DE2712030C2

DE2712030C2 - Entzündungshemmende pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an Liposomen

Info

Publication number: DE2712030C2
Application number: DE2712030A
Authority: DE
Inventors: John Thomas Whittlesford Cambridge Dingle; John Laurie Cambridge Gordon; Geraint Gawsworth Macclesfield Cheshire Jones; Clive Graham Fenstation Huntingdon Cambridgeshire Knight; John Saunders Wilsmlow Cheshire Lowe
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1976-03-19
Filing date: 1977-03-18
Publication date: 1985-10-03
Also published as: ZA771090B; DE2712030A1; NL7702954A; DE2712031A1; AU2268077A; BE852444A; CA1075156A; FR2344287B1; NZ183411A; BE852445A; JPS52143218A; AU509606B2; FR2344290A1; FR2344287A1; GB1523965A; JPS52114026A; US4427649A; ZA771091B; IE44865L; IL51568A

Description

Cortisol-21-hexadecanoat, Fluorcinolonacetonid-21-hexadecanoat, Dexamethason-21-hexadecanoat

oder Cortisol-21-octanoat Cortisol-21-cyclohexancarboxylat, Cortisol-21-(2-methyl-dodecanoat),
Cortisol-21-cyclopentylacetatCortisol-21-(2-äthyl-hexanoat),Cortisol-21-pivalatoder
Prednisolon-21-hexadecanoat

Die Erfindung bezieht sich auf eine entzündungshemmende pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an Liposomen.

In den letzten Jahren bestand ein zunehmendes Interesse für die Verwendung von Liposomen als Träger für Wirkstoffe, Enzyme, immunologische Hilfsstoffe und insbesondere auch Medikamente (siehe z.B. DE-OS 25 32 317 und Clinical Science and Molecular Medicine, 49 (1975), 99-106). Liposome sind in der Literatur vielfach beschrieben. Ihre Struktur ist allgemein bekannt Es handelt sich um zwiebelartige Strukturen, die eine

Reihe von Lipidschichten aufweisen, die voneinander durch ein wäßriges Material getrennt sind, wobei die äußerste Schicht aus Lipid besteht Formulierungen mit Liposomträgern werden im allgemeinen intravenös, subkutan oder oral verabreicht Sie besitzen den Vorteil, daß durch den Einschluß des Wirkstoffs in ein Liposom die Wirkstoffabgabe verzögert werden kann. So ist es beispielsweise durch die direkte Verabreichung von Liposomen in einen Hohlraum, in welchem eine Entzündung vorliegt, möglich, eine erhdhte Retension des

Mittels an der gewünschten Wirkungsstelle zu erreichen, wodurch ein Vorteil sowohl hinsichtlich der Wirkung gegen die Entzündung als auch hinsichtlich der Beschränkung irgendwelcher Nebeneffekte erzielt wird.

Aus der vorstehend zitierten Literatur ist es auch bekannt, steroidhaltige Arzneimittel in Liposome einzuarbeiten.
Es hat sich aber gezeigt, daß der Gehalt an wirksamen Steroid in den Liposomen verhältnismäßig schnell

verringert wird. So fällt beispielsweise der Cortisolgehalt von Liposomen, die aus Dipalmitoyl-phosphatidylcho-Hn hergestellt sind und 30% Cortisol enthalten, bei einer Inkubation während 3 Tagen bei 37° C auf 12% des Anfangsgehalts.

Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß durch die Einarbeitung von am C-Atom 21 lipophil substituierten Corticosteroiden (wie sie beispielsweise aus J. Med. Chem. 18,9 (1975) S. 873—883 sowie Chem.

Abstracts, 71 (1969), Ref. 105 200, und 76 (1972), Ref. 149 315, bekannt sind) in nach bekannten Verfahren hergestellte Liposome Produkte erhalten werden, bei denen der Steroidgehalt wesentlich langsamer abfällt.

Gegenstand der Erfindung ist also eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an Liposomen, die entzündungshemmende Steroide enthalten, wobei das Kennzeichen darin liegt, daß das Steroidgerüst von Hydrocortison, Cortisol oder einem Λ 1-Dehydro- oder 9-Fluoroderivat davon über die Hydroxygruppe am

C-Atom 21 durch eine cyclische oder acyclische Kohlenwasserstoffkette mit 6 bis 25 Kohlenstoffatomen lipophil verestert ist.

Es wurde beispielsweise gefunden, daß beim Einsatz von Cortisoloctanoat oder Cortisolpalmitat anstelle von Cortisol bei dem vorstehend genannten Test nach einer 3-tägigen Inkubation bei 37° C noch 40 bzw. 71% der ursprünglichen Wirkstoffmenge erhalten waren.

Die erfindungsgemäßen Liposome finden insbesondere Anwendung bei der Behandlung von rheumatischen

Erkrankungen, wobei die Liposome intraartikulär verabreicht werden, sie ist aber auch bei der Behandlung von

Entzündungen an anderen Stellen mit einem Hohlraum anwendbar, wie z. B. bei den Augen, der Lunge, den Hoden und im Bauchfell.

Die ersten Stufen der Herstellung von Liposomen gemäß der Erfindung folgen zweckmäßig in der Technik

beschriebenen Verfahren, d. h., daß die Lipidausgangsmaterialien in einem Lösungsmittel aufgelöst werden, das dann eingedampft wird, worauf die resultierende Lipidschicht in dem gewählten wäßrigen Medium dispergiert wird. Im Gegensatz zur üblichen Praxis wird es jedoch bevorzugt, die so hergestellten Liposome nicht zu be challen, da hierdurch ihre Größe verringert wird. Die durch ein solches Verfahren hergestellten Liposome besitzen üblicherweise einen Größenbereich. Die erfindungsgemäßen Liposome besitzen vorzugsweise einen Durchmesser von mehr als 100 nm, insbesondere mehr als 250 nm und ganz besonders mehr als 500 nm. Es ist beispielsweise bekannt, daß Liposome mit einem Durchmesser bis zu 5000 nm leicht phagocytosiert werden können. Es wird deshalb bevorzugt, daß die durch diese Technik hergestellten Liposome fraktioniert werden, um im wesentlichen alle diejenigen zu entfernen, die Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise weniger

als 250 nm und ganz besonders weniger als 500 nm aufweisen. Die Fraktionierung erfolgt zweckmäßig durch Molekularsiebchromatografie. Die Größe des Siebs wird entsprechend der gewünschten Liposomgröße ausgewählt

