DE69531699T2

DE69531699T2 - Cyclodextrinderivate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE69531699T2
Application number: DE69531699T
Authority: DE
Inventors: Luuk Hilgers
Original assignee: Dimminaco AG
Current assignee: Pfizer AG
Priority date: 1994-12-27
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2015-12-22
Also published as: CN1132630C; EP0800539B1; US6328965B1; DE69520376D1; DK0800539T3; BR9510223A; JPH10511997A; EP0814836B1; WO1996020222A1; DE69531699D1; JPH11502192A; EP0814836A1; DE69520376T2; PT800539E; MX9704822A; CN1109049C; ATE199644T1; JP3927235B2; ES2204969T3; AU713997B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Familie von Cyclodextrinderivaten und insbesondere eine neuartige Familie von Cyclodextrinderivaten mit sowohl „höheren" Alkylgruppen, als auch Sulfatgruppen, welche unter anderem für biopharmazeutische Anwendungen brauchbar sind, und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Cyclodextrine (CDs) sind eine gut bekannte Familie von kristallinen, nicht-hygroskopischen Molekülen, bestehend aus einer Kette von entweder sechs, sieben oder acht Glucopyranoseeinheiten, die an den Enden miteinander verbunden sind. Aus sterischen Gründen bilden Cyclodextrine eine zyklische Struktur aus Kreisringförmigen Makroringen, welche einen inneren axialen Hohlraum haben. Die äußere Oberfläche dieser Moleküle ist hydrophil. Der innere Hohlraum dieser Moleküle ist von apolarer Art.
Verwendet für eine Vielzahl an Zwecken ist eine besonders wichtige Verwendung für Cyclodextrine die als Träger für Arzneimoleküle und Antigene gewesen, welche im inneren Hohlraum davon eingeschlossen werden können.
Nachteile bei Cyclodextrinen schließen die Tatsache ein, dass sie verschiedene physikalische, chemische und biochemische Eigenschaften haben (wie Löslichkeit), welche, während sie passend für die beabsichtigte Verwendung sind, nicht passend für die Verwendung mit anderen Molekülen und/oder für andere Verwendungen sind.
Um CDs mit gewünschten physikalischen, chemischen und biochemischen Eigenschaften vorzusehen, sind verschiedene chemische und/oder enzymatische Modifikationen am CD-Molekül vorgenommen worden, um CD-Derivate davon vorzusehen.
In solchen CD-Derivaten ist wenigstens eine der freien Hydroxylgruppen des CD-Moleküls (wobei es drei solcher freien Hydroxylgruppen an jeder der Glucopyranoseeinheiten des CD-Moleküls gibt) modifiziert worden. Solche Modifikation wird durch Substitution von entweder dem Wasserstoffatom der Hydroxylgruppe oder von der gesamten Hydroxylgruppe selbst mit einer aus einer großen Vielfalt an substituierenden Gruppen durchgeführt. Auf diese Weise können je nach Anzahl und Art der durchgeführten Substitution(en) CD-Derivate erhalten werden, welche bestimmte spezifische biochemische Eigenschaften besitzen, die zur beabsichtigten Verwendung gewünscht werden.
Bezogen auf die Verwendung von CD-Derivaten als Träger für Arzneimoleküle und Antigene wird vermerkt, dass die Komplexation eines Arzneimoleküls oder eines Antigens mit einem CD-Derivat signifikante Vorteile bezüglich Verbessern der biologischen Verfügbarkeit und Stabilität des Arzneimoleküls vorsehen kann. In solchen Fällen können Verbesserungen bei der Assoziation zwischen dem CD-Derivat und dem Arzneimolekül gleichzeitige Verbesserungen bei der biologischen Verfügbarkeit und/oder Stabilisierung des Arzneimoleküls vorsehen.
Unglücklicherweise kann sich die Herstellung solcher CD-Derivate häufig als schwierig erweisen und/oder die Verwendung von Verfahren einbeziehen, welche schwierig, teuer und sogar gefährlich sind, insbesondere im industriellen Maßstab.
Ein weiteres Problem mit CD-Derivaten ist, dass sie wie herkömmliche CDs spezifische physikalische, chemische und biochemische Eigenschaften besitzten (wie ihre Form, welche das Passen der Gastmoleküle im inneren axialen Hohlraum bewirken kann), welche ihre breitere Verwendung für andere Zwecke begrenzen, während sie für die speziellen beabsichtigten Zwecke geeignet gemacht werden.
Entsprechend ist es offensichtlich, dass ein Bedarf für Cyclodextrinderivate bleibt, welche biochemische Eigenschaften besitzen, die ihre breitere Verwendung für verschiedene Zwecke erlauben. Es kann ferner gesehen werden, dass ein Bedarf für ein leichtes, sicheres und preiswertes Verfahren für die Herstellung solcher CD-Derivate in industriellem Maßstab bleibt.
Es ist ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung, CD-Derivate vorzusehen, welche in der Lage sind, Komplexe mit einer breiten Vielfalt an Gastmolekülen, insbesondere Arzneimolekülen und Antigenen zu bilden, und welche biochemische Eigenschaften besitzen, welche für eine breite Vielfalt an Zwecken geeignet ist.
Es ist ein weiteres primäres Ziel der vorliegenden Erfindung, CD-Derivate vorzusehen, welche in der Lage sind, Komplexe mit speziellen Gastmolekülen, und insbesondere mit speziellen Arzneimolekülen und Antigenen zu bilden, und welche bestimmte biochemische Eigenschaften besitzen, welche für den spezifischen Zweck, für welchen sie beabsichtigt sind, geeignet sind.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es hierin ein primäres Ziel, einfache, leichte und preiswerte Verfahren für die Herstellung von Zusammensetzungen aus CD-Derivaten mit biochemischen Eigenschaften vorzusehen, die ihre breite Verwendung für verschiedene Zwecke erlaubt, und für die Herstellung von CD-Derivaten, welche spezifische biochemische Eigenschaften besitzen, welche besonders zu bestimmtem/-en Gastmolekül(en) passen, welche(s) sie tragen sollen.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es ein Ziel hierin, so hergestellten CD-Derivate und Zusammensetzungen davon für eine breite Vielfalt von Verwendungen zu verwenden, einschließlich unter anderem für medizinische Zwecke, wie für die Herstellung von Impfstoffen und/oder Hilfsstoffen für Impfstoffe.
Gemäß den Lehren der vorliegenden Erfindung werden hierin CD-Derivate und Zusammensetzungen davon offenbart, welche in der Lage sind, Komplexe mit einer breiten Vielfalt an Gastmolekülen und insbesondere mit Arzneimolekülen und Antigenen zu bilden, welche in der Lage sind, die Reaktivität und/oder Beweglichkeit der darin getragenen besonderen Moleküle (wie eines Arzneimoleküls) zu stabilisieren und zu reduzieren, und welche biochemische Eigenschaften besitzen, welche für eine breite Vielfalt an Verwendungen geeignet sind.
Eine weitere Übereinstimmung mit der Lehre der vorliegenden Erfindung, welche hierin offenbart wird, sind CD-Derivate und Zusammensetzungen davon, welche in der Lage sind, mit besonderen Gastmolekülen und insbesondere mit besonderen Arzneimolekülen und Antigenen Komplexe zu bilden, welche in der Lage sind, die Reaktivität und/oder Beweglichkeit dieses darin getragenen besonderen Moleküls (wie eines Arzneimittelmoleküls) zu stabilisieren und zu reduzieren, und welche bestimmte biochemische Eigenschaften besitzen, welche für den bestimmten Zweck geeignet sind, für welchen sie beabsichtigt sind.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Cyclodextrinderivat vor, dadurch gekennzeichnet, dass es durch mindestens eine lineare Kohlenwasserstoffkette von mindestens acht Kohlenstoffatomen und mindestens einer, aber nicht mehr als sieben Sulfatgruppen substituiert ist, vorausgesetzt, dass das Cyclodextrinderivat keine Verbindung der Formel I
Formel I ist, worin:
M ein pharmazeutisch annehmbares Kation darstellt;
p 1 oder 2 ist;
q für n/2 steht wenn p 2 ist und q für n steht wenn p 1 ist;
R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₁₂-nied.-Alkyl, C₃-C₁₂-Cycloalkyl und Aryl oder Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert mit 1–3 Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, C₁-C₁₂-nied.-Alkyl oder C₁-C₁₂-Alkoxy; und n eine ganze Zahl von 6–8 ist, α-Cyclodextrin (n = 6), (3-Cyclodextrin (n = 7) und γ-Cyclodextrin (n = 8) darstellt.
Falls gewünscht können die neuartigen Cyclodextrinderivate dadurch weiter gekennzeichnet werden, dass sie mindestens eine freie Hydroxylgruppe haben.
In einer besonderen Ausführungsform werden die neuartigen Cyclodextrinderivate dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine aber nicht mehr als N-7 „höhere" Alkylgruppen und/oder mindestens eine aber nicht mehr als N-7 Sulfatgruppen haben, wobei N die Gesamtzahl von Hydroxylgruppen des Cyclodextrins ist, von welchem das Derivat erhalten wurde.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform haben die neuartigen Cyclodextrinderivate mindestens eine, aber nicht mehr als dreizehn Sulfatgruppen.
In noch einer besonderen Ausführungsform werden die neuartigen Cyclodextrinderivate weiter dadurch gekennzeichnet, dass die „höheren" Alkylgruppen Lipide sind. Diesbezüglich können die „höheren" Alkylgruppen aliphatische Kohlenstoffketten sein, wie lineare Kohlenstoffketten, deren allgemeine Struktur -OC(=O)-(CH₂)_n-CH₃ ist, worin n mindestens 6 ist, und -OC(=O)-(CH₂)_m-CH=CH- (CH₂)_m-CH₃, worin m mindestens 6 ist. Ferner werden solche linearen Kohlenstoffketten offenbart, worin n zwischen 6 und 24 ist. Ferner werden solche linearen Kohlenstoffketten offenbart, worin n zwischen 6 und 16 ist.
Insbesondere werden solche linearen Kohlenstoffketten offenbart, wo n 6 (Octanoyloxy), 8 (Decanoyloxy), 10 (Dodecanoyloxy, -OC(=O)-(CH₂)₁₀CH₃, hierein auch als Lauroyloxy bezeichnet), 12 (Tetradecanoyloxy, auch als Myristoyloxy bekannt), 14 (Hexadecanoyloxy, auch als Palmitoyloxy bekannt) und 16 (Octadecanoyloxy, auch als Stearoyloxy bekannt) sein kann. Ferner wird -OC(=O)–(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇-CH₃ (Oleoyloxy) hierin offenbart.
In noch einer anderen besonderen Ausführungsform werden die neuartigen Cyclodextrinderivate ferner durch die Sulfatgruppen mit der allgemeinen Formel OSO₃R gekennzeichnet, worin R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Atomen und/oder Molekülen, die einwertige Kationen bilden. Beispiele für Mitglieder solch einer Gruppe schließen H, Na, K, Li und NH₄ ein. Spezielle Ausführungsformen schließen Cyclodextrinderivate ein, gekennzeichnet durch die Sulfatgruppen -OSO₃H und -OSO₃Na.
In einem anderen Aspekt der Lehre der vorliegenden Erfindung, werden hierin leichte, sichere und preiswerte Verfahren für die Herstellung von CD-Derivaten offenbart, einschließlich den CD-Derivaten der vorliegenden Erfindung.
Insbesondere werden hierin Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen von CD-Derivaten mit biochemischen Eigenschaften offenbart, welche zur Verwendung mit einer breiten Vielfalt an Gastmolekülen geeignet sind, mit welchen sie assoziiert werden können, als auch Verfahren zum Herstellen von CD-Derivaten und Zusammensetzungen davon, welche spezielle biochemische Eigenschaften besitzen, welche besonders für das Gastmolekül geeignet sind, welches sie tragen sollen.
Diesbezüglich wird hierin ein Verfahren für die Herstellung der Cyclodextrinderivate und Zusammensetzungen davon offenbart, welches durch die Schritte des Kontaktierens eines Cyclodextrin mit sowohl Acoylchlorid(en), als auch sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en) gekennzeichnet ist.
Bevorzugte Acoylchloride sind Octanoylchorid, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid), Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid), Hexadecanoylchlorid (Palmitoylchlorid) und Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid).
Bevorzugte sulfonierende SO₃-Komplexe sind HClSO₃ (Chlorsulfonsäure), SO₃-Pyridin, SO₃-2-Methylpyridin, SO₃-2,6-Dimethylpyridin, SO₃-Dimethylformamid, SO₃-Trimethylamin, SO₃-Triethyl-amin, SO₃-Dimethylanilin, SO₃-N-Ethylmorpholin, SO₃-Diethylanilin und SO₃-Dioxan.
Vorzugsweise wird das Cyclodextrin mit dem/den Acoylchlorid(en) kontaktiert, wodurch ein L-CD-Derivat gebildet wird, vorm Kontaktieren mit dem/den sulfonierenden SO₃-Komplex(en).
Das Verfahren ist ferner dadurch gekennzeichnet, dass etwa 1 Mol Cyclodextrin mit mindestens etwa 1 Mol aber nicht mehr als etwa N-1 Mol des/der Acoylchlorid(e) und mit mindestens 1 Mol aber nicht mehr als etwa N-1 Mol des/der sulfonierenden SO₃-Komplex(e) kontaktiert wird, wobei die gesamte kombinierte Anzahl an Mol von Acoylchlorid und sulfonierendem SO₃-Komplex N nicht übersteigt und worin N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des kontaktierten Cyclodextrin ist.
Vorzugsweise wird solch ein Kontakt in Gegenwart von organischem/-en Lösungsmittel(n) durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Cyclodextrin mit dem/den Acoylchlorid(en) für etwa 6 Stunden bei etwa 60°C kontaktiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Cyclodextrin mit dem/den sulfonierenden SO₃-Komplex(en) für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur kontaktiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren ferner durch Entfernen der/des organischen Lösungsmittels) aus den so erhaltenen CD-Derivaten gekennzeichnet. Diesbezüglich wird es bevorzugt, dass solch eine Entfernung von organischem/-en Lösungsmittel(n) aus den CD-Derivaten Dialysieren oder Ultrafiltrieren der so erhaltenen CD-Derivate einschließt.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren ferner durch Dialysieren oder Ultrafiltrieren der CD-Derivate in Gegenwart eines nicht-dialysierbaren Detergens gekennzeichnet, wodurch die CD-Derivate von dem/den organischen Lösungsmittel(n) abgetrennt oder entfernt werden, welche(s) für die Herstellung (Synthese) davon verwendet wird/werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren ferner durch Lyophilisieren der von organischen Lösungsmittel(n) abgetrennten oder entfernten CD-Derivate gekennzeichnet, wodurch ein trockenes CD-Derivatprodukt erhalten wird.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen hierin offenbart, welche reich an CD-Derivaten mit speziellen Anzahlen und Arten von Sulfat- und „höheren" Alkylgruppen sind, um so in der Lage zu sein, Komplexe mit besonderen Gastmolekülen zu bilden, und insbesondere mit besonderen Arzneimolekülen und Antigenen, welche in der Lage sind, die Reaktivität und/oder Beweglichkeit der darin getragenen besonderen Moleküle (wie eines Arzneimoleküls) zu stabilisieren und zu reduzieren, und welche bestimmte biochemische Eigenschaften besitzen, welche für den speziellen Zweck geeignet sind, für den sie beabsichtigt sind.
Insbesondere werden hierin Verfahren zum Herstellen von Zusammensetzungen offenbart, welche reich an CD-Derivaten mit einer besonderen Anzahl an Sulfatgruppen und „höheren" Alkylgruppen pro CD-Derivat sind, gekennzeichnet durch die Schritte des Kontaktierens von etwa 1 Mol Cyclodextrin mit etwa 1 Mol Acoylchlorid(en) für jede dadurch hergestellte „höhere" Alkylgruppe, welche pro CD-Derivat gewünscht wird, und mit etwa 1 Mol sulfonierenden SO₃-Komplex(en) für jede dadurch hergestellte Sulfatgruppe, welche pro CD-Derivat gewünscht wird, wobei die gesamte kombinierte Anzahl an Mol von Acoylchlorid(en) und dem/den sulfonierenden SO₃-Komplex(en) N nicht überschreitet und worin N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des kontaktierten Cyclodextrin ist.
Auf diese Weise werden Zusammensetzungen, reich an CD-Derivaten mit speziellen Anzahlen an Sulfatgruppen und „höheren" Alkylgruppen pro Molekül CD-Derivat mit biochemischen Eigenschaften gebildet, welche zur Verwendung mit speziellen Gastmolekülen) besonders geeignet sind, mit welchen sie assoziiert werden sollen.
