cyclodextrins",
erschienen in "Cyclodextrins
and their industrial uses",
Editions de Santé,
Paris 1987, Seiten 213–257.
- [2]: A. Yabe et al., "Thin
Solid Films", (1988),
160, Seiten 33–41.
- (3]: L. Jullien et al., "J.
Chem. Soc. Perkin Trans" 2,
1993, Seiten 1011–1022.
- [4]: A. Gulik et al. in "Langmuir" (1998), 14, Seiten
1050–1057.
- [5]: FR-A-2 736 056.
- [6]: "J. Chem.
Soc. Perkin Trans" 2,
(1998), Seiten 2638–2646.
- [7]: Uekama et Irie in "Chemical
Review" (1998),
98, Seiten 2045–2076.
- [8]: "Tetrahedron
Lett." (1993), 34,
Seiten 2457–2460.
- [9]: "J. Chem.
Soc. Perkin Trans" 2
(1995), Seiten 723–730.
- [10]: "Tetrahedron
Lett." (1977), Seiten
1977–1980.
- [11]: "Liposomes:
a practical approach",
R.R.C. New Ed., "IRL
Press, Oxford University Press",
(1990).
- [12]: FR-A-2 726 765.