Es kann eine große Reihe von Lipidmaterialien zur Herstellung der Liposome verwendet werden, jedoch werden Lipide, die nichtimmunogen und biologisch abbaubar sind, bevorzugt Die Eigenschaften des Lipids, beispielsweise seine Phasenübergangstemperatur, können einen wesentlichen Einfluß auf die Retention und Aufnahme der Liposome im Hohlraum haben, und aus diesem Grunde werden die gut definierten synthetischen Lecithine den natürlichen Lecithinen vorgezogen. Beispiele für synthetische Lecithine, die verwendet werden können, sind zusammen mit ihrer entsprechenden Phasenübergangstemperatur in der Folge aufgeführt: Di(tetradecanoyQphoshatidylcholin (23°C), Di(hexadeconyl)phospbatidylcholin (41°C) und Di(octadecanoyl)phosphatidylcholin (55° C). Andere synthetische Lecithine, die verwendet werden können, sind ungesättigte synthetische Lecithine, wie z.B. Di(oleyl)phosphatidylcholin und DiOinoleylJphosphatidylcholin. Bevorzugte synthetische Lecithine sind Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin und D^octadecanoyfyphosphatidylcholin (letzteres ggf. mit einem ungesättigten Lecithin, so daß das Gemisch eine Phasenübergangstemperatur aufweist, die niedriger als diejenige des erwähnten Octadecanoylderivats liegt, beispielsweise eine Phasenübergangstemperatür im Bereich von 35 bis 45° C). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Gemisch von Lecithinen und insbesondere ein Gemisch von synthetischen Lecithinen verwendet welches eine beständige Abgabe des Steroidderivats innerhalb des Hohlraums ergibt Zusätzlich zu dem hauptsächlichen liposombildenden Lipid oder den hauptsächlichen liposombildenden Lipiden, die üblicherweise Phospholipide sind, können auch andere Lipide mit verwendet werden. Beispielsweise kann Cholesterin verwendet werden, die Struktur der Liposommembran zu modifizieren, damit sie fließfähiger oder härter wird, je nach der Natur des hauptsächlichen liposombildenden Lipids oder der hauptsächlichen liposombildenden Lipide. Eine fakultative dritte Komponente ist ein Material, das eine negative Ladung beisteuert, wie z. B. Phosphatidinsäure, Dicethylphosphat oder Rinderhirngangliosid, oder ein solches, welches eine positive Ladung beisteuert, wie z. B. Stearylaminacetat

Ein geeignetes Steoridderivat für die Verwendung gemäß der Erfindung ist ein antiinflammatorisches Corticosteroid, welches chemisch modifiziert worden ist so daß es einen lipophilon Substituenten trägt Das Corticosteroid kann (vor seiner Modifizierung) beispielsweise Corticosteron oder Cortisol (d. h. Hydrocortison oder 17-Hydroxycorticosteron) oder ein Derivat einer dieser Verbindungen sein, einschließlich des A -Dehydro- oder 9-Fluoroderivats, wie z. B. Prednisolon (J'-Dehydrocortisol), Methylprednisolon (öa-Methyl-J'-dehydrocortisol), Paramethason (6λ-Fluoro- 16«-methylprednisolon), Fluocinolonacetonid (6«,9<*-Difluoro-16^hydroxyprednisolon-16,17-acetonid), Fludrocortisonacetat (9«-Fluorocortisol-21-acetat), Triamcinolon (^ar-Fluoro-ieÄ-hydroxy-J'-dehydrocortisol) oder Dexamethason (9a:-FIuoro-16«-methyl-.<4¹-dehydrocortisol). Eine bevorzugte Gruppe besteht aus antiinflammatorischen Corticosteroiden, die einen 11-Hydroxysubstituenten tragen.

Die Anknüpfung des lipophilen Substituenten an der 21-Stellung eines Steroids wird bevorzugt, wenn dies zweckmäßig ist, jedoch kann auch eine Anknüpfung an anderen Ringstellungen, wie z.B. an der 11- oder 17-Stellung, in Betracht gezogen werden. Der Substituent leitet seinen lipophilen Charakter zweckmäßig von der Anwesenheit einer Kohlenwasserstoffkette ab, die cyclisch oder acyclisch sein kann, aber üblicherweise einen aliphatischen Charakter und weniger einen aromatischen Charakter hat. Die Kohlenwasserstoffkette kann Substituenten tragen und durch die Anwesenheit mindestens eines Heteroatoms, wie z. B. eines Sauerstoffatoms, unterbrochen sein, enthält aber zweckmäßig mindestens 4 und vorzugsweise 6 bis ungefähr 25 Kohlenstoffatome. Die Anknüpfung des Substituenten erfolgt zweckmäßig durch eine geeignete funktionell Gruppierung, die in die Verbindung eingeführt wird oder vorzugsweise bereits dort vorliegt. Eine besonders zweckmäßige funktionell Gruppe für diesen Zweck ist die Hydroxygruppe. Der lipophile Substituent wird oftmals an das Steroidringsystem beispielsweise durch den Rest einer solchen Gruppe oder einer anderen Gruppe mit einer Hydroxygruppe, wie z. B. —CO-CH2—OH, gebunden sein. Die Anknüpfung des Substituenten an die Hydroxygruppe kann zweckmäßig durch die Bildung einer Äther- oder einer Carbonsäure- oder einer Carbomoylestergruppierung erfolgen, wobei der Substituent dann zweckmäßig eine Kohlenwasserstoffkette R—, eine Alkanoylgruppe RCO- oder eine substituierte Carbamoylgruppe RN HCO- umfaßt. Die Kohlenwasserstoffkette R kann in jedem Fall cyclisch sein, wie dies bei Cyclohexyl der Fall ist, ist aber vorzugsweise acyclisch, nämlich geradkettig oder verzweigt. Sie kann gesättigt oder ungesättigt sein. Eine solche Gruppe R kann eine Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl-, Decyl-, Undecyl-, Dodecyl-, Tridecyl-, Tetradecyl-, Pentadecyl-, Hexacyl-, Heptadecyl- oder Octadecylgruppe sein. Die Gruppen mit mindestens 7 oder 8 und insbesondere 15,16 oder 17 Kohlenstoffatomen sind von besonderem Interesse. Besonders bevorzugte Verbindungen enthalten eine Alkanoylgruppe mit 16 oder 18 Kohlenstoffatomen, d. h. eine Hexadecanoyl- oder Octadecanoylgruppe.

Wie oben bereits festgestellt, sind Steroide, die an der 21-Stellung modifiziert sind, von besonderem Interesse. Beispiele für solche Steroid? sind solche, wie z. B. Cortisol, welche die folgenden Seitenketten an der 17-Stellung gebunden enthalten (wobei darauf hinzuweisen ist, daß die anfängliche —COCHjO-Gruppierung in den folgenden Seitenketten der —COCHjOH-Gruppe entspricht, die an der 17-Stellung des Cortisols selbst substituiert ist): ....