In einer Ausführungsform werden hierin Verfahren zum Herstellen von CD-Derivaten mit höherer Wasserlöslichkeit, niedrigerer Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln und einer verringerten Kapazität offenbart, an hydrophobe Oberflächen zu binden. Diesbezüglich wird es bevorzugt, dass das/die Acoylchlo rid(e) Octanoylchlorid, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid) und/oder Tetradecanoylchlorid (Myristoyl-chlorid) ist/sind. Bevorzugter sind diesbezüglich das/die Acoylchlorid(e) Octanoylchlorid, Decanoylchlorid und/oder Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid). Am meisten bevorzugt sind diesbezüglich das/die Acoylchlorid(e) Octanoylchlorid und/oder Decanoylchlorid.
In noch einer weiteren Ausführungsform werden hierin Verfahren zum Herstellen von CD-Derivaten mit niedrigerer Wasserlöslichkeit, höher Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln und erhöhter Kapazität vorgesehen, an hydrophobe Oberflächen zu binden. Diesbezüglich wird es bevorzugt, dass das/die Acoylchlorid(e) Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid), Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid), Hexadecanoylchlorid (Palmitoyl-Chlorid) und/oder Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid) sind. Bevorzugter diesbezüglich sind das/die Acoylchlorid(e) Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid), Hexadecanoylchlorid (Palmitoylchlorid) und/oder Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid). Am meisten diesbezüglich bevorzugte(s) Acoylchlorid(e) sind Hexadecanoylchlorid (Palmitoylchlorid) und/oder Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid).
In einer weiteren Ausführungsform wird das Verfahren ferner durch Dialysieren oder Ultrafiltrieren der so erhaltenen CD-Derivate in Gegenwart eines einwertigen Kations gekennzeichnet, welches H⁺, K⁺, Li⁺, Na⁺ und/oder NH₄ ⁺ ist, wodurch CD-Derivate mit Sulfatgruppen einschließlich der Atome/Moleküle besagter Kationen vorgesehen werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Dialysieren oder Ultrafiltrieren der so erhaltenen CD-Derivate in Gegenwart von H⁺ und/oder NH₄ ⁺ durchgeführt, wodurch CD-Derivate mit höherer Wasserlöslichkeit und einer höheren Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln vorgesehen werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform wird das Dialysieren oder Ultrafiltrieren der so erhaltenen CD-Derivate in Gegenwart von K⁺ und/oder Na⁺ durchgeführt, wodurch CD-Derivate mit niedrigerer Wasserlöslichkeit und einer niedrigeren Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln vorgesehen werden.
In noch einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden hierin Verwendungen für so hergestellte CD-Derivate offenbart, einschließlich unter anderem Verwendungen zu medizinischen Zwecken.
Diese Erfindung sieht ebenfalls eine Impfstoff-Zusammensetzung vor, welche ein Cyclodextrinderivat umfasst, welches durch mindestens eine lineare Kohlenwasserstoffkette aus mindestens acht Kohlenstoffatomen und mindestens eine Sulfatgruppe substituiert ist.
Ebenfalls vorgesehen wird die Verwendung eines Cyclodextrinderivats, welches durch mindestens eine lineare Kohlenwasserstoffkette aus mindestens acht Kohlenstoffatomen und mindestens eine Sulfatgruppe substituiert ist, bei der Herstellung eines Hilfsstoffs oder einer Impfstoffzusammensetzung.
Die Art und die Substanz der Lehren der vorliegenden Erfindung, als auch Ziele und Vorteile davon, werden mit Verweis auf die folgende Beschreibung, wenn sie in Verbindungen mit den begleitenden Figuren gelesen wird, vollständiger geschätzt und besser verstanden werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft unsere Erfindung einer Familie von CD-Derivaten mit „höheren" Alkylgruppen und Sulfatgruppen und Zusammensetzungen davon, welche gewünschte biochemische Eigenschaften haben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner unsere Erfindung eines einfachen und leichten Verfahrens zum sicheren Herstellen einer Familie von CD-Derivaten, wobei verschiedene (oder alle) Hydroxylgruppen (und/oder Teile davon) des CD-Moleküls mit „höheren" Alkylgruppen und mit Sulfatgruppen substituiert werden, um so CD-Derivate mit biochemischen Eigenschaften vorzusehen, die für eine breite Vielfalt an Verwendungen geeignet sind.
Ferner, und das wird unten ausführlich diskutiert werden, haben wir herausgefunden, dass beim Verwenden des Verfahrens der vorliegenden Erfindung durch entweder (1) Variieren der Mengen (Verhältnisse) der verschiedenen verwendeten Ausgangsmaterialien; und/oder (2) Variieren des/der verwendeten Acoylchlorid(e); und/oder (3) Variieren des/der in der wässerigen Lösung eingesetzten Kation(e), welche zur Dialyse oder Ultrafiltration beim Praktizieren des Verfahrens der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unterschiedliche Zusammensetzungen aus CD-Derivaten mit höheren oder niedrigeren Mengen an (sind reich an) bestimmten Derivaten mit speziellen biochemischen Eigenschaften hergestellt werden können, welche zur Verwendung mit bestimmtem/-en Molekül(en) und/oder bestimmter/-en Verwendung(en) besonders geeignet sind.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „höhere Alkylgruppen" lineare Kohlenwasserstoffketten aus mindestens acht Kohlenstoffatomen.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Sulfatgruppen" Gruppen mit der allgemeinen Formel -OSO₃R, wobei R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Atomen und/oder Molekülen, die einwertige Kationen bilden. Beispiele für Mitglieder solch einer Gruppe sind H, Na, K, Li und NH₄.
Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Hydroxylgruppen" Gruppen mit der Formel -OH.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist brauchbar bei Cyclodextrinen, welche aus entweder sechs Glucopyranoseeinheiten (α-Cyclodextrine), sieben Glucopyranoseeinheiten (β-Cyclodextrine) und/oder acht Glucopyranoseeinheiten (γ-Cyclodextrine) bestehen, zum Herstellen von Cyclodextrinderivaten, welche die gleiche Anzahl an Glucopyranoseeinheiten enthalten.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zum Herstellen von CD-Derivaten der vorliegenden Erfindung ist eine einfache, leichte und sicher durchzuführende Zwei-Schritt-Umsetzung, bestehend aus: (1) zuerst Kontaktieren eines Cyclodextrins mit einem oder mehreren Acoylchlorid(en), um Lipid-CD (L-CD)-Derivate zu bilden; und (2) zweitens Kontaktieren der gebildeten Lipid-CD-Derivate mit einem oder mehreren sulfonierenden SO₃-Komplex(en), um die Sulfo-Lipid-CD (SL-CD)-Derivate der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Die zwei bei der Synthese von CD-Derivaten der vorliegenden Erfindung einbezogenen Schritte werden als zufallsbedingte Umsetzungen angesehen, was eine Sammlung von unterschiedlichen CD-Derivaten ergibt, welche im Sulfatgruppen und „höheren" Alkylgruppengehalt variieren und als Folge in der Struktur und dadurch besessenen biochemischen Eigenschaften.
Im ersten Schritt dieses Verfahrens wird etwa 1 Mol Cyclodextrin mit mindestens etwa 1 Mol aber nicht mehr als etwa N-1 Mol Acoylchlorid(en) kontaktiert, wobei die gesamte kombinierte Anzahl an Mol von Acoylchlorid(en) und sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en) N nicht überschreitet und wobei N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des kontaktierten Cyclodextrin ist.
In diesem Schritt wird das Cyclodextrin mit dem/den Acoylchlorid(en) für etwa 6 Stunden bei etwa 60°C kontaktiert. Falls gewünscht kann das Cyclodextrin mit dem/den Acoylchlorid(en) für etwa 18 zusätzliche Stunden bei Raumtemperatur weiter kontraktiert werden.
Im zweiten Schritt dieses Verfahrens wird etwa 1 Mol Cyclodextrin mit von etwa 1 Mol bis etwa N-1 Mol sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en) kontraktiert, wobei die gesamte kombinierte Anzahl an Mol von Acoylchlorid(en) und sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en) N nicht überschreitet und wobei N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des kontaktierten Cyclodextrin ist.
In diesem Schritt wird das Cyclodextrin mit dem/den sulfonierenden SO₃-Komplex(en) für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur kontaktiert. Falls gewünscht kann solch ein Kontakt so lange wie (oder länger als) 24 Stunden sein.
Bezogen auf das Obige wird vermerkt, dass Durchführung des Verfahrens bei Raumtemperatur bedeutet, dass die Temperatur für das Verfahren nicht kritisch ist. Solch ein Merkmal erlaubt es dem Verfahren, bei einer großen Bandbreite an Temperaturen und unter einer großen Bandbreite an Bedingungen mit gleichzeitigen Einsparungen durchgeführt zu werden.
Diesbezüglich wird hierin erwogen, dass Raumtemperaturen nicht geringer als etwa 10°C annehmbar wären. Bevorzugt wären Temperaturen nicht geringer als etwa 15°C. Bevorzugter wären Temperaturen nicht geringer als etwa 18°C. Am meisten bevorzugt wären Temperaturen nicht geringer als etwa 22°C.
Ferner wären diesbezüglich Raumtemperaturen von nicht mehr als etwa 50°C annehmbar. Bevorzugt wären Temperaturen nicht höher als etwa 40°C. Bevorzugter wären Temperaturen nicht höher als etwa 25°C. Am meisten bevorzugt wären Temperaturen nicht höher als etwa 22°C.
Die zwei Schritte der vorliegenden Erfindung werden in Gegenwart von organischem/-en Lösungsmittel(n) durchgeführt, in welchen die Cyclodextrine, aus welchen die Derivate hergestellt werden, gelöst sind. Bevorzugt wird diesbezüglich ein Gemisch aus wasserfreiem Dimethylformamid und wasserfreiem Pyridin und/oder ein Gemisch aus wasserfreiem N-Methylpyrrolidinon und wasserfreiem Pyridin.
Das/die CD-Derivat(e), welche(s) durch die Verwendung des Verfahrend der vorliegenden Erfindung hergestellt wird/werden, wird/werden aus den organischen Lösungsmitteln entfernt. Es wird bevorzugt, dass solche eine Entfernung von Lösungsmitteln aus den CD-Derivaten Dialysieren oder Ultrafiltrieren der so erhaltenen CD-Derivate einschließt. Diesbezüglich wird angemerkt, dass in solch einem Verfahren einwertige Kationen eingesetzt werden können. Diese einwertigen Kationen sind vorzugsweise K⁺, Li⁺, H⁺, Na⁺ und NH₄ ⁺.
Es wird ferner angemerkt, dass solches Dialysieren oder Ultrafiltrieren in Gegenwart eines nicht dialysierbaren Detergens durchgeführt werden kann, wodurch die CD-Derivate aus den zur Synthese verwendeten organischen Lösungsmitteln zu ihrer weiteren Verwendung auf wässerige Lösungen übertragen werden. Beispiele für solche nicht dialysierbaren Detergenzien sind TWEEN 80 und TRITON X-100.
Die CD-Produkte, aus welchen Lösungsmittel entfernt worden ist, können dann lyophilisiert werden, falls ein trockenes CD-Derivatprodukt gewünscht wird. Dafür kann jedes den Fachleuten gut bekannte Lyophilisationsverfahren, welches zum Erhalten von trockenen Produkten aus wässerigen Lösungen brauchbar ist, eingesetzt werden. Diesbezüglich vermerken wir, dass vorzugsweise solche Lyophilisation bei Raumtemperatur bei einem inneren Druck von weniger als 0,1 mbar und einer Kühlfalle von weniger als –25°C durchgeführt wird.
Wie oben angemerkt kann beim Praktizieren des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die Herstellung von bestimmten CD-Derivaten wie gewünscht erhöht und/oder verringert werden, durch: (1) Variieren der Mengen (Verhältnisse) der Ausgangsmaterialien; und/oder (2) Variieren der Arten der Ausgangsmaterialien und/oder (3) Variieren der Arten von Kation(en) in den zur Dialyse oder Ultrafiltration verwendeten wässerigen Lösungen.
Variieren der Mengen (Verhältnisse) der Ausgangsmaterialien durch Erhöhen der Menge an sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en) und/oder durch Verringern der Menge an Acoylchlorid(en), welche in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, kann CD-Derivate mit mehr Sulfatgruppen bezogen auf „höhere" Al kylgruppen vorsehen.
Umgekehrt können durch Verringern der Menge an sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en) und/oder durch Erhöhen der Menge an Acoylchlorid(en), welche im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, CD-Derivate mit mehr „höheren" Alkylgruppen bezogen auf Sulfatgruppen vorgesehen werden.
Zur Veranschaulichung dieses Punkts wird Verwenden von fünf Mol sulfonierendem SO₃-Komplex (wie Chlorsulfonsäure) und 3 Mol Acoylchlorid (wie Lauroylchlorid) eine Zusammensetzung vorsehen, welche reich an CD-Derivaten mit 5 Sulfatgruppen und 3 „höheren" Alkylgruppen ist. Ähnlich wird Verwenden von 5 Mol von sulfonierendem SO₃-Komplex (wie Chlorsulfonsäure) und 11 Mol Acoylchlorid (wie Lauroylchlorid) eine Zusammensetzung vorsehen, welche reich an CD-Derivaten mit 5 Sulfatgruppen und 11 „höheren" Alkylgruppen ist.
Variieren des/der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzten Acoylchlorid(e) sieht CD-Derivate mit unterschiedlichen „höheren" Alkylgruppen vor, welche spezielle gewünschte biochemische Eigenschaften besitzen, welche zur Verwendung mit bestimmten Molekül(en) und/oder bestimmter/-en Verwendung(en) besonders geeignet sind. Zum Beispiel wird Octanoylchlorid Alkylgruppen der Formel -OC(=O)-(CH₂)₆-CH₃ ergeben, Decanoylchlorid wird Alkylgruppen der Formel -OC(=O)-(CH₂)₈-CH₃ ergeben, Dodecanoylchlorid wird Alkylgruppen mit der Formel -OC(=O)-(CH₂)₁₀CH₃ ergeben, Tetradecanoylchlorid wird Alkylgruppen mit der Formel -OC(=O)-CH₂)₁₂-CH₃ ergeben, Hexadecanoyl-chlorid wird Alkylgruppen mit der Formel -OC(=O)-(CH₂)₁₄-CH₃ ergeben und Octadecanoylchlorid wird Alkylgruppen mit der Formel -OC(=O)-(CH₂)₁₆-CH₃ oder -OC(=O)-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇-CH₃ ergeben.
Verschiedene Arten von in der wässerigen Lösung eingesetztem/-en Kation(en), welche(s) zur Dialyse oder Ultrafiltration in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird/werden, sehen unter Verwendung von H⁺, K⁺, Na⁺, NH₄ ⁺ und/oder Li⁺ CD-Derivate mit unterschiedlichen Sulfatgruppen vor (-OSO₃H, -OSO₃K, -OSO₃Na, -OSO₃NH₄ bzw. -OSO₃Li) – welche spezielle gewünschte biochemische Eigenschaften besitzten, welche zur Verwendung mit bestimmtem/-en Molekül(en) und/oder bestimmter/-en Verwendung(en) besonders geeignet sind.
Auf die obige Weise kann die Herstellung von bestimmten CD- Derivaten wie gewünscht gesteigert/verringert werden, so dass die dadurch erhaltene Zusammensetzung größere oder geringere Mengen von (ist reich an) bestimmten CD-Derivaten mit speziellen biochemischen Eigenschaften enthält, welche zur Verwendung mit bestimmtem/-en Molekül(en) und/oder bestimmter/-en Verwendung(en) besonders geeignet sind.
Dies basiert auf unserer Entdeckung, welche unten ausführlich diskutiert werden wird, dass die biochemischen Eigenschaften der gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten CD-Derivate von dem Verhältnis der vorhandenen Sulfatgruppen, „höheren" Alkylgruppen und Hydroxylgruppen, der Art des Gegen-Ions der Sulfatgruppen und der Art der „höheren" Alkylgruppen der CD-Derivate abhängt. Der hydrophobe Charakter der „höheren" Alkylgruppe ist diesbezüglich besonders anzumerken.
Biochemische Eigenschaften der CD-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche so angepasst werden können, schließen unter anderem Löslichkeit in wässerigen (Wasser) und nicht wässerigen (apolaren) Lösungsmitteln, die Fähigkeit, Mizellen und gemischte Mizellen mit anderen Verbindungen zu bilden, die Fähigkeit, hydrophobe Oberflächen zu adsorbieren und Oberflächenaktivität/-Tensio-Wirksamkeit ein.
Die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten mit höherer (oder gesteigerter) Wasserlöslichkeit sind, kann gesteigert werden durch:

