DE69822934T2

DE69822934T2 - Chirale Trennung von pharmazeutischen Verbindungen mit geladenen Cyclodextrinen durch Kapillarelektrophorese

Info

Publication number: DE69822934T2
Application number: DE1998622934
Authority: DE
Inventors: Fu-Tai A. Brea Chen; Gene G.Y. Diamond Bar Shen; Ramon A. Placentia Evangelista; Chan S. Chino Hills Oh
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2018-07-11
Also published as: EP0893453A2; DE69822934D1; US6316613B1; JP4503715B2; JPH11100402A; JP2010132907A; EP0893453B1; EP0893453A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Verwendung von Cyclodextrinen, um optische Isomere durch Kapillarelektrophorese zu trennen.
Hintergrund der Erfindung
Viele chemische Verbindungen, die in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden, verfügen über ein asymmetrisches Zentrum, das für die optische Aktivität verantwortlich ist, die deren pharmakologische Eigenschaften stark beeinflussen kann. Beispiele von synthetischen Arzneimitteln, bei denen ein von zwei Enantiomeren verschiedene pharmakologische Eigenschaften besitzt, sind allgemein bekannt. Beispielsweise ist (–)-Propanolol 100-fach wirksamer als (+)-Propanolol. Außerdem kann eins von zwei Enantiomeren desselben Arzneimittels toxischer sein, beispielsweise Thalidomid, Ketamin. Folglich werden analytische Verfahren, die Enantiomere mit hohem Auflösungsvermögen und hoher Wirksamkeit trennen, immer wichtiger. Die Notwendigkeit für stereochemische reine Arzneimittel und das sorgfältige Testen bestehender Racemate macht die Entwicklung von wirksamen, schnellen, empfindlichen und genauen chiralen Analyseverfahren erforderlich.
Chromatographietechniken, insbesondere Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), werden gewöhnlich zur Analyse von Enantiomeren verwendet. Kürzlich ist die Kapillarelektrophorese (CE) zur Verwendung in Verbindung mit chiralen Selektoren angepaßt worden. Die häufigst eingesetzte Strategie ist die Verwendung von Cyclodextrinen zur differenziellen Einschlußkomplexierung von Enantiomerpaaren [Fanali, S., J., Chromafogr., 735: 77–121 (1996); Nishi, H., und Terabe, S., J., Chromatogr., 694: 245–276 (1995); Guttman, A., "Capillary Electrophoresis Separation of Enantiomers by Cyclodextrin Array Chiral Analysis", S. 75–100 im Handbook of Capillary Electrophoresis, 2. Auflage, J. Landers, Ed., 1997, CRC Press Inc., Boca Ra ton, FL]. Im Gegensatz zu den HPLC-Trennungen, bei denen man aus der breiten Vielzahl erhältlicher Säulen, die das Auftrennungsmittel, das an den Feststoffträger gebunden ist, enthalten, sorgfältig auswählen muß, werden chirale CE-Analysen stark vereinfacht, weil sie chirale Selektoren, wie Cyclodextrin, das in dem Trennungspuffer gelöst ist, aufweisen.
Cyclodextrine (CD) sind cyclische Oligosaccharide, bestehend aus sechs, sieben oder acht Glucoseeinheiten, die den Namen α-, β- oder γ-Cyclodextrin entsprechen. CD's bilden einen Kegelstumpf mit einem Rand sekundärer Hydroxygruppen an der Öffnung mit dem größeren Durchmesser. Der Innernhohlraum enthält keine Hydroxyfunktionen und weist einen hydrophoben Charakter auf. Diese hydrophobe Beschaffenheit ermöglicht es den CD's, hochselektive Einschlußkomplexe mit aromatischen oder Alkylgruppen zu bilden. Unterschiede in den Komplexbildungskonstanten eines CD und seiner Gastmoleküle können sich auf die relativen elektrophoretischen Mobilitäten von strukturell ähnlichen optischen Isomeren auswirken, was zu einer klaren Trennung von Enantiomeren führt.
Bei den chiralen Trennungen von sauren und basischen Verbindungen migriert der CD-Komplex unter dem Einfluß der Ladung ionischer Analyten. Jedoch sind für neutrale Analyten ungeladene Cyclodextrine nicht anwendbar, da der Analyt, das Cyclodextrin und der Komplex keine elektrophoretischen Mobilitäten aufweisen. Die Verwendung von geladenen Cyclodextrinen wurde daher entwickelt, um das Problem der chiralen Trennung von neutralen Verbindungen zu lösen.
Mayer et al. [J. Microcol. Sep., 6: 43–48 (1994)] und Tait et al. [Anal. Chem., 66: 4013– 41018 (1994)] berichteten als erste über die Verwendung eines Sulfobutylether-β-cyclodextrins (SBE-βCD) für CE-Chiraltrennungen. Nachfolgende Berichte beschrieben die Analyse von Aminen und neutralen Verbindungen unter Verwendung von SBECD als chiralen Selektor [Dette et al., Electrophoresis, 15: 799–803 (1994); Chankvetadze of al., Electrophoresis, 15: 804–807 (1994); Lurie et al., Anal. Chem., 66: 4019–4026 (1994)]. Vincent et al. ("A family of novel, single-isomer chiral resolving agents for capillary electrophoresis" Teil 2: Heptakis-6-sulfato-β-cylodextrin, eingereicht bei Analytical Biochemistry, 15. April 1997) paßten die selektiven Schutz- und Entschützungsverfahren von Moriya et al. [J. Med. Chem., 36: 1674–1677 (1993)] an, um ein β-CD mit hohem Sulfatanteil (7SβCD), das Sulfatester ausschließlich an den 6-Positionen am schmalen Ende des becherförmigen Cyclodextrinmoleküls aufweist, zu synthetisieren. Dieses synthetische Schema wurde gestaltet, um die Geometrie des Hohlraums und die Komplexierungseigenschaften von natürlichem β-Cyclodextrin zu erhalten. Stalcup und Kollegen (Stalcup, A., et al., Anal. Chem., 68: 1360–1368 (1996); Wu, W., et al., Chromatogr., 18: 1289–1315 (1995)] berichteten kürzlich über die Verwendung eines Gemisches aus Cyclodextrinsulfatestern zur Trennung von Racematen neutraler Verbindungen und Aminen in unbehandelten Quarzglaskapillaren, was für 40 untersuchte Verbindungen wirkungsvoll war.
Trotz dieser ermutigenden Ergebnisse gibt es kein einheitliches System zur Durchführung chiraler Trennung durch CE. Dies ist so, weil die CE-Trennungen von dem Umfang der Komplexierung mit einem speziellen Cyclodextrin stark abhängig sind. Zusätzlich zu der Größe des CD-Hohlraums können Wechselwirkungen zwischen dem gelösten Stoff und den funktionellen Gruppen an dem CD-Rand die chirale Selektivität beeinflussen. Folglich läßt die Auswahl eines partikulär geladenen oder neutralen Cyclodextrins, das am besten zur Trennung eines partikulären chiralen Paars geeignet ist, ein empirisches Versuchs- und Fehlerverfahren übrig.