-COCH₂O-(CHj)₇CH₃ -COCH₂O-(CHj)₁₇CH₃

-COCHjO-C(CH₃MCHj)₄CH₃ —C0CH₂0^^h\

-COCH₂O-CO(CHj)₆CH₃ -COCH₂O-CO(CHj)₁₄CH₃

-COCH₂O-CO(CH₂)UCh₃ —COCH₂O--CO(CHj)₂CO₂H

-COCH₂O-COC(CH₃MCH₂)JCh₃ — COCH₂O- CO

-COCH₂O-CONH(Ch₂)SCH₃ -COCH₂O-CONH(Ch₂)I₆CH₃

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— COCH₂O-CONHC(CH₃)J(Ch₂)JCH₃ oder -COCH₂O-CONH—C H

Eine besonders bevorzugte Gruppe von Steroiden für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Liposomen setzt sich aus den antiinflammatorischen Corticosteroiden zusammen, die einen 11-Hydroxysubstituenten tragen und die weiterhin einen lipophilen Substituenten tragen, der mit Hilfe einer Carbonsäureestergruppierung an den Rest einer Hydroxygruppe gebunden ist, die selbst in der 21-Stellung des Corticosteroids vorliegt, wobei dieser lipophile Substituent eine acyclische aliphatische Kette von 7 bis 18 Kohlenstoffatomen aufweist.

Viele der erwähnten modifizierter' Steroidderivate sind neue Verbindungen. Diese Verbindungen stellen eine weitere Erscheinungsform der Erfindung dar. Spezielle neue Verbindungen der Erfindung sind: CortisoI-21-hexadecanoat, Cortisol-21-(2-methyldodecanoat), Cortisol-21-cyclopentylacetat, Cortisol-21-(2-äthylhexanoat), Prednisolon-21-hexadecanoat, Fluoänolonacetonid-21-hexadecanoat und Dexamethason-21-hexadecanoaL

Die erwähnten modifizierten Steroidderivate sind erhältlich durch herkömmliche Syntheseverfahren, die zur Anknüpfung des lipophilen Substituenten der beschriebenen Art herangezogen werden können, wie z. B. die Veresterung oder Veretherung von Hydroxygruppen, oder durch naheliegende chemisch analoge Verfahren. So kann beispielsweise die Veresterung mit einer Carbonsäure durch Reaktion der Hydroxygruppe eines Steroids mit der freien Säure, üblicherweise in Gegenwart eines geeigneten Kondensationsmittels, wie z. B. eines Carbondiimids, oder mit einem geeigneten funktionellen Säurederivat, wie z. B. dem Anhydrid oder Halogenid, durchgeführt werden, während die Veresterung mit einer substituierten Carbaminsäure durch Umsetzung mit einem Isocyanat erfolgen kann. Ein geeignetes Verätherungsverfahren ist beispielsweise die Umsetzung einer Hydroxygruppe in Form eines Sodioderivats (-O⁶Na^ mit einem Halogenid.

Die erfindungsgemäße Liposompräparate werden üblicherweise direkt in den Hohlraum, in welchem eine Entzündung vorliegt, verabreicht. Teilchen mit einer Größe von mehr als 250 nm können nicht leicht aus synovialen Gelenken entweichen. Die synovial fixierten Makrophagen können leicht die in das Gelenk eingespritzten Liposome phagocytosieren, so daß der größte Teil des injizierten pharmakologisch aktiven Materials die Zellen erreicht, die es erreichen soll. Dies bedeutet, daß viel geringere Dosen im Vergleich zu den üblicherweise verabreichten Steroiddosen verwendet werden können (wodurch gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit von unerwünschten Nebeneffekten verringert wird). Zwar hängt die Dosierung von dem verwendeten modifizierten Steroiddtrivat ab, jedoch sind Mengen von nur 1 mg bis hinunter zu 50 μg oder sogar noch weniger oftmals ausreichend. Es wird darauf hingewiesen, daß die Art dieses speziellen Formulierungsverfahrens auch die Verabreichung von Stoffen gestattet, die zu giftig sind, als daß sie durch übliche Verfahren verabreicht werden könnten.

Anwendungen der erfinungsgemäßen Zusammensetzungen bei anderen als rheumatischen Erkrankungen sind die Behandlung durch topisches Aufbringen bei gewissen inflammatorischen Augenerkrankungen, die Aerosolanwendung auf die Lunge bei allergischen und anderen Entzündungen und Hohlrauminjektionen zur Entzündungsbekämpfung in den Hoden und im Bauchfell.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

(a) (I) 8 mg synthetisches D^hexadecanoyljphosphatidylcholin, 1 mg Phosphatidinsäure und 1 mg Cortisol-21-octanoat in 1 ml Chloroform wurden in einem birnenförmigen Kolben mit 1,25 ml Chloroform gemischt. Das Lösungsmittel wurde dann durch Rotntionsverdampfung in Vakuum bei einer Temperatur von ungefähr 61° C verdampft (20⁰C über der Phasenübergangstemperatur des Lecithins). Der dabei auf den Wandungen des Kolbens gebildete dünne Lipidfilm wurde durch regelmäßiges heftiges Schütteln in 1 ml 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 735) bei der gleichen Temperatur wie die Rotationsverdampfung dispergiert. Die phosphat-gepufferte Salzlösung wurde wie folgt hergestellt:

Die folgenden Salze wurden in 2,51 destilliertem Wasser aufgelöst:

Natriumchlorid 106,25 g

Dinatrium-hydrogen-orthophosphat 40,20 g

Natrium-dihydrogen-orthophosphat 1,95 g

Die resultierende Lösung wurde mit 6 η Salzsäure auf pH 7,35 eingestellt. Diese Grundlösung wurde dann wie folgt verdünnt:

Phosphat-gepufferte Salzgrundlösung 100 ml Destilliertes Wasser 1,91 Natriumchlorid 12,75 g Diese Bestandteile wurden zur Herstellung einer 5 mM phosphatgepufferten Salzlösung (pH 7,35) gemischt.