(1) Steigern der Menge an sulfonierendem/-en SO₃-Komplex(en), welche in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, und/oder durch Verringern der Menge an Acoylchlorid(en), welche im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sodass CD-Derivate vorgesehen werden, welche größere Anzahlen an Sulfatgruppen haben, bezogen auf die Anzahl an vorhandenen „hohen" Alkylgruppen; und/oder
(2) Einsetzen von Octanoylchlorid, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid) und/oder Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid) als Acoylchlorid Reagens(ien); und/oder
(3) Auswählen von H⁺ und/oder NH₄ ⁺ als Gegen-Ion für die Sulfatgruppen bei entweder Dialyse und/oder Ultrafiltration, was das dadurch hergestellte CD-Derivat mit den Sulfatgruppen -OSO₃H bzw. -OSO₃NH₄ vorsieht.

Umgekehrt kann die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten mit niedrigerer (oder verringerter) Wasserlöslichkeit sind, erhöht werden durch:

(1) Verringern der Menge an in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetztem/-en sulfonierenden SO₃-Komplex(en) und/oder durch Steigern der Menge an im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetztem/-en Acoylchlorid(en), so dass CD-Derivate mit niedrigeren Anzahlen an Sulfatgruppen bezogen auf die Anzahl an vorhandenen „höheren" Alkylgruppen vorgesehen werden; und/oder
(2) Einsetzen von Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid), Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid), Hexadecanoylchlorid (Palmitoylchlorid) und/oder Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid) als Acoylchlorid Reagens(ien); und/oder
(3) Auswählen von K⁺ und/oder Na⁺ als Gegen-Ion für die Sulfatgruppen in entweder Dialyse und/oder Ultrafiltration, was das dadurch hergestellte CD-Derivat mit den Sulfatgruppen -OSO₃K bzw. -OSO₃Na vorsieht.

Die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten von hoher (oder erhöhter) Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln (wie Chloroform, Methyl-tert.-butylether, Dichlormethan, Hexadecan und Mineralöl) sind, kann gesteigert werden durch:

(1) Verringern der Menge an sulfonierenden in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetztem/-en SO₃-Komplex(en) und/oder durch Erhöhen der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzten Menge an Acoylchlorid(en); und/oder
(2) Einsetzen von Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid), Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid), Hexadecanoylchlorid (Palmitoylchlorid) und/oder Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid) als Acoylreagens(ien): und/oder
(3) Auswählen von H⁺ und/oder NH₄ ⁺ als Gegen-Ion für die Sulfatgruppen in entweder Dialyse und/oder Ultrafiltration, was die dadurch hergestellten CD-Derivate mit Sulfatgruppen -OSO₃H bzw. -OSO₃NH₄ vorsieht.

Umgekehrt kann die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten sind, welche niedrigere (oder verringerte) Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln haben, vorgesehen werden durch:

(1) Steigern der Menge an in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetztem/-en sulfonierenden SO₃-Komplex(en) und/oder durch Verringern der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzten Menge an Acoylchlorid(en); und/oder
(2) Einsetzen von Octanoylchlorid, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid) und/oder Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid) als Acoylchlorid Reagens(ien); und/oder
(3) Einsetzen von K⁺ und/oder Na⁺ als Gegen-Ion für die Sulfatgruppen in entweder Dialyse und/oder Ultrafiltration, was die dadurch hergestellten CD-Derivate mit Sulfatgruppen -OSO₃K bzw. -OSO₃Na vorsieht.

