CN1171052A - 疫苗佐剂 - Google Patents

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Abstract

一种含有硫脂多糖和界面形成成分的疫苗佐剂。本发明还提供了一种制备疫苗的方法,它是通过乳化抗原水溶液和硫脂多糖。该佐剂在高温下是稳定的,而且至少与常规佐剂一样有效。它们的局部毒性剂反应原性一般低于常规佐剂。

Description

疫苗佐剂
本发明涉及新颖的疫苗佐剂。
抗原被定义为某一生物体的外来物质，使用时如非胃肠道给药时，会引发免疫反应，例如形成抗体。
抗体是包含于血液和其它体液以及组织中的物质，它与抗原结合而使之无害。抗体构成了身体的天然屏障之一。它们具有很高的特异性，并可杀死、结合或使引发抗体形成的抗原无害。
抗原与免疫系统接触时会激活一系列复杂的细胞的相互反应以消除抗原和/或再建立以前的平衡。
抗原特征中的两个特征是它们的免疫原性，即它们能在体内引发免疫反应(包括形成特异性的抗体)和它们的抗原性，即它们能被起源为抗原的抗体选择性地识别。
已知如何通过使用疫苗来给予特定的抗原，从而故意刺激免疫反应。该程序可获得生物体内的一种免疫应答状态，该状态使生物体以后与抗原接触时可产生更为迅速和有效的应答。
但是，有些抗原只有微弱的免疫原性，它们引发不充足的免疫反应以获得对生物体的有效保护。
可通过与称为佐剂的物质的混合使用，来增加抗原的免疫原性，佐剂或者通过直接对免疫学系统的作用或者通过修饰抗原的药物动力学特性来增加对抗原的应答，这样增加了抗原与免疫系统相互作用的时间。
目前，大量兽用疫苗所使用的疫苗仍含有标准的矿物油乳剂，如矿物油包水型(W/O)或水包油型(O/W)佐剂。若干年以来，已开始调查研究以寻找低毒的、有类似效力的替代物。注射基于矿物油的标准佐剂常伴有局部反应，其严重程度在很大程度上取决于乳剂的类型以及所用的油的性质。因此，基于矿物油的佐剂仅限于用于家畜(猪、鸡、反刍动物等)和试验动物。
早些时候，已表明多聚蔗糖和表氯醇(epichloridrin)的合成共聚物-菲可(Ficoll)-具有硫酸根基和脂基(SL-菲可)，当掺入水包角鲨烷(S)(S/W)型乳剂中时，在不同动物(包括猪)中对不同类型的抗原具有高佐剂效应，其中包括一些重要的病毒抗原(疫苗，Vol.12，pp 653-660(1994)和疫苗，Vol.12，pp.661-665(1994)，EPO 0,549,074)。这些基于菲可的佐剂制剂足以有效地替换在不同的猪疫苗中所用的标准水包矿物油型制剂。
然而，局部毒性即这些基于菲可的制剂在猪和小鼠中的反应原性(reactogenicity)并不弱于标准的O/W型矿物油制剂。
此外，对于基于菲可的制剂，温度对乳剂的稳定性有明显的影响。某些乳剂在4℃可稳定存在数年，但在37℃时水相和油相会在数天内分离，而在60℃约10分钟便分离了。
本发明的目的是提供一种有效的疫苗佐剂，它在高温下有更高的稳定性而且局部毒性更低。
该目的是通过这样的一种疫苗佐剂实现的，该佐剂含有硫脂多糖和界面形成成分(如油/水型(O/W)乳剂)。
本发明佐剂的一个优点是，与基于菲可的佐剂相比，它在高温下更稳定。
该目的是通过含有硫脂多糖和界面形成成分的疫苗佐剂而实现的。
术语“多糖”指具有至少3个相互共价连接的重复糖单元的化合物。
术语“硫脂多糖”指这样的化合物，它具有至少3个相互共价连接的重复糖单元、至少一个硫酸根基(sulfate group)和至少一个脂基。
较佳地，硫脂多糖是疏水性多糖。
术语“疏水多糖”指多糖在水相中的溶解性低于在非极性有机相中的溶解性。
根据第一个有利的例子，硫脂多糖选自下组：环糊精、麦芽糖糊精、菊糖、菲可和支链淀粉(Pullulan)。
较佳地，硫脂多糖选自：环糊精、麦芽糖糊精和菊糖。
优选的硫脂多糖是环糊精。
平均地，硫脂多糖含有至少0.01个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。较佳地，硫脂多糖平均含有至少0.12个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
平均地，硫脂多糖含有至多1.0个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。较佳地，硫脂多糖平均含有至多0.23个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是麦芽糖糊精时，它平均含有约0.23个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是环糊精时，它平均含有约0.20个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是菊糖时，它平均含有约0.19个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是支链淀粉时，它平均含有约0.16个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是菲可时，它平均含有约0.12个硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