Die resultierende Liposomsuspension wurde 1 st bei Raumtemperatur stehen gelassen, worauf die Liposome 3mal mit 1 ml 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 735) gewaschen und dann auf ein 30 cm χ 1,5 cm to messenden Kolonne aufgegeben wurden, die mit Control-Pore-Glasperlen (03—0,15 mm; theoretisches Exklusionslimit 250 nm) bepackt war, welche mit 1% G/G Carbowax 20 M vorbehandelt worden war. Die Kolonne war vor der Verwendung mit Latexteilchen bekannter Größe standardisiert worden. Die Kolonne wurde mit 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung eluiert, und die austretenden Fraktionen wurden durch Absorptionsspektralphotometrie bei 410 nm überwacht. Die liposomhaltigen Fraktionen bestanden aus Bläschen mit 500 bis 5000 nm Durchmesser, bestimmt durch (I) Elektronenmikroskopie, (II) Lichtmikroskopie und anschließende Anfärbung mit Acridinorange und Standardisierung mit Latexperlen bekannten Durchmessers und (III) Verteilung in einem Coulter-Counter mit einem 30 000 nm-Rohr, wobei wiederum Latexperlen bekannter Größe als Standard verwendet wurden.

Das im obigen Beispiel verwendete Cortisol-21 -octanoat wurde wie folgt erhalten:

50 mg Cortisol wurden in 1 ml Pyridin bei 0°C mit 0,05 ml Octanoylchlorid behandelt, und nach einer 16 st dauernden Reaktion, während der die Temperatur auf Raumtemperatur stieg, wurde das Lösungsmittel bei 40° C in Vakuum entfernt Der Rückstand wurde in 10 ml Chloroform aufgelöst und mit 3 10-ml-Portionen der folgenden wäßrigen Lösungen gewaschen: Vi₀ gesättigtes Natriumchlorid, gesättigtes Natriumbicarbonat, 10% G/V Citronensäure, Vi₀ gesättigtes Natriumchlorid und abschließend Wasser. Die Chloroformlösung wurde dann über Magnesiumsulfat getrocknet und in Vakuum bei 40° C eingedampft, wobei Cortisol-21-octanoat, Fp. 115 -116° C, erhalten wurde.

Ester mit anderen Monocarbonsäuren, wie z. B. Hexadecansäure und Cyclohexancarbonsäure, werden durch analoge Verfahren wie unmittelbar vorstehend beschrieben erhalten, wobei ein 2facher Überschuß des entsprechenden Säurechlorids in Pyridin verwendet wird, während Ester mit substituierten Carbaminsäuren, einschließ- lieh N-Octylcarbaminsäure, durch ein ähnliches Verfahren erhalten werden, wobei das entsprechende Isocyanat anstelle des Säurechlorids verwendet wird.

(II) Bei einer Abwandlung des in Beispiel 1 (a) (I) beschriebenen Verfahrens wurde das Di(hexadecanoyl)phosphatidylcho!in durch ein anderes Lecithin ersetzt, wie z. B. Di(tetradecanoyl)- oder Di(octadecanoyl)phosphatidylcholin.

(HI) Bei einer Abwandlung des in Beispiel 1 (a) (I) oder 1 (a) (II) beschriebenen Verfahrens wurde das Cortisol-21-octanoat durch ein gleiches Gewicht an Cortisol-21-cyclohexancarboxylat (Fp. 199—201°C) ersetzt

(b) Das in Beispiel 1 (a) (I), (II) oder (III) beschriebene Verfahren wurde durch Ersatz des 1 mg Phosphatidinsäure durch Stearylamin verändert

(c) Das in Beispiel 1 (a) )I), (II) oder (III) beschriebene Verfahren wurde durch Weglassen der Phosphatidinsäure verändert

Beispiel 2

Für diese Versuche wurden Liposome im wesentlichen wie in Beispiel 1 (a) (I) hergestellt, wobei jedoch ein radioaktiv markiertes Steroid, nämlich f 1,2,6,7(n)-³H]-Cortisol-21-octanoat, verwendet und außerdem als zusätzliche Markierungen ³⁵S (als SO₁--) für die wäßrige Phase und mit ¹²⁵J markiertes N-Octadecyl-3-(4-hydroxyphenyl)propionamid (»OHP«) für die Lipidphase einverleibt wurde.

1 ml der Loposomsuspension wurde mit der lOfachen Menge 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 735) verdünnt und bei 37° C inkubiert Der Puffer wurde alle 24 st im Anschluß an Zentrifugierung gewechselt, und die Geschwindigkeit der Abtrennung der verschiedenen Markierungen wurde studiert Typischerweise wurden beide Phasenmarkierungen und das [l,2,6,7(n)-³H]-CortisoI-21-octanoat mehrere Tage im Liposom zurückgehalten.

Beispiel 3

Liposome, die [lAeJin^rfj-Cortisol^l-octanoat enthielten, wurden an Kulturen von synovialen Zellen in vitro verabreicht und die Aufnahme der Liposome wurde die radioaktive Markierung und durch cytochemische Beobachtung verfolgt Die Zellen zeigten typischerweise verlängerte biochemische Änderungen, einschließlich einer verringerten mitotischen Aktivität und einer Abnahme der proteolytischen Enzymsynthese und Sekretion.

Beispiel 4

Eine gemischte unfraktionierte Population von LJposomen, die im wesentlichen gemäß Beispiel 1 (a) (I) hergestellt worden war, wobei aber das Steroid weggelassen und mit ¹²⁵J markiertes OHP in die Lipidphase einverleibt wurde, wurde intraartikulär an ein normales und an ein arthritisches Gelenk von monoarthritischen Kaninchen verabreicht Im arthritischen Gelenk wurde nach 3 st im Gegensatz zum normalen Gelenk eine beträchtliche Menge der Markierung festgestellt, die mit dem Gelenk verbunden war. Diese bevorzugte Verbin-

dung der Markierung mit dem kranken Gelenk war sogar 6 Tage nach der intraartikulären Verabreichung feststellbar und betrug mehr als 30% der verabreichten Menge.

Beispiel 5
5

Bei diesen Tests wurden 20 Kaninchen verwendet, die die sog. Page-Thomas-Modellarthritis aufwiesen, welche durch Polylysin induziert wurde (siehe Beispiel 21). 1 mg neutrale Liposome, die im wesentlichen gemäß Beispiel 1 (c) aus Di(hexadecanoyl)-phosphatidylcholin hergestellt worden waren und 100 μg Cortisol-21-octanoat enthielten, wurden an ein arthritisches Gelenk dieser Kaninchen verabreicht. 30% des Steroids wurden im to Gelenk festgehalten. Diese Verabreichung ergab eine typische Abnahme der lysomalen Enzymsekretion durch das Gelenk herunter bis zu Vergleichswerten und eine verringerte inflammatorische Reaktion, die histologisch demonstrierbar war.