Die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten sind, welche eine höhere (oder gesteigerte) Fähigkeit haben, Mizellen zu bilden, kann durch Steigern der Menge an in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetztem/-en sulfonierenden SO₃-Komplex(en) oder durch Steigern der Menge an Acoylchlorid(en) vorgesehen werden.
Umgekehrt kann die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten sind, welche eine niedrigere (oder verringerte) Fähigkeit haben, Mizellen zu bilden, durch Verringern der Menge an in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetztem/-en sulfonierenden SO₃-Komplex en) und durch Verringern der Menge an Acoylchlorid(en) vorgesehen werden.
Die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten sind, welche eine höhere (oder gesteigerte) Oberflächenaktivität/Tensio-Wirksamkeit haben, kann durch Steigern der Menge an sowohl dem/den verwendeten sulfonierenden SO₃-Komplex(en), als auch der Menge an in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzten Acoylchlorid(en) vorgesehen werden.
Umgekehrt kann die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten mit einer niedrigeren (oder verringerten) Oberflächenaktivität/Tensio-Wirksamkeit sind, durch Verringern der Menge an sowohl dem/den eingesetzten sulfonierenden SO₃-Komplex(en), als auch der Menge an in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzten Acoylchlorid(en) vorgesehen werden.
Die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten sind, welche eine höhere (oder gesteigerte) Fähigkeit haben, an hydrophobe Oberflächen zu binden, kann durch Einsetzen von Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid), Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid), Hexadecanoylchlorid (Palmitoylchlorid) und/oder Octadecanoylchlorid (Stearoylchlorid und Oleoylchlorid) als Acoylchlorid Reagens(ien) vorgesehen werden.
Umgekehrt kann die Herstellung von Zusammensetzungen, welche reich an CD-Derivaten sind, welche eine niedrigere (oder verringerte) Fähigkeit haben, an hydrophobe Oberflächen zu binden, durch Einsetzen von Octanoylchlorid, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid (Lauroylchlorid) und/oder Tetradecanoylchlorid (Myristoylchlorid) als Acoylchlorid Reagens(ien) vorgesehen werden.
Unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung können Zusammensetzungen aus neuartigen Cyclodextrinderivaten vorgesehen werden.
Die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung vorgesehenen neuartigen Cyclodextrinderivate können Cyclodextrinderivate sein, welche aus entweder sechs Glucopyranoseeinheiten (α-Cyclodextrine), sieben Glucopyranoseeinheiten (β-Cyclodextrine) oder acht Gulcopyranoseeinheiten (γ-Cyclodextrine) bestehen.
Die biochemischen Eigenschaften der CD-Derivate der vorliegenden Erfindung hängen von der Anzahl (und dem Verhältnis) von Sulfatgruppen und (zu) „höheren" Alkylgruppen ab (und zu einem geringeren Ausmaß von der Anzahl an Hydroxylgruppen), welche vorhanden sind, als auch von der Art des Gegen-Ions der Sulfatgruppen und der Art und Natur der „höheren" Alkylgruppen.
Die neuartigen Cyclodextrinderivate dieser Erfindung haben sowohl Sulfatgruppen, als auch „höhere" Alkylgruppen (und falls gewünscht Hydroxylgruppen), die gemeinsam an das CD-Molekül gebunden sind. Insbesondere werden in den neuartigen Cyclodextrinderivaten der vorliegenden Erfindung solche Gruppen für verschiedene der freien Hydroxylgruppen substituiert, welche an dem herkömmlichen CD-Molekül vorhanden sind, von welchem das Derivat erhalten wurde. Solche Zusammensetzungen aus CD-Derivaten haben biochemische Eigenschaften, welche für eine breite Vielfalt an Verwendungen geeignet sind.
In den gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten CD-Derivaten sind die „höheren" Alkylgruppen Lipidgruppen. Diesbezüglich sind bevorzugte Lipidgruppen aliphatische Kohlenstoffketten, wie lineare Kohlenstoffketten, wobei die allgemeine Struktur -OC(=O)-(CH₂)_n-CH₃ ist, worin n mindestens 6 ist, und OC(=O)-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH₃, worin m mindestens 6 ist. Bevorzugt werden solche linearen Kohlenstoffketten, worin n zwischen 6 und 24 ist. Ferner werden solche linearen Kohlenstoffketten bevorzugt, worin n zwischen 6 und 16 ist.
Insbesondere können „höhere" Alkylgruppen lineare Kohlenstoffketten sein, wo n 6 (Octanoylchlorid), 8 (Decanoylchlorid), 10 (Dodecanoylchlorid, -OC(=O)-(CH₂)₁₀CH₃, hierin auch als Lauroylchlorid bezeichnet), 12 (Tetradecanoylchlorid, auch als Myristoylchlorid bekannt), 14 (Hexadecanoylchlorid, auch als Palmitoylchlorid bekannt) und 16 (Octadecanoylchlorid, wie Stearoylchlorid) ist. Ferner wird -OC(=O)-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇-CH₃ (Oleoylchlorid) hierin offenbart.
In den gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten CD-Derivaten sind die Sulfatgruppen hydrophile Gruppen. Bevorzugte Sulfatgruppen sind jene mit der allgemeinen Formel -OSO₃R, worin R ausgewählt wird aus (der Gruppe bestehend aus) Atomen und/oder Molekülen, die einwertige Kationen bilden. Beispiele für solche Atome/Moleküle sind H, Na, K, Li und NH₄. Besonders bevorzugte Sulfatgruppen sind -OSO₃H und -OSO₃Na.
Falls gewünscht können die neuartigen Cyclodextrinderivate ferner freie Hydroxylgruppen mit der Formel -OH haben. Jedoch merken wir an, dass falls gewünscht, die hierin offenbarten CD-Derivate keine Hydroxylgruppen haben können.
Weitere hierin offenbarte CD-Derivate haben nicht mehr als N-7 solcher „höheren" Alkylgruppen, wobei N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des Cyclodextrin ist, von welchem das Derivat erhalten wurde.
Weitere hierin offenbarte CD-Derivate haben nicht mehr als sieben solcher Sulfatgruppen.
Weitere CD-Derivate der vorliegenden Erfindung haben eine Gesamtzahl von Sulfat- und „höheren" Alkylgruppen von zwischen 4 und N-7, wobei N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des Cyclodextrin ist, von welchem das Derivat erhalten wurde.
Im Allgemeinen werden die neuartigen Cyclodextrinderivate ferner dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine, aber nicht mehr als dreizehn Sulfatgruppen haben.
Sollten die hierin offenbarten CD-Derivate Hydroxylgruppen haben, können mindestens eine, aber nicht mehr als N-2 solcher Hydroxylgruppen vorhanden sein, wobei N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des Cyclodextrin ist, von welchem das Derivat erhalten wurde. Weitere hierin offenbarte CD-Derivate haben nicht mehr als N-4 solcher Hydroxylgruppen, wobei N die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des Cyclodextrin ist, von welchem das Derivat erhalten wurde.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden CD-Derivate mit Verhältnissen von Sulfatgruppen zu „höheren" Alkylgruppen vorgesehen, welche das CD-Derivat mit biochemischen Eigenschaften vorsehen, die für einen bestimmten beabsichtigten Zweck oder Verwendung speziell geeignet (optimiert) sind.
Diesbezüglich sind viele unterschiedliche CD-Derivate der vorliegenden Erfindung gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung synthetisiert worden, um CD-Derivate vorzusehen, welche spezielle biochemische Eigenschaften haben. Je nach dem Profil der pharmazeutischen Form und den biochemischen und biologischen Eigenschaften des Arzneimoleküls, welches damit komplexiert und dadurch getragen wird, zeigen unterschiedliche CD-Derivate deutliche Effizienz mit potentiellen Vorteilen in bestimmten Fällen.
Hierin vorgesehene CD-Derivate haben biochemischen Eigenschaften wie unter anderem Löslichkeit in wässerigen und nicht wässerigen Lösungsmitteln, die Fähigkeit, Mizellen zu bilden, die Fähigkeit, mit anderen Verbindungen gemischte Mizellen zu bilden, die Fähigkeit, an hydrophobe Oberflächen zu adsorbieren und spezielle Oberflächenaktivität/Tensio-Wirksamkeit.
Insbesondere werden CD-Derivate mit gesteigerter Wasserlöslichkeit vorgesehen, worin das Verhältnis der vorhandenen Sulfatgruppen zu vorhandenen „höheren" Alkylgruppen gesteigert ist. Dies kann zum Beispiel auch dadurch erreicht werden, dass die Sulfatgruppen -OSO₃H und -OSO₃NH₄ sind und/oder die „höheren" Alkylgruppen -OC(=O)-(CH₂)_nCH₃ sind, worin n 6–12 ist, wie ausführlich oben diskutiert wurde.
Umgekehrt werden CD-Derivate mit verringerter Wasserlöslichkeit vorgesehen, wenns das Verhältnis von vorhandenen Sulfatgruppen zu vorhandenen „höheren" Alkylgruppen verringert wird.
Dies kann auch dadurch erreicht werden, dass beispielsweise die Sulfatgruppen -OSO₃K und -OSO₃Na sind und/oder die „höheren" Alkylgruppen -OC(=O)-(CH₂)_nCH₃ sind, worin n 12–18 ist, und/oder -OC(=O)–(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH₃ sind, worin m mindestens 6 ist, wie ausführlich oben diskutiert wurde.
Um den Punkt zu veranschaulichen, der Verhältnisse einbezieht, werden folgende Bespiele genannt: CD-Derivate, welche 2 Sulfatgruppen und 10 „höhere" Alkylgruppen haben, sind wasserlöslicher als CD-Derivate mit 2 Sulfatgrupen und 11 oder mehr „höheren" Alkylgruppen, aber weniger wasserlöslich als CD-Derivate mit 2 Sulfatgrupen und 9 oder weniger „höheren" Alkylgruppen. Ähnlich werden CD-Derivate mit 2 Sulfatgruppen und 10 „höheren" Alkylgruppen wasserlöslicher sein, als CD-Derivate mit 1 Sulfatgruppe und 10 „höheren" Alkylgruppen, aber weniger wasserlöslich als CD-Derivate mit 3 Sulfatgruppen und 10 „höheren" Alkylgruppen.
CD-Derivate mit gesteigerter Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln (wie Chloroform, Methyl-tert.-butylester, Dichlormethan, Hexadecan und Mineralöl) werden vorgesehen, wenn das Verhältnis der vorhandenen Sulfatgruppen zu vorhandenen „höheren" Alkylgruppen gesteigert wird. Dies kann auch dadurch erreicht werden, dass beispielsweise die Sulfatgruppen -OSO₃H und -OSO₃NH₄ sind und/oder die „höheren" Alkylgruppen -OC(=O)–(CH₂)_nCH₃ sind, worin n 12–18 ist und/oder -OC(=O)-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH₃, worin m mindestens 6 ist, wie oben ausführlich diskutiert wurde.
Umgekehrt werden CD-Derivate mit einer verringerten Löslichkeit in apolaren Lösungsmitteln vorgesehen, wenn das Verhältnis von vorhandenen Sulfatgrupen zu vorhandenen „höheren" Alkylgruppen gesteigert wird. Dies kann ebenfalls dadurch erreicht werden, dass zum Beispiel die Sulfatgruppen -OSO₃K und -OSO₃Na sind und/oder die „höheren" Alkylgruppen -OC(=O)-(CH₂)_nCH₃ sind, worin n 6–12 ist, wie oben ausführlich diskutiert wurde.
CD-Derivate mit einer gesteigerten Fähigkeit, Mizellen zu bilden, werden vorgesehen, wenn die Anzahl an vorhandenen Sulfatgruppen und die Anzahl an vorhandenen hydrophoben (also „höheren" Alkyl-)Gruppen gesteigert wird.
Umgekehrt werden CD-Derivate mit einer verringerten Fähigkeit, Mizellen zu bilden, vorgesehen, wenn die Anzahl an vorhandenen Sulfatgruppen und die Anzahl an vorhandenen hydrophoben (also „höheren" Alkyl-)Gruppen verringert wird.
Hinsichtlich des Obigen können CD-Derivate der vorliegenden Erfindung große gemischte Mizellen mit anderen Verbindungen bilden. Zum Beispiel bildet ein CD-Derivat mit einem Sulfat/Lauroyl-Verhältnis von 1,4 Sulfatgruppen zu 7,7 Lauroylgruppen pro CD-Derivatmolekül große gemischte Mizellen mit TWEEN 80 (MERCK), welche Ultrafiltrationsmembranen mit einem so hohen Rückhaltevermögen wie 100000 Daltons nicht passieren. Die Größe der gemischten Mizellen mit anderen Verbindungen hängt von dem Verhältnis der hydrophilen (also Sulfat-) Gruppen und hydrophoben (also „höheren" Alkyl-)Gruppen, von der Hydrophobizität der hydrophoben Gruppen und von den biochemischen Merkmalen des damit zu assoziierenden Moleküls ab.
CD-Derivate mit einer gesteigerten Oberflächenaktivität/Tensio-Wirksamkeit werden vorgesehen, wenn die Gesamtzahl an vorhanden Sulfatgruppen gesteigert wird und/oder die Gesamtzahl an vorhandenen hydrophoben (also „höheren" Alkyl) Gruppen gesteigert wird und/oder wenn die Gesamtzahl an vorhandenen Sulfatgruppen und vorhandenen „höheren" Alkylgruppen gesteigert wird.
CD-Derivate mit einer verringerten Oberflächenaktivität/Tensio-Wirksamkeit werden vorgesehen, wenn die Gesamtzahl an vorhanden Sulfatgruppen verringert wird und/oder die Gesamtzahl an vorhandenen hydrophoben (also „höheren" Alkyl) Gruppen verringert wird und/oder wenn die Gesamtzahl an vorhandenen Sulfatgruppen und vorhandenen „höheren" Alkylgruppen verringert wird.
In Veranschaulichung des Obigen: CD-Derivate der vorliegenden Erfindung können an hydrophobe Oberflächen binden (zum Beispiel binden die CD-Derivate der vorliegenden Erfindung mit einem Verhältnis (pro CD-Derivat) von Sulfatgruppen zu Lauroylgruppen von 1,4 Sulfatgruppen zu 7,7 Lauroylgruppen pro CD-Derivatmolekül an Tröpfchen einer Squalan-in-Wasser Emulsion).
CD-Derivate mit gesteigerter Fähigkeit, an hydrophobe Oberflächen zu binden, werden vorgesehen, indem die „höheren" Alkylgruppen -OC(=O)-(CH₂)_nCH₃ sind, worin n 12–18 ist und/oder -OC(=O)-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH₃, worin m mindestens 6 ist, wie ausführlich oben diskutiert wurde.
Umgekehrt werden CD-Derivate mit einer verringerten Fähigkeit, an hydrophobe Oberflächen zu binden, vorgesehen indem die „höheren" Alkylgruppen -OC(=O)-(CH₂)_nCH₃ sind, worin n 6–12 ist, wie oben ausführlich diskutiert wurde.
Unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung können Zusammensetzungen aus neuartigen Cyclodextrinderivaten vorgesehen werden, welche als solche verwendet werden können, ohne von den anderen CD-Derivaten getrennt zu werden, welche damit hergestellt werden und vorhanden sind.
Jedoch falls gewünscht und/oder notwendig kann/können bestimmtes) CD-Derivat(e), welche(s) durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellt wird/werden, dann zur nachfolgenden Verwendung durch die Verwendung von klassischen, nach Stand der Technik gut bekannten Verfahren, wie Ionenaustausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Kristallisation aus Lösungen usw. von dem Rest der hergestellten CD-Derivate getrennt und gereinigt werden.
Die hierin offenbarten CD-Derivate sehen verbesserte Bioverfügbarkeit des Moleküls aus festen und/oder halbfesten und/oder flüssigen Formulierungen vor, wenn sie mit einem Molekül (wie einem Arzneimolekül oder Antigen) komplexiert werden. Sie sehen auch erhöhte Stabilität und verbesserte Lagerbeständigkeit vor. Ferner reduzieren sie die Nebenwirkungen (Toxizität) der dadurch getragenen Gastmoleküle. Letztendlich ermöglichen sie das Vorsehen von gleichförmigen, leicht zu handhabenden Pulvern (sogar von Flüssigkeiten) und wässerigen injizierbaren Lösungen (von schlecht löslichen Arzneien).
Die neuartigen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung können für jene gleichen Zwecke verwendet werden, für welche CDs und andere CD-Derivate gegenwärtig und herkömmlich eingesetzt werden. Insbesondere wird hierin erwogen, dass die CD-Derivate der vorliegenden Erfindung zu medizinischen Zwecken als Träger für Arzneimoleküle und Antigene verwendet werden können.
Diesbezüglich können die CD-Derivate der vorliegenden Erfindung unter Verwendung von Protokollen und anderen Bedingungen, welche den Fachleuten gut bekannt sind, mit Arzneimolekülen und/oder Antigenen (welche den Fachleuten zur medizinischen Verwendung ebenfalls gut bekannt sind) komplexiert werden, um therapeutische und/oder prophylaktische Zusammensetzungen wie Impfstoffe und andere therapeutische und/oder prophylaktische Zusammensetzungen vorzusehen, welche dann für solche medizinischen Zwecke verwendet werden können. Ein Beispiel für solch eine medizinische Verwendung ist die Verwendung von CD-Derivaten (und Zusammensetzungen davon) in Hilfsstoffen. Geeignete Hilfsstoffe schließen jene ein, welche gewöhnlich als Öl-in-Wasser (einschließlich Squalan-in-Wasser, Mineralöl-in-Wasser und Sojaöl-in-Wasser) Emulsionen bezeichnet werden.
Nachdem die bevorzugten Ausführungsformen der CD-Derivate der vorliegenden Erfindung und die Verfahren zu ihrer Herstellung beschrieben worden sind, wird nun auf die folgenden Beispiele verwiesen, welche hierin nur als veranschaulichend beabsichtigt sind.
Beispiel 1
Für die Synthese der Cyclodextrine der vorliegenden Erfindung, wie in diesem und in den folgenden Beispielen beschrieben, wurden die größtmöglichen Vorsichtsmaßnahmen getroffen, um Kontaktieren der unterschiedlichen Ausgangsmaterialien mit Wasser zu verhindern.
Wasser wurde aus 4 Gramm Proben von β-CD (ACROS) durch Erhitzen der 4 Gramm Proben für 4 Stunden bei 120°C entfernt. Wasser wurde aus einem 1 : 1 (Vol./Vol.) Gemisch aus wasserfreiem Dimethylformamid (JANSSEN CHEMICA) und wasserfreiem Pyridin (JANSSEN CHEMICA) durch zugeben eines molekularen Siebs (2A von MERCK, Darmstadt, Deutschland) dazu und Inkubieren des Gemisches in einem geschlossenen Behälter für mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Das wasserfreie Dimethylformamid/Pyridin-Gemisch wurde dann durch Dekantieren des wasserfreien Gemisches in einen trockenen Behälter von den molekularen Sieben getrennt.
Die jeweiligen 4 Gramm Proben des getrockneten CD wurden dann in den jeweiligen 50 ml Proben des wasserfreien Dimethylformamid/Pyridin-Gemisches gelöst.
Lauroylchlorid (MERCK, DEUTSCHLAND) wurde dann zu den jeweiligen gelösten CD-Proben in den in Tabelle 1 dargestellten Mengen zugegeben und die Umsetzungsgemische wurden für sechs Stunden bei 60°C inkubiert, gefolgt von Inkubation für 18 Stunden bei Temperaturen von zwischen 15 und 22°C (Raumtemperatur). Auf diese Weise wurden L-CD-Lösungen erhalten.
Chlorsulfonsäure (MERCK, DEUTSCHLAND) wurde in den in Tabelle 1 dargestellten Mengen zu den jeweiligen Proben aus dem wasserfreien Dimethylformamid/Pyridin-Gemisch zugegeben, welches wie oben beschrieben hergestellt worden war. Diese jeweiligen Gemische wurden dann zu jeweiligen L-CD-Lösungen zugegeben, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die so erhaltenen Umsetzungsgemische wurden dann für 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 15 und 22°C (Raumtemperatur) inkubiert.
Nach Inkubation wurden die Lösungsmittel dann durch Abdampfen bei niedrigem Druck (200 Millibar) für 1–2 Stunden bei 60°C aus den Umsetzungsgemischen entfernt. Die Lösungsmittel wurden ferner durch extensive Dialyse unter Verwendung einer Membran aus regenerierter Cellulose mit einem Rückhaltevermögen von zwischen 1000 und 10000 Dalton (SPECTRA/POR) gegenüber isotonischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, bestehend pro Liter Wasser aus: 8 g Natriumchlorid, 0,2 g Kaliumchlorid und 1,15 g Dinatriumhydrogenphosphat mit einem pH von 7,3) und nachfolgend gegen ultrareines Wasser entfernt, bis kein Lösungsmittel in dem Filtrat nachgewiesen wurde. Das Volumenverhältnis von Dialysat (PBS oder ultrareines Wasser) und dem in der Dialyse verwendeten Rückstand wurde bei > 10 : 1 (Vol./Vol.) gehalten. Das Dialyseverfahren wurde für mindestens 10 Tage durchgeführt, wobei das Dialysat mindestens einmal am Tag ersetzt wurde. Trockene Produkte wurden durch Lyophilisation des Rückstands bei Raumtemperatur, einem inneren Druck von weniger als 0,1 mbar und einer Kühlfalle von weniger als –25°C erhalten.
Die chemischen Zusammensetzungen der erhaltenen CD-Derivate wurden dann durch Messen des Cyclodextringehalts, des gebundenen Sulfatgehalts, des Gesamtlipidgehalts, des freien Lipidgehalts und des gebundenen Lipidgehalts (berechnet durch Subtrahieren des freien Lipidgehalts vom Gesamtlipidgehalt) bestimmt, wie in Hilgers et al., VACCINE 12, 653–660 (1994) beschrieben.
Die Zusammensetzung der CD-Derivate wurde als mittlere Zahl an gebundenen Sulfatgruppen pro Molekül der hergestellten Cyclodextrinderivate und der mittleren Zahl an gebundenen Lipidgruppen pro Molekül des hergestellten Cyclodextrinderivats ausgedrückt.
Die Zusammensetzung der mittleren Zahlen an gebundenen Sulfatgruppen und gebundenen Lipidgruppen pro Molekül der hergestellten Cyclodextrinderivate werden in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 Chemische Zusammensetzung von CD-Derivatlösung
Aus den in Tabelle 1 gezeigten Ergebnissen kann die genaue Verteilung der unterschiedlichen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung berechnet werden, welche in den verschiedenen durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung hergestellten Lösungen vorhanden sind, und zwar unter Verwendung der Formel: % hergestelltes Cyclodextrinderivat = P(X)·P(X)·100worin
worin X = reale Anzahl an Sulfatgruppen pro CD-Molekül und
worin e = der Basiswert des natürlichen log (ln) und
worin, wenn das mittlere Lipidverhältnis ≤ N/2 ist und N für die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen pro Cyclodextrinmolekül steht, von welchem die Derivate erhalten wurden,
worin Y = reale Anzahl an Lipidgruppen pro CD-Molekül und
worin e = der Basiswert des natürlichen log (ln)
oder worin, wenn das mittlere Lipidverhältnis > N/2 ist und N für die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen pro Cyclodextrinmolekül steht, von welchem die Derivate erhalten wurden,
worin Y = reale Anzahl an Lipidgruppen pro CD-Molekül und
worin e = der Basiswert des natürlichen log (ln) und
worin N = die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen pro Molekül Cyclodextrin, von welchem die Derivate erhalten wurden.
Auf diese Weise wird die genaue Verteilung der unterschiedlichen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche in den jeweiligen durch die Verwendung des Verfahrens der Erfindung wie oben in diesem Beispiel beschrieben hergestellten Lösungen vorhanden sind, wie folgt in Tabelle 2–21 dargestellt:
Beispiel 2
Eine Zusammensetzung aus CD-Derivaten wurde auf gleiche Weise wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellt (und die chemischen Zusammensetzungen davon wurden bestimmt), aber mit den folgenden Ausnahmen: (1) dass das wasserfreie Dimethylformamid/wasserfreie Pyridin Gemisch ein 4 : 3 (Vol./Vol.) Gemisch aus wasserfreiem Dimethylformamid (4 Teilen) und wasserfreiem Pyridin (3 Teilen) war, (2) dass jeweils 280 Gramm Proben des getrockneten CD in jeweils 2000 ml Proben des wasserfreien Dimethylformamid/Pyridin-Gemisches gelöst wurden; und (3) dass die Mengen an Lauroylchlorid und Chlorsulfonsäure zu jenen geändert wurden, welche unten in Tabelle 22 dargestellt werden:
Tabelle 22 Chemische Zusammensetzung von CD-Derivatlösung
Die genaue Verteilung der unterschiedlichen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche in den jeweiligen durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wie oben in diesem Beispiel beschrieben hergestellten Lösungen vorhanden sind, wurde unter Verwendung der gleichen Formel, wie oben in Beispiel 1 beschreiben bestimmt, deren Ergebnisse wie folgt in Tabellen 23–25 dargestellt werden:
Beispiel 3
Eine Zusammensetzung aus CD-Derivaten wurden auf die oben in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt (und die chemischen Zusammensetzungen davon wurden bestimmt), aber mit den folgenden Ausnahmen: (1) N-Methylpyrrolidinon wurde anstelle von Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet; (2) dass das wasserfreie N-Methylpyrrolidinon/wasserfreie Pyridin Gemisch ein 5 : 2 (Vol./Vol.) Gemisch aus wasserfreiem N-Methylpyrrolidinon (5 Teile) und wasserfreiem Pyridin (2 Teile) war; (3) dass jeweils 280 Gramm Proben von dem getrockneten CD in jeweils 2000 ml Proben des wasserfreien N-Methylpyrrolidinon/Pyridin-Gemisches gelöst wurden; und (4) dass die Mengen an Lauroylchlorid und Chlorsulfonsäure zu jenen geändert wurden, welche in Tabelle 26 dargestellt werden:
Tabelle 26 Chemische Zusammensetzung von CD-Derivatlösung
Die genaue Verteilung der unterschiedlichen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche in den jeweiligen durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wie oben in diesem Beispiel beschrieben hergestellten Lösungen vorhanden sind, wurde unter Verwendung der gleichen Formel, wie oben in Beispiel 1 beschreiben bestimmt, deren Ergebnisse wie folgt in Tabellen 27–29 dargestellt werden:
Beispiel 4
Eine Zusammensetzung aus CD-Derivaten wurden auf die oben in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt (und die chemischen Zusammensetzungen davon wurden bestimmt), aber mit den folgenden Ausnahmen: (1) N-Methylpyrrolidinon wurde anstelle von Dimethylformamid als Lösungsmittel verwendet; (2) dass das wasserfreie N-Methylpyrrolidinon/wasserfreie Pyridin Gemisch ein 6 : 1 (Vol./Vol.) Gemisch aus wasserfreiem N-Methylpyrrolidinon (6 Teile) und wasserfreiem Pyridin (1 Teil) war; (3) dass jeweils 10 Gramm Proben von dem getrockneten CD in jeweils 35 ml Proben des wasserfreien N-Methylpyrrolidinon/Pyridin-Gemisches gelöst wurden; und (4) dass die Mengen an Lauroylchlorid und Chlorsulfonsäure zu jenen geändert wurden, welche unten in Tabelle 30 dargestellt werden:
Tabelle 30 Chemische Zusammensetzung von CD-Derivatlösung
Die genaue Verteilung der unterschiedlichen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche in den jeweiligen durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wie oben in diesem Beispiel beschrieben hergestellten Lösungen vorhanden sind, wurde unter Verwendung der gleichen Formel, wie oben in Beispiel 1 beschreiben bestimmt, deren Ergebnisse wie folgt in Tabellen 31–32 dargestellt werden:
Beispiel 5
Wasser wurde aus 310 Gramm Proben von β-CD (ACROS) durch Erhitzen der 310 Gramm Proben für 4 Stunden bei 120°C entfernt, was etwa 280 Gramm getrocknetes CD ergab.
Wasser wurde aus einem 5 : 2 (Vol./Vol.) Gemisch aus wasserfreiem N-Methylpyrrolidinon (5 Teile) und wasserfreiem Pyridin (2 Teile) durch Zugeben eines molekularen Siebs (2A von MERCK, Darmstadt, Deutschland) dazu und Inkubieren des Gemisches in einem geschlossenen Behälter für mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur entfernt. Das wasserfreie N-Methylpyrrolidinon/Pyridin-Gemisch wurde dann durch Dekantieren des wasserfreien Gemisches in einen trockenen Behälter von den molekularen Sieben getrennt.
Jeweils 280 Gramm Proben des getrockneten CD wurden dann in jeweils 2000 ml Proben des wasserfreien N-Methylpyrrolidinon/Pyridin-Gemisches gelöst.
Lauroylchlorid wurde dann zu den jeweiligen gelösten CD-Proben in den in Tabelle 33 unten dargestellten Mengen zugegeben und das Umsetzungsgemisch wurde für sechs Stunden bei 60°C inkubiert, gefolgt von Inkubation für 18 Stunden bei Temperaturen von zwischen 15 und 22°C (Raumtemperatur). Auf diese Weise wurden L-CD-Lösungen erhalten.
Chlorsulfonsäure wurde in den in Tabelle 33 dargestellten Mengen zu den jeweiligen Proben aus dem wasserfreien N-Methylpyrrolidinon/Pyridin-Gemisch zugegeben, welches wie oben beschrieben hergestellt worden war. Diese jeweiligen Gemische wurden dann zu jeweiligen L-CD-Lösungen zugegeben, wie ebenfalls in Tabelle 33 dargestellt. Die so erhaltenen Umsetzungsgemische wurden dann für 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 15 und 22°C (Raumtemperatur) inkubiert.
Nach Inkubation wurden die Lösungsmittel dann aus den Umsetzungsgemischen entfernt, indem dazu (pro Gramm CD in dem Umsetzungsgemisch) sowohl 5 Gramm TWEEN 80 (ICI), als auch 5 Gramm ultrareines Wasser zugegeben wurden. Dann wurden zwei Teile (Vol./Vol.) ultrareines Wasser zu den jeweiligen Gemischen zugegeben und die Gemische nachfolgend über einer Ultrafiltrationsmembran aus regenerierter Cellulose mit einem 10 kD (Kilodalton) Rückhaltevermögen (HOECHST) ultrafiltriert, bis das ursprüngliche Volumen zurückgewonnen war.
Das Verfahren des Zugebens von zwei Teilen (Vol./Vol.) ultrareinen Wassers zu dem gewonnenen Rückstand, gefolgt von Ultrafiltration wurde dann zwölf Mal wiederholt, um sicherzustellen, dass die Lösungsmittelkonzentration innerhalb eines annehmbaren Grads war.
Auf diese Weise wurden wässerige Lösungen der CD-Derivate plus TWEEN 80 in ultrareinem Wasser erhalten.
Die chemischen Zusammensetzungen der erhaltenen CD-Derivate wurden dann wie oben in Beispiel 1 ausführlich beschrieben bestimmt und werden hier unten in Tabelle 33 zusammengefasst:
Tabelle 33 Chemische Zusammensetzung von CD-Derivatlösung
Die genaue Verteilung der unterschiedlichen CD-Derivate der vorliegenden Erfindung, welche in den jeweiligen durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wie oben in diesem Beispiel beschrieben hergestellten Lösungen vorhanden sind, wurde unter Verwendung der gleichen Formel, wie oben in Beispiel 1 beschreiben bestimmt, deren Ergebnisse wie folgt in Tabellen 34–36 dargestellt werden:
Beispiel 6
Eine 4,5 Gramm Probe von β-Cyclodextrin (ACROS) wurde in einem 100 ml 1 : 1 (Vol./Vol.) Gemisch aus wasserfreiem Dimethylformamid (JANSSEN CHEMICA) und wasserfreiem Pyridin (JANSSEN CHEMICA) gelöst, Wasser wurde dann aus der Lösung entfernt, und zwar durch Zugegen von molekularen Sieben (2A durch MERCK, Darmstadt, Deutschland) dazu und Inkubieren des Gemisches in einem geschlossenen Behälter für mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur. Das wasserfreie Gemisch wurde dann durch Dekantieren des wasserfreien Gemisches in einen trockenen Behälter von den molekularen Sieben getrennt.
6,6 Gramm Lauroylchlorid (MERCK, Deutschland) wurden dann zu der gelösten CD-Probe zugegeben und die Umsetzungsgemische wurden für sechs Stunden bei 60°C inkubiert, gefolgt von Inkubation für 18 Stunden bei Temperaturen von zwischen 15 und 22°C (Raumtemperatur). Auf diese Weise wurden L-CD-Lösungen erhalten.
0,6 Gramm Chlorsulfonsäure (MERCK, DEUTSCHLAND) wurden dann zu einer 10 ml Probe aus dem wasserfreien Dimethylformamid/Pyridin-Gemisch zugegeben, welches wie oben in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Dieses Gemisch wurde dann zu der L-CD-Lösung zugegeben. Das so erhaltenen Umsetzungsgemisch wurde dann für 24 Stunden bei einer Temperatur von zwischen 15 und 22°C (Raumtemperatur) inkubiert.
Nach Inkubation wurden die Lösungsmittel dann durch Abdampfen bei niedrigem Druck (200 Millibar) für 1–2 Stunden bei 60°C teilweise aus dem Umsetzungsgemisch entfernt. Die Lösungsmittel wurden ferner durch extensive Dialyse unter Verwendung einer Membran aus regenerierter Cellulose mit einem Rückhaltevermögen von 10000 Dalton (SPECTRA/POR) gegenüber isotonischer Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (dessen Zusammensetzung ausführlich oben in Beispiel 1 diskutiert wird) und nachfolgend gegen ultrareines Wasser entfernt, bis kein Lösungsmittel in dem Filtrat nachgewiesen wurde. Das Volumenverhältnis von Dialysat (PBS oder ultrareines Wasser) und dem in der Dialyse verwendeten Rückstand wurde bei > 10 : 1 (Vol./Vol.) gehalten. Das Dialyseverfahren wurde für mindestens 10 Tage durchgeführt, wobei das Dialysat mindestens einmal am Tag ersetzt wurde. Trockene Produkte wurden durch Lyophilisation des Rückstands bei Raumtemperatur, einem inneren Druck von weniger als 0,1 mbar und einer Kühlfalle von weniger als –25°C erhalten.
Die chemischen Zusammensetzungen der erhaltenen CD-Derivate wurden dann durch Messen des Cyclodextringehalts, des gebundenen Sulfatgehalts, des Gesamtlipidgehalts, des freien Lipidgehalts und des gebundenen Lipidgehalts (berechnet durch Subtrahieren des freien Lipidgehalts vom Gesamtlipidgehalt) bestimmt, wie in Hilgers et al., VACCINE 12, auf Seiten 653–660 (1994) beschrieben.
Die Zusammensetzung der CD-Derivate wurde als mittlere Zahl an gebundenen Sulfatgruppen pro Molekül der hergestellten Cyclodextrinderivate und der mittleren Zahl an gebundenen Lipidgruppen pro Molekül des hergestellten Cyclodextrinderivats ausgedrückt. Diesbezüglich wurde die berechnete mittlere Zahl an gebundenen Lipidgruppen als 7,35 gebundene Lipidgruppen/CD-Molekül bestimmt und die berechnete mittlere Zahl an gebundenen Sulfatgruppen wurde als 1,4 gebundene Sulfatgruppen/CD-Molekül bestimmt.
Eine 1% (Gew./Vol.) Lösung der SL-CD-Derivate wurde durch Lösen von etwa 1 Gramm der erhaltenen CD-Derivate in einem minimalen Volumen von etwa 20 ml Methyl-tert.-Butylether (MERCK), Zugeben (pro Gramm des zugegebenen CD-Derivats) von 2 ml des TWEEN 80 und Abdampfen des tert.-Methylbutylethers bei einer erhöhten Temperatur (etwa 60°C) und verringertem Druck (80 Millibar), bis eine visköse Lösung des SL-CD-Derivats im TWEEN 80 erhalten worden ist.
10 ml Wasser pro Gramm des SL-CD-Derivats wurden langsam zugegeben. Danach wurden die passenden Volumina an PBS und entweder Squalan (ALDRICH) oder Sojaöl oder Hexadecan (SIGMA) zu den jeweiligen Proben zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Mikroverflüssiger (MICROFLUIDICS Corp., USA) emulgiert, bis keine Tropfen Öl größer als 2 oder 3 μm unter dem Mikroskop (Größe 1000) sichtbar waren. Die Emulsionen, welche pro ml 10 mg SL-CD, 20 mg TWEEN 80 und 80 mg von entweder Squalan, Sojaöl oder Hexadecan enthielten, wurden dann bei 4°C bis zur Verwendung gelagert.
Die Impfstoffe wurden durch Mischen von einem Volumen Antigen mit einem Volumen Hilfsstoff hergestellt. Die Antigene wurden als solche wie in Vaccine 12, p. 653–660 und Vaccine 12, p. 661–665 (1994) beschrieben hergestellt. Zwei Lösungen aus un terschiedlichen Antigenen wurden verwendet: Lösung I, welche pro ml 10 μg inaktivierten Influenza-Virus MRC-11 (SOLVAY DUPHAR) und 1000 μg OVA (SIGMA) einschloss; und Lösung II, welche pro ml 4,4 μg/ml inaktivierten Influenza-Virus, Stamm A/Schwein (SOLVAY DUPHAR), 4,0 μg inaktivierten Influenza-Virus, Stamm MRC-11 (SOLVAY DUPHAR), 2,0 μg inaktivierten Influenza-Virus, Stamm X-79 (SOLVAY DUPHAR) und 10⁸ TCID₅₀ inaktivierten Pseudotollwut-Virus (SOLVAY DUPHAR) einschloss.
8–10 Wochen alte NMRI weibliche Mäuse (CHARLES RIVER, Deutschland), welche jeweils etwa 20 Gramm wogen, wurden durch Injektion in den Fußballen mit 0,025 ml Impfstoff immunisiert und die Anitkörpertiter wurden drei Wochen später gemessen.
Die Antikörpertiter wurden durch geometrische Mittel (²log ± SEM) ausgedrückt. Die Analyse der Antikörpertiter wurde durch standardisierte Tests unter Verwendung von Kriterien bezüglich ihrer Validität wie vorhergehend in Vaccine 12, p. 653–660 (1994) beschrieben durchgeführt.
Der Studententest wurde durchgeführt, um die statistische Signifikanz der Ergebnisse zu analysieren und ein P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Die Hilfsstoffformulierungen wurden in Mäusen in zwei unabhängigen Versuchen getestet.
Die Ergebnisse dieser Versuche werden unten in Tabelle 37 zusammengefasst:
Tabelle 37
Schlüssel

n: Anzahl an Arten
SEM: mittlere Standardabweichung
SL-CD/S/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Squalan-in-Wasser
SL-CD/Sojaöl/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Sojaöl-in-Wasser

Alle SL-CD-Derivat/Öl/Wasser-Emulsionen steigern die humorale Respons gegen Influenza-Virus, Stamm MRC-11 und gegen OVA.
Beispiel 7
Scheine im Alter von 8 bis 10 Wochen sind auf mögliche Präsenz von Antikörpern gegen die fraglichen viralen Antigene getestet worden und die Schweine mit nachweisbaren Antikörpertitern sind ausgeschlossen worden.
Die SL-CD-Derivate der vorliegenden Erfindung wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben synthetisiert.
Eine Mineralöl-in-Wasser Emulsion, verkauft unter dem Namen SUVAXYN O/W EMULSION (SOLVAY DUPHAR) wurde dann erhalten und Formulierungen von SL-CD-Derivaten in einer Emulsion von Squalan-in-Wasser wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
Impfstoffe, welche die Hilfsstoffformulierungen enthielten, wurden ebenfalls wie oben in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
Die Formulierungen von SL-CD-Derivaten-in-Squalan-in-Wasser, von Mineralöl-in-Wasser und ohne Hilfsstoff wurden dann auf ihre Hilfsstoffwirkung auf Schweine mit inaktiviertem Pseudotollwut-Virus und inaktivierten Influenza-Virus Stämmen MRC-11 und A/Schwein als Antigene getestet. Die Tiere wurden zwei Mal (Woche 0 und Woche 3) immunisiert und die Antikörpertiter wurden drei Wochen (Woche 6) nach der zweiten Injektion gemessen.
Die Ergebnisse dieser Versuche werden unten in Tabelle 38 zusammengefasst:
Tabelle 38
Schlüssel

SEM: mittlere Standardabweichung
SL-CD/S/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Squalan-in-Wasser

Die Antikörpertiter gegen PRV (Anti-PRV) wurden durch Verwendung von Emulsionen von SL-CD-Derivaten-in-Squalan-in-Wasser (SL-CD/Sgualan/Wasser) erhöht. Die gemessenen Antikörpertiter waren vergleichbar mit oder höher als jene, welche durch die in herkömmlichen Produkten verwendeten Mineralöl-in-Wasser Emulsionen erhalten wurden. Die Antikörperrespons gegen A/Schwein und gegen MRC-11 wurde ebenfalls durch die Formulierungen von SL-CD-Derivaten-in-Squalan-in-Wasser (SL-CD/S/W) und Mineralöl-in-Wasser erhöht.
Beispiel 8
Neben der Hilfsstoffwirkung sind weitere Eigenschaften für die Bewertung eines Impfstoffs wichtig. Unter anderem ist eine lokale Reaktion ein wichtiger Aspekt, als auch wie eine bestimmte Reaktion an der Stelle der Injektion im Allgemeinen in bestimmten Tierarten akzeptiert wird. Die lokale Toxizität ist in vivo nach dem Schwellen der Mäuseballen nach Injektion des Impfstoffs getestet worden. Es zeigte, dass dieses Verfahren sehr empfindlich ist.
Die SL-CD-Derivate der vorliegenden Erfindung wurden wie in Beispiel 6 oben beschrieben synthetisiert.
Formulierungen von SL-CD-Derivaten in Öl-in-Wasser-Emulsionen von Squalan-in-Wasser, von Sojaöl-in-Wasser und von Hexadecan-in-Wasser wurde wie oben in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
Impfstoffe, welche die Hilfsstoffformulierungen enthalten, wurden ebenfalls wie oben in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
Gruppen von sechs Mäusen wurden mit 25 μl Impfstoff pro subkutaner Injektion im Ballen des hinteren rechten Fußes behandelt. Der Impfstoff schloss ein Volumen Antigenlösung, enthaltend 10 μg MRC-11 und 1 mg Ovalbumin (OVA) pro ml PBS und ein Volumen Hilfsstoff ein.
Die Dicke des Ballens wurde einen Tag vor und bei mehreren Intervallen nach der Injektion durch eine halbelektronische Vorrichtung gemessen, welche speziell für diesen Zweck durch die Universität von Utrecht (UTRECHT, Niederlande) entwickelt worden ist. Die Genauigkeit dieses Apparats beträgt etwa 0,02 mm.
Das Schwellen wurde durch Subtrahieren der Dicke des Ballens vor der Behandlung von der Dicke des Ballens nach der Behandlung berechnet, wobei solche Dicke in 0,01 mm ausgedrückt wurde.
Die Ergebnisse werden unten in Tabellen 39 und 40 zusammengefasst:
Tabelle 39

SL-CD/S/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Squalan-in-Wasser
SL-CD/Sojaöl/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Sojaöl-in-Wasser

Tabelle 40

SL-CD/S/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Squalan-in-Wasser
SL-CD/Sojaöl/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Sojaöl-in-Wasser
SL-CD/Hexadecan/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Hexadecan-in-Wasser

Gemäß der obigen Tabelle war die in den unterschiedlichen Ölen eingeschossene Reaktogenizität von SL-CD sehr schwach oder abwesend. Die Emulsionen, welche SL-Cyclodextrin in Squalan und Hexadecan enthielten, provozierten etwas Schwellung für ein bis zwei Tage nach der Injektion, während das SL-Cyclodextrin in Sojaöl keine sichtbare Reaktion provozierte.
Die Reaktogenizität, also die an Mäusen getestete lokale Toxizität, zeigt hervortretende Wirkungen in Funktion der Ölart.
Beispiel 9
Die SL-CD-Derivate der vorliegenden Erfindung wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben synthetisiert.
Formulierungen von SL-CD-Derivaten in Öl-in-Wasser Emulsionen von Squalan-in-Wasser, von Sojaöl-in-Wasser und von Hexadecan-in Wasser wurden wie oben in Beispiel 6 beschrieben hergestellt.
Die Stabilität der Emulsionen wurden in vitro getestet, indem die Formulierungen einer erhöhten Temperatur während eines festgesetzten Zeitraums ausgesetzt wurden. Im Allgemeinen sind Emulsionen bei höheren Temperaturen weniger stabil und von dem Test bei erhöhten Temperaturen wird angenommen, dass er Hinweise bezüglich des langfristigen Verhaltens bei niedrigeren Temperaturen liefert.
Die Stabilität der Emulsionen wurde bei 37°C bestimmt. Sterile Aliquoten von 5 ml Emulsion, welche 0,01% (Gew./Vol.) Thimersol (SIGMA) umfassten, wurden bei 37°C inkubiert und die Bildung von Öltropfen, das Erscheinen einer Ölphase und andere Modifikationen sind jeden Tag durch Inspektion der Emulsionen mit dem nackten Auge verifiziert worden.
Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 41 zusammengefasst:
Tabelle 41
Schlüssel:

SL-CD/S/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Squalan-in-Wasser
SL-CD/Sojaöl/W: SL-Cyclodextrinderivat-in Sojaöl-in-Wasser
SL-CD/Hexadecan/W: SL-Cyclodextrinderivat-in-Hexadecan-in- Wasser
+: weiße homogene Emulsion, keine Öltropfen mit nacktem Auge sichtbar
±: kleine Tropfen Öl an der flüssigen Phase für das nackte Auge sichtbar
±/+: zwischen ± und +

Die SL-CD-Derivate der vorliegenden Erfindung haben eine bemerkenswerte Stabilität, wenn sie in Ölemulsionen von Squalan, Sojaöl und Hexadecan eingeschlossen sind und bleiben für mehr als 53 Tage bei 37°C stabil.

Claims

Cyclodextrinderivat, dadurch gekennzeichnet, dass es durch mindestens eine lineare Kohlenwasserstoffkette von mindestens acht Kohlenstoffatomen und mindestens einer, aber nicht mehr als sieben Sulfatgruppen substituiert ist, vorausgesetzt, dass das Cyclodextrinderivat keine Verbindung der Formel I
Formel I ist, worin: M ein pharmazeutisch annehmbares Kation darstellt; p 1 oder 2 ist; q für n/2 steht wenn p 2 ist und q für n steht wenn p 1 ist; R ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₁₂-nied.-Alkyl, C₃-C₁₂-Cycloalkyl und Aryl oder Heteroaryl, gegebenenfalls substituiert mit 1–3 Substituenten, unabhängig ausgewählt aus Halogen, C₁-C₁₂-nied. -Alkyl oder C₁-C₁₂-Alkoxy; und n eine ganze Zahl von 6–8 ist, α-Cyclodextrin (n = 6), (β-Cyclodextrin (n = 7) und γ-Cyclodextrin (n = 8) darstellt.
Cyclodextrinderivat wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die Anzahl an Hydroxylgruppen des Cyclodextrin, von welchem das Derivat erhalten wurde, achtzehn, einundzwanzig oder vierundzwanzig beträgt.
Cyclodextrinderivat, wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass die Ketten lineare Kohlenstoffketten mit einer allgemeinen Formel -OC(=O)-(CH₂)_n-CH₃ sind, worin n mindestens 6 ist, und/oder -OC(=O)-(CH₂)_m-CH=CH-(CH₂)_m-CH₃, worin m mindestens 6 ist.
Cyclodextrinderivat wie in Anspruch 3 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass die Ketten lineare Kohlenstoffketten mit einer allgemeinen Formel -OC(=O)-(CH₂)_n-CH₃ sind, worin n zwischen 6 und 24 ist.
Cyclodextrinderivat wie in Anspruch 3 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass die Ketten lineare Kohlenstoffketten mit der Formel -OC(=O)–(CH₂)₁₀-CH₃ oder -OC(=O)–(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇-CH₃ sind.
Cyclodextrinderivat wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass die Sulfatgruppen -OSO₃R sind, worin R ein Atom und/oder ein Molekül darstellt, das einwertige Kationen bildet.
Cyclodextrinderivat wie in Anspruch 6 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass R für H, Na, K, Li und/oder NH₄ steht.
Cyclodextrinderivat wie in einem der vorhergehenden Ansprüche beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine freie Hydroxylgruppe hat.
Cyclodextrinderivat wie in einem der Ansprüche 1–8 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass es mit Antigenen komplexiert ist.
Verfahren zur Herstellung der Cyclodextrinderivate wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht, gekennzeichnet durch die Schritte des Kontaktierens eines Cyclodextrin mit sowohl Acoylchlorid, als auch sulfonierendem SO₃-Komplex.
Verfahren wie in Anspruch 10 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass Kontaktieren des Cyclodextrin mit Acoylchlorid Kontaktieren mit sulfonierendem SO₃-Komplex vorausgeht.
Verfahren wie in Anspruch 10 oder Anspruch 11 beansprucht, wobei das Cyclodextrin für etwa sechs Stunden bei etwa 60°C mit Acoylchlorid kontaktiert wird.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 10 bis 12 beansprucht, wobei das Cyclodextrin durch mindestens ein Mol aber nicht mehr als N-1 Mol Acoylchlorid kontaktiert wird, wobei die gesamte vereinigte Anzahl an Mol von Acoylchlorid und sulfonierendem SO₃-Komplex N nicht überschreitet und wobei N für die Gesamtzahl an Hydroxylgruppen des kontaktierten Cyclodextrin steht.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 10 bis 13 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass Acoylchlorid Octanoylchlo rid, Decanoylchlorid, Dodecanoylchlorid, Tetradecanoylchlorid, Hexadecanoylchlorid, Octadecanoylchlorid und/oder Oleoylchlorid ist.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 10 bis 14 beansprucht, ferner dadurch gekennzeichnet, dass der sulfonierende SO₃-Komplex HClSO₃, SO₃-Pyridin, SO₃-2-Methylpyridin, SO₃-2,6-Dimethylpyridin, SO₃-Dimethylformamid, SO₃-Trimethylamin, SO₃-Triethylamin, SO₃-Dimethylanilin, SO₃-N-Ethylmorpholin, SO₃-Diethylanilin und/oder SO₃-Dioxan ist.
Verfahren wie in einem der Ansprüche 10 bis 15 beansprucht, ferner gekennzeichnet durch Dialysieren und/oder Ultrafiltrieren der erhaltenen Cyclodextrinderviate in Gegenwart von einwertigen Kationen.
Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, wobei die einwertigen Kationen mindestens eines von entweder H⁺, Na⁺, K⁺, Li⁺ oder NH₄ ⁺ einschließen.
Verfahren wie in Anspruch 16 oder Anspruch 17 beansprucht, wobei solches Dialysieren und/oder Ultrafiltrieren der erhaltenen Cyclodextrinderivate in Gegenwart eines nicht-dialysierbaren Detergens durchgeführt wird.
Impfstoffzusammensetzung, welche ein Cyclodextrinderivat umfasst, welches durch mindestens eine lineare Kohlenwasserstoffkette von mindestens acht Kohlenstoffatomen und mindestens einer Sulfatgruppe substituiert ist.
Verwendung eines Cyclodextrinderivats, welches durch mindestens eine lineare Kohlenwasserstoffkette von mindestens acht Kohlenstoffatomen und mindestens einer Sulfatgruppe substituiert ist, bei der Herstellung eines Hilfsstoffs oder einer Impfstoffzusammensetzung.