Aus den vorstehenden Gründen besteht eine Notwendigkeit für einen neuen Satz geladener Cylodextrine, die verwendet werden können, um einen breiten Bereich von chiralen Verbindungen durch Kapillarelektrophorese zu trennen. Die neuen Cyclodextrine können ideal unter Verwendung einer einfachen Verfahrensweise synthetisiert werden, und ergeben reproduzierbare Trennungen von Enantiomeren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf einen Satz geladener Cyclodextrine gerichtet, die der Notwendigkeit genügen, einen breiten Bereich von chiralen Verbindungen durch Kapillarelektrophorese zu trennen. Die bevorzugten chiralen Selektoren sind α-, β- und γ-Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil. Diese geladenen Cyclodextrine weisen einen höheren Sulfatierungsgrad und engere Heterogenität als herkömmlich erhältli che Cyclodextrine auf. CE-Analysen unter Verwendung von Cyclodextrinen mit hohem Sulfatanteil können die Auflösung einer breiten Vielzahl an chiralen Arzneimitteln im Vergleich zu anderen chiralen Selektoren verbessern. Außerdem erzeugen α-, β- und γ-Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil Trennungen, die sich gegenseitig ergänzen, was die Auflösung eines noch breiteren Bereiches von neutralen und basischen Arzneimitteln ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen geladenen Cyclodextrine können ein α-Cyclodextrin, ein β-Cyclodextrin oder ein γ-Cyclodextrin sein, die einen geladenen Substituenten an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins, mindestens eine Modifikation einer sekundären Hydroxylgruppe an der 2-Position und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position aufweisen. Bevorzugte geladene Cyclodextrine weisen die folgende allgemeine Formel auf:
Für ein Cyclodextrin, in dem n 6 oder 8 ist, ist mindestens eine Gruppe R¹ eine modifizierte Hydroxylgruppe, und weniger als n Gruppen R¹ sind Hydroxylgruppen. Für ein Cyclodextrin, in dem n 7 ist, sind mindestens 5 Gruppen R¹ modifizierte Hydroxylgruppen, und weniger als 3 Gruppen R¹ sind Hydroxylgruppen. Die modifizierte Hydroxylgruppe ist eine Hydroxylgruppe, in der das Wasserstoffatom durch eine Sulfat-, eine Carboxylat-, eine Phosphat- oder eine quartäre Ammoniumgruppe substituiert ist. Der am stärksten bevorzugte Substituent ist Sulfat.
Bevorzugte alpha-Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil besitzen mindestens 7 Sulfatsubstituenten; bevorzugte beta-Cylodextrine mit hohem Sulfatanteil besitzen mindestens 12 Sulfatsubstituenten; und bevorzugte gamma-Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil besitzen mindestens 9 Sulfatsubstituenten.
Die erfindungsgemäßen geladenen Cyclodextrine können in einem Verfahren zum Trennen von Enantiomeren eines kleinen Moleküls durch Kapillarelektrophorese verwendet werden. Das Verfahren umfaßt die Schritte: a) Füllen einer Kapillare mit einem Elektrophoresepuffer, der ein geladenes Cyclodextrin und einen Elektrolyt umfaßt; b) Injizieren einer Probe, die Enantiomere einer chiralen Verbindung enthält, in die Kapillare; c) Durchführen einer elektrophoretischen Trennung der Enantiomere; und d) Detektieren der Enantiomere der chiralen Verbindung. Vorzugsweise wird die elektrophoretische Trennung im Zustand der Unterdrückung des elektroendoosmotischen Flusses durchgeführt. Beispielsweise kann eine beschichtete Kapillare verwendet werden, oder der Elektrophoresepuffer kann sauer sein. Die Probe ist im allgemeinen ein kleines chirales Molekül (MW < 5.000), das vorzugsweise eine neutrale oder basische Verbindung ist. Gegebenenfalls wird ein interner Standard, wie ein Salz von 1,3,6,8-Pyrentetrasulfonsäure, zu der Probe gegeben, um das Normalisieren bezüglich der Zeit zu ermöglichen.
Die erfindungsgemäßen Reagenzien können in einem Kit zur Verwendung bei der Trennung chiraler Verbindungen durch Kapillarelektrophorese vereinigt werden. Die Kits werden mindestens zwei Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem alpha-Cyclodextrin, das mindestens 7 Sulfatsubstituenten besitzt; b) einem beta-Cyclodextrin, das mindestens 12 Sulfatsubstituenten besitzt; und c) einem gamma-Cyclodextrin, das mindestens 9 Sulfatsubstituenten besitzt. Außerdem können die Kits gegebenenfalls einen Elektrophoresepuffer, ein pH-Einstellungsmittel, einen internen Standard und/oder ein Kapillarröhrchen enthalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und weitere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bezüglich der folgenden Beschreibung, der anhängenden Ansprüche und der begleitenden Zeichnungen besser verstanden, wobei:
1 Elektropherogramme von 7SβCD (A), HSαCD (B) und einem Gemisch von 7SβCD und HSαCD zeigt;
2 Elektropherogramme von 7SβCD (A), HSβCD-CD (B) und einem Gemisch von 7SβCD und HSβCD-CD zeigt;
3 Elektropherogramme von 7SβCD (A), HSγCD (B) und einem Gemisch von 7SβCD und HSγCD zeigt;
4 Elektropherogramme von einigen geladenen Cyclodextrinen einschließlich ABI SBECD (A) und die Cyclodextrine mit Sulfatanteil von Cerestar (B) und Aldrich (C) zeigt;
5 die elektrophoretischen Trennungen von Amphetamin zeigt, das unter Verwendung von HSαCD (A), HSβCD (B) und HSγCD (C) erhalten wurde; und
6 die elektrophoretischen Trennungen von racemischem Thalidomid zeigt, das unter Verwendung von HSαCD (A), HSβCD (B) und HSγCD (C) erhalten wurde.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die hierin beschriebenen Verfahren und Reagenzien bringen eine einfache verallgemeinerte Verfahrensweise zur Trennung von Enantiomeren von neutralen und basischen Arzneimitteln mit sich. Ein neuer Satz geladener Cyclodextrine wird verwendet, um zwischen den Enantiomerpaaren zu unterscheiden. Unterschiedliche Komplexierung mit den Enantiomeren führt zu veränderten elektrophoretischen Mobilitäten und zur Trennung des Paars während der Kapillarelektrophorese.
CD's sind Ringe aus Oligosacchariden, bestehend aus Glucoseeinheiten, die durch α(1,4)-Glycosidbindungen miteinander verbunden sind. Obwohl CD's aus 6 bis zu 12 Glucoseeinheiten isoliert worden sind, werden diese mit sechs, sieben bzw. acht Einheiten, α-, β- bzw. γ-Cyclodextrin genannt, bevorzugt. Die Form der CD's ist ähnlich der eines Kegelstumpfes mit einem relativ hydrophoben Hohlraum, der in der Lage ist, Analyten aufzunehmen. Natürliche CD's weisen einen hydrophilen Außenbereich auf, der Hydroxylgruppen an den 2-, 3- und 6-Positionen der Glucopyranosemoleküle aufweist.
Die erfindungsgemäßen CD's weisen modifizierte Hydroxylgruppen auf, die einen geladenen Substituenten an der 6-Position jeder Glucoseeinheit an dem Cyclodextrin umfassen. Außerdem wird mindestens eine der sekundären Hydroxylgruppen an der 2-Position ebenfalls durch eine geladene Gruppe substituiert. Dies bedeutet, daß zusätzlich zu den geladenen Gruppen an der schmalen Öffnung des Kegelstumpfes, ebenfalls geladene Gruppen am Rand der breiten Öffnung des Cyclodextrinbechers auftreten. Da der breitere Rand der Teil ist, der sich um das "Gast"molekül während der Komplexierung wickelt, wird das aufnehmende Ende des Bechers relativ zu dem des natürlichen Cyclodextrins gestört. Diese Störung des Bechers weist aufgrund der Veränderung der sekundären Hydroxylgruppen den nachgewiesenen Nutzen des selektiven Komplexierungsverfahrens auf, und führt unerwartet zur besseren chiralen Unterscheidung durch CE.
Die Strukturformel für bevorzugte Versionen des HSCD ist wie folgt:
Für ein Cyclodextrin, in dem n 6 oder 8 ist, ist mindestens eine Gruppe R¹ eine modifizierte Hydroxylgruppe, und weniger als n Gruppen R¹ sind Hydroxylgruppen. Für ein Cyclodextrin, in dem n 7 ist, sind mindestens 5 Gruppen R¹ modifizierte Hydroxylgruppen, und weniger als 3 Gruppen R¹ sind Hydroxylgruppen. Die modifizierte Hydroxylgruppe ist eine Hydroxylgruppe, in der das Wasserstoffatom durch eine geladene Gruppe substituiert ist. Vorzugsweise ist der geladene Substituent eine negativ geladene Gruppe, beispielsweise eine Carboxylat-, Phosphat- oder Sulfatgruppe. Alternativ kann der geladene Substituent eine positiv geladene Gruppe, wie beispielsweise eine quartäre Ammoniumgruppe, sein. Die am stärksten bevorzugte modifizierte Gruppe R¹ ist eine Sulfatgruppe.
Für α-CD's werden mindestens 7 Hydroxylgruppen substituiert, und vorzugsweise werden etwa 10 bis 12 substituiert. Ein am stärksten bevorzugtes α-CD weist 11 Hydroxylgruppen auf, die mit Sulfatsubstituenten modifiziert werden.
Für β-CD's werden mindestens 12 Hydroxylgruppen des CD mit einem geladenen Substituenten modifiziert, und vorzugsweise werden 12 bis 15 substituiert. Ein am stärksten bevorzugtes β-CD weist 12 Hydroxylgruppen auf, die mit Sulfatsubstituenten modifiziert wurden.
Für γ-CD's werden mindestens 9 Hydroxylgruppen substituiert, und vorzugsweise werden 12 bis 16 substituiert. Ein am stärksten bevorzugtes γ-CD weist 13 Hydroxylgruppen auf, die mit Sulfatsubstituenten modifiziert wurden.
Die Synthese der bevorzugten CD's mit Sulfatanteil beinhaltet eine Reaktion zwischen getrocknetem α-, β- oder γ-Cyclodextrin und 19 Moläquivalenten vom Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplex in DMF ohne jeden Schutz der funktionellen Gruppen. Diese Reaktion stellt konsequent ein Cyclodextrin mit einem hohen Sulfatierungsgrad her. Folglich wird das Produkt dieser Synthese α-, β- oder γ-Cyclodextrin mit hohem Sulfatanteil (HSαCD, HSβCD bzw. HSγCD) genannt.
Eine breite Vielzahl an Analyten kann gemäß der vorliegenden Erfindung bewertet werden. Geeignete Analyten können jeden "Gast" umfassen, beispielsweise optische Isomere, Enantiomerpaare, racemische Arzneigemische, die einen Komplex mit einem geladenen CD-"Wirt" bilden können. Es kann praktisch jedes chirale Paar, das unterschiedliche Komplexierungs-Gleichgewichtskonstanten mit den geladenen CDs aufweist, wie hierin beschrieben, analysiert werden. Die Proben sind im allgemeinen kleine Moleküle (MW < 5.000) mit einem optisch aktiven, chiralen Zentrum. In erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsformen sind die Proben pharmazeutische Verbindungen, wie diese, die in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung aufgelistet werden. Die am stärksten bevorzugten Proben sind neutrale Verbindungen oder Amine.
Es kann mindestens eine interne Markierungssubstanz zu der Probe zugegeben werden, um das Normalisieren bezüglich der Zeit zu ermöglichen. Vorzugsweise migriert die Markierungssubstanz vor den Versuchsbestandteilen, was einen Nullpunkt zum Vergleichen der relativen Migrationszeiten der Enantiomere bereitstellt. Pyren-1,3,6,8-tetrasulfonat-(PTS-)-Tetranatriumsalz ist ein bevorzugter interner Standard, der als eine zuverlässige Markierungssubstanz für die meisten Trennungen dient. Unter sauren Bedingungen erzeugt PTS einen Peak mit kurzer Migrationszeit, die in erster Linie von dessen elektrophoretischer Mobilität abhängt. Aufgrund seiner großer Molekülgröße und seiner vier negativen Ladungen, weist es keine Wechselwirkungen mit den Cyclodextrinen mit Sulfatanteil auf.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Kapillarelektrophorese (CE) verwendet, um die Trennung der chiralen Verbindungen zu vermitteln. Im allgemeinen enthält CE die Einführung von Probenbestandteilen in ein Kapillarröhrchen, d. h. ein Röhrchen mit einem inneren Durchmesser von 2 bis 2.000 Mikron (μm), und die Anlegung eines elektrischen Feldes auf das Röhrchen. Das elektrische Potential des Feldes zieht die Probenbestandteile durch das Rohr und trennt sie gemäß ihrer einzelnen elektrophoretischen Mobilitäten.
Das erfindungsgemäße CE-Verfahren wird vorzugsweise in dem Zustand durchgeführt, bei dem der elektroendoosmotische Fluß (EOF) unterdrückt ist. Wenn ein "offenes" CE-Format verwendet wird, wird ein Quarzglas-Kapillarröhrchen mit einem elektrisch leitenden Puffer ohne Polymer und Gel gefüllt. Die Quarzglaskapillare wird signifikant negativ geladen, bei einem pH größer als etwa 5,0, was eine Schicht aus positiven Ionen aus dem Puffer anzieht. Wenn diese Ionen unter dem Einfluß des elektrischen Potentials zu der Kathode fließen, werden die Pufferlösung und die zu analysierende Probe in dieselbe Richtung getragen. Der resultierende EOF stellt eine fixierte Geschwindigkeitskomponente bereit, die trotz der Ladung sowohl neutrale Arten als auch ionische Arten zu der Kathode schiebt. Dadurch wird unter Bedingungen, die den elektroendoosmotischen Fluß nicht unterdrücken, die Migrationsgeschwindigkeit der Probenbestandteile in erster Linie dadurch bestimmt, dass sie dem EOF unterliegen, was die elektrophoretischen Mobilitäten der Probenbestandteile überwältigen kann.
Es gibt eine Vielzahl an Verfahren, die den EOF ausreichend unterdrücken können, um Trennungen, bezogen auf die elektrophoretischen Mobilitäten der Probenbestandteile, zu ergeben. Der einfachste Versuch ist die Verwendung von Elektrophoresepuffern mit einem sauren pH. Folglich weisen die erfindungsgemäßen Puffer einen pH von weniger als 7 auf. Am stärksten bevorzugte Puffer weisen einen pH zwischen 1 und 5 auf, der für die meisten Anwendungen bei pH 2,5 bis 4 optimiert wird.
Ein Elektrolyt mit einer geeigneten Pufferkapazität innerhalb des bevorzugten pH-Bereiches wird als Komponente des Elektrophoresepufters aufgenommen. Geeignete Elektrolyten zur Verwendung bei einem sauren pH umfassen organisches oder anorganisches Phosphat, Acetat oder Citrat. Ein bevorzugter Elektrolyt des Elektrophoresepuffers ist Triethylammoniumphosphat. Die Molarität des Elektrolyts in dem Puffer beträgt im allgemeinen 5 bis 200 mM, vorzugsweise 10 bis 100 mM, und am stärksten bevorzugt 25 bis 50 mM. Die Ionenstärke von Puffern mit höheren Konzentrationen an Elektrolyten kann zu unerwünschten Joule-Erwärmungseffekten führen.
Ein alternatives Verfahren zur Unterdrückung des EOF ist die Verwendung von beschichteten Kapillarröhrchen. Die Oberfläche der Kapillare kann dynamisch durch Einschließen von Hilfsmitteln, wie oberflächenaktiven Stoffen, zwitterionischen Salzen oder hydrophilen linearen Polymeren, in das Puffersystem beschichtet werden. Jedoch würde eine bevorzugte Kapillarbeschichtung ein Polymer sein, wie eine Polyacrylamid-, Polyethylenglykol- oder Diol-Epoxy-Beschichtung, das chemisch an die Kapillaroberfläche gebunden ist. Eine am stärksten bevorzugte Polymerbeschichtung ist Poly(vinylalkohol), einfach bekannt als PVA.
Die Kapillarröhrchen, die in der Praxis der Erfindung verwendet werden, weisen im allgemeinen einen inneren Durchmesser auf, der in der Größe zwischen 10 μm und etwa 200 μm liegt. Am stärksten bevorzugt werden die Kapillarröhrchen mit einem inneren Durchmesser von etwa 25 μm zur CE-Trennung von Enantiomeren verwendet. Die bevorzugte Länge des Kapillarröhrchens beträgt 10 bis 100 cm, am stärk sten bevorzugt etwa 27 cm. Ein Nachweisfenster ist vorzugsweise in dem Kapillarröhrchen ungefähr 6,5 cm von dem Säulenauslaß angebracht.
Die Auswahl eines α-, β- oder γ-Cyclodextrin-"Wirts" zur Verwendung mit einem speziellen Analyt-"Gast" ist im allgemeinen eine empirische Angelegenheit. Eine grobe Richtlinie zur Auswahl von CD-Derivaten ist, daß die Trennung mit α-CD für Verbindungen mit einem aromatischen Ring bevorzugt wird, β-CD für Verbindungen mit einem substituierten aromatischen Ring bevorzugt wird, und γ-CD für Verbindungen mit mehreren Ringen bevorzugt wird. Jedoch können die aktuellen Ergebnisse, wie in den 4 und 5 gezeigt, im wesentlichen von der allgemeinen Faustregel abweichen.
Ebenso kann die Konzentration von geladenen α-, β- oder γ-Cyclodextrinen in der Kapillare während der elektrophoretischen Trennung in einer empirischen Weise für jede chirale Verbindung optimiert werden. Im allgemeinen sollte die Konzentration des geladenen Cyclodextrins im molaren Überschuß relativ zu den Probenbestandteilen sein. Ein geeigneter CD-Konzentrationsbereich zur Optimierung liegt zwischen 1 und 20 Gew.-%, bezogen auf das Volumen, vorzugsweise eingeengt auf 2 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Volumen. Die am stärksten bevorzugte Konzentration von geladenem CD beträgt etwa 5 Gew.-%, bezogen auf das Volumen.
Die CD's werden vorzugsweise zu dem Elektrophoresepuffer zugegeben und in das Kapillarröhrchen eingebracht. Ein Trennungspuffer kann durch Mischen von 1 Teil 20%igem HSCD in Wasser, 2 Teilen einer zweifachen Lösung aus Elektrophoresepuffer (beispielsweise 50 mM Trethylammoniumphosphat, pH 2,5) und 1 Teil Wasser hergestellt werden. Die Kapillare wird mit dem Trennungspuffer 1 min durch Druck bei 137 kPa (20 psi) ausgespült. Nach der Probeninjektion wird der Kapillareneinlaß und -auslaß in den Trennungspuffer eingetaucht und dann wird eine Spannung angelegt, um die Elektrophorese zu initiieren. Weniger bevorzugte Alternativen umfassen das Binden der CD's an die Kapillarwand oder das Einschließen der CD's in eine Gelmatrix.
Die Proben werden durch Auflösen eines Analyts in 0 bis 50 Mol-% Methanol in Wasser bei einer detektierbaren Konzentration, im allgemeinen 0,1 bis 10 mM und vorzugsweise etwa 1 mM hergestellt. Außerdem kann ein interner Standard, wie PTS, bei einer Konzentration von etwa der Hälfte von der des Analyts, vorzugsweise etwa 0,5 mM, zu der Probe zugegeben werden. Die Probe kann dann durch elektrokinetische Injektion, hydrodynamischen Druck, Vakuum oder eine Spritzpumpe eingebracht werden. Vorzugsweise werden die Proben durch Druckinjektion bei Druckbereichen von 3 bis 103 kPa (0,5 bis 15 psi), am stärksten bevorzugt etwa 3 kPa (0,5 psi), und während einer Zeit von 1 bis 99 s, am stärksten bevorzugt 2 bis 5 s, in die Kapillarsäule eingebracht.
In der Praxis der Erfindung können ein Kapillar-Elektrophorese-System der Serien P/ACE 2000, P/ACE 5000 oder P/ACE MDQ (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Calif.); außerdem Beckmann System Gold.TM. Software, Beckmann P/ACE-TM. Software oder Beckman P/ACE.TM. Datenstationssoftware, die durch einen IBM PS/2-, IBM 350 466 DX2- oder IBM 350-P90-PC gesteuert wird, verwendet werden. Die Probe wird bei einer Spannung zwischen 1 kV und 100 kV, vorzugsweise 5 kV und 20 kV, und am stärksten bevorzugt 7,5 kV und 12 kV, der Elektrophorese unterworfen.
Die Detektion wird vorzugsweise durch UV-Absorbanz, vorzugsweise bei einer Wellenlänge, die den Probenbestandteil und den internen Standard, aber nicht das geladene CD detektiert, durchgeführt. Bevorzugte Wellenlängen zur Detektion liegen zwischen 180 nm und 380 nm, mit einer am stärksten bevorzugten Detektionswellenlänge von etwa 214 nm.
Wenn CE unter Bedingungen des Unterdrückens des elektroendoosmotischen Flusses, beispielsweise bei einem sauren pH, durchgeführt wird, wird die CE vorzugsweise unter Verwendung umgekehrter Polarität, mit der Anode, die dem Nachweisfenster am nächsten angebracht ist, durchgeführt. Unter diesen Bedingungen werden die Analyten durch Komplexierung mit einem negativ geladenen Cyclodextrin, das zu der Anode migriert, zu der Anode geschleppt. Wenn jedoch das Ende eines schneller migrierenden Hauptpeaks einen Nebenpeak verhüllt, wäre es wünschens wert, die Migrationsreihenfolge der Peaks umzukehren. Im allgemeinen ist die bevorzugte Trennungsbedingung eine, wo eine geringere Verunreinigung vor der Hauptkomponente migriert. Die Umkehr der Migrationsreihenfolge kann durch Erhöhen des pHs des Puffers auf mehr als 7, vorzugsweise etwa pH 8, und durch Verändern der Polarität erreicht werden, so daß die Kathode dem Nachweisfenster am nächsten ist. Unter derartigen Bedingungen ist der EOF stark genug, um die gesamten Verbindungen zu der Kathode zu spülen, einschließlich der freien und Analyt-gebundenen geladenen Cyclodextrine.
Um ein systematisches Schema zur Optimierung chiraler Analysen durch CE zu erleichtern, können die erfindungsgemäßen Reagenzien leicht in einem Kit vereinigt werden. Um bei der Auswahl des am stärksten geeigneten Cyclodextrin-"Wirts" behilflich zu sein, werden die Kits mindestens zwei Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem alpha-Cyclodextrin, das mindestens 7 Sulfatsubstituenten besitzt; b) einem beta-Cyclodextrin, das mindestens 12 Sulfatsubstituenten besitzt: und c) einem gamma-Cyclodextrin, das mindestens 9 Sulfatsubstituenten besitzt.
Außerdem können die Kits gegebenenfalls mindestens einen Elektrophoresepuffer, vorzugsweise bei einem sauren pH, enthalten. Jedoch kann ein weiterer Puffer zur Verwendung bei einem höheren pH enthalten sein, sowie ein pH-Einstellungsmittel, wie NaOH oder Phoshporsäure. Die Veränderung der Zusammensetzung und/oder des pH des Puffers kann die Auflösung und/oder Umkehr der Mirgrationsreihenfolge des der Analyse unterliegenden chiralen Paars verbessern. Weitere Zugaben zu dem Kit können einen internen Standard, wie PTS, und beschichtete oder nicht beschichtete Kapillarröhrchen umfassen.
Die vorher beschriebenen Versionen der Erfindung weisen viele Vorteile auf, einschließlich eines einfachen Ein-Schritt-Verfahrens der Synthese, reproduzierbarer Trennungen einer breiten Vielzahl an optischen Isomeren und verbesserte Auflösung für eine Anzahl von neutralen und basischen chiralen Verbindungen. Das Verfahren ist preisgünstig und wird vielmals mit den Verfahren der chiralen Analyse verglichen, die HPLC verwendet, das eine Vielzahl unterschiedlicher stationärer Pha sensäulen erfordert, um die Leistung zu optimieren. Die erfindungsgemäßen Reagenzien, Verfahren und Kits können ohne weiteres einem System der Qualitätskontrolle angepaßt werden, um die stereochemische Reinheit von pharmazeutischen Arzneimitteln, Nahrungsstoffen, Umweltschadstoffen, Pestiziden oder jedem weiteren racemischen Gemisch zu kontrollieren.
Die erfindungsgemäßen Materialien und Verfahren können hinsichtlich der folgenden Beispiele besser verstanden werden.
Beispiel 1
Synthese von HSCDs
Dieser erste Satz an Beispielen zeigt die einfachen Einzelschrittverfahren, die verwendet werden können, um die α-, β- und γ-Cyclodextrine mit Sulfatanteil zu synthetisieren, sowie den konsistenten hohen Sulfatierungsgrad der resultierenden Produkte.
Die Synthese eines α-Cyclodextrins mit hohem Sulfatanteil wurde durch Zugabe von 100 Gramm ofengetrocknetem α-Cyclodextrin (102,8 mMol) und 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) zu einem trockenen 2-Liter-Reaktor, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war, durchgeführt. Der Behälter wurde in einem Ölbad bei 50°C unter Rühren erwärmt, um das meiste des Feststoffes zu lösen. Ein teilweise gelöstes Gemisch eines Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes (272 g, 1.953 mMol) in 300 ml DMF wurde langsam in den Reaktor gegossen und bei 50°C kräftig gerührt. Nach 35 min wurde ein gummiartiges Produkt gebildet und das Rühren unterbrochen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abgegossen, das gummiartige Produkt zweimal mit 300 ml Reagensalkohol ausgespült und das Lösungsmittel erneut abgegossen.
Ebenso wurde die Synthese eines β-Cylodextrins mit hohem Sulfatanteil durch Zugabe von 100 Gramm ofengetrocknetem β-Cyclodextrin (88,1 mMol) und 500 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) zu einem trockenen 2-Liter-Reaktor, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war, durchgeführt. Der Behälter wurde in einem Ölbad bei 50°C unter Rühren erwärmt, um das meiste des Feststoffes zu lösen. Ein teilweise gelöstes Gemisch eines Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes (240 g, 1.724 mMol) in 300 ml DMF wurde langsam in den Reaktor gegossen und 1 h bei 50°C kräftig gerührt. Es wurde ein gummiartiges Produkt gebildet und das Rühren unterbrochen. Das Lösungsmittel wurde, so lange es noch heiß war, abgegossen, das gummiartige Produkt zweimal mit 300 ml Reagensaikohol ausgespült und das Lösungsmittel erneut abgegossen.
Ein vergleichbares Syntheseschema zur Herstellung eines γ-Cylcodextrins mit hohem Sulfatanteil wurde durch Zugabe von 100 Gramm ofengetrocknetem γ-Cyclodextrin (77,1 mMol) und 900 ml wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) zu einem trockenen 2-Liter-Reaktor, der mit einem mechanischen Rührer ausgestattet war, durchgeführt. Der Behälter wurde in einem Ölbad bei 50°C unter Rühren erwärmt, um das meiste des Feststoffes zu lösen. Ein teilweise gelöstes Gemisch eines Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplexes (204 g, 1.460 mMol) in 300 ml DMF wurde langsam in den Reaktor gegossen und bei 50°C kräftig gerührt. Nach 35 min wurde ein gummiartiges Produkt gebildet und das Rühren unterbrochen. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel abgegossen, das gummiartige Produkt zweimal mit 300 ml Reagensaikohol ausgespült und das Lösungsmittel erneut abgegossen.
Die gummiartigen Produkte aus den oben beschriebenen Syntheseschemen wurden in 375 ml 4 N Natriumhydroxid gelöst und gerührt. Die Lösungen wurden bei einem pH von etwa 10 gehalten, in einen 2-Liter-Rundkolben übertragen und der Rotationsverdampfung unterworfen, um Trimethylamin sowie etwas Wasser unter reduziertem Druck zu entfernen. Die Kolben wurden dann über Nacht in einen kalten Raum gestellt. Die Feststoffe aus den übrig gebliebenen Lösungen (etwa 600 ml) wurden durch Filtration gesammelt. Etwa 800 ml Aceton wurden zu jedem der Filtrate zugegeben und jedes bildete einen weichen Gummi. Die Gemische wurden 10 min kräftig gerührt und das Aceton abgegossen. Weitere 800 ml Aceton wurden dann zugegeben, 10 min gerührt und abgegossen. Die gummiartigen Produkte wurden jeweils in 500 ml deionisiertem Wasser gelöst, und die Lösungen wurden unter kräftigem Rühren langsam in 2 l Methanol gegossen. Die erhaltenen grauweißen Feststoffe wurden mittels Filtration gesammelt, dreimal mit 300 ml Methanol gewaschen und bei 110°C über Nacht unter Hochvakuum getrocknet.
Wenn sie in Wasser resuspendiert wurden, wiesen die Lösungen von allen HSCD eine hellbraune Farbe aufgrund einer Verunreinigung auf, die aus dem Schwefeltrioxid-Trimethylamin-Komplex stammt. Die Lösungen wurden durch Behandlung mit entfärbender Aktivkohle (Aldrich Kat.-Nr. 16, 155-1) entfärbt und dann durch Zentrifugation und Filtration durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter gereinigt.
Vier verschiedene Chargen von HSβCD, eine Charge von HSαCD und eine Charge von HSγCD wurden der Elementaranalyse unterworfen und mit einer Charge von 7SβCD verglichen, das gemäß der Verfahren von Moriya et al., wie durch Vincent et al. angepaßt, synthetisiert wurde. Der Sulfatierungsgrad wurde für jede Charge bestimmt, wie in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1. Sulfatierung von Cyclodextrinen
Wie in Tabelle 1 gezeigt, ergab das Syntheseverfahren, das verwendet wurde, um erfindungsgemäße HSCDs herzustellen, konsistent einen hohen Sulfatierungsgrad (> 11) mit einem Durchschnitt von mindestens etwa 1,6 Sulfatmolekülen pro Glucosemolekül.
Beispiel 2
Charakterisierung von β-CDs mit Sulfatgehalt durch indirekte UV-Detektion
Dieses Beispiel zeigt die erfindungsgemäßen HSCDs, die höheren Sulfatanteil aufweisen als das CD mit Sulfatanteil von Vincent et al., und weniger heterogen sind als einige herkömmlich erhältliche CDs mit Sulfatanteil.
Sulfobutylether-β-Cyclodextrine (SBE-βCD) wurden von Perkin-Elmer/ABI (Foster City, CA) mit einem durchschnittlichen Sulfatierungsgrad von 4 pro Cyclodextrin erworben. Außerdem stellt Cerestar (Hammond, Indiana) ein Gemisch von β-CDs mit Sulfatanteil (durchschnittlicher Grad an Sulfat = 4) bereit, und Cyclodextrin mit Sulfatanteil mit einem durchschnittlichen Sulfatierungsgrad von 7 bis 10 pro β-CD wurde von Aldrich (Milwaukee, Wisconsin) erhalten. Diese herkömmlich erhältlichen geladenen CD's wurden mit einem C-6-Sulfatester von b-Cyclodextrin (7SβCD, 7 Sulfatgruppen pro b-CD) von Vincent et al. und α-, β- und γ-HSCDs, die gemäß Beispiel 1 synthetisiert wurden, verglichen.
Die CE-Analyse mit indirekter UV-Detektion wurde auf einem P/ACE 5000-System von Beckman Instruments Inc. (Fullerton, CA) durchgeführt, das mit einer UV-Detektion bei 254 nm unter Verwendung einer 50 μm × 27 cm PVA-kovalent beschichteten Kapillare, erhalten von Beckman Instruments Inc. (P/N 2232111), ausgestattet war. Der Trennungspuffer bestand aus 40 mM p-Toluolsulfon-(TSA-)-säure, die mit Tris auf pH 8,0 eingestellt wurde. In diesem Verfahren ersetzen die nicht-absorbierenden Cyclodextrine mit Sulfatanteil den ionischen Chromophor TSA, der elektrophoretisch zu der Anode migriert, um die Zonen niedriger UV-Absorbanz herzustellen. Das Ergebnis ist, daß die anionischen Analyten Signale negativer Absorbanz erzeugen, wenn sie den Detektor passieren. Die Peaks sind breiter als die, die mit der direkten UV-Absorbanzdetektion vermutlich aufgrund einer mangelhaften Übereinstimmung der Mobilitäten zwischen den sulfatierten Cyclodextrinanalyten und des TSA-Hintergrundchromophors erhalten wurden.
Die resultierenden Elektropherogramme für HSαCD, HSβCD und HSγCD werden in den 1, 2 bzw. 3 gezeigt. Alle α-, β- und γ-HSCDs erzeugen Peaks mit kürzeren Migrationszeiten als 7SβCD, was zeigt, daß der Sulfatierungsgrad für jedes HSCD höher als sieben ist. Die Tatsache, daß Gemische eines HSCD und 7SβCD zwei unterschiedliche Peaks erzeugen, ist ein Zeichen, daß die HSCDs von Beckman keine Ausgangsgemische von vollständig zufällig-sulfatierten Arten sind. Wenn die Gemische außerdem HSCD-Moleküle mit 8, 9 oder 10 Sulfaten enthalten, würden die erwarteten Elektropherogramme keine unterschiedlichen Trennungen zwischen den HSCD- und 7SβCD-Peaks zeigen. Folglich bestätigen die Ergebnisse, daß der durchschnittliche Sulfatisierungsgrad der HSCDs größer als 10 ist.
Die Tatsache, daß die Peaks von HSCDs nicht viel breiter als die von 7SβCD sind, zeigt, daß die molekulare Heterogenität der HSCDs nicht breit ist. Im Vergleich dazu sind die Elektropherogramme des SBE-βCD, Cerestar-Sulfatcyclodextrins und β-CD mit Sulfatanteil von Aldrich (4) viel komplizierter, die aus einigen unterschiedlichen Peaks bestehen. Im Vergleich dazu ist HSCD ein Gemisch aus Cyclodextrinen mit höherem Sulfatierungsgrad und schmalerer Heterogenität als das der anderen herkömmlich erhältlichen Cyclodextrine mit Sulfatanteil.
Beispiel 3
Chirale Trennungen unter Verwendung des β-Cyclodextrins mit hohem Sulfatanteil (HSβCD)
Der wichtigste Faktor bei der Auswahl eines chiralen Selektors zur CE ist dessen Fähigkeit, die größte Vielzahl an Analyten aufzulösen. Folglich führten wir eine vergleichende Studie durch, um zu zeigen, daß sich die Enantiotrennung von neutralen und basischen Arzneimitteln unter Verwendung von HSβCD günstig mit den chiralen Trennungen unter Verwendung von SBECD von ABI (Durchschnitt von 4 Sulfobutylethergruppen pro β-CD), β-CDs mit Sulfatanteil von Cerestar (variable Anzahl von Sulfatgruppen pro β-CD), und des C-6-Sulfatesters von β-Cyclodextrin (7SβCD, 7 Sulfatgruppen pro β-CD) von Vincent et al. vergleichen läßt.
Phosphatpuffer wurden durch Titrieren von Phosphorsäure mit der entsprechenden Base, wie Triethylamin oder NaOH-Lösung, hergestellt. β-CD mit Sulfatanteil wurde in 25 mM Triethylammoniumphosphat, pH 2,5, gelöst. Aufgrund der ungenauen Beschaffenheit des Sulfatanteils, wurden die Konzentrationen der β-CD mit Sulfatanteil in Gewicht, bezogen auf die Volumengrundlage, ausgedrückt. Die Proben von neutralen Racematen wurden in 50% Methanol in Wasser gelöst, während die Amino-basierenden Racemate in Wasser gelöst wurden. Alle Proben wurden in die Kapillare injiziert, die 1 mM des racemischen Gemisches und 0,5 mM 1,3,6,8-Pyrentetrasulfonsäure-Natriumsalz (PTS) als interner Standard enthält. PTS migriert wegen seiner vier negativen Ladungen vor jeder Verbindung in das Gemisch.
Eine große Anzahl von Racematen neutraler Verbindungen und Aminen wurden der Kapillarelektrophorese unter praktisch denselben Trennungsbedingungen unterworfen. Die Trennungen wurden auf einem P/ACE 5000-CE-System von Beckman Instruments Inc. (Fullerton, CA), das mit UV-Detektion ausgestattet war, bei 214 nm unter Verwendung einer 25 μm × 27 cm unbehandelten Quarzglaskapillare durchgeführt. Die Konzentrationen von Cyclodextrinen mit Sulfatanteil wurden verändert (siehe Tabellen 2A und 2B). Die Elektrophorese wurde bei 10 oder 12 kV angelegter Spannung unter Bedingungen umgekehrter Polarität durchgeführt. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2A und 2B zusammengefaßt. Die in Klammern gezeigten Prozentwerte zeigen die Konzentration von Cyclodextrin mit Sulfatanteil in den Trennungspuffern, die optimale Trennungen erzeugen.
Tabelle 2A. Trennung von neutralen, chiralen, racemischen Gemischen (Unterschiedliche Konzentrationen von β-Cyclodextrin mit Sulfatanteil)
Tabelle 2B. Trennung von basischen, chiralen, racemischen Gemischen (Unterschiedliche Konzentration von β-Cyclodextrin mit Sulfatanteil)
Die gesamten Amine und sieben der getesteten neutralen Verbindungen sind bekannte Arzneimittel. Zwei der analysierten Amine, Fluoxetin und Verapamil, wurden aus Kapseln von herkömmlichen Arzneimitteln erhalten (Prozac^® bzw. Verelan^®). Die Ergebnisse in den Tabellen 2A und 2B zeigen die Auflösung R der Peaks, die als Quotient des Abstandes zwischen den Peakmitten ?x und 4σ, das Mittel der zwei Standardabweichungen der Peaks, definiert wird. Die Ergebnisse zeigen, daß HSβCD, das in einer einfachen Ein-Schritt-Synthese hergestellt wurde, gute Auflösung (> 1) für 18 neutrale Racemate und 11 Amin-Enantiomerpaare bereitstellt. Einige der Racemate (Glutethimid, Lorazepam, Praziquantel, Hydrobenzoin, α-Cyclopropylbenzylalkohol und 1,1'-Bi-2-naphtol) erzeugten ungewöhnlich große Auflösungswerte (> 7) unter Verwendung des HSβCD. Im Vergleich dazu erzeugte 7SβCD ausreichende Trennung für eine größere Anzahl von chiralen Paaren (8 neutrale und 8 Amine).
Eine Beobachtung aus den Elektropherogrammen der neutralen Racemate, wenn HSβCD verwendet wurde, war, daß die Migrationszeiten im allgemeinen kleiner als die entsprechenden Zeiten für die 7SβCD-Trennungen waren. Dies legt nahe, daß die Komplexierungs-Gleichgewichtskonstante zwischen dem 7SβCD und den meisten neutralen Verbindungen höher als die entsprechenden Werte für HSβCD ist. Diese höhere Affinität ist vermutlich der Hauptgrund, daß 7SβCD schlechte Trennungen für eine Mehrheit von getesteten neutralen Verbindungen erzeugte, d. h. die Komplexbildung ist für beide Enantiomere zu stark, was zu keiner chiralen Unterscheidung führt.
Für die chiralen Amine wurde der entgegengesetzte Verlauf beobachtet. Die Migrationszeiten, die durch HSβCD erzeugt wurden, waren fast alle kürzer als die, die unter Verwendung des 7SβCD erhalten wurden. Ein Grund für dieses Ergebnis ist, daß der höhere Sulfatierungsgrad des HSβCD höhere elektrophoretische Mobilitäten zur Anode hin aufgrund von mehr negativen Ladungen erzeugt. Es ist wahrscheinlich, daß die erhöhten negativen Ladungen ebenfalls höhere elektrostatische Anziehung zwischen dem Cyclodextrin mit Sulfatanteil und den protonierten Aminen erzeugten. Im Gegensatz zu neutralen Analyten, bei denen höhere Komplexierungskonstanten niedrigere Auflösung zu produzieren scheinen, erzeugte die scheinbar höhere Affinität von Beckman's HSβCD für Amine eine größere Anzahl erfolgreicher chiraler Amintrennungen als das 7SβCD.
Die Ergebnisse zeigen große Unterschiede in dem Auflösungsvermögen unter den verschiedenen geladenen CD's. Die CD's mit einem durchschnittlichen Sulfatierungsgrad von mehr als 7 zeigten wesentlich bessere chirale Auflösung mit einem größeren Bereich von molekularen Arten (siehe Tabelle 2A und 2B). In dieser Hinsicht läßt sich das HSβCD, das unter Verwendung der hierin beschriebenen einfachen Ein-Schritt-Synthese mit hoher Ausbeute hergestellt wurde, günstig mit jedem der verschiedenen getesteten Cyclodextrine mit Sulfatanteil vergleichen.
Beispiel 4
Wirkung von verschiedenen Synthesechargen auf die Reproduzierbarkeit der CE-Trennung
Ein weiteres wichtiges Kriterium für einen chiralen Selektor ist die Reproduzierbarkeit der Leistung unter verschiedenen Synthesechargen. Da von der direkten Sulfatierung von drei verschiedenen Arten von Hydroxylgruppen (2-, 3- und 6-Positionen an jeder Glucoseeinheit) erwartet wurde, eine zufälligere Substitution als die Fünf-Schritt-Synthese der 7SβCD-Verbindung zu erzeugen, war die Veränderung innerhalb verschiedener Chargen von HSCD eine Möglichkeit, die berücksichtigt werden mußte. Hinsichtlich dessen wurden die fünf verschiedenen Chargen von HSCD (GS4747-65, GS4747-70, GS4747-82, GS4747-85 und GS4747-90), die aus den fünf Synthesen resultieren, hinsichtlich der Trennung von 5-(4-Methylphenyl)-5-phenylhydantoin-, α-Methyl-α-phenylsuccinimid- und Thalidomid-Racematen getestet. Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß die Reproduzierbarkeit in der Migrationszeit und die Auflösung für vier der synthetischen Chargen sehr gut ist. Nur Charge 85 unterschied sich etwas von den anderen, die schnellere Migration und niedrigere Auflösung erzeugten. Diese Ergebnisse zeigen, daß wiederholte Synthesen unter Verwendung der einfachen Verfahrensweise der direkten Sulfatierung von ungeschützten β-HSCD ein konsistentes Produkt mit reproduzierbarer besonders guter Leistung als chiralen Selektor für CE ergibt.
Tabelle 3: Reproduzierbarkeit der Auflösung unter verschiedenen β-HSCD-Chargen
Beispiel 5
Chirale Trennungen unter Verwendung von α-, β- und γ-Cyclodextrinen mit hohem Sulfatanteil Dieses Beispiel zeigt, daß der Bereich von chiralen Verbindungen, die getrennt werden können, durch das Einschließen von α- und γ-Cyclodextrinen mit hohem Sulfatanteil (HSαCD bzw. HSγCD) in die CE-basierenden chiralen Trennungen erweitert wird. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß sich die Trennungen, die durch drei verschiedene HSCDs erzeugt wurden, gegenseitig ergänzen, um eine breite Vielzahl an neutralen und basischen Arzneimitteln abzudecken. Es wurde herausgefunden, das HSγCD beim Trennen von Enantiomeren von pharmazeutisch wichtigen Phenethylaminen besonders wirksam ist. Beispiele der chiralen CE-Analyse von Amphetamin und Thalidomid werden in den 5 bzw. 6 dargestellt. Die optimale Auflösung für Amphetamin (R = 21,68) wurde unter Verwendung von HSγCD erhalten, wobei HSβCD die beste Trennung von Thalidomid (R = 3,37) ergab.
Tabelle 4. Auflösung von racemischen Verbindungen mit α-, β- und γ-Cyclodextrinen mit Sulfatanteil (5% in TEA-Phosphat pH 3,0)
Obwohl die vorliegende Erfindung in beträchtlichen Einzelheiten in Bezug auf bestimmte bevorzugte Versionen davon beschrieben worden ist, sind weitere Versionen möglich. Beispielsweise können Cyclodextrine mit anderen negativ geladenen Bestandteilen, wie Phosphat, oder einem positiv geladenen Bestandteil, wie ein quartäres Amin, modifiziert werden. Außerdem können CE-Trennungen unter Ver wendung verschiedener Puffer oder pH-Bedingungen durchgeführt werden, um die Auflösung der geladenen CD-Komplexe zu verbessern. Daher sollte der Umfang der anhängenden Ansprüche nicht auf die Beschreibung der hierin enthaltenden bevorzugten Versionen begrenzt werden.

Claims

Geladenes Cyclodextrin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem alpha-Cyclodextrin, b) einem beta-Cyclodextrin und c) einem gamma-Cyclodextrin, wobei das Cyclodextrin einen geladenen Substituenten an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins, mindestens eine Modifikation einer sekundären Hydroxylgruppe an der 2-Position und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position umfaßt.
Geladenes Cyclodextrin mit der folgenden allgemeinen Formel:
ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem Cyclodextrin, wobei n 6 oder 8 ist, mindestens eine Gruppe R¹ eine modifizierte Hydroxylgruppe ist und weniger als n Gruppen R¹ Hydroxylgruppen sind und b) einem Cyclodextrin, wobei n 7 ist, mindestens 5 Gruppen R¹ modifizierte Hydroxylgruppen sind und weniger als 3 Gruppen R¹ Hydroxylgruppen sind, wobei die modifizierte Hydroxylgruppe eine Hydroxylgruppe ist, wobei das Wasserstoffatom durch eine Sulfat-, eine Carboxylat-, eine Phosphat- oder eine quartäre Ammoniumgruppe substituiert ist.
Geladenes Cyclodextrin nach Anspruch 1 oder 2, wobei die modifizierten Hydroxylgruppen Hydroxylgruppen sind, die durch eine Sulfatgruppe substituiert sind.
Alpha-Cyclodextrin mit hohem Sulfatanteil, wobei das alpha-Cyclodextrin mindestens 7 Sulfatsubstituenten und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position besitzt, wobei mindestens ein Substituent an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins vorliegt.
Beta-Cyclodextrin mit hohem Sulfatanteil, wobei das beta-Cyclodextrin mindestens 12 Sulfatsubstituenten und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position besitzt, wobei mindestens ein Substituent an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins vorliegt.
Gamma-Cyclodextrin mit hohem Sulfatanteil, wobei das gamma-Gyclodextrin mindestens 9 Sulfatsubstituenten und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position besitzt, wobei mindestens ein Substituent an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins vorliegt.
Zusammensetzung, umfassend ein geladenes Cyclodextrin nach Anspruch 1 und einen Elektrophoresepuffer.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei die Konzentration des Cyclodextrins zwischen 1 Gew.-% und 20 Gew.-%, bezogen auf das Volumen, beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der Elektrophoresepuffer sauer ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei der pH-Bereich des sauren Puffers zwischen 1 und 5 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei der Elektrophoresepuffer einen Elektrolyten umfaßt, der aus der Gruppe, bestehend aus Phosphaten, Acetaten und Citraten, ausgewählt ist.
Zusammensetzung, umfassend eine Probe, ein geladenes Cyclodextrin nach Anspruch 1 und einen Elektrophoresepuffer, wobei die Probe ein kleines chirales Molekül ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Probe eine neutrale Verbindung oder ein Amin umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Konzentration der Probe von 0,1 bis 10 mM beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das Cyclodextrin in einem molekularen Überschuß relativ zu der Probe vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Probe ein Arzneimittel oder eine pharmazeutische Verbindung umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, welche ferner einen internen Standard umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei der interne Standard 1,3,6,8-Pyrentetrasulfonsäure oder dessen Salz ist.
Verfahren zur Trennung von Enantiomeren eines kleinen Moleküls, umfassend die Schritte: a) Füllen einer Kapillare mit einem Puffer, umfassend ein Cyclodextrin, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: 1) einem alpha-Cyclodextrin, 2) einem beta-Cyclodextrin mit mindestens 12 modifizierten Hydroxyl gruppen und 3) einem gamma-Cyclodextrin, wobei das Cyclodextrin einen geladenen Substituenten an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins, mindestens eine Modifikation einer sekundären Hydroxylgruppe an der 2-Position und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position umfaßt, b) Injizieren einer Probe, umfassend Enantiomere einer chiralen Verbindung in die Kapillare, c) Durchführen einer elektrophoretischen Trennung der Enantiomere und d) Detektieren der getrennten Enantiomere der chiralen Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die elektrophoretische Trennung unter Bedingungen des Unterdrückens des elektroendoosmotischen Flusses durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Kapillare eine beschichtete Kapillare ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der Puffer sauer ist.
Kit zum Trennen chiraler Verbindungen, umfassend mindestens zwei Cyclodextrine mit hohem Sulfatanteil, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) einem alpha-Cyclodextrin, das mindestens 7 Sulfatsubstituenten besitzt, b) einem beta-Cyclodextrin, das mindestens 12 Sulfatsubstituenten besitzt, c) einem gamma-Cyclodextrin, das mindestens 9 Sulfatsubstituenten besitzt, wobei das Cyclodextrin einen geladenen Substituenten an der 6-Position von jeder Glucoseeinheit des Cyclodextrins, mindestens eine Modifikation einer sekundären Hydroxylgruppe an der 2-Position und eine unmodifizierte sekundäre Hydroxylgruppe an der 3-Position umfaßt.
Kit nach Anspruch 23, welcher ferner mindestens einen Elektrophoresepuffer umfaßt.
Kit nach Anspruch 23, welcher ferner einen internen Standard umfaßt.
Kit nach Anspruch 23, welcher ferner mindestens eine Kapillare umfaßt.
Kit nach Anspruch 24, welcher ferner mindestens ein pH-Einstellungsmittel umfaßt.