Beispiel 6

0,5 ml Hexadeeanoylehiorid wurden zu einer gerührten Lösung von 0,5 g Cortisol in 10 rn! frisch destilliertem Pyridin bei 0⁰C zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei 0°C gerührt. Weitere 0,5 ml Hexadecanoylchlorid wurden dann zugegeben, und das Gemisch wurde 18 st bei Raumtemperatur gerührt Das Gemisch wurde mit 50 ml 2 N Salzsäure gemischt und dann 3mal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extracte wurden aufeinanderfolgend mit 50 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung, 50 ml Wasser und 50 ml gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde aus wäßrigem Methanol kristallisiert. Dabei wurde Cortisol-21-hexadecanoat (Pregn-4-en-3,20-dion-ll_/tf,17<!t;-dihydroxy-21-hexadecanoat), Fp. 104- 106⁰C, erhalten.

Beispiel 7

14,9 mg synthetisches Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin, 2 mg Phosphatidinsäure und 1,66 mg Cortisol-21-hexadecanoat wurden in einem Rundkolben mit 2 ml Chloroform gemischt Das Lösungsmittel wurde abdampfen gelassen, während der Kolben mäßig durch Hand bewegt wurde. Die endgültigen Chloroformspuren wurden mit einem in den Kolben eingeblasenen Stickstoffstrom entfernt. 5 ml 5 mM phosphat-gepufferte Salzlösung (ph 7,4) wurden in den Kolben eingebracht, der dann auf einem Wasserbad auf 70°C erhitzt wurde.
Die phosphat-gepufferte Salzlösung bestand aus folgendem:

Dinatrium-hydrogen-orthosphosphat-dihydrat 3,22 g

Natrium-dihydrogen-ortophosphat 0,156 g

Natriumchlorid 18 g

Destilliertes Wasser, auf 21

Wenn der pH nicht 7,4 betrug, dann wurde er mit N Natriumhydroxid oder N Salzsäure auf diesen Wert eingestellt

Der Lipidfilm wurde dann durch Vibrieren des Kolbens auf einem Vibrationsmischer dispergiert, so daß eine Dispersion von Liposomen erhalten wurde, die Cortisol-21-hexadecanoat enthielt. Der Inhalt des Kolbens wurde dann in ein 25-ml-Ultrazentrifugenrohr überführt und mit 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) auf 25 ml gebracht, worauf dann die Liposome 60 min einer Ultrazentrifugierung bei 120 000 g unterworfen wurden. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgetrennt und durch einen frischen Puffer ersetzt. Die Liposome wurden dann auf dem Vibrationsmischer wieder bei 70° C dispergiert Nach Ultrazentrifugierung wie oben wurde das Verfahren wiederholt und das Liposomsediment wurde abschließend in 5 ml Puffer dispergiert Auf diese Weise wurde eine Dispersion von negativ geladenen Liposomen erhalten, die Cortisol-21-hexadecanoat enthielten.

Beispiel 8

Liposome wurden in einem 250-ml-RundkoIben hergestellt der sorgfältig mit Chromsäure gereinigt wiederholt mit destilliertem Wasser und dann Methanol gespült und abschließend mit Chloroform gespült worden war.

143 mg Di(hexadecanoyl)-phosphatidylcholin, 0,95 mg Stearylaminacetat und 1,66 mg [lÄ6,7(n)-³H]-cortisol-21-hexadecanoat (spezifische Aktivität 67,4 μθ/^) wurden als Chloroformlösungen in einem gesamten Volumen von Iß ml in den Kolben eingebracht Das Chloroform wurde langsam durch Schwenken des Kolbens von Hand verdampft, so daß ein gleichförmig gemischter Steroid/Lipid-Film an den Wandungen des Kolbens entstand Die letzten Spuren des Chloroforms wurden vom Film durch Einblasen eines trockenen Stickstoffatoms in den Kolben während einiger Minuten entfernt 5 ml 5 mM Phosphatpuffer (siehe unten; pH 7,4) wurden in den Kolben eingebracht, und der Kolben wurde samt Inhalt in einem Wasserbad auf annähernd 70⁰C erhitzt Der Lipidfilm wurde augenblicklich unter Bildung von Liposomen durch Rühren des heißen Gemischs auf einem Bench-Vibromixer dispergiert Das Erhitzen war nötig, da die Liposome nur bei einer Temperatur über der Kristall/Flüssigkristall-Übergangstemperatur des Phospolipids (Tc) erhalten werden könnten, die im Falle von Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin 41 ° C beträgt Die Radioaktivität der Liposumsuspension vor dem Waschen wurde durch Dispergieren von 50^1-Duplikatproben der Suspension in 10 μΐ einer Triton/Toluol-Szintillationslösung und Zählen der Radioaktivität mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler gemessen.
Die Liposomsuspension wurde dann durch Verdünnen mit 25 ml eines 5 mM Phosphatpuffers (pH 7,4) und

60 min dauerndes Ultrazentrifugieren bei 275 000 g verdünnt. Die klare überstehende Flüssigkeit wurde aus dem Rohr entnommen, und der Liposompfropfen wurde wieder durch erneutes Dispergieren über 41⁰C in 25 ml 5 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) und Ultrazentrifugieren wie oben gewaschen. Der resultierende Liposompfropfen wurde anschließend mit 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4), die auf 50—100⁰C erhitzt war, in eine Dispersion von 5 ml gebracht. Die Aktivität der Liposomsuspension nach dem Waschen wurde durch Szintillationszählung der 50^1-Duplikatproben der Dispersion wie oben gemessen. Die Einverleibung des Cortisol-21-hexadecanoats in die Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholinliposome wurde aus dem Verhältnis der Aktivitäten der Suspension vor und nach dem Waschen errechnet. Sie war 88% der Gesamtmenge an Wirkstoff, der bei der Herstellung zugegeben wurde.
Der oben erwähnte 5 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) bestand aus folgendem:

Dinatrium-hydrogen-orthophosphat-dihydrat
Natrium-dihydrogen-orthophosphat
Destilliertes Wasser, auf

3,22 g
0,156 g
21

Wenn der pH nicht 7,4 betrug, dann wurde er mit N Natriumhydroxid oder N Salzsäure auf diesen Wert eingestellt.

Beispiel 9

Das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß das Stearylaminacetat durch 2 mg Phosphatidinsäure ersetzt wurde. Auf diese Weise wurden negativ geladene Liposome erhalten. Die Einverleibung des Cortisol-21-hexadecanoats in diese Liposome erfolgte zu 97% der Gesamtmenge, die bei der Herstellung verwendet wurde.