平均地，硫脂多糖含有至少0.01个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。较佳地，硫脂多糖平均含有至少1.05个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
平均地，硫脂多糖含有至多2.0个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。较佳地，硫脂多糖平均含有至多1.29个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是麦芽糖糊精时，它平均含有约1.29个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是环糊精时，它平均含有约1.05个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是菊糖时，它平均含有约1.24个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是支链淀粉时，它平均含有约1.24个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是菲可时，它平均含有约1.22个脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
脂基较佳地含有4-22个碳原子。
硫酸根基对脂基的比例较佳地为0.01-2个硫酸根基/脂基。更佳地，硫酸根基对脂基的比例为0.10-0.19个硫酸根基/脂基，同时维持化合物的疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是麦芽糖糊精时，硫酸根基对脂基的比例约为0.18个硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是环糊精时，硫酸根基对脂基的比例约为0.19个硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是菊糖时，硫酸根基对脂基的比例约为0.15个硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是支链淀粉时，硫酸根基对脂基的比例约为0.13个硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
较佳地，当硫脂多糖是菲可时，硫酸根基对脂基的比例约为0.10个硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
术语“界面形成成分(interface-forming constituent，IFC)”指这样的物质，它在水介质中会在物质和水相之间形成物理界面。
界面形成成分选自水不混溶性液体(如角鲨烷、豆油、矿物油、十六烷)或在水相中不溶的固体。
本发明的在水相中不溶的固体包括：不溶性盐类(如Al(OH)3、AlPO4、明矾、草酸钙)，微颗粒，纳颗粒(nanoparticles)，一种或多种聚合物、共聚物(如聚丙烯酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚交酯、聚乙交酯(polyglycolide))的微球或纳球(nanosphere)，脂双层或亲脂剂(如磷脂)或表面活性剂的微团。
较佳地，“IFC”是水不混溶性液体。
有利的，界面形成成分选自：豆油、角鲨烷和十六烷。
稳定的疫苗佐剂是那些含有(疏水的)硫脂多糖衍生物、界面形成成分和乳化剂的佐剂。
此外，本发明佐剂的效力与标准佐剂的效力相当，甚至更好。局部毒性即本发明佐剂的反应原性一般小于标准佐剂而且也小于基于菲可的佐剂。
似乎分子量较低的硫脂多糖的局部毒性更低。
根据本发明的另一方面，提出用硫脂多糖作为疫苗中的佐剂。
根据本发明的另一方面，提出了一种制备乳剂中疫苗的方法，它的特征是将抗原水溶液在硫脂多糖、乳化剂和界面形成成分存在下进行乳化。
根据本发明的另一特征，提出了一种疫苗，它含有致免疫量的抗原(免疫原)和本发明的佐剂。
较佳地，佐剂的浓度是0.1-100mg/ml，更佳地为2-20mg/ml。
除了佐剂、抗原，疫苗还可含有例如灭活的病毒、活病毒、细菌、亚基、蛋白质、肽和灭活的流感病毒株MRC-11、卵白蛋白(OVA)、灭活的流感病毒株A/Swine和/或灭活的假性狂犬病毒(iPRV)。
测得的抗体效价高于使用那些在商业产品中所用的水包矿物油型乳剂时所获得的效价。已表明，在SL-菲可和乳剂之间有强烈的增效活性，这在猪中比在小鼠中更明显(Hilgers等人，疫苗，Vol.12，pp.661-664，1994)。在小鼠中的抗体应答大大增加(Hilgers等人，疫苗，Vol.12，pp.653-660，1994)。
结论是，反应原性取决于制剂中所含的多糖和油的类型，而且多糖的分子量是重要因素之一。
环糊精及其衍生物是众所周知的，它们能够形成包含复合体，其中在它们环状结构形成的空穴中包裹其他物质如药物。
这些包含复合体提供的好处有：改善了溶解性，改善了生物有效性(bioavailbility)和/或化学稳定性，提高了半衰期长度，减少了副作用，以及提供了生产过程中的某些好处，如更易获得干粉末以用作液体制剂的起点。
除了用作佐剂之外，基于环糊精的硫脂多糖(SLP)还有令人感兴趣的用途，这如下所述。
事实上，SL-环糊精是表面活性剂，因为在这些分子中同时存在阴离子基团(硫酸根基)和疏水基团(脂族链)。该特性导致：在水相中会形成微团，或者在其他表面活性剂存在下会形成混合微团，以及形成水不混溶性液体的乳剂，不溶性颗粒在水相中悬浮，或在水相和液态或固态的不溶性物质之间形成界面。
因此，SL-环糊精提供了能够形成包含复合体和能够作为表面活性剂的双重优势。
因此可以认为它们构成了一族具有新特性的产品，这些特性使其在药物领域中有开创性的用途。
已获得了各种不同的SL-环糊精；因环糊精的类型(如α、β、γ)、硫酸根基的含量以及脂基的性质，造成它们的生理化学特性有所不同，
实施例1
测试不同的多糖，以确定它们在用于合成的有机溶剂中的溶解性，那些溶解性不够的多糖被放弃。将4.5克麦芽糖糊精(麦芽糖糊精15；Amylum，Belgium)、4.5克β-环糊精(ACROS)、4.5克菊糖(Dahlia Tubers；Sigma，USA)和4.5克支链淀粉(Hayashibara Co.Ltd.，Japan)分别溶解于100毫升的无水二甲基甲酰胺和无水吡啶(体积比1∶1)的混合物中。在短时间内(48小时)，这些多糖的溶液通过分子筛(规格2埃)(Merch，Darmstadt，Germany)而加以干燥。加入6.6克月桂酰氯(Merck，Germany)，然后混合物在60℃下保温6小时，并在室温(约15-22℃)下保温18小时。然后，加入处于(10毫升)无水二甲基甲酰胺和无水吡啶的混合物中0.6克氯磺酸(Merck，Germany)，重复在室温的保温程序。在60℃通过减压(200mb)蒸发1-2小时而去除溶剂，然后在截断阈值为10,000D的再生纤维素膜上，用等渗的磷酸盐缓冲液(该磷酸盐溶液在每升水中含有8克氯化钠、0.2克氯化钾和1.15克磷酸氢二钠，pH7.3)、并随后用超纯水进行透析，直到在滤液中不再检测到微量的溶剂。透析溶液(PBS盐溶液或超纯水)与透析过程中所用的残留物的体积比维持在10∶1(体积/体积)之上。透析进行至少10天，而且透析溶液至少每天更换一次。这样获得的硫脂多糖(SLP)在室温下冻干，其中内压低于0.1mb，而冷阱温度低于-25℃。
用如上所述的方法(疫苗，Vol.12，pp.653-660)，通过分析多糖、结合的硫酸根基、总脂含量和结合的脂类含量，确定SLP的组成。
通过先将SLP溶解在最小体积(20毫升)的甲基叔丁基醚(Merck)中，然后对每克SLP加入2毫升Tween 80(Merck)，在高温(±60℃)和减压(50mb)下蒸发甲基叔丁基醚直至获得Tween 80中的SLP粘溶液。这样制得SLP在磷酸盐溶液(PBS)中1重量％/体积(wt/vol)的溶液(含2％体积/体积(v/v)Tween 80)。对每克SLP缓慢加入10毫升水，然后加入适当体积的PBS和油。用微液化器(microfluidizer)(Microfluidics Corp.，Newton，USA)使混合物乳化，直到在显微镜下(放大1000倍)看不到大于2或3微米的油滴。乳剂在使用前在4℃下储存。
通过混合一份体积的抗原和一份体积的佐剂而制备疫苗。抗原如上法进行制备(疫苗，Vol.12，pp 653-660(1994)和疫苗，Vol.12，pp.661-665(1994))。使用两种不同抗原的溶液：溶液II在每毫升中含有：10微克灭活的流感病毒株MRC-11(SOLVAY DUPHAR)+1000微克OVA(SIGMA)；而溶液I在每毫升中含有：4.4微克/毫升灭活的流感病毒株A/Swine(SOLVAY DUPHAR)、4.0微克灭活的流感病毒株MRC-11(SOLVAY DUPHAR)、2.0微克灭活的流感病毒株X-79(SOLVAY DUPHAR)和108TCID50灭活的假性狂犬病毒(iPRV)(SOLVAYDUPHAR)。
通过在爪中注射0.025毫升的疫苗而使8-10周大小(约20克)的雌性NMRI小鼠(Charles River，Germany)免疫，在3周后测定抗体效价。
抗体效价用几何平均值(2log+SEM)表示。用标准的测试方法进行抗体效价的分析，判断有效的标准是早先描述过的(疫苗，Vol.12，pp 653-660(1994))。
进行Student氏t-测验，以分析数据的统计显著性，p＜0.05被认为是显著的。
在2个独立的小鼠试验中，测试佐剂制剂。
              表I.某些基于油包硫脂多糖(SLP)
       和水包硫脂多糖的乳剂在小鼠中的佐剂效应
              佐剂[mg SLP和μl油]/ml n                抗体效价的2log
        MRC11           OVA
  平均值    SEM   平均值    SEM
试验I
SL-麦芽糖糊精15/S/W[10/100]    6     13.1     0.7     7.3     0.2
SL-环糊精/S/W[10/100]    6     12.9     1.0     7.2     0.6
SL-菊糖/SW[10/100]    6     12.7     0.8     7.2     0.2
SL-支链淀粉/S/W[10/100]    6     13.3     0.7     6.9     0.4
SL-麦芽糖糊精15/豆油/W[10/100]    6     12.8     0.6     6.5     0.7
SL-环糊精/豆油/W[10/100]    6     13.6     1.1     6.0     0.8
SL-菊糖/豆油/W[10/100]    6     12.5     0.6     6.8     1.3
SL-支链淀粉/豆油/W[10/100]    6     12.5     0.8     6.6     0.4
SL-菲可/S/W[10/100]    6     13.0     0.9     6.9     0.4
SL-菲可/豆油/W[10/100]    6     12.0     0.6     6.6     0.3
SL-菲可/十六烷/W[10/100]    4     12.4     0.9     7.2     0.6
SL-菲可/矿物油/W[10/100]    4     12.2     0.5     6.8     0.3
对照(无佐剂)    6     11.3     0.7     3.5     2.0
试验II
SL-麦芽糖糊精15/S/W[10/100]    6     13.3     0.8     9.0     1.1
SL-环糊精/S/W[10/100]    6     13.0     0.6     8.6     0.8
SL-菊糖/S/W[10/100]    6     12.8     0.9     8.6     0.8
SL-支链淀粉/S/W[10/100]    6     13.6     0.5     8.8     0.8
SL-麦芽糖糊精15/豆油/W[10/100]    6     11.2     0.7     7.4     0.3
SL-环糊精/豆油/W[10/100]    6     11.7     0.5     6.5     1.0
SL-菊糖/豆油/W[10/100]    6     11.8     0.5     7.5     0.4
SL-支链淀粉/豆油/W[10/100]    6     10.9     0.8     7.3     0.4
SL-麦芽糖糊精15/十六烷/W[10/100]    6     12.2     0.7     8.3     0.8
SL-环糊精/十六烷/W[10/100]    6     12.5     0.6     8.2     0.6
SL-菊糖/十六烷/W[10/100]    6     12.2     0.4     7.4     0.4
SL-支链淀粉/十六烷/W[10/100]    6     13.2     0.4     7.7     0.2
对照(无佐剂)    6     10.0     0.4     4.2     0.9
SL-菲可/S/W[10/100]    2     13.4     0.7     8.5     0.7
n=动物数目
SEM=离平均值的标准误差
W=水
S=角鲨烷
所有的SLP/油/水乳剂都增加了对流感病毒株MRC-11和OVA的体液的应答。已表明，就涉及到的不同制剂的佐剂效应而言，它们之间存在差异，而且某些引起的活性相当于SL-菲可/S/W的活性。没有观察到SLP类型造成的明显效应。至于所用的油类型，含有角鲨烷(S)的乳剂产生的应答大大高于含十六烷的乳剂，而豆油造成的应答最低。
实施例2
测试8-10周大小的猪，以检测是否存在抗欲测病毒抗原的抗体。具有可检测的抗体效价的动物被排除在外。
用实施例1中所述的方法制备SLP在水包角鲨烷乳剂中的制剂，以及以品名SUVAXYN O/W EMULSION(SOLVAY DUPHAR)出售的水包矿物油型乳剂。
用实施例1中所述的方法制备疫苗，它含有佐剂制剂。
测试SLP/角鲨烷/水制剂，以确定它们对用iPRV和灭活的流感病毒--株MRC-11和A/Swine作为抗原免疫的猪所产生的佐剂效果(表II)。动物被免疫两次(0周和3周时)，在第二次注射后3周测定抗体效价。
用SL-菲可/角鲨烷/水、SL-麦芽糖糊精15/角鲨烷/水、SL-菊糖/角鲨烷/水和SL-环糊精/角鲨烷/水乳剂都增加了针对PRV(抗-PRV)的抗体效价。测得了抗体效价与用市售产品中水包矿物油型乳剂所获得的结果相当或更好。不同的SLP/角鲨烷/水制剂还增加了对A/Swine的抗体应答，但是某些应答与用标准的油/水乳剂所获得的结果一样高。不同的制剂增加了对MRC-11的抗体效价，而且某些SLP/角鲨烷/水乳剂产生的效价与那些用矿物油/水乳剂所获得的结果相当或更高。
这些分析结果列于表II。
           表II.不同的硫脂多糖与数种水包油型乳剂
       对抗-iPRV/A/Swine/MRC-11抗体应答的影响，在猪中测定
        佐剂[mg SLP和μl油]/ml                        6周后抗体效价的2log
         iPRV         A/Swine          MRC-11
 平均值     SEM     平均值     SEM     平均值     SEM
PBS     0.5     0.0     ＜3.3     0.0     ＜3.9     0.5
矿物油/W[0/500]     6.5     0.4     10.7     1.3     10.7     0.9
SL-菲可/S/W[10/100]     7.8     0.8     11.5     2.9     ＞12.7     2.4
SL-麦芽糖糊精15/S/W[10/100]     7.5     1.1     8.7     1.1     13.1     1.3
SL-环糊精/S/W[10/100]     9.0     1.1     10.1     1.5     ＞12.9     2.2
SL-菊糖/S/W[10/100]     8.9     1.3     10.3     1.0     ＞13.7     1.3
SEM=离平均值的标准误差
S=角鲨烷
W=水
从上述同时在两种动物上测试佐剂效果的试验中可以看出，在SL-菲可和乳剂间有强烈的协同活性，而且在猪中的协同活性比在小鼠中更明显(疫苗，Vol.12，pp653-660(1994)和疫苗，Vol.12，pp.661-664(1994))。在小鼠中抗体应答被大大增加，而且已表明，所用的油类型有明显的影响，而多糖类型没有明显影响。
在小鼠中，与没有接受抗原的动物相比所增加的因子仅限于1或2个2log单位。在猪中，佐剂效果更明显，主要是因为针对没有佐剂的抗原的应答非常低。抗-iPRV和抗-A/Swine和抗-MRC-11的抗体效价增加了6个2log单位以上。
基于矿物油的佐剂大大增加抗体应答，但是不同的新佐剂制剂甚至造成更高的效价，上述的FL-菲可/S/W佐剂(疫苗，Vol.12，pp 653-660(1994)和疫苗，Vol.12，pp.661-665(1994))表明比矿物油更有效，而某些新SLP可产生与SL-菲可相当或更高的活性。
实施例3
除了佐剂效果之外，其他特性在评估疫苗中也是重要的。它们包括局部反应，这是一个重要方面，尽管在注射部位有一定程度的反应一般为某些动物品种所接受。在注射疫苗之后，通过在体内监测小鼠爪的肿胀而测试局部毒性。已表明该方法非常灵敏。
用实施例1所述的方法，制备SLP在角鲨烷/水型、豆油/水型、矿物油和十六烷/水型乳剂中的制剂，以及不含佐剂的对照制剂。
用实施例1中所述的方法制备疫苗，它含有佐剂制剂。
将每组6只小鼠，通过在后左脚的脚掌中皮下注射25微升疫苗而进行处理。疫苗含有抗原溶液，该溶液含有10微克MRC-11和1毫克卵白蛋白(OVA)/毫升PBS和1体积佐剂。
在注射前一天以及在注射后若干次，用半电子式设备(尤其是荷兰的StateUniversity of Utrecht开发的用于该目的的设备)测量爪的厚度。该设备的精度约为0.02毫米。
从处理后的爪厚度中减去处理前的爪厚度而计算出肿胀，它用0.01毫米进行表示。
这些试验的结果列于表III。
               表III.不同的佐剂在小鼠中的反应原性
试验I
         佐剂[mg SLP和μl油]/ml                               平均肿胀(10-2mm)
                               天数
    1     2   3   4    5    6   7     8     9
SL-麦芽糖糊精15/S/W[10/100]    169    110   89   65   39   16   18    19    17
SL-环糊精/S/W[10/100]    88    21    8    8    9    3    6    12    -1
SL-菊糖/S/W[10/100]    146    145   94   102   44   30   25    26    20
SL-支链淀粉/S/W[10/100]    235    231   137   112   87   74   60    64    42
SL-麦芽糖糊精15/豆油/W[10/100]    30    10   5   0   2   10   5    5     1
SL-环糊精/豆油/W[10/100]     2     0   0   0   0   0   4    10    -7
SL-菊糖/豆油/W[10/100]    117    64   13   7  7   10   20    18     1
SL-支链淀粉/豆油/W[10/100]    40    23   7   0   0   0   3    10    -2
SL-菲可/S/W[10/100]    196    273   299  305  305  237   177    144    97
SL-菲可/豆油/W[10/100]    124    59   24   20   26   17   12    7    -5
SL-菲可/十六烷/W[10/100]    241    277   242  209   92   35   42    49    14
SL-菲可/矿物油/W[10/100]    233    295   300  292   201   165   120    89    75
对照(无佐剂)     2     0    0    0    0    0    4    -6    -4
S=角鲨烷
W=水试验II
          佐剂[mg SLP和μl油]/ml                         平均肿胀(10-2mm)
                           天数
    1     2     6    10    17   22
SL-麦芽糖糊精15/S/W[10/100]   133    95    61    30    35   24
SL-环糊精/S/W[10/100]    62    54    10    15    17    1
SL-菊糖/S/W[10/100]   176   134    71    51    55   48
SL-支链淀粉/S/W[10/100]   200   199    91    94    77   46
SL-麦芽糖糊精15/豆油/W[10/100]    20    10    7    0    0    0
SL-环糊精/豆油/W[10/100]    19    16    21    16    11   12
SL-菊糖/豆油/W[10/100]    52    38    22    11    24    0
SL-支链淀粉/豆油/W[10/100]    52    38    11     4    15    0
SL-麦芽糖糊精15/十六烷/W[10/100]   108    65    14    14    22    0
SL-环糊精/十六烷/W[10/100]   107    74    14    10    25    0
SL-菊糖/十六烷/W[10/100]   121   114    46    30    22    0
SL-支链淀粉/十六烷/W[10/100]   224   213   112    59    40   23
对照(无佐剂)     2     0    0     0     0    0
SL-菲可/S/W[10/100]    73   293   325   239   178   99
S=角鲨烷
W=水
制剂引起注射部位不同程度的肿胀，而且在某些情况下在第一天肿胀非常厉害，肿胀会慢慢消退(表III)。含有十六烷的乳剂一般会比含有豆油的乳剂造成更强烈的反应。至于SLP，含有SL-菲可的角鲨烷乳剂造成更强的肿胀，它维持了3周以上。含有SL-麦芽糖糊精15、SL-菊糖或SL-支链淀粉的乳剂造成了相当的肿胀反应，然而该肿胀比那些由SL-菲可造成的肿胀消退快得多，它们仅持续了1-2周。
包含在不同油中的SL-环糊精的反应原性是非常弱的，或者甚至没有。含有在角鲨烷或十六烷中的SL-环糊精的乳剂造成了注射后1-2天的某些肿胀，而在豆油中的SL-环糊精不造成肉眼可见的反应。
在小鼠上测试的反应原性，即局部毒性，有明显效果，该效果是油类型和多糖类型的作用。一般，SL-菲可比其他测试的SLP造成更强的反应。SL-菲可与角鲨烷或矿物油混合时，造成非常强且持续的局部反应，而与十六烷和豆油混合的SL-菲可仅分别产生中等或弱反应(表II)。至于角鲨烷的乳剂比那些含有十六烷的乳剂造成强得多的反应。豆油仅造成非常弱的反应。
这些油的疏水性有差别。角鲨烷、矿物油和十六烷是非常疏水的烃，而豆油(它是不同物质的混合物)疏水性较低。不同油的疏水性，可用为了在获得水中的稳定乳剂而需要的清洁剂的HLB值来表示。
SL-支链淀粉比其他3种SLP造成更强的局部毒性。SL-菊糖和SL-麦芽糖糊精15造成相当的局部肿胀，而SL-环糊精仅在1或2天内造成明显的反应。
在其他性质中，SLP的分子量有差别，它以SL-菲可=SL-支链淀粉＞SL-菊糖＞SL-麦芽糖糊精15＞SL-环糊精的次序递减。可观察到反应原性和分子量之间的平行关系，但是需要进一步研究以建立直接关系。
从上述内容可以得出结论，反应原性取决于制剂中所包含的多糖和油的类型，而且多糖的分子量是一个重要因素。
实施例4
合成麦芽糖糊精15、菊糖、环糊精和支链淀粉的硫脂衍生物，将它们掺入基于角鲨烷、矿物油、十六烷和豆油的水包油型乳剂中，然后在体外研究稳定性。
用实施例1所述的方法合成本发明的SLP，然后混合在角鲨烷、十六烷和豆油的水包油型乳剂中，在体外研究这些乳剂的稳定性。
用实施例1所述的方法制备SLP在水包角鲨烷、水包豆油和水包十六烷乳剂中的制剂。
通过将制剂暴露于高温一段时间而测试乳剂的稳定性。一般，乳剂在高温下更不稳定，因而可认为在高温下进行的测试可表示在较低温度下的长期行为。
在37℃研究乳剂的稳定性。将各份5毫升的灭菌乳剂在37℃保温，每天用肉眼观察乳剂，以证实形成油滴、出现油相和其他变化。
将S/L比值约为0.1/1.0的SLP掺入到基于角鲨烷、十六烷和豆油的水包油型乳剂中。
将含有0.01％(w/v)乙基汞硫代水杨酸钠(SIGMA)的灭菌试样在37℃下保温，按不同的时间间隔通过肉眼观察而确定乳剂的状态。
这些试验的结果列于表IV。
  表IV.不同油的不同乳剂的稳定性，其中SLP在PBS中的
  终浓度为1％(w/v)SLP、2％(v/v)Tween 80、10％(v/v)油
         佐剂[mg SLP和μl油]/ml                                           37℃下稳定性(天)
   1    2    7    10    14    21    28    35    46    53    115
SL-麦芽糖糊精15/S/W[10/100]   +   +   +    +   ±   +   +   +   +   +   ±/+
SL-环糊精/S/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +   ±/+
SL-菊糖/S/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   ±   ±   +   +     +
SL-支链淀粉/S/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   ±   -     --
SL-麦芽糖糊精15/豆油/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +     +
SL-环糊精/豆油/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +     +
SL-菊糖/豆油/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +     +
SL-支链淀粉/豆油/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +     -
SL-麦芽糖糊精15/十六烷/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +     +
SL-环糊精/十六烷/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +    ±
SL-菊糖/十六烷/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +    ±
SL-支链淀粉/十六烷/W[10/100]   +   +   +    +   +   +   +   +   +   +     -
S=角鲨烷
W=水
--＝两相；油相和透明水相
-＝两相；油相和白色水相
±＝在水相中有小油滴，肉眼可见
+＝白色均匀的乳剂，没有肉眼可见的油滴
±/+＝在“±”和“+”之间
掺入在这些角鲨烷油、十六烷或豆油的乳剂中的新SLP(SL-支链淀粉、SL-菊糖、SL-麦芽糖糊精15和SL-环糊精)有显著的稳定性。SL-菊糖、SL-环糊精和SL-麦芽糖糊精15在角鲨烷中的乳剂在37℃可稳定存在超过53天。与SL-菲可/角鲨烷/水型乳剂相比，这是重大进步。尽管在37℃的稳定性测试的预见性价值有限，但是它表明对导致不稳定因素的抵抗性提高了。
所有的乳剂，除了SL-支链淀粉/角鲨烷/水之外，都可在37℃下维持稳定至少53天。在115天之后，含有SL-麦芽糖糊精15、SL-环糊精和SL-菊糖的大多数乳剂维持稳定，尽管含角鲨烷和十六烷的乳剂显示在乳剂上有一些小油滴。

Claims (35)

1.一种疫苗佐剂，其特征在于，含有硫脂多糖和界面形成成分。
2.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是疏水的多糖。
3.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖选自下组：环糊精、麦芽糖糊精、菊糖、菲可和支链淀粉。
4.如权利要求3所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是环糊精。
5.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至少0.01硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
6.如权利要求5所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至少0.12硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
7.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至多1.0硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
8.如权利要求7所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至多0.23硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
9.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是麦芽糖糊精，而且它平均含有约0.23硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
10.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是环糊精，而且它平均含有约0.20硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
11.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是菊糖，而且它平均含有约0.19硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
12.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是支链淀粉，而且它平均含有约0.16硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
13.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是菲可，而且它平均含有约0.12硫酸根基/单糖，同时维持其疏水特性。
14.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至少0.01脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
15.如权利要求14所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至少1.05脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
16.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至多2.0脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
17.如权利要求16所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖平均含有至多1.29脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
18.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是麦芽糖糊精，而且它平均含有约1.29脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
19.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是环糊精，而且它平均含有约1.05脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
20.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是菊糖，而且它平均含有约1.24脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
21.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是支链淀粉，而且它平均含有约1.24脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
22.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是菲可，而且它平均含有约1.22脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
23.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，脂基含有4-22个碳原子。
24.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，硫酸根基与脂基之比为0.01-2硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
25.如权利要求24所述的佐剂，其特征在于，硫酸根基与脂基之比为0.10-0.19硫酸根基/脂基，同时维持其疏水特性。
26.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是麦芽糖糊精，其硫酸根基与脂基之比约为0.18脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
27.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是环糊精，其硫酸根基与脂基之比约为0.19脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
28.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是菊糖，其硫酸根基与脂基之比约为0.15脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
29.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是支链淀粉，其硫酸根基与脂基之比约为0.13脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
30.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，该硫脂多糖是菲可，其硫酸根基与脂基之比约为0.10脂基/单糖，同时维持其疏水特性。
31.如权利要求1所述的佐剂，其特征在于，界面形成成分选自：水不混溶性液体或在水相中不溶的固体。
32.如权利要求31所述的佐剂，其特征在于，水不混溶性液体选自：角鲨烷、豆油、矿物油和十六烷。
33.如权利要求1-30中任一权利要求所述的硫脂多糖作为疫苗佐剂的用途。
34.制备乳剂中疫苗制剂的方法，其特征在于，乳化抗原水溶液、如权利要求1-30中任一权利要求所述的硫脂多糖、界面形成成分和乳化剂。
35.一种疫苗，其特征在于，它含有致免疫量的抗原和佐剂，该佐剂含有如权利要求1-30中任一权利要求所述的硫脂多糖和界面形成成分。
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