Beispiel 10

Ein Rundkolben mit 250 ml Fassungsvermögen wurde wie in Beispiel 8 vorbereitet. 16,1 mg Eilecithin, 0,95 mg Stearylaminacetat und 1,66 mg [l,2,6,7(n)-³H]-cortisol-21-hexadecanoat (spezifische Aktivität 67,4 μθ^) wurden dann in den Kolben als Chloroformlösungen in einem Gesamtvolumen von 2,5 ml zugegeben. Das Verfahren der Liposombildung, das Waschen und die Bestimmung waren ähnlich wie in Beispiel 8, außer daß in diesem Beispiel das Lipid/Steroid-Gemisch in allen Stufen der Herstellung und Reinigung bei Raumtemperatur dispergiert wurde. Dies erfolgte, weil die Kristall/Flüssigkristall-Übergangstemperatur für Eilecithin unterhalb Raumtemperatur liegt Die Einverleibung des Cortisol-21-hexadecanoats in Eilecithinliposome erfolgte zu 86%, bezogen auf zugegebene Wirkstoffmenge.

Beispiel 11

Das in Beispiel 10 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, außer daß das Stearylaminacetat durch 2 mg Phosphatidinsäure ersetzt wurde. Die Einverleibung des Cortisol-21-hexadecanoats in diese Liposome erfolgte zu 57% der Gesamtmenge des bei der Herstellung verwendeten Wirkstoffs.

Beispiel 12

Liposome, die Cortisol-21-octanoat enthielten, wurden aus verschiedenen Phospholipiden unter Verwendung im wesentlichen der gleichen Verfahren wie in den Beispielen 8 bis 11 hergestellt Die Einzelheiten, einschließlich der Temperatur, bei der das Lipid dispergiert werden muß, sind in Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

Herstel	Neutrales	Geladenes	Gewicht an	Dispersions-	Relevantes	Steroid-
lung	Upid und	Unid und	Cortisol-	temnpratur	Beispiel	pinypr-
	Gewid.t	Gewicht	derivat	(°~c)^r		leibung
	(mg)	(mg)	(mg)			(%)
a	HPC 14,9	SA 0,95	0,81	50-100	8	90
b	HPC 14,9	PTA 2	1	50-100	9	34
C	EL 16,1	PTA 2	1	Raumtemperatur	11	79
d	OPC 16	PTA 2	1	Raumtemperatur	11	75
HPC -	Di(hexadecanoyl)phosphatidiylcholin
EL -	Eilecithin
OPC -
SA -	Dioleylphosphatidylcholin
PTA -	Stearylaminacetat
Phosphatidinsäure

Beispiel 13

Liposome, die Cortisol-21-butyrat enthielten, wurden unter Verwendung im wesentlichen der gleichen Methoden wie in den Beispielen 8 bis 11 hergestellt. Die relevanten Einzelheiten sind in Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Herstel	Neutrales	Geladenes	Gewicht an	Dispersions-	Relevantes	Steroid-
lung	Lipid und	Lipid und	Cortisol	Temperatur	Beispiel	einver-
	Gewicht	Gewicht	derivats	("C)		leibung
	(mg)	(mg)	(mg)			(%)
a	HPC 14,9	SA 0,95	0,65	50-100	8	15
b	HPC 14,9	PTA 2	0,65	50-100	9	8
C	EL 16,9	SA 0,95	0,65	Raumtemperatur	10	38
d	EL 16,9	PTA 2	0,65	Raumtemperatur	11	27

Beispiel 14

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 6, aber unter Verwendung der unten angegebenen ICristallisationslösungsmittel wurden die folgenden Verbindungen unter Verwendung entsprechender Ausgangsmaterialien erhalten:

Cortisol-21 -(2-methyldodecanoat), Fp. 55—58° C (Methanol);
Cortisol-21-cyclopentylacetat, Fp. 178—180° C (Äthylacetat);
Cortisol-21-(2-äthyl-hexanoat), Fp. 120—123° C (kein Kristallisationslösungsmittel

verwendet); und
Prednisolon-21-hexadecanoat, Fp. 115— 116° C (wäßriges Methanol).

Beispiel 15

0,4 ml Hexadecanoylchlorid wurden zu einer gerührten Lösung von 0,2 g Fluocinolonacetonid in 8 ml frisch destilliertem Pyridin zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gehalten und dann mit 15 ml Wasser gemischt und 3mal mit je 50 ml Diäthyläther extrahiert. Die vereinigten ätherischen Extrakte wurden aufeinanderfolgend mit 7mal 20 ml Wasser, 50 ml 2% G/V Salzsäure und 50 ml gesättigter Natriumcicarbonatlösung gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet Das Lösungsmittel wurde in Vakuum abgedampft, und der Rückstand wurde durch präparative Dünnschichtchromatografie unter Verwendung von Toluol und Äthylacetat im Volumenverhältnis von 1 :1 als Entwicklungslösemittel gereinigt. Auf diese Weise wurde Fluocinolonacetonid-21-hexadecanoat, Fp. 54—55°C, erhalten.

In ähnlicher Weise, aber unter Verwendung von Dexamethason als Steroidausgangsmaterial wurde Dexamethason-21-hexadecanoat, Fp. 48—50° C, erhalten.

Beispiel 16

Das in Beispiel ^beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei jedoch 1,2 mg Cortisol-21 -pivalat, 16,1 mg Eilecithin und 2 mg Phosphatidinsäure verwendet wurden. Auf diese Weise wurden negativ geladene Liposome erhalten. Die Einverleibung des Steroidderivats in diese Liposome war 7% der Gesamtmenge, die bei der Herstellung verwendet wurde.

Beispiel 17

Liposome, die Fluocinolonacetonid-21-hexadecanoat enthielten, wurden unter Verwendung im wesentlichen der gleichen Verfahren wie in den Beispielen 8 und 9 hergestellt. Die relevanten Details sind in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3	Gewicht an HPC (mg)	Geladenes Lipid und Gewicht (mg)	Gewicht des Steroids (mg)	Dispersions- Temperatur (⁰C)	Relevantes Beispiel	Steroid- einver- leibung (o/o)
Herstellung	143 14,9	SA 0,95 PTA 2	0,99 0,99	50-100 50-100	8 9	83 85
a b

Beispiel 18

Liposome, die Dexar^ethason-21-hexadecanoat enthielten, wurden unter Verwendung im wesentlichen der gleichen Verfahren wie in den Beispielen 8 und 9 hergestellt Die relevanten Einzelheiten sind in Tabelle 4 angegeben.

Tabelle 4

Herstellung	Gewicht an	Geladenes	Gewicht des	Dispersions-	Relevantes	Steroid-
	HPC	lipid	Steroids	Temperatur	Beispiel	emver-
	(mg)	und Gewicht	(mg)	("C)		leibung
		(mg)				(%)

a b

14,9 14,9

SA 035 PTA 2

Beispiel 19

50-100
50-100

93
88

Die Einverleibung von Cortisol-21-hexadecanoat in die Phospholipidphase von Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin-Liposomen kann durch Differentialabtastkalorimetrie der Liposome bestimmt werden. Diese Versuche wurden ausgeführt, um zu zeigen, daß in solchen Liposomen Cortisol-21-hexadecanoat molekular im Phospholipid dispergiert ist und daß die Liposomsuspension nicht ein Gemisch von Liposomen und diskreten Steroidteilchen ist Die Technik basiert auf der Tatsache, daß hydratisierte Phospholipide, welche Liposome bilden, einen endothermen Obergang von der Kristall- zur Flüssigkristallphasr zeigen und daß diese Wärmetönung leicht durch Differentialabtastkalorimetrie (in der Folge mit »DSC« abgekürzt) festgestellt werden kann. Verbindungen wie Cholesterin, von denen bekannt ist, daß sie beispielsweise in biologische Membranen einverleibt sind, ändern ebenfalls bekanntermaßen die Übergangstemperatur der Phospholipide in diesen Membranen, worunter auch Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin fällt Die DSC-Spektren der Liposome, die Cortisol-21-hexadecanoat enthielten, wurden deshalb mit den Spektren von hydratisierten physikalischen Gemischen von Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin und Cortisol-21-hexadecanoat verglichen. Die Resultate zeigen beträchtliche Unterschiede zwischen den Liposomen und den Gemischen und legen nahe, daß in den Liposomen das Steroid molekular im Phospholipid dispergiert ist

Eine Reihe von neutralen Diiiiexadecanoyljphosphatidylcholin-Liposomproben, die steigende Mengen an Cortisol-21-hexadecanoat enthielten, wurden im wesentlichen wie in Beispiel 8 hergestellt Um jedoch die Interpretation der DSC-Daten zu vereinfachen, wurde Stearylaminacetat aus diesen Herstellungen weggelassen und wurde außerdem destilliertes Wasser als wäßriges Medium zum Dispergieren und Waschen verwendet 14,9 mg Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin wurden in 5 ml Chloroform, welches die in Tabelle 5 angegebenen Mengen an Cortisol-21-hexadecanoat enthielt in einem 250-ml-Rundkolben aufgelöst Liposome wurden hergestellt und gereinigt wie es in Beispiel 8 beschrieben ist Nach der zweiten Waschung wurden die Liposompfropfen von ihren Überständen abgetrennt, worauf die Pfropfen dann unter intermittierendem Mischen in einem Vakuur^evTÜckator getrocknet wurden, bis die Probengewichte zeigten, daß jede 50 Gew.-% Wasser enthielt. Diese Proben wurden dann für die DSC-Messungen verwendet

Die hydratisierten Gemische von Phospholipid und Steroid wurden durch inniges Mischen von 14,9 mg pulverisiertem Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin mit den gleichen Gewichten an pulverisiertem Cortisol-21-hexadecanoat wie sie bei der Herstellung der Liposome verwendet wurden, hergestellt. Jede Probe wurde dann durch Zugabe eines Gewichts an destilliertem Wasser hydratisiert, welches dem Gesamtgewicht an Phospholipid und Steroid entsprach. Diese Proben wurden dann für die DSC-Messungen verwendet.

Es wurde eine Differentialabtastkalorimetrie an Proben mit gleichem Gewicht ausgeführt, die hermetisch in geeigneten Probenhaltern eingeschlossen waren. Duplikatproben (»A« und »B« in Tabelle 5 unten) wurden für jedes Liposom und für jedes Steroid/Lipid-Gemisch verwendet. Das Spektrum zwischen 0⁰C und 80⁰C wurde auf einem Perkin-EImer-Differentialabtastkalorimeter unter Verwendung einer Abtastgeschwindigkeit von 8° C/min gemessen.

Reines hydratisiertes Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin unterliegt zwei endothermen Übergängen: einem bei 35° C (die Vorübergangswärmetönung) und dem anderen bei 41° C (die Hauptübergangswärmetönung). Die mittlere Spitzenbreite beim Hauptübergang ist 3,0—4,O⁰C. Im Falle der oben erwähnten Gemische hatte das Steroid keinen Einfluß weder auf die Vorübergangswärmetönung noch auf die Hauptübergangswärmetönung. Im Gegensatz dazu wurde im Falle der obigen Liposome durch den Einschluß des Steroids die Vorübergangswärmetönung eliminiert und eine Erhöhung der mittleren Spitzenbreite der Hauptübergangswärmetönung verursacht wenn die Konzentration des Steroids erhöht wurde (siehe Tabelle 5). Die Zunahme war bis zu 12 M% Steroid (1,66 mg) am ausgeprägtesten und zeigte dann bei 21 M% Steroid (3,22 mg) wenig Änderung. Diese Unterschiede zwischen Liposomen und einfachen Gemischen zeigen, daß die Konzentration an Steroid in den Liposomen, die in Beispiel 8 für Cortisol^l-hexadecanoat angegeben ist direkt mit der Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin-Phase in Verbindung steht und daß deshalb die Liposome als Träger für das Steroid wirken.

15 20 25 30 35 40 45 50

60 65

	27 12 030	3,00 433 6,66 839 6,66	Gemische A	B
Tabelle 5			4,0 2.66·) 4,00 4,00 433	4,0 2.66·) 4,00 4,00 4,00
Gewicht an Cortisol- 21-hexadecanoat (mg)	Mittlere Spitzenbreite (° C) Liposome A B		·) Diese Resultate waren anomal, der Grund ist jedoch nicht bekannt
0 0,5 1 1,66 322	333 3,83 539 639 633

	Beispiel 20

6 mg Diihexadecanoytyphosphatidylcholin und 3 mg Cortisol-21-hexadecanoat wurden in 1,25 ml Chloroform, das 1 mg Phosphatidinsäure enthielt, aufgelöst. Das Chroroform wurde aus dem Gemisch durch Rotationsverdampfung in Vakuum unter Stickstoff bei einer Temperatur von 61⁰C entfernt (d. h. 20⁰C über der Phasenübergangstemperatur von Di(hexadecanoyl)phosphatidylcholin). Der getrocknete Lipidfilm wurde in 2 ml 5 mM phosphat-gepufferte Salzlösung (pH 7,4) suspendiert, und die Suspension wurde dann 15 min heftig bei 61⁰C geschüttelt Die Suspension wurde 1 st bei 21°C gehalten und dann 3mal mit 1 ml 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) durch Zentrifugieren bei 50 000 g während 10 min bei 21° C gewaschen und anschließend in 1 ml 5 mM phosphat-gepufferter Salzlösung (pH 7,4) suspendiert Dieses Liposompräparat wurde in den in den Beispielen 21 und 22 beschriebenen Versuchen verwendet.

Beispiel 21

Eine bilaterale Arthritis wurde in 18 Kaninchen (Old English) (Durchschnittsgewicht 2,05 kg) durch intraartikulare Injektion von 7,5 mg Poly-D-lysin (Molekulargewicht 150 000) und 7,5 mg Hyaluronsäure in 1 ml 03% G/V Salzlösung induziert Eine Suspension von Liposomen (hergestellt wie in Beispiel 20), welche Cortisol-21-hexadecanoat (eine Dosis entsprechend 20 μg Cortisol) enthielt, wurde in ein Knie der Kaninchen 4,8 oder 15 Tage nach Injektion des Poly-D-lysin/Hyaluronsäure-Komplexes injiziert

Die Gelenktemperatur wurde mit einem Heinmann-Radiation-Thermometer bei einer Raumtemperatur von 194 ± 0,5⁰C gemessen, und der Gelenkdurchmesser wurde mit einem Baty-Mikrometer mit Federbelastung gemessen. Die Tiere wurden 3 Tage nach der Liposominjektion getötet.

Resultate
(a) Tiere, die am 4. Tag behandelt wurden

Es bestand eine wesentliche augenblickliche Abnahme in der Temperatur des behandelten Knies im Vergleich zum unbehandelten Knie. Der Unterschied dauerte 3 Tage nach Behandlung. Es war auch bei der Behandlung eine beträchtliche Abnahme des Gelenkdurchmessers, was durch das Gelenkdurchmesserverhältnis gezeigt ist, festzustellen. Die Abnahme blieb 3 Tage nach der Behandlung bestehen.

(b) Tiere, die am 8. Tag behandelt wurden

Diese Behandlung ergab ähnliche Resultate wie oben unter (a). Die Änderung im Gelenktemperaturunterschied bei der Behandlung war nicht so groß wie bei den Tieren, die am 4. Tag behandelt worden waren. Sie trat maximal 48 st nach der Liposominjektion auf. Die Temperatur und die Gelenkgrößenänderung blieben 3 Tage nach der Behandlung bestehen.

(c) Tiere, die am 15. Tag behandelt wurden

Bei dieser Gruppe war nur eine leichte Änderung in der Temperatur des behandelten Knies festzustellen. Außerdem wurde der Temperaturunterschied zwischen dem behandelten und dem unbehandelten Knie nicht 3 Tage lang nach der Behandlung aufrechterhalten. Die Änderung im Gelenkdurchmesserverhältnis bei Behandlung war wesentlich kleiner als sie bei den am 4. und 8. Tag behandelten Gruppen beobachtet wurde. Diese Änderung blieb nach der Behandlung keine 3 Tage bestehen.

Schlußfolgerungen

Vun den drei Gruppen zeigte die 4-Tage-Gruppe das günstigste Ansprechen. Der Betrag der Temperaturverringerung und der Gelenkgrößenverringerung zeigte, daß das Liposompräparat therapeutisch aktiv war. Das Ansprechen schien bei der 8-Tage-Gruppe geringer und war bei der 15-Tage-Gruppe nahezu nicht vorhanden.

Beispiel 22

Eine bilaterale Arthritis wurde bei 18 männlichen Kaninchen (Old English) wie in Beispiel 21 induziert Die Kaninchen wurden dann in drei Gruppen von jeweils sechs unterteilt 4 Tage nach der Indiizierung der Arthritis geschah folgendes:

(a) Die Kaninchen in der Gruppe I erhielten nur in das linke Knie eine intraartikulare Injektion einer Liposomsuspension (hergestellt wie in Beispiel 20), die Cortisol-21-hexadecanoat (in einer Dosis entsprechend 20 μg Cortisol) enthielt

(b) Die Kaninchen der Gruppe II erhielten nur in das linke Knie eine intraartikulare Injektion eines Liposom-Präparats, das nach der Vorschrift von Beispiel 20 hergestellt worden war, aber kein Cortisolderivat enthielt

(c) Die Kaninchen der Gruppe IH erhielten nur in das linke Knie eine intraartikulare Injektion einer Suspension von Cortisol-21-acetat (in einer Dosis entsprechend 20 pg Cortisol). Die Suspension wurde durch Schütteln von Cortisol-21-acetat (in einer Menge entsprechend 20 μg Cortisol) in 0,5 ml pyrogenfreier Salzlösung (B. P.) hergestellt

Die Gelenktemperatur wurde mit einem Heinmann-Radiation-Thermometer bei einer Raumtemperatur von 19,5 ± 0,5° C gemessen. Die Durchmesser der Gelenke wurden mit einem Baty-Mikrometer mit Federbelastung gemessen. Die Messungen erfolgen täglich während 3 aufeinanderfolgenden Tagen im Anschluß an die Liposominjektion.

Resultate

Weder die Liposome, die kein Cortisolderivat (Gruppe II) enthielten, noch die Cortisol-21-acetat-Suspension (Gruppe III) besaßen einen wesentlichen Effekt auf die Temperatur und die Größe des injizierten Gelenks. Im Gegensatz hierzu war bei den Tieren der Gruppe I eine merkliche Abnahme der Temperatur und der Grc2e des behandelten Gelenks im Vergleich zum unbehandelten Gelenk festzuste'len, die 3 Tage während der Beobachtung bestehen blieb.

Claims

Patentansprüche:

1. Pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an Liposomen, die entzündungshemmende Steroide enthalten, dadurchgekennzeichnet.daÜdas Steroidgerüst von Hydrocortison, Cortisol oder

s einem Δ 1-Dehydro- oder 9-Fluoroderivat davon über die Hydroxygruppe am C-Atom 21 durch eine cyclische oder acyclische Kohlenwasserstoffkette mit 6 bis 25 Kohlenwasserstoff atomen lipophil verestert ist

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lipophile Substituent eine Alkanoylgruppe R-CO oder eine substituierte Carbamoylgnippe R-NHCO ist, worin R für einen cyclischen oder acyclischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff mit 15 bis 17 Kohlenstoffatomen steht

ίο 2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der lipophile Substituent eine Hexa-

decanoyl- oder Octadecanoylgruppe ist

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß folgende Steroide im Liposom vorliegen: