WO2022239704A1 - 抗体組成物の精製方法 - Google Patents

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孝行 吉森
ステファン アイルソ
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株式会社カイオム・バイオサイエンス
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    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an antibody composition. More specifically, it relates to a method for purifying an antibody composition in which isomers with sugar chains added to other than the Fc region sugar chain-binding consensus region are reduced.
  • Antibody drugs that use monoclonal antibodies as active ingredients are expected to be one of the molecular target drugs that make use of the high binding affinity and binding specificity of antibody molecules to antigens, and research and development have progressed. Antibody drugs have become indispensable for the treatment of various diseases, including cancer and autoimmune diseases, and currently, nearly 100 products have been approved and used around the world (non-patented). Document 1, Non-Patent Document 2). There are still high expectations for the development of new antibody drugs that satisfy unmet medical needs, and it is expected that many new antibody drugs will be researched and developed in the future.
  • Antibodies have N at the 297th Asn residue (Asn297) in the glycosylation consensus region (Asn297-X-Ser/Thr, where X is an amino acid other than Pro) present in the Fc portion of the heavy chain. - It has a conjugated sugar chain.
  • the sugar chains present in this glycosylation consensus region are known to contribute to biological activity, blood dynamics, safety, etc. as antibody molecules (Non-Patent Documents 3 and 4). For example, removal of the Fuc residue (core fucose) attached to the N-acetylglucosamine (GlcNAc) residue at the reducing end of the N-linked sugar chain of Asn297 enhances antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Non-Patent Document 5 Non-Patent Document 5
  • Non-Patent Document 3 Non-Patent Document 6
  • Non-Patent Document 8 Non-Patent Document 8
  • Glycosylation isomers have various properties such as biological activity (Non-Patent Document 10, Non-Patent Document 11), immunogenicity (Non-Patent Document 8, Non-Patent Document 10), blood half-life (Non-Patent Document 9), etc. It is known that it can affect the properties of antibodies. In particular, when a sugar chain is bound near the Fab region or the CDR region, there is concern that the biological activity may decrease. Similarly, glycosylated isomers of antibodies in which sugar chains are bound to sites other than the glycosylated consensus region have safety concerns such as immunogenicity.
  • glycosylation outside the glycosylation consensus region significantly reduces biological activity or significantly increases immunogenicity, it will have negative effects that are not desirable as a component of an antibody drug. Therefore, these glycosylated isomers are regarded as target substance-derived impurities. Such target-substance-derived impurities are not desirable to be included as components of pharmaceuticals, and it is desirable to remove them as much as possible from the viewpoint of regulation (Non-Patent Document 12).
  • the sugar chain will not bind to that site. Generally, such as changing the consensus sequence to another amino acid sequence. In that case, the binding activity may be lowered compared to the performance of the original antibody, and it may not be possible to obtain an antibody having the desired therapeutic effect.
  • Glycosylation isomers in which sugar chains are bound to regions other than the glycosylation consensus region of the antibody, such as Fab or CDR, are evaluated by separating glycosylation isomers at a small amount and at a high-performance analytical level. , can be discerned.
  • a method of evaluating a peptide fragment by combining high-performance liquid chromatography and mass spectrometry and a method of evaluating a sugar chain itself cleaved from an antibody are known (Non-Patent Document 6, Non-Patent Document 9).
  • HIC hydrophobic interaction chromatography
  • Non-Patent Document 14 discloses the usefulness of separation performance of many antibodies, but does not suggest that glycosylation isomers can be separated by a purification method using HIC.
  • Non-Patent Documents 15 and 16 There are reports on the separation of glycosylated isomers by affinity chromatography using a lectin that specifically binds to a given sugar chain. It uses Concanavalin A as a ligand and is known to have high separation characteristics, but since it is separation by affinity and uses natural products, it is not suitable for the production of pharmaceuticals, and is not suitable for the production of antibody pharmaceuticals. There are no applicable cases.
  • Patent Document 1 As a technology that has realized the separation of sugar chain components other than antibodies, there is a known case of separating recombinant antithrombin by chromatography based on the difference in the number of sugar chains (Patent Document 1). In addition, recombinant erythropoietin and its derivatives are separated by chromatography based on the difference in the number of sialic acid additions (Patent Document 2). Similarly, there is a case in which isoelectric focusing chromatography was used to separate ovalbumin and transferrin (Patent Document 3). However, these techniques cannot be directly applied to antibodies, and there is no report on a production method for separating and removing glycosylated isomers in antibody compositions.
  • Non-Patent Document 17 a method of removing sugar chains by enzymatic treatment is known (Non-Patent Document 17).
  • the isolation, removal, and origin of the enzyme are also problematic, making it difficult to use this method as a manufacturing technology for pharmaceuticals.
  • the sugar chains of antibodies are removed with an enzyme, it is also impossible to distinguish between the sugar chains of the glycosylated consensus region and the non-consensus region.
  • the anti-hDLK-1 antibody described in Patent Document 4 is expected to have anti-tumor activity.
  • an object of the present invention is to provide a method for removing glycosylated isomers of antibody drugs.
  • an object of the present invention is to obtain a more effective and safer purified anti-hDLK-1 antibody composition.
  • glycosylated isomers of antibody drugs cannot be separated by chromatography.
  • no removable manufacturing or preparation techniques have been reported.
  • the inventors of the present invention have made intensive studies to solve the above problems, and found that, surprisingly, by using a conventional hydrophobic interaction chromatography carrier, in particular, glycosylation isomers and target substances can be adsorbed. And by optimizing the separation conditions, it was found that a purified antibody composition with reduced glycosylated isomers can be prepared.
  • the present inventors separated the glycosylated isomer and the purified. Glycosylated isomers having sugar chains near the CDRs of the antibody may affect the binding activity of the antibody. It is also possible that there is no effect. Surprisingly, it was found that in the anti-hDLK-1 antibody described in Patent Document 4, the glycosylated isomer completely lost its activity and therefore became an "impurity" in pharmaceuticals. As a result, the present inventors succeeded in identifying the glycosylation isomer as a new impurity in the crudely purified anti-hDLK-1 antibody, and by enabling its removal, it is more effective and safer. have achieved the provision of a purified composition of an anti-hDLK-1 antibody.
  • the present invention relates to the following (1) to (27).
  • the heavy chain has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, and 36;
  • the purified antibody composition obtained the content of glycosylated isomers in which sugar chains are added to a site other than the Fc region glycosylated consensus region is reduced compared to the crude antibody product. ing, the aforementioned method.
  • the carrier for conventional chromatography is a hydrophobic interaction chromatography carrier or a mixed mode chromatography carrier.
  • the carrier for conventional chromatography has an average particle size of 15 ⁇ m or more.
  • the carrier for conventional chromatography is a hydrophobic interaction chromatography carrier, and after loading the crude antibody product onto the carrier, washing the carrier with a washing solution prior to elution (1) The purification method according to any one of (6).
  • a method for purifying the antibody composition according to (1) The antibody crude product adjusted to a salt concentration of 0.5 M or more is subjected to conventional chromatography using a carrier having a particle size of 20 to 100 ⁇ m and having a benzyl group or a butyl group, and the glycosylated isomer is passed through. to remove to washing the carrier with a washing liquid; and obtaining a purified antibody composition by eluting the antibody adsorbed to the carrier with an elution solution having a salt concentration of 0.5 M or less or containing no salt and having a pH of 5 to 7;
  • the ratio of glycosylated isomers to the total antibody in the purified antibody composition is reduced compared to the crude antibody product.
  • a method for purifying the antibody composition according to (1) The crude antibody product adjusted to pH 4 to 6 is subjected to conventional chromatography using a carrier having a particle size of 20 to 100 ⁇ m and having a benzyl group or a butyl group to remove glycosylated isomers into a flow-through fraction.
  • a purified antibody composition by eluting the antibody adsorbed to the carrier with an elution solution having a salt concentration of 0.5 M or less or containing no salt and having a pH of 5 to 7, wherein in the purified antibody composition, The ratio of glycosylated isomers to the whole antibody is reduced compared to the crude antibody product, the aforementioned method.
  • the protein load per unit amount of the carrier for conventional chromatography is 20 g/L or more, and the washing is performed by flowing a washing solution of 5 carrier volumes or more, (1) to (20)
  • a method according to any one of (22) The ratio of the antibody, which does not have sugar chains added to sites other than the Fc region glycosylation consensus region, to the total antibody, which includes the purification method according to any one of (1) to (21), is 95. % or higher.
  • the heavy chain has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, and 36;
  • a method for producing a purified anti-hDLK-1 antibody composition wherein the light chain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, Applying the crudely purified antibody to conventional chromatography using a carrier having a particle size of 20 to 100 ⁇ m having a benzyl group or a butyl group, Adsorbing to the carrier an antibody having no sugar chain added to a site other than the Fc region glycosylation consensus region; removing glycosylated isomers by washing the carrier one or more times with a washing solution containing a salt of 0.5 M or more; Obtaining a purified antibody composition by eluting the antibody adsorbed to the carrier, Here, the ratio of glycosylated isomers to the total antibody in the purified antibody composition is reduced compared to the crude antibody product.
  • the heavy chain has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, and 36; and a glycosylated isomer in which a sugar chain is added to a site other than the Fc region glycosylation consensus region from a crude anti-hDLK-1 antibody light chain having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12
  • the heavy chain has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, and 36; and an anti-hDLK-1 antibody composition in which the light chain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, and wherein no sugar chain is added to a site other than the Fc region glycosylation consensus region. , the antibody composition containing 95% or more of the total antibody.
  • the heavy chain has an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, and 36; and an anti-hDLK-1 antibody whose light chain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 12, wherein no sugar chain is added to a site other than the Fc region glycosylation consensus region.
  • the present invention makes it possible to reduce or eliminate glycosylated isomers in which sugar chains are added to non-glycosylated consensus regions of antibodies.
  • the first effect of the present invention it is possible to provide a medical antibody composition with a reduced proportion of glycosylated isomers.
  • a highly pure antibody composition purified by the method and having reduced glycosylated isomers can be made into a pharmaceutical preparation with higher purity.
  • the purified composition of the anti-hDLK-1 antibody purified in the present invention is a pharmaceutical composition with excellent efficacy and safety because glycosylation isomers, which are impurities having no activity, have been removed. can provide.
  • Fig. 3 is a graph showing the HIC-HPLC analysis pattern of the crude product obtained from the culture medium of cells producing humanized anti-hDLK-1 monoclonal antibody.
  • Fig. 10 is a photograph showing the results of SDS-PAGE analysis after protein A purification of the culture supernatant by CHO cells transiently expressing a humanized anti-hDLK-1 monoclonal antibody.
  • FIG. 10 is a graph showing the separation profile of antibody compositions on CaptoButyl hydrophobic interaction chromatography support.
  • FIG. 1 is a graph and a table showing the results of a purity analysis test by HIC-HPLC of a purified antibody composition separated on a CaptoButyl carrier.
  • Peak1 and Peak2 in the table are glycosylated isomer antibodies (Peak1 has a sugar chain attached to one CDR of four polypeptide chains, Peak2 has a sugar chain attached to two CDRs), Peak3 The ratio (%) of antibodies with sugar chains bound only to the glycosylation consensus region is shown.
  • FIG. 10 is a graph showing the separation profile of antibody compositions on CaptoButyl carrier.
  • FIG. 10 is a graph showing the separation profile of antibody compositions on Poros Benzyl Ultra carrier.
  • FIG. Fig. 4 is a graph showing the results of analysis by design of experiments on control of glycosylated isomer content by optimizing chromatography conditions using POROS Benzyl Ultra carrier.
  • (c) shows the results of HIC-HPLC analysis of the fraction collected as the pre-peak in HIC-HPLC of (a).
  • 1 is a graph showing the results of evaluating the ADCC activity of glycosylated isomers. The vertical axis indicates fluorescence intensity indicating ADCC activity, and the horizontal axis indicates antibody concentration. Circles are the fractions fractionated as the main peak in FIG. 9(b) (components not containing the glycosylated isomer), isomers), and the triangles indicate the results of crude antibody purification before isolation in FIG. 9(a).
  • the base sequence (SEQ ID NO: 37) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 38) of the coding region of the H chain ( ⁇ 1 chain) of HuBA-1-3D-1 are shown.
  • Amino acids are represented by single-letter code, and termination codon positions are indicated by " ⁇ ".
  • the base sequence (SEQ ID NO: 41) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 42) of the coding region of the H chain ( ⁇ 1 chain) of HuBA-1-3D-2 are shown. Amino acids are represented by single-letter code, and termination codon positions are indicated by " ⁇ ”.
  • the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 69) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 70) of the coding region of the L chain ( ⁇ chain) are shown. In the figure, amino acids are represented by single-letter codes, and the positions of termination codons are indicated by " ⁇ ".
  • HuBA-1-3D-1 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 53) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 54) of the H chain ( ⁇ 1 chain) coding region of T73K. Amino acids are represented by single-letter code, and termination codon positions are indicated by " ⁇ ".
  • SEQ ID NO: 18 In the deduced amino acid sequence of VH of HuBA-1-3D-1 T73K (SEQ ID NO: 18), a peptide consisting of 19 amino acids from the N-terminus is a signal peptide.
  • the cDNA nucleotide sequence of the VH mature peptide of HuBA-1-3D-1 T73K is shown in SEQ ID NO:19, and its deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:20.
  • the cDNA nucleotide sequence of the mature peptide of VH of HuBA-1-3D-1 A24G/T73K is shown in SEQ ID NO:23, and its deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:24.
  • the numbers in parentheses indicate the sequence numbers in the sequence listing.
  • Fc region glycosylation consensus region refers to a glycosylation consensus sequence usually present in the Fc portion of an antibody, including Asn297 ( Typically, it refers to Asn297-X-Ser/Thr (where X is an amino acid other than Pro)).
  • the glycosylation consensus sequence and the nucleotide sequence encoding the glycosylation consensus region include any sequence that encodes the amino acid sequence.
  • glycosylation isomer means an antibody in which sugar chains are added to amino acids other than the glycosylation consensus region.
  • a sugar chain attached to an amino acid other than the glycosylated consensus region is referred to as a “non-consensus sugar chain”.
  • the regions to which the non-consensus sugar chain is bound in the glycosylated isomer include the Fab region, the Fv (variable) region that binds to the antigen, the complementarity determining region (CDR) region, and regions other than the glycosylated consensus region. Included are Fc regions, and fusion sequence portions in fusion antibodies, typically CDR regions.
  • the N-type sugar chain to Asn-X-Ser/Thr (where X is an amino acid other than Pro), which is a glycosylation consensus sequence. or an O-type sugar chain to Ser or Thr.
  • a crude antibody purification product to be purified in the present invention may contain an antibody having one or more non-consensus sugar chains.
  • the number of non-consensus sugar chains bound per antibody molecule is 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, Or it may be 10 or more.
  • an antibody consists of four polypeptide chains (usually two heavy chains and two light chains).
  • the binding ratio of sugar chains to the binding regions of non-consensus sugar chains in crude antibody preparations is determined by the ratio of the heavy and light chains in one antibody molecule.
  • the non-consensus sugar chain to the structure corresponding to "combination" or the case where the non-consensus sugar chain to the corresponding structure is completely bound is taken as 100%, it may be 0.1% or more and 200% or less per antibody molecule.
  • it is 1% or more and 50% or less.
  • 200% means that non-consensus sugar chains are bound to both (two sites) of the paired "combination of heavy chain and light chain" in one antibody molecule.
  • the term "antibody” includes full-length antibodies, antibody fragments, fusions of full-length antibodies or antibody fragments with other substances, such as mouse antibodies, mouse-human chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, It also includes amino acid variants, adducts, deletions, substitutions, sugar chain variants and the like of these.
  • the immunoglobulin class of the antibody is not particularly limited, and may be any immunoglobulin class (isotype) of IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, or IgY, preferably IgG.
  • the antibody of the present invention is IgG, it may be of any subclass (IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4).
  • Antibody fragments are preferably antigen-binding fragments such as F(ab') 2 , Fab', Fab, Fab 3 , single-chain Fv (hereinafter referred to as "scFv"), (tandem) bispecific single-chain Fv (sc(Fv) 2 ), single-chain triple body, nanobody, divalent VHH, pentavalent VHH, minibody, (double-stranded) diabody, tandem diabody, bispecific tribody, bispecific bibody, dual affinity retargeting molecules (DART), triabodies (or tribodies), tetrabodies (or [sc(Fv) 2 ] 2 or (scFv-SA) 4), disulfide-bonded Fv (hereinafter referred to as "dsFv”), compact IgG , heavy chain antibodies, or polymers thereof. Fusions of antibody fragments with other substances include fusion proteins, particularly Fc fusion proteins.
  • the antibodies herein have a heavy chain selected from and the light chain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10 or 12.
  • the anti-hDLK wherein the heavy chain has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO: 4, 8, 16, 20, 24, 28, 32 and 36, and the light chain has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12 -1 antibody.
  • an antibody composition containing a glycosylated isomer to be purified is referred to as a "crude antibody product".
  • Crude antibody product Any crude antibody product can be used as long as it contains a glycosylated isomer.
  • crude antibody products include a biological composition such as plasma or a processed product thereof, and a culture medium of transformed cells into which an antibody gene has been integrated (a culture supernatant may be used; the same shall apply hereinafter) or a processed product thereof. can give.
  • bio-derived compositions include compositions containing antibodies obtained from transgenic non-human animals or plants. Transformed cells may be any cells that can bind sugar chains.
  • cell lines that have the property of binding sugar chains such as animal cells, plant cells or yeast cells, and more specifically cell lines that can bind sugar chains.
  • Chinese hamster ovary cells CHO cells
  • mouse myeloma cells NS0 cells, SP2/0 cells, rat myeloma cells YB2/0 cells, IR983F cells Syrian hamster kidney-derived BHK cells
  • human embryonic kidney-derived 293 cells human myeloma cells
  • human myeloma cells such as Namalwa cells, embryonic stem cells, or cells into which an antibody gene has been introduced, such as fertilized egg cells.
  • Various subspecies derived from primary immortalized cell lines can also be used as the aforementioned cell lines.
  • CHO K1 strain for CHO cells, CHO K1 strain, CHO DG44 strain, CHO S strain, and derivatives thereof can be used (Palsson et al., Nature Biotechnology 31(8), 759-765, 2013).
  • a crude antibody product By culturing these cells in a medium suitable for protein production, a crude antibody product can be obtained as a culture medium.
  • Any medium can be used, for example, serum-containing medium, medium containing no animal-derived components such as serum albumin or serum fractions, serum-free medium or protein-free medium, but preferably serum-free.
  • a medium, an animal-derived raw material-free medium, a protein-free medium, or a completely chemically defined medium is used.
  • the above crudely purified antibody includes a bio-derived composition or culture solution that has been subjected to filtration, salting out, one or more types of chromatography, pH adjustment, buffer replacement, concentration, dilution, etc., and a bio-derived composition. It is also possible to use a composition such as an intermediate composition obtained by performing an operation such as purification on a culture solution. As an intermediate composition that has undergone a purification operation, any solution after any unit operation for constructing the manufacturing process of an antibody drug can be used. For example, a composition after Protein A affinity chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, buffer exchange, low pH treatment, and filtration is desired.
  • the possibility of the presence of glycosylated isomers can be estimated from the amino acid sequence or gene sequence of the antibody.
  • the sugar chain binding site can be estimated by peptide mapping and mass spectrometry of the antibody.
  • a peptide-N-glycosidase (PNGase)-treated antibody and an untreated antibody are compared by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to determine changes in protein migration zone.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the types of antibodies are as described above, and this method is suitable as a purification method in the production of antibodies as antibody pharmaceuticals, including therapeutic, diagnostic or prophylactic antibodies. This is because antibody drugs are required to have a constant content of antibody isomers contained therein, and it is necessary to reduce impurities derived from the target substance as much as possible (ICH Q6B guideline).
  • therapeutic or prophylactic antibodies include antibodies that bind to ligands and neutralize the activity of ligands, antibodies that bind to cell surface receptors and neutralize ligand binding, antibodies that bind to cell surface and Antibodies exhibiting cytotoxic activity can be mentioned.
  • diagnostic antibodies include antibodies that bind to ligands or cell surface receptors.
  • Cell-damaging activity includes antibody-dependent cellular cytotoxicity, complement-dependent cytotoxicity, antibody-dependent cellular phagocytosis, etc. mentioned.
  • chemically modified antibodies such as antibody-drug conjugates, radioisotope-labeled antibodies, fusion antibodies with cytokines, etc., multi-specific antibodies (Nature, 580 ( 16), 330-338 (2020)), the technology of the present invention can be used for antibody derivatives having sugar chains.
  • Fusion proteins include soluble TNF receptor Fc fusion proteins, CTLA4 modified Fc fusion proteins, Fc-TPOR agonist peptide fusion proteins, VEGF receptor-Fc fusion proteins, and the like. This method can be used to purify any of these antibodies or fusion proteins.
  • Tables 1 and 2 below contain the full-length sequences of the anti-human DLK-1 antibodies described in Patent Document 4 (WO2014/054820) supra (the underline indicates the signal sequence. In the mature protein, the underlined sequence is not included), but in the antibody, for example, the N of the NSS sequence surrounded by a square frame is the sugar chain binding consensus sequence. Therefore, when this gene is expressed in animal cells or the like, a sugar chain composition containing glycosylated isomers may be produced. Similarly, DLK-1 antibodies with sequences similar to those of the anti-DLK-1 antibody have similar potential. This method is useful as a method for removing or reducing glycosylated isomers from a crude antibody containing such glycosylated isomers.
  • the amino acid sequences of the H chain of A24G/T73K and the L chain of HuBA-1-3D are listed in SEQ ID NOs: 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, and 70, respectively .
  • amino acid sequences of the mature proteins obtained by removing the signal sequence from these sequences are listed in SEQ ID NOs: 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, and 72, respectively.
  • H chain means heavy chain
  • L chain means light chain.
  • the amino acid sequence of CDR1 of HuBA-1-3D VH1 and HuBA-1-3D VH2 is "DYAMH” (SEQ ID NO: 73)
  • the amino acid sequence of CDR2 is "VISTYYGNTNYNQKFKG” (SEQ ID NO: 74)
  • the amino acid sequence of CDR3 is "GGLREYYYAMDY”. ” (SEQ ID NO: 75).
  • the amino acid sequence of CDR1 of HuBA-1-3DVL is "KSSQSLLNSSNQKNYLA” (SEQ ID NO: 76)
  • the amino acid sequence of CDR2 is “FASTRES” (SEQ ID NO: 77)
  • the amino acid sequence of CDR3 is "QQHYSTPPT” (SEQ ID NO: 78).
  • Antibodies of the present invention may be antibodies having all or part of these CDRs. These CDR sequences were defined by Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991).
  • VH means a heavy chain variable region
  • VL means a light chain variable region.
  • An antibody composition in which the content of the glycosylated isomer is reduced compared to the crude antibody is a crude antibody containing the glycosylated isomer. It can be obtained by subjecting it to conventional chromatography as a starting material. Therefore, the present invention provides a method for purifying a crude antibody product, wherein the crude antibody product is subjected to conventional chromatography to obtain an antibody having no sugar chain added to a site other than the Fc region glycosylation consensus region.
  • the present invention relates to a method in which the content of glycosylated isomers in which sugar chains are added to sites other than the region glycosylation consensus region is reduced compared to the crude antibody product before purification.
  • hydrophobic interaction chromatography carriers include hydrophobic functional groups such as methyl, ethyl, propyl, butyl, octyl, hexyl, propylene glycol, phenyl, alkylphenyl, benzyl and alkylbenzyl groups. to the base material can be used.
  • Examples of mixed-mode chromatography carriers include those obtained by mixing the above-described hydrophobic functional groups and ion-exchange functional groups in an arbitrary ratio.
  • hydrophobic functional groups for example, N-benzyl-N-methylethanolamine or the like can be used as the functional group.
  • Typical examples of cation-exchangeable functional groups include CM (Carboxymethyl, —O—CH 2 —COOH), SP (Sulfopropyl, —O—C 3 H 6 —SO 3 H) and the like.
  • exchangeability examples include DEAE (Diethylaminoethy, -O-C 2 H 4 -N-(C 2 H 5 ) 2 ), QAE (Quaternized aminoethyl or Diethyl-(2-hydroxypropyl)-aminoethyl, -O- C 2 H 4 —N—(C 2 H 5 ) 2 (CH 2 —CH(OH)—CH 2 )) and the like can be used.
  • Carrier bases include cellulose, Sephadex, cross-linked agarose, polyacridamides, methacrylates and various synthetic polymers. Either porous or non-porous supports can be used.
  • mixed-mode chromatography support includes those having functional groups such as calcium phosphate, such as hydroxyapatite ( Ca10 ( PO4) 6 (OH) 2 ) and fluoroapatite ( Ca10 (PO4) 6F2 ). is mentioned.
  • the chromatography carrier can be obtained and used as a commercial product. Specifically, Butyl-Sepharose (registered trademark) 4 Fast Flow (average particle diameter 90 ⁇ m), Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow (average particle diameter 90 ⁇ m), Octyl Sepharose (registered trademark) 4 Fast Flow (average particle diameter 90 ⁇ m) ), Phenyl Sepharose (registered trademark) 6 Fast Flow (high sub) (average particle diameter 90 ⁇ m), Phenyl Sepharose (registered trademark) 6 Fast Flow (low sub) (average particle diameter 90 ⁇ m), Butyl Sepharose (registered trademark) High Performance (average particle size 90 ⁇ m), Phenyl Sepharose High Performance (average particle size 90 ⁇ m), SOURCE 15ETH (average particle size 15 ⁇ m), SOURCE 15 ISO (average particle size 15 ⁇ m), SOURCE 15PHE (average particle size 15 ⁇ m), Capto Phenyl (High Performance) ) (average particle size
  • the average particle size of the chromatography carrier used for the purification purpose of the present invention can be 15 ⁇ m or more, 20 ⁇ m or more, 30 ⁇ m or more, or 40 ⁇ m or more.
  • the liquid volume of the crude antibody product that can be processed by the chromatography carrier can be 100 mL or more, 1 L or more, 10 L or more, or 100 L or more.
  • the chromatography column packed with this carrier can have a capacity of about 100 mL to 1,000 L (diameter of about 5 cm to 2 m).
  • the amount of the crude antibody product subjected to chromatographic purification is at least 1 L or more, preferably 10 L or more, more preferably 100 L or more, still more preferably 500 L or more, and up to about 20,000 L.
  • the linear flow velocity in chromatography is 1,000 cm/hr or less, preferably 500 cm/hr or less.
  • the amount of antibody to be purified is 10 g or more, preferably 100 g or more, more preferably 1 kg or more, and still more preferably 10 kg or more in terms of protein amount.
  • the glycosylated isomers to be removed or reduced by this technique are contained in the first half fraction of the antibody eluted by chromatography, and the desired antibody of interest is eluted in the second half fraction to obtain a sugar chain. It separates and removes addition isomers.
  • an antibody non-glycosylated isomer antibody
  • glycosylated chains added only to at least the glycosylated consensus region, which is the target component
  • Conditions that allow adsorption to the chromatography carrier are required. Adsorption of antibodies is caused by interaction between the degree of hydrophobicity and hydrophilicity of antibodies and chromatography carriers.
  • buffers commonly used for hydrophobic interaction chromatography, hydrophobic chromatography, and mixed mode chromatography can be used.
  • Any antibody that is stable under chromatographic conditions may be used, such as phosphate buffer, acetate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glycine buffer, borate buffer, tartrate buffer, MES buffer. , HEPES buffers, MOPS buffers, amino acid buffers, and mixed buffers thereof.
  • concentration of these buffer solutions can be arbitrarily selected within the generally used range of about 0.1 mM to 300 mM.
  • the pH of the buffer solution can be arbitrarily selected within the range of pH 4-8, but pH 4-6 is desirable.
  • Salts such as sodium sulfate, ammonium sulfate, sodium chloride, sodium citrate, etc., are added to these buffers in an appropriate amount as necessary to the extent that the antibody does not form a precipitate, thereby enhancing the interaction with the chromatography carrier. , adsorption to chromatographic supports.
  • One or more of the above salts can be arbitrarily selected, and the salt concentration used is such that the antibody can be stably present in the range of 300 mM to 2 M and the antibody can be sufficiently adsorbed to the chromatography carrier.
  • a salt concentration of about 1 M is preferred, and a low salt concentration that allows the antibody to be adsorbed is preferred.
  • the amount of antibody that can be adsorbed to the chromatography carrier per unit amount varies depending on the type of chromatography carrier and the conditions of the buffer solution, but 10 mg or more of antibody per 1 mg of carrier, preferably 20 mg or more of antibody per 1 mg of carrier should be adsorbed. can be done. Chromatographic operations can be performed at any temperature between 0°C and 40°C. Operation at room temperature is desirable, and operation under temperature-controlled conditions is more desirable.
  • the crude antibody containing glycosylated isomers is loaded on the chromatography, and then separated and purified by elution. Separation of glycosylated isomers by chromatography is carried out by adsorbing an antibody to a chromatography carrier, and then stepwise, continuously, or a combination of both to lower the salt concentration or raise the pH of the buffer flowing through the column. , reduced conductivity, or a combination thereof. After the antibody is adsorbed on the chromatography carrier, the glycosylated isomer is first eluted, and then the antibody with the sugar chain added only to the glycosylated consensus region (non-glycosylated isomer antibody) is eluted.
  • the term “elution” refers to weakening the binding of an antibody component bound to a chromatographic carrier by hydrophobic interaction or the like to the carrier and discharging the antibody component from the chromatographic carrier.
  • Conditions for elution of glycosylated isomers include buffer conditions where the interaction between the glycosylated isomer and the chromatography carrier is sufficiently weaker than the interaction between the non-glycosylated isomer antibody and the chromatography carrier. is.
  • the buffer for elution removal (washing) of the glycosylated isomers should have a salt concentration difference of 10 mM or more and/or 0.5 mM between the buffer for eluting the non-glycosylated isomer antibodies. Any buffer with a pH difference of 2 units or more can be used. After the non-glycosylated isomer antibody is adsorbed on the chromatography carrier at a high salt concentration (usually in the range of 300 mM to 2 M), the washing solution used to wash the chromatography carrier has a salt concentration equal to or higher than the elution salt concentration.
  • the salt concentration can be 10 mM or more higher than the concentration of 0.5 M or more, or 1.0 M or more, for example.
  • the pH of the washing solution can be in the range equal to or up to 2 units higher than the pH at which the antibody is adsorbed, or in the range equal to or up to 2 units lower than the pH at the time of elution. can.
  • the pH of the wash solution may be 0.2 units below the pH of the elution solution.
  • the pH of the wash solution may be in the range of pH 4-8.
  • the amount of buffer solution (washing solution) for eluting and removing glycosylated isomers is 2 CV or more, 3 CV or more, 4 CV or more, 5 CV or more, or 10 CV or more with respect to the chromatography carrier volume. , 15 CV or more, or 20 CV or more, or 5-20 CV, 5-15 CV, 5-10 CV, or 10-20 CV.
  • the change in pH and/or salt concentration from loading of the crude antibody product to washing may be stepwise (one or more steps, two or more steps, three or more steps, several steps, etc.). , may be continuous.
  • the pH range from loading to washing of antibody crudes is usually in the range of 4-6.
  • the conditions of salt concentration, pH and/or amount of washing solution are determined according to the content of the glycosylated isomer in the crude antibody used as a raw material, and the properties of the antibody itself such as the isoelectric point and amino acid sequence of the antibody. can be set as appropriate.
  • the method for separating glycosylated isomers by chromatography is to allow the glycosylated isomers to pass through the chromatography carrier (flow-through), and then separate the antibody having a glycosylated chain added only to the glycosylated consensus region. Elution may also be included, which allows the preparation of a purified antibody composition with high purity of the non-glycosylated isomeric antibody.
  • Flow-through refers to elution of glycosylated isomers out of the column without being adsorbed onto the chromatography carrier when the crude antibody product is loaded onto a column packed with the chromatography carrier.
  • the glycosylated isomer in the crude antibody may have a weak interaction with the chromatography carrier, but the equilibration buffer (preferably 1 column volume or more) is passed continuously or intermittently.
  • the equilibration buffer preferably 1 column volume or more
  • the interaction between the glycosylated isomer and the chromatographic carrier should be such that the interaction between the glycosylated isomer and the chromatographic carrier is such that the antibody and the chromatographic carrier have sugar chains bound only to the glycosylated consensus regions. Select a buffer with sufficiently weak conditions compared to the interaction.
  • a buffer solution with conditions such as salt concentration different from the above buffer solution is used to elute the bound antibody from the chromatography carrier to prepare a desired purified antibody composition.
  • the buffer that allows only the glycosylated isomers to pass through should have a salt concentration difference of 10 mM or more (10 mM or more higher salt concentration ), and/or any buffer solution with a pH difference of 0.2 units or more (0.2 or more lower pH) can be used as a wash-through solution.
  • the salt concentration of the buffer should be equal to or 1M higher (preferably 0.5M higher) than the salt concentration at which the non-glycosylated isomer antibody is eluted from the carrier. can be done.
  • the salt concentration at this time is usually in the range of 100% or more of the salt concentration for eluting the antibody.
  • the change in pH or/and salt concentration may be in one step or in several steps, and may be continuous.
  • the salt concentration and pH of the buffer solution are usually adjusted to an appropriate range before the crude antibody as a raw material is applied to the chromatography carrier.
  • the amount of the buffer solution (washing solution) to allow the glycosylated isomer to pass through is selected to be two times or more, preferably five times or more, the amount of the chromatography carrier.
  • the flow rate of the cleaning liquid More desirably, it is 10 to 20 times or more as the flow rate of the cleaning liquid.
  • the above salt concentration, pH and/or the amount of washing solution are appropriately set according to the content of glycosylated isomers in the crude antibody used as a raw material.
  • the amount of loading of the antibody in the crude antibody purification product affects the ability to separate glycosylated isomers, so that the resulting purified antibody composition has the desired yield and purity (
  • the amount of protein loaded per chromatography carrier is determined so that the content of glycosylated isomers).
  • chromatographic operations there is a limit to the amount of protein that can be adsorbed onto a carrier, and chromatographic operations are managed using parameters such as the maximum dynamic binding capacity (DBC) as indices.
  • DBC maximum dynamic binding capacity
  • the loading amount it is preferable to set the loading amount to a certain amount or more so as not to adsorb unnecessary glycosylated isomers.
  • the glycosylated isomers are separated and removed by loading 20 mg or more, 25 mg or more, 30 mg or more, or 35 mg or more and not more than the maximum dynamic adsorption capacity.
  • the amount of protein to be loaded can be determined according to the content of glycosylated isomers in the crude antibody product to be purified. That is, when the content of glycosylated isomers in the crude antibody product before chromatographic purification is high, the loading amount can be close to the maximum dynamic adsorption capacity.
  • the method of the present invention comprises a step of selecting a conventional chromatography carrier to be used according to the properties of the antibody to be separated, and a step of optimizing the separation and removal of glycosylated isomers by the selected chromatography carrier.
  • any two or more types of chromatography carriers are loaded with a crude antibody to be purified under the salt concentration and pH conditions described above, and sugar chains are added only to the glycosylation consensus region.
  • a chromatographic carrier with a large amount of adsorbed antibody to which is attached can be selected.
  • elution is carried out with an eluate whose salt concentration is reduced stepwise or continuously, so that only glycosylated isomers and/or glycosylated consensus regions in the eluate that has passed through the carrier are subjected to sugar chain addition.
  • the amount of the chain-attached antibody is measured, and a chromatography carrier that provides an eluate containing a small amount of glycosylated isomers and a large amount of the antibody having a sugar chain added only to the glycosylation consensus region is selected as a glycosylated carrier. It can be selected as a chromatographic support with better separation of adduct isomers.
  • Optimization steps for the separation and removal of glycosylated isomers by the selected chromatography carrier include the composition, concentration, and pH of the buffer solution used during loading, the type and concentration of salt to be added, and the crude antibody purification onto the chromatography carrier. Loading amount, composition, concentration, pH, number of washings and amount of washing solution during washing, composition, concentration and pH of buffer during elution, type and concentration of salt to be added, and method for changing them, sugar Examine and select conditions such as adsorption or straight-through removal of chain addition isomers. These optimization steps can be optimized for each parameter one by one, or the optimum conditions can be selected including the interaction of multiple parameters using statistical analysis methods such as design of experiments. can also
  • purification processes are usually constructed using three-step chromatography.
  • two or more of protein A affinity chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, mixed mode chromatography, hydrophobic interaction chromatography and the like are used in combination.
  • the method of the invention can be incorporated into any step of antibody chromatography using conventional chromatography during the purification process of these antibodies. Specifically, in the purification process using protein A affinity chromatography in the first step, cation exchange chromatography in the second step, and hydrophobic interaction chromatography in the third step, the hydrophobic interaction chromatography in the third step is performed.
  • the hydrophobic interaction chromatography in the third step is performed by the method of the present invention.
  • the hydrophobic interaction chromatography in the second step is performed by the method of the present invention.
  • the purification process uses protein A affinity chromatography in the first step, anion exchange chromatography in the second step, and hydrophobic interaction chromatography in the third step, the hydrophobic interaction chromatography in the third step of the present invention.
  • the step of mixed mode chromatography together with or without hydrophobic interaction chromatography may be included in the method of the present invention.
  • glycosylated isomers are efficiently removed, and a purified antibody composition containing glycosylated isomers in an amount reduced to the desired content can be provided.
  • the ratio of the amount of the glycosylated isomer to the amount of the total antibody in the purified antibody composition after purification by the method of the present invention can be 10% or less, more preferably 5% or less, 4% or less, or 3%. 2% or less, 1% or less, 0.5% or less, or 0.2% or less.
  • the ratio of the amount of glycosylated isomer contained in the crude antibody product before purification to the total amount of antibody may be 50% or more, 20% or more, 10% or more, or 5% or more.
  • the method of the present invention may be a method of obtaining an antibody with a reduced amount of glycosylated isomers at a step yield of 20% or more, 40% or more, or 50% or more.
  • the content and content ratio of the glycosylated isomer and the purification yield in the final purified antibody composition or the antibody composition after purification can be achieved by adjusting the above-described chromatographic parameters, preferably , glycosylation isomers are reduced to any amount and optimized to give an acceptable purification yield for antibody production.
  • glycosylated isomers can be confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC: High Performance Liquid Chromatography) or ultra high performance liquid chromatography (UHPLC: Ultra High Performance Liquid Chromatography) for analytical evaluation.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • UHPLC Ultra High Performance Liquid Chromatography
  • a carrier having an average particle size of 15 ⁇ m or less is used, and glycosylation isomers can be separated by chromatography at ultrahigh flow rate and ultrahigh pressure.
  • TSKgel Butyl-NPR column (average particle size 2.5 ⁇ m, Tosoh), TSKgel Phenyl-5PR column (average particle size 10 or 13 ⁇ m, Tosoh), TSKgel Ether-5PW column (average particle size 10 ⁇ m, Tosoh)
  • TSKgel BioAssist Phenyl column (average particle size 10 ⁇ m, Tosoh)
  • Protein-Pak Hi Res HIC column Waters
  • BioPro HIC column average particle size 2.3 or 4 ⁇ m, YMC
  • Proteomix HIC column (average Particle size 1.7 or 5 ⁇ m, MS equipment), AdvanceBio HIC column (average particle size 3.5 ⁇ m, Agilent)
  • MAbPac HIC-10LC column average particle size 5 ⁇ m, ThermoFisher
  • MAbPac HIC-20LC column average Particle size 5 ⁇ m, ThermoFisher
  • MAbPac HIC-Butyl LC column (average
  • a purified antibody composition purified by the method of the present invention can be used as an active ingredient of an antibody drug, as a therapeutic, preventive, or diagnostic agent for various diseases in humans and animals.
  • the CHO cell line DG44 was transformed with an expression vector having a gene encoding the amino acid sequence of the anti-hDLK-1 antibody to prepare a stable expression cell line pool DGC8-R-T11-14.2d.
  • a stable expression cell line pool DGC8-R-T11-14.2d.
  • culturing was carried out in a 1 L-scale DASGIP (registered trademark) Parallel Bioreactor System (manufactured by Eppendorf) bioreactor. Cultivation was carried out using a serum-free completely chemically defined medium under the conditions of pH 7 and 34° C. to 37° C. by fed-batch method for 13 days. This culture supernatant was purified by Protein A chromatography (MabSelect SuRe carrier (Cytiva)) to obtain an antibody composition.
  • DASGIP registered trademark
  • Parallel Bioreactor System manufactured by Eppendorf
  • HIC-HPLC analysis of antibody composition The obtained antibody composition was subjected to HIC-HPLC analysis under the following conditions.
  • HPLC apparatus Prominence HPLC System (Shimadzu Corporation) Analysis column: TSKgel Butyl-NPR column (Tosoh, 0014947; 4.6 mm ⁇ 3.5 cm, average particle size 2.5 ⁇ m)
  • Mobile phase A 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 2.3 M ammonium sulfate
  • Mobile phase B 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) Analysis conditions: protein concentration 2 mg/mL x 10 ⁇ L injection, gradient 0-3 min; 0% B, 3-15 min; 0-100% B, 15-20 min; 100% B, flow rate 0.5 mL/min, detection wavelength 220 nm or 280 nm
  • Peak 3 is an antibody with a sugar chain attached only to the glycosylation consensus region
  • peak 2 is a glycosylation isomer with a sugar chain attached to the antibody in peak 3 at another site
  • peak 1 is a sugar chain in the antibody in peak 3.
  • the culture supernatant was purified by Protein A affinity chromatography, and the obtained antibody crude product was treated with peptide-N-glycosidase F (PNGase F) or not treated with PNGase F, and then subjected to reducing SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS -PAGE) (silver staining).
  • PNGase F peptide-N-glycosidase F
  • SDS -PAGE SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • FIG. 4 shows the results of evaluation by the HIC-HPLC analysis method of Example 1 for the sample loaded onto the column, the fraction passed through the CaptoButyl column, and the fraction adsorbed onto the same column.
  • the 2.1% (Peak 1) and 12.1% (Peak 2) of the glycosylated isomers contained in the load sample were removed in the flow-through fraction (HIC389 Flow-through) and transferred to the column adsorption fraction (HIC389 Elute).
  • An antibody (Peak3) composition with 100% purity from which glycosylated isomers were removed was obtained.
  • glycosylation isomers can be separated by using a hydrophobic interaction chromatography carrier (Capto Butyl). It was found that when the selected chromatography carrier is used, glycosylated isomers are efficiently removed to the flow-through fraction, and a highly purified antibody composition can be obtained in the adsorbed fraction.
  • a hydrophobic interaction chromatography carrier Capto Butyl
  • Example 2 Separation of Glycosylation Isomers by Hydrophobic Interaction Chromatography Support 2
  • the culture supernatant containing the prepared humanized anti-human DLK-1 monoclonal antibody was purified by Protein A affinity chromatography, and a crude product of the same antibody containing about 10% glycosylated isomer was obtained. Obtained.
  • the pH was adjusted to 4.5, 4.7, or 5.0
  • the conductivity was adjusted to 70 mS / cm or less, and the product was transferred to a chromatography carrier. was used as a sample for loading.
  • Capto Butyl (average particle size 90 ⁇ m, manufactured by Cytiva) and POROS Benzyl Ultra (average particle size 50 ⁇ m, manufactured by Thermo Fisher) Hydrophobic interaction chromatography columns (carrier capacity 5 mL) ) was evaluated in the adsorption-desorption mode.
  • the amount of protein sample loaded onto each column was 20 mg/mL as protein amount per carrier, and the flow rate was 300 cm/h. Chromatography was performed under the following mobile phase conditions.
  • Mobile phase A 20 mM sodium citrate buffer (pH 4.5, 4.7, or 5.0) containing 1 M sodium chloride
  • Mobile phase B 20 mM sodium citrate buffer (pH 4.5, 4.7, or 5.0) 1.
  • the antibody is eluted throughout the entire washing/elution phase regardless of pH, and by collecting the middle layer of the elution, it is possible to obtain a high-purity antibody with no glycosylation other than the glycosylation consensus region. was shown.
  • the peak fluctuates depending on the pH (at pH 4.5, the antibody is well adsorbed and eluted from the column in the latter half of the elution, but at pH 5.0 about 80% is not adsorbed and during washing Antibodies are eluted), indicating that elution components can be controlled according to pH.
  • the salt concentration of the sample loading solution, the pH and salt concentration of the washing solutions (washing solution I, washing solution II), and the type and pH of the elution buffer are examined, and the antibody yield and non-glycosylation of the purified fraction are examined.
  • Isomeric antibody purity purity of antibody with no glycosylation other than the glycosylation consensus region
  • content of glycosylated isomers by HIC-HPLC analysis was measured. Table 3 shows the test results.
  • the yield is 40 to 40 with a purity of 97 to 100%. It was found to be controllable to 80% (Table 4).
  • the purity of the purified antibody composition tended to be higher with a protein loading of 30 g/L or 35 g/L rather than 25 g/L.
  • increasing the amount of washing fluid tended to improve the purity, although the yield of the resulting purified antibody composition decreased. This result indicated that the purity of the purified antibody composition could be increased by increasing the amount of washing solution under the condition of low protein load.
  • FIG. 6 shows the result of analyzing the results by the design of experiment (DoE).
  • DoE design of experiment
  • the position of the glycosylation isomer removal step in the purification process and the effect of the amount of washing solution on purity The culture supernatant containing the anti-hDLK-1 antibody prepared in the same manner as in Example 1 was purified by Protein A affinity chromatography. to obtain a crude product of the same antibody containing about 10% glycosylated isomer. This crude antibody product was kept at pH 3-4 for a certain period of time and neutralized, and used as a sample for loading onto a chromatography carrier.
  • This antibody crude product was purified in the order of hydrophobic interaction chromatography followed by mixed mode chromatography or mixed mode chromatography followed by hydrophobic interaction chromatography in the two types of flow shown in FIG. POROS Benzyl Ultra was used as the hydrophobic interaction chromatography carrier, and Capto MMC was used as the mixed mode chromatography carrier.
  • the conditions for hydrophobic interaction chromatography were as follows. ID No. HIC446, HIC457, and HIC463 were subjected to mixed-mode chromatography after hydrophobic chromatography, and ID No. HIC447 was subjected to mixed mode chromatography followed by hydrophobic chromatography.
  • Table 5 and Figure 8 show the yield and purity of the purified antibody composition obtained in the hydrophobic interaction chromatography step.
  • the yield was 60% or more, and the purity (indicating the amount of glycosylated isomer contaminant) by HIC-HPLC analysis was 99% or more. It was also found that the yield and purity can be controlled depending on the liquid volume (6 to 15 CV) of washing 1. That is, it was found that a composition with an antibody purity of about 90% improved to about 98% after 5 CV washing, about 99% after 8 CV washing, and about 99.5% after 15 CV washing.
  • the culture supernatant was filtered and subjected to Protein A affinity chromatography (MabSelect SuRe 10L; Cytiva), low pH virus inactivation, hydrophobic interaction chromatography using POROS Benzyl Ultra carrier (Thermo Fisher, 10L), Captoadhere carrier ( Cytiva, 10L), virus filtration, replacement with formulation buffer by tangential flow filtration (TFF), sterilization filtration, etc., to obtain a highly purified antibody composition.
  • Protein A affinity chromatography MobSelect SuRe 10L; Cytiva
  • POROS Benzyl Ultra carrier Thermo Fisher, 10L
  • Captoadhere carrier Cytiva, 10L
  • virus filtration replacement with formulation buffer by tangential flow filtration (TFF), sterilization filtration, etc.
  • the purified antibody composition finally obtained through all steps had a total yield of 46%.
  • the purity of the purified antibody composition was 100% by HIC-HPLC analysis, and did not contain glycosylated isomers.
  • glycosylation isomer removal step (Capto Butyl) A culture supernatant containing an anti-hDLK-1 antibody prepared in the same manner as in Example 1 was obtained. It was confirmed that about 10% of the glycosylated isomer was contained in the crude antibody product.
  • Protein A affinity chromatography step carrier: MabSelect SuRe
  • low pH virus inactivation step low pH virus inactivation step
  • hydrophobic interaction chromatography step Capto Butyl carrier
  • mixed mode chromatography step Capto adhere
  • the hydrophobic chromatography step improved the glycosylation isomer-free rate to 99.8% purity, and a purified antibody composition could be obtained with an overall yield of 25%. As shown in these results, it was found that a highly purified antibody composition can be obtained even by using a hydrophobic interaction chromatography carrier other than the POROS Benzyl Ultra carrier.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing the crude antibody product (a) before fractionation and the purified antibody composition (b, c) after fractionation using HIC-HPLC shown in Example 1.

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Abstract

本発明は、抗体医薬品の糖鎖付加異性体を除去する方法等の提供を課題とする。本発明は、例えば、抗体組成物の精製方法であって、前記抗体組成物をコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体をクロマトグラフィ担体に吸着させること、及び前記担体を溶出液で溶出させることにより、前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含む、前記精製方法を提供するものである。

Description

抗体組成物の精製方法
　本発明は抗体組成物の製造方法に関する。より詳しくは、Ｆｃ領域糖鎖結合コンセンサス領域以外に糖鎖が付加した異性体が低減された抗体組成物の精製方法に関する。
　モノクローナル抗体を有効成分とする抗体医薬品は、抗体分子の持つ抗原への高い結合親和性と結合特異性を活かした分子標的薬の１つとして期待され、研究開発が進展してきた。抗体医薬品は、がんや自己免疫疾患をはじめとする様々な疾患の治療に不可欠なものとなっており、現在、１００品目近くの製品が世界で承認され使用される状況に至っている（非特許文献１、非特許文献２）。アンメットメディカルニーズを満たす新規抗体医薬品開発への期待は依然として高く、今後も数多くの新たな抗体医薬品が研究され、開発されることが期待されている。
　抗体（ＩｇＧ）は、重鎖のＦｃ部分に存在する糖鎖付加コンセンサス領域（Ａｓｎ２９７－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）中の２９７残基目のＡｓｎ残基（Ａｓｎ２９７）にＮ－結合型糖鎖を有している。この糖鎖付加コンセンサス領域に存在する糖鎖は抗体分子としての生物活性や血中動態、安全性等に寄与することが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。たとえば、Ａｓｎ２９７のＮ－結合型糖鎖の還元末端のＮ―アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基に付加しているＦｕｃ残基（コアフコース）を除去すると抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性が増強されることが知られている。同様に、Ｆｃ部分に結合する糖鎖の非還元末端部分のガラクトース（Ｇａｌ）残基の数が多いほど補体第一成分（Ｃ１ｑ）への結合が増強され、結果として補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性が増強されることが分かっている（非特許文献５）。
　一方、抗体のＦｃ領域の糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が結合した抗体（糖鎖付加異性体）の事例もよく知られている。たとえば、ＳＰ２／０細胞で産生された抗悪性腫瘍剤であるＣｅｔｕｘｉｍａｂは、Ｆａｂ部分にＮ－結合型糖鎖が結合していることが確認された（非特許文献３）。これ以外にも糖鎖付加異性体についての様々な報告がなされている（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。
　糖鎖付加異性体は、生物活性（非特許文献１０、非特許文献１１）、免疫原性（非特許文献８、非特許文献１０）、血中半減期（非特許文献９）など、様々な抗体の特性に影響を及ぼす可能性があることが知られている。特に、Ｆａｂ領域又はＣＤＲ領域付近に糖鎖が結合した場合、生物活性が低下する可能性が懸念される。同様に、糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が結合した抗体の糖鎖付加異性体は免疫原性等の安全性の懸念もある。
　糖鎖付加コンセンサス領域以外の糖鎖の付加により、生物活性が大幅に低下したり、免疫原性が大幅に増加したりする場合、抗体医薬品の成分としては望ましくないマイナスの影響が生じることになるため、これらの糖鎖付加異性体は目的物質由来不純物とみなされる。このような目的物質由来不純物は、医薬品の成分として含有されることは望ましくなく、規制上の観点からも可能な限り除去することが望ましい（非特許文献１２）。
　抗体のＦｃ領域の糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加する可能性のあるコンセンサス配列を含む抗体が、医薬品の開発候補の分子として見出された場合は、その部位に糖鎖が結合しないようにコンセンサス配列を別のアミノ酸配列へ変更するなどが一般的に行われる。その際、元の抗体の性能に比較して結合活性等の低下を生じることもあり、目的の治療効果を有する抗体を取得できない可能性がある。
　抗体の糖鎖付加コンセンサス領域以外のＦａｂ又はＣＤＲ等の領域に糖鎖が結合した糖鎖付加異性体は、少量かつ高性能の分析レベルでの糖鎖付加異性体の分離を行うことで評価し、見分けることが可能である。高速液体クロマトグラフィと質量分析を組み合わせてペプチド断片を評価する方法や、抗体から切り出した糖鎖そのものを評価する方法が知られている（非特許文献６、非特許文献９）。また、抗体のＦａｂ領域に糖鎖が結合した抗体を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）により分析した事例が知られている（非特許文献１３）。しかし、これらの事例では、いずれも分析を目的としてごく少量の抗体を用いて分離性能の極めて高い分析レベルの方法を用いており、分離された組成物を抗体医薬品として利用することはできない。また、ＨＩＣ分析の総説（非特許文献１４）により、数多くの抗体の分離性能の有用性が公開されているが、ＨＩＣによる精製法で糖鎖付加異性体を分離できることは一切示唆されていない。
　このように、こうした糖鎖付加異性体を分離・除去し、糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加した異性体を含まない、あるいは十分低減された抗体組成物の調製方法は知られていなかった。すなわち、従来の技術では、糖鎖付加異性体は、分析レベルで糖鎖の付加状況を評価できるにとどまり、抗体の糖鎖付加異性体を分離・除去し、医薬品として提供できる量の抗体組成物を製造する方法は存在せず、そのような抗体組成物も知られていなかった。
　よって、通常、抗体のＦｃ領域に存在する糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加し、そのような糖鎖付加異性体が含まれてしまう場合、それらの成分は分離されずに抗体医薬品の一部として含有されている。前述したＣｅｔｕｘｉｍａｂも、Ｆｃ部分の糖鎖付加コンセンサス領域及びＦａｂ内の非コンセンサス領域の両方に糖鎖が付加した混合物の組成で開発が行われている（非特許文献３）。仮に糖鎖付加異性体が生物活性を有しない場合、目的物質由来不純物が医薬品の成分として含まれることになり望ましくない。
　なお、所定の糖鎖に特異的に結合するレクチンを用いたアフィニティクロマトグラフィによる糖鎖付加異性体の分離は報告がある（非特許文献１５、非特許文献１６）。Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａをリガンドとして用いるものであり、分離特性も高いことが分かっているが、アフィニティによる分離であり、天然物を使用することから、医薬品の製造には適しておらず、抗体医薬品の製造に適用された事例は存在しない。
　抗体以外で糖鎖成分の分離を実現した技術としては、遺伝子組換えアンチトロンビンを糖鎖本数の違いによりクロマトグラフィで分離した事例が知られている（特許文献１）。また、遺伝子組換えエリスロポエチン及びその誘導体はシアル酸の付加数の違いでクロマトグラフィによる分離が行われている（特許文献２）。同様に、等電点クロマトグラフィを用いて卵白アルブミンやトランスフェリンを分離した事例がある（特許文献３）。しかし、これらの技術をそのまま抗体に適用することはできず、抗体組成物において、糖鎖付加異性体を分離除去する製造法は一切報告が無い。
　前記以外の技術としては、酵素処理することで糖鎖を除去する方法が知られている（非特許文献１７）。しかし、安全性の観点から、酵素の分離・除去や由来なども問題になるため、医薬品の製造技術として利用することは難しい。酵素で抗体の糖鎖を除去する場合、糖鎖付加コンセンサス領域と非コンセンサス領域の糖鎖を区別して除去することも不可能である。
　特許文献４に記載される抗ｈＤＬＫ－１抗体は、その抗腫瘍活性が期待されている抗体である。
国際公開第２００８／１２０８０１号 特開２００１－０６４３００号公報 国際公開第２００５／１００３７９号 国際公開第２０１４／０５４８２０号
ＹＡＫＵＧＡＫＵ　ＺＡＳＳＨＩ　１３７（７），　８１５－８１６　（２０１７） Ｂｕｌｌ．　Ｎａｔｌ．　Ｉｎｓｔ．　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉ．，　１３２，　３６－４６　（２０１４） ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ，　３４（２），　８３－８８　（２０１３） Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｅｌｌ，　９，　６３－７３　（２０１８） Ｆｒｏｎｔ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　８　（６４６），　１－８　（２０１７） Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２８４　（４７），　３２４９３－３２５０６　（２００９） Ｅｍｂｏ　Ｊ．，　１０，　２７１７－２７２３　（１９９１） Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１９６，　１４３５－１４４１　（２０１６） Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　３４９，　１９７－２０７　（２００６） Ｎａｔｕｒｅ　Ｒｅｖｉｅｗ｜Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，　ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｏｎｌｉｎｅ，　０４　Ｆｅｂ，　（２０１９） Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．，　３３８　（２），　５２９－５３８　（１９９９） ＩＣＨ　Ｑ６　Ｂ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｍＡｂｓ，　６　（４），　８５２－８５８　（２０１４） Ｊ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｉｏｍｅｄ．　Ａｎａｌ．，　１３０，　３－１８　（２０１６） Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２８５　（２１），　１６０１２－２２　（２０１０） Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，　７　（２１），　３１１６６－７６　（２０１６） Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｍｅｔｈｏｄｓ，　４６７，５８－６２　（２０１９）
　抗体の糖鎖付加コンセンサス領域以外に結合した糖鎖は生物活性や安全性の観点からも望ましくなく、抗体医薬品が含有する糖鎖付加異性体を十分なレベルまで除去することができ、簡便に均一な精製抗体組成物を調製可能な技術の開発が求められている。よって、本発明は、抗体医薬品の糖鎖付加異性体を除去する方法の提供を課題とする。
　別の態様において、本発明は、より有効かつより安全な抗ｈＤＬＫ－１抗体の精製組成物を得ることを課題とする。
　前述した従来の技術が示すように、分析評価の目的で糖鎖付加異性体を精密かつ高度な分離能を有するクロマトグラフィで分離した報告はあるものの、抗体医薬品の糖鎖付加異性体をクロマトグラフィで分離し除去可能な製造技術又は調製技術は報告が無かった。本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、驚くべきことに、コンベンショナルな疎水性相互作用クロマトグラフィ担体を使用することで、特には、糖鎖付加異性体及び目的物質の吸着及び分離条件を最適化することで、糖鎖付加異性体が低減された精製抗体組成物を調製可能であることを見出した。
　また、本発明者らは新たに見出した糖鎖付加異性体の低減方法を用いて特許文献４に記載される抗ｈＤＬＫ－１抗体について糖鎖付加異性体の分離、非糖鎖付加異性体の精製を行った。抗体のＣＤＲ付近に糖鎖を有する糖鎖付加異性体は抗体の結合活性に影響を及ぼすかも知れないが、その活性の低下の程度は糖鎖の大きさや結合位置にも関係するため、活性に影響しない可能性も考えられる。驚くべきことに特許文献４に記載される抗ｈＤＬＫ－１抗体においては、糖鎖付加異性体は完全に活性が消失し、そのため医薬品における「不純物」となることを見出した。これにより、本発明者らは、抗ｈＤＬＫ－１抗体粗精製物中の新たな不純物として糖鎖付加異性体を特定することに成功し、その除去を可能とすることで、より有効かつより安全な抗ｈＤＬＫ－１抗体の精製組成物の提供を達成した。
　すなわち、本発明は以下の（１）～（２７）に関する。
（１）　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体組成物の精製方法であって、
　抗体粗精製物をコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を前記クロマトグラフィの担体に吸着させること、及び
　前記担体を溶出液で溶出させることにより、前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
　ここで、得られた前記精製抗体組成物における、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加した糖鎖付加異性体の含有量が、前記抗体粗精製物と比較して減少している、
前記方法。
（２）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体が、疎水性相互作用クロマトグラフィ担体、又は、ミックスモードクロマトグラフィ担体である、（１）に記載の精製方法。
（３）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の平均粒子径が１５μｍ以上である、（１）又は（２）に記載の精製方法。
（４）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の平均粒子径が２０～１００μｍである、（１）又は（２）に記載の精製方法。
（５）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体が、ベンジル基又はブチル基を有する、（１）～（４）のいずれか１項に記載の精製方法。
（６）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の単位量あたりのタンパク質負荷量が、２０ｍｇ／ｍＬ以上である、（１）～（５）のいずれか１項に記載の精製方法。
（７）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体が疎水性相互作用クロマトグラフィ担体であり、かつ、前記抗体粗精製物を前記担体に負荷した後、溶出前に当該担体を洗浄液で洗浄することを含む、（１）～（６）のいずれか１項に記載の精製方法。
（８）　前記洗浄液の塩濃度が、前記溶出液の塩濃度より１０ｍＭ以上高いことを特徴とする、（７）に記載の精製方法。
（９）　前記洗浄液の塩濃度が、０．５Ｍ以上であることを特徴とする、（７）又は（８）に記載の精製方法。
（１０）　前記洗浄液の塩濃度が、１．０Ｍ以上であることを特徴とする、（７）又は（８）に記載の精製方法。
（１１）　前記洗浄液のｐＨが、前記溶出液のｐＨより０．２ユニット以上低いｐＨであり、かつ、ｐＨ４～８の範囲内である、（７）～（１０）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１２）　前記洗浄が、２担体容量以上の洗浄液を流すことにより行われる、（７）～（１１）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１３）　段階的又は直線的にｐＨ又は／及び塩濃度が変化する移動相を使用することにより、洗浄及び溶出を行うことを特徴とする、（７）～（１２）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１４）　前記溶出液が０．５Ｍ以下の塩濃度であるか又は塩を含まず、かつ、ｐＨ５～７である、（７）～（１３）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１５）　収率が２０％以上である、（１）～（１４）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１６）　前記精製抗体組成物中の全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が５％以下である、（１）～（１５）のいずれか１項に記載の精製方法。
（１７）　前記抗体粗精製物中の全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が５％より大きい、（１６）に記載の精製方法。
（１８）　（１）に記載の抗ｈＤＬＫ－１抗体組成物の精製方法であって、
　抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷すること、
　前記担体に、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を吸着させること、
　ｐＨ４～６の洗浄液で前記担体を１回以上洗浄することにより糖鎖付加異性体を除去すること、及び、
　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まないｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
前記方法。
（１９）　（１）に記載の抗体組成物の精製方法であって、
　０．５Ｍ以上の塩濃度に調整された前記抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して糖鎖付加異性体を素通り画分に除去すること、
　前記担体を洗浄液で洗浄すること、及び、
　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まない、ｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
前記方法。
（２０）　（１）に記載の抗体組成物の精製方法であって、
　ｐＨ４～６に調整された前記抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して糖鎖付加異性体を素通り画分に除去すること、
　前記担体を洗浄液で洗浄すること、及び、
　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まない、ｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み
　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
前記方法。
（２１）　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の単位量あたりのタンパク質負荷量が２０ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記洗浄が、５担体容量以上の洗浄液を流すことにより行われる、（１）～（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）　（１）～（２１）のいずれか１項に記載の精製方法を含む、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体の、全抗体に対する割合が９５％以上である抗体組成物の製造方法。
（２３）　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体精製組成物の製造方法であって、
　抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷すること、
　前記担体に、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を吸着させること、
　０．５Ｍ以上の塩を含む洗浄液で前記担体を１回以上洗浄することにより糖鎖付加異性体を除去すること、及び
　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まないｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
前記方法。
（２４）　（２２）又は（２３）に記載の製造方法により製造された抗体組成物。
（２５）　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する抗ｈＤＬＫ－１抗体粗精製物から、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加した糖鎖付加異性体を除去する方法であって、
　抗体粗精製物を疎水性相互作用クロマトグラフィ担体に負荷して、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を前記担体に吸着させること、
　前記担体を洗浄液で洗浄すること、及び、
　前記担体から溶出液で溶出させることにより、前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含む、
前記方法。
（２６）　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体組成物であって、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を、全抗体の９５％以上含有する、前記抗体組成物。
（２７）　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体であって、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない、前記抗体。
　本発明は、抗体の糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加した糖鎖付加異性体を低減・除去することが可能である。
　本願発明の第一の効果としては、糖鎖付加異性体の割合が減少した医療用抗体組成物の提供を行うことができる。これにより当該方法により精製され糖鎖付加異性体が低減された高純度の抗体組成物は、より純度の高い医薬品製剤とすることができる。
　本願発明の第二の効果としては、糖鎖付加異性体を除去した医療用抗体組成物の提供を行うことができる。これにより活性本体の純度の非常に高い組成物、すなわち有効性と安全性において優れる医薬組成物として提供することができる。
　特に、本発明において精製された抗ｈＤＬＫ－１抗体の精製組成物は、活性を持たない不純物である糖鎖付加異性体が除去されていることから、有効性と安全性において優れる医薬組成物として提供することができる。
ヒト化抗ｈＤＬＫ－１モノクローナル抗体を産生する細胞の培養液から取得した粗精製物のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析パターンを示すグラフである。 ヒト化抗ｈＤＬＫ－１モノクローナル抗体を一過性発現したＣＨＯ細胞による培養上清のＰｒｏｔｅｉｎ　Ａ精製後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の結果を示す写真である。 Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ疎水性相互作用クロマトグラフィ担体による抗体組成物の分離プロファイルを示すグラフである。 Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ担体で分離した精製抗体組成物のＨＩＣ－ＨＰＬＣによる純度分析試験の結果を表すグラフ及び表である。表中のＰｅａｋ１及びＰｅａｋ２は糖鎖付加異性体抗体（Ｐｅａｋ１は４本のポリペプチド鎖の１か所のＣＤＲに糖鎖が結合、Ｐｅａｋ２は２か所のＣＤＲに糖鎖が結合）、Ｐｅａｋ３は糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が結合した抗体の割合（％）を示す。 Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ担体による抗体組成物の分離プロファイルを示すグラフである。 Ｐｏｒｏｓ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体による抗体組成物の分離プロファイルを示すグラフである。 ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体を用いたクロマトグラフィ条件の最適化による糖鎖付加異性体含量の制御を実験計画法により解析した結果を表すグラフである。 抗体組成物の精製プロセスにおけるクロマトグラフィステップのシーケンスを表す図である。 疎水性相互作用クロマトグラフィにおける洗浄液量を変化させたときの溶出パターン及び収率と純度を示すグラフである（上図：洗浄液１が６ＣＶで洗浄液２が５ＣＶの条件、中図：洗浄液１が８ＣＶで洗浄液２が５ＣＶの条件、下図：洗浄液１が１５ＣＶで洗浄液２が５ＣＶの条件）。 ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析を用いた抗体粗精製物の精密分取による単離成分の分析データを示す。（ａ）単離前の抗体粗精製物のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。（ｂ）（ａ）のＨＩＣ－ＨＰＬＣにおいてメインピークとして分取された画分のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。（ｃ）（ａ）のＨＩＣ－ＨＰＬＣにおいて前ピークとして分取された画分のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析の結果を示す。 糖鎖付加異性体のＡＤＣＣ活性を評価した結果を表すグラフである。縦軸がＡＤＣＣ活性を示す蛍光強度、横軸は抗体濃度を示す。丸は図９（ｂ）のメインピークとして分取された画分（糖鎖付加異性体を含まない成分）、四角は図９（ｃ）の前ピークとして分取された画分（糖鎖付加異性体）、三角は図９（ａ）の単離前の抗体粗精製物の結果を示す。 ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１のＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号３７）とアミノ酸配列（配列番号３８）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。 ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－２のＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号４１）とアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。 Ｌ鎖（κ鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６９）とアミノ酸配列（配列番号７０）を示す。図中、アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。 ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ｔ７３ＫのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号５３）とアミノ酸配列（配列番号５４）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。上記ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ｔ７３ＫのＶＨの推定アミノ酸配列（配列番号１８）中、Ｎ末端から１９アミノ酸からなるペプチドはシグナルペプチドである。ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ｔ７３ＫのＶＨの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号１９に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号２０に示す。 ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＨ鎖（γ１鎖）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６１）とアミノ酸配列（配列番号６２）を示す。アミノ酸は一文字表記で表し、ターミネーションコドンの位置は“・”で示している。上記ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＶＨの推定アミノ酸配列（配列番号２２）中、Ｎ末端から１９アミノ酸からなるペプチドはシグナルペプチドである。ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＶＨの成熟ペプチドのｃＤＮＡ塩基配列は配列番号２３に示し、その推定アミノ酸配列は配列番号２４に示す。 ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ１、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ１　Ａ２４Ｇ、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ１　Ｔ７３Ｋ、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ１　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋ、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ２、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ２　Ａ２４Ｇ、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ２　Ｔ７３Ｋ、及びＨｕＢＡ－１－３Ｄ－ＶＨ２　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３Ｋのアミノ酸配列アラインメントを示す図である。カッコ内は配列表における配列番号を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2021-079977号明細書（令和3年（2021年）5月10日付け出願）の全体を包含する。本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
　本明細書において、「糖鎖付加コンセンサス配列」又は「糖鎖結合コンセンサス配列」とは、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）で示されるアミノ酸配列を意味し、抗体中におけるこの配列の位置、及びＡｓｎの存在する位置は問わない。本明細書において、「Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域」、「糖鎖付加コンセンサス領域」又は「糖鎖結合コンセンサス領域」とは、抗体のＦｃ部分に存在する通常Ａｓｎ２９７を含む糖鎖付加コンセンサス配列（代表的には、Ａｓｎ２９７－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸））をいう。糖鎖付加コンセンサス配列、及び糖鎖付加コンセンサス領域をコードする塩基配列は、当該アミノ酸配列をコードする配列であれば如何なるものも含まれる。
　本明細書において「糖鎖付加異性体」とは、糖鎖付加コンセンサス領域以外のアミノ酸に糖鎖が付加している抗体を意味する。糖鎖付加コンセンサス領域以外のアミノ酸に付加している糖鎖を「非コンセンサス糖鎖」という。糖鎖付加異性体において非コンセンサス糖鎖が結合している領域としては、Ｆａｂ領域、抗原との結合領域であるＦｖ（可変）領域、ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ（ＣＤＲ）領域、糖鎖付加コンセンサス領域以外のＦｃ領域、及び融合抗体における融合配列部分が含まれ、代表的には、ＣＤＲ領域である。非コンセンサス糖鎖の糖鎖付加コンセンサス領域以外のアミノ酸への糖鎖結合様式としては、糖鎖付加コンセンサス配列であるＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸）へのＮ型糖鎖でも良いし、Ｓｅｒ又はＴｈｒへのＯ型糖鎖でも良い。
　抗体分子の構造は、通常、ヘテロテトラマーであり、２種類の同一ポリペプチド鎖が２個ずつ結合して形成されているため、非コンセンサス糖鎖の結合部位としては理論的に抗体１分子中に２の倍数か所ずつ存在することになる。本発明の精製対象となる抗体粗精製物は、１個以上の非コンセンサス糖鎖を有する抗体を含んでいればよい。抗体１分子当たりの非コンセンサス糖鎖の結合数は、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上であってもよい。また、抗体は４本（通常は重鎖２本及び軽鎖２本）のポリペプチド鎖からなるところ、いずれか１本に結合している非コンセンサス糖鎖の結合数が、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、又は１０個以上であってもよい。抗体粗精製物中の非コンセンサス糖鎖の結合可能領域への糖鎖の結合割合率、すなわち、糖鎖付加異性体の存在割合としては、抗体１分子中の片方の「重鎖と軽鎖の組み合わせ」又はそれに該当する構造への非コンセンサス糖鎖が完全に結合している場合を１００％とした場合、抗体１分子あたり、０．１％以上２００％以下であってよく、通常、本発明の方法を適用する必要のある場合は、１％以上５０％以下である。ここで、２００％とは、１分子の抗体において、対となる「重鎖と軽鎖の組み合わせ」の両方（２か所）に非コンセンサス糖鎖が結合していることを意味する。
　本明細書において「抗体」は、全長抗体の他、抗体断片、全長抗体又は抗体断片と他の物質との融合物を含み、例えば、マウス抗体、マウス－ヒトキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、及び、これらのアミノ酸改変体、付加体、欠失体、置換体、糖鎖改変体などを含む。抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラス（アイソタイプ）であってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体がＩｇＧの場合、いずれのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であってもよい。抗体断片は、好ましくは抗原結合性断片であり、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２、若しくは（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体を含む。抗体断片と他の物質との融合物としては、融合タンパク質、特にはＦｃ融合タンパク質などが挙げられる。
　特には、本明細書における抗体としては、重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体を意味する。好ましくは、重鎖が配列番号４、８、１６、２０、２４、２８、３２及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体である。
　本明細書において、精製対象となる糖鎖付加異性体を含む抗体組成物は、「抗体粗精製物」という。抗体粗精製物は、糖鎖付加異性体を含む限り、如何なるものでも利用することができる。例えば、抗体粗精製物として、血漿など生体由来組成物又はその処理物、及び抗体遺伝子が組み込まれた形質転換細胞の培養液（培養上清であってもよい、以下同様）又はその処理物があげられる。生体由来組成物としては、トランスジェニック非ヒト動物あるいは植物などから得られた抗体を含む組成物などがあげられる。形質転換細胞としては、糖鎖を結合できる細胞であれば何れでも良く、具体的には、動物細胞、植物細胞あるいは酵母細胞などの糖鎖を結合できる性質を有する細胞株、さらに具体的には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスミエローマ細胞であるＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ラットミエローマ細胞であるＹＢ２／０細胞、ＩＲ９８３Ｆ細胞、シリアンハムスター腎臓由来であるＢＨＫ細胞、ヒト胎児腎由来である２９３細胞、ヒトミエローマ細胞であるナマルバ細胞、胚性幹細胞、又は、受精卵細胞などに抗体遺伝子を導入した細胞があげられる。前述の細胞株としては、初代不死化細胞株から派生した種々の亜種を利用することも可能である。例えば、ＣＨＯ細胞であれば、ＣＨＯ　Ｋ１株、ＣＨＯ　ＤＧ４４株、ＣＨＯ　Ｓ株及びこれらの派生株などを利用できる（Ｐａｌｓｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３１（８），７５９－７６５，２０１３）。これらの細胞を、タンパク質の生産に適した培地で培養することで、培養液として抗体粗精製物が得られる。用いられる培地としては、例えば、血清含有培地、血清アルブミンあるいは血清分画物などの動物由来成分を含まない培地、無血清培地又は無タンパク質培地など、いずれの培地も用いられるが、好ましくは無血清培地、動物由来原料不含培地、無タンパク質培地、完全化学合成培地が用いられる。
　更に、上記抗体粗精製物としては、ろ過、塩析、１種類以上のクロマトグラフィ、ｐＨ調整、緩衝液置換、濃縮、希釈などの処理を行った生体由来組成物や培養液や、生体由来組成物や培養液に対して精製等の操作を行った中間体組成物などの組成物を利用することもできる。精製操作を行った中間体組成物としては、抗体医薬品の製造プロセスを構築するための何れの単位操作の後の溶液であっても利用できる。たとえば、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィ後、陽イオン交換クロマトグラフィ後、陰イオン交換クロマトグラフィ後、緩衝液交換後、低ｐＨ処理後、ろ過後の組成物などが望まれる。
　Ｎ型糖鎖の場合、糖鎖付加異性体の存在する可能性については当該抗体のアミノ酸配列又は遺伝子配列から推定することができる。また、糖鎖の型によらず、抗体のペプチドマッピング及び質量分析により、糖鎖結合位置を推定することができる。より簡便な方法としては、ペプチド－Ｎ－グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）処理した抗体と当該処理を行わない抗体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）して比較することにより、タンパク質の泳動帯の変化として糖鎖の結合を観察することができる。
　抗体の種類としては、前記に示した通りであるが、本方法は、治療用、診断用又は予防用抗体を含む抗体医薬品としての抗体の生産における精製方法として適している。抗体医薬品は、含まれる抗体の異性体の含量に恒常性があることが必要とされ、目的物質由来不純物は可能な限り低減されることが必要であるためである（ＩＣＨ　Ｑ６Ｂガイドライン）。治療用又は予防用抗体の例としては、リガンドに結合しリガンドの活性を中和する抗体、細胞表面の受容体に結合してリガンドの結合を中和する抗体、細胞表面に結合して細胞自身へ傷害活性を示す抗体があげられる。診断用抗体の例としては、リガンド又は細胞表面の受容体に結合する抗体があげられる。細胞への傷害活性としては、抗体依存性細胞傷害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、補体依存性細胞傷害活性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞貪食（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）活性などが挙げられる。また、抗体－薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｒｕｇ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、放射性標識抗体（Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅ－ｌａｂｅｌｌｅｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）などの化学修飾抗体、サイトカイン等との融合抗体、多重特異性抗体（Ｍｕｌｔｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）（Ｎａｔｕｒｅ，　５８０（１６），　３３０－３３８　（２０２０））など、糖鎖を有する抗体誘導体であれば本発明の技術を利用できる。
　更に具体的には、ＣＤ３、ＥＧＦ受容体、ＣＤ２０、ＲＳウイルス、ＴＮＦα、ＣＤ２５、ＩＬ－６受容体、ＣＤ３３、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、補体Ｃ５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１β、ＲＡＮＫＬ、ＣＣＲ４、ＨＥＲ２、ＣＤ３０、ＩＬ－５、ＩＬ－５受容体、α４インテグリン、α４β７インテグリン、ＰＤ－１、ＣＤ５２、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７受容体、ＣＴＬＡ－４、ＰＣＳＫ９、ＳＬＡＭＦ７、ＢｌｙＳ、ＣＤ３８、ＰＤ－Ｌ１、ＩＬ－４α受容体、ＣＤ２２、ＣＤ２３、第ＩＸａ因子、Ｘ因子、ＣＤ１９、スクレロスチン、ＤＬＫ－１などのタンパク質抗原（好ましくは、ヒトに由来のタンパク質抗原）に対する抗体の精製に本方法を利用することが可能である。融合タンパク質としては、可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合タンパク質、ＣＴＬＡ４改変Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ－ＴＰＯＲアゴニストペプチド融合タンパク質、ＶＥＧＦ受容体－Ｆｃ融合タンパク質などがあげられる。これらの如何なる抗体あるいは融合タンパク質等の精製に本方法を利用することが可能である。
　最も望ましい事例の一つは、抗ＤＬＫ－１抗体の精製である。具体的には、前掲の特許文献４（ＷＯ２０１４／０５４８２０）に記載されているヒト化抗ヒトＤＬＫ－１抗体であり、例えば、配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖（特にはこれらのアミノ酸配列を可変領域として有する重鎖、本段落において以下同様）、及び配列番号１０又は１２に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖（特にはこれらのアミノ酸配列を可変領域として有する軽鎖、本段落において以下同様）を含む抗体を挙げることができ、好ましくは、配列番号４、８、１６、２０、２４、２８、３２及び３６から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号１２に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体である。このようなヒト化抗ヒトＤＬＫ－１モノクローナル抗体は、その軽鎖の可変領域に糖鎖結合コンセンサス配列を有する。
　以下の表１及び２は、前掲の特許文献４（ＷＯ２０１４／０５４８２０）に記載されている抗ヒトＤＬＫ－１抗体の全長配列を含むものである（下線はシグナル配列を示す。成熟タンパク質においては下線部の配列を含まない。）が、例えば当該抗体においては、四角い枠で囲まれたＮＳＳ配列のＮが糖鎖結合コンセンサス配列となる。そのため、動物細胞等にこの遺伝子を発現させた場合、糖鎖付加異性体を含む糖鎖組成物が生成する可能性がある。同様に、当該抗ＤＬＫ－１抗体の配列に類似する配列を有するＤＬＫ－１抗体も同様の可能性を有する。こうした糖鎖付加異性体を含む抗体粗精製物から糖鎖付加異性体を除去又は低減する方法として本方法は有用である。なお、以下の表に記載された、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１のＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－２のＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ａ２４ＧのＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－２　Ａ２４ＧのＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ｔ７３ＫのＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－２　Ｔ７３ＫのＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－１　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＨ鎖、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ－２　Ａ２４Ｇ／Ｔ７３ＫのＨ鎖、及びＨｕＢＡ－１－３ＤのＬ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号３８，４２，４６，５０，５４，５８，６２，６６，及び７０に記載されている。また、これらの配列からシグナル配列を除いた成熟タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号４０，４４，４８，５２，５６，６０，６４，６８，及び７２に記載されている。本願明細書等において、「Ｈ鎖」は重鎖、「Ｌ鎖」は軽鎖を意味する。
　ＨｕＢＡ－１－３Ｄ　ＶＨ１及びＨｕＢＡ－１－３Ｄ　ＶＨ２のＣＤＲ１のアミノ酸配列は「ＤＹＡＭＨ」（配列番号７３）、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は「ＶＩＳＴＹＹＧＮＴＮＹＮＱＫＦＫＧ」（配列番号７４）、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は「ＧＧＬＲＥＹＹＹＡＭＤＹ」（配列番号７５）である。また、ＨｕＢＡ－１－３Ｄ　ＶＬのＣＤＲ１のアミノ酸配列は「ＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＮＹＬＡ」（配列番号７６）、ＣＤＲ２のアミノ酸配列は「ＦＡＳＴＲＥＳ」（配列番号７７）、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は「ＱＱＨＹＳＴＰＰＴ」（配列番号７８）である。本発明の抗体は、これらのＣＤＲの全部又は一部を有する抗体であってもよい。なお、これらＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔｓ，Ｆｉｆｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ．９１－３２４２，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）の定義に従った。本願明細書等において、「ＶＨ」は重鎖可変領域、「ＶＬ」は軽鎖可変領域を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　抗体粗精製物と比較して糖鎖付加異性体の含有量が減少した抗体組成物（本明細書において、「精製抗体組成物」という）は、糖鎖付加異性体を含む抗体粗精製物を出発原料として、コンベンショナルクロマトグラフィに供することで得られる。よって、本発明は、抗体粗精製物の精製方法であって、前記抗体粗精製物をコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を前記担体に吸着させること、及び前記担体を溶出液で溶出させることにより、前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、得られた精製抗体組成物における、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加した糖鎖付加異性体の含有量が、精製前の抗体粗精製物と比較して減少している方法に関する。
　コンベンショナルクロマトグラフィで使用する担体としては、疎水性相互作用クロマトグラフィ担体、疎水クロマトグラフィ担体、若しくは、ミックスモードクロマトグラフィ担体（マルチモードクロマトグラフィ担体ともいう、好ましくは疎水クロマトグラフィの性質をもつミックスモードクロマトグラフィ担体）を利用することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィ担体としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、オクチル基、ヘキシル基、プロピレングリコール基、フェニル基、アルキルフェニル基、ベンジル基、アルキルベンジル基などの疎水性官能基をベース基材に結合したものを用いることができる。ミックスモードクロマトグラフィ担体としては、前記の疎水性官能基とイオン交換性の官能基を任意の割合で混合したものが挙げられる。例えば、Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミンなどを官能基として利用することができる。陽イオン交換性の官能基の代表的なものにはＣＭ（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ）、ＳＰ（Ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ、－Ｏ－Ｃ３Ｈ６－ＳＯ３Ｈ）などが挙げられ、陰イオン交換性の代表的なものにはＤＥＡＥ（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙ、－Ｏ－Ｃ２Ｈ４－Ｎ－（Ｃ２Ｈ５）２）、ＱＡＥ（Ｑｕａｔｅｒｎｉｚｅｄ　ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ又はＤｉｅｔｈｙｌ－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ、－Ｏ－Ｃ２Ｈ４－Ｎ－（Ｃ２Ｈ５）２（ＣＨ２－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨ２））などが挙げられ、これらを利用できる。担体の基材としてはセルロース、セファデックス、架橋アガロース、ポリアクリドアミド、メタクリレート及び各種合成ポリマーが挙げられる。担体は細孔があってもなくても、何れでも利用できる。ミックスモードクロマトグラフィ担体の別の形態としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）やフルオロアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６Ｆ２）のようにリン酸カルシウム等の官能基を持つものが挙げられる。
　クロマトグラフィ担体は市販品として入手して利用することができる。具体的には、Ｂｕｔｙｌ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（平均粒子径９０μｍ）、Ｂｕｔｙｌ－Ｓ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（平均粒子径９０μｍ）、Ｏｃｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　４　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（平均粒子径９０μｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　（ｈｉｇｈ　ｓｕｂ）（平均粒子径９０μｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ｌｏｗ　ｓｕｂ）（平均粒子径９０μｍ）、Ｂｕｔｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（平均粒子径９０μｍ）、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（平均粒子径９０μｍ）、ＳＯＵＲＣＥ　１５ＥＴＨ（平均粒子径１５μｍ）、ＳＯＵＲＣＥ　１５ＩＳＯ（平均粒子径１５μｍ）、ＳＯＵＲＣＥ　１５ＰＨＥ（平均粒子径１５μｍ）、Ｃａｐｔｏ　Ｐｈｅｎｙｌ（Ｈｉｇｈ　Ｓｕｂ）（平均粒子径９０μｍ）、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ（平均粒子径９０μｍ）、Ｃａｐｔｏ　Ｏｃｔｙｌ（平均粒子径９０μｍ）、Ｃａｐｔｏ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＩｍｐＲｅｓ（平均粒子径３６－４４μｍ）、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ　ＩｍｐＲｅｓ（平均粒子径３６－４４μｍ）、Ｃａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ（平均粒子径９０μｍ）、Ｃａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ　ＩｍｐＲｅｓ（平均粒子径３６－４４μｍ）、Ｃａｐｔｏ　ＭＭＣ（平均粒子径９０μｍ）、Ｃａｐｔｏ　ＭＭＣ　ＩｍｐＲｅｓ（平均粒子径３６－４４μｍ）、Ｃａｐｔｏ　Ｃｏｒｅ　７００（平均粒子径９０μｍ）、ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ　Ａｄｓｏｒｂｅｒ　Ｐｈｅｎｙｌ（以上、Ｃｙｔｉｖａ社、英国）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　Ｂｕｔｙｌ－６００（平均粒子径４０－９０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　Ｐｈｅｎｙｌ－６００（平均粒子径４０－９０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　ＰＰＧ－６００（平均粒子径４０－９０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　Ｂｕｔｙｌ－６５０（平均粒子径４０－９０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　Ｐｈｅｎｙｌ－６５０（平均粒子径４０－９０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　ＳｕｐｅｒＢｕｔｙｌ－５５０（平均粒子径４０－９０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　Ｈｅｘｙｌ－６５０（平均粒子径５０－１５０μｍ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）　Ｅｔｈｅｒ－６５０（平均粒子径４０－９０μｍ）（以上、東ソー社製）、ＰＯＲＯＳ　Ｅｔｈｙｌ（平均粒子径５０μｍ）、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ（平均粒子径５０μｍ）、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ（平均粒子径５０μｍ）（以上、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ　ｔ－Ｂｕｔｙｌ　ＨＩＣ（平均粒子径５０μｍ）、Ｍａｃｒｏ－Ｐｒｅｐ　Ｍｅｔｈｙｌ　ＨＩＣ（平均粒子径５０μｍ）、セラミックハイドロキシアパタイト（平均粒子径２０－８０μｍ）、セラミックフルオロアパタイト（平均粒子径２０－８０μｍ）、バイオゲルＨＴ（平均粒子径２０－８０μｍ）（以上、バイオ・ラッド社製）、ＱＭＡ　Ｓｐｈｅｒｏｓｉｌ（平均粒子径５０μｍ）、Ｍｅｔｈｙｌ　Ｃｅｒａｍｉｃ　Ｈｙｐｅｒ　Ｄ（平均粒子径５０μｍ）（以上、ポール社製）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＥＭＤ　Ｐｈｅｎｙｌ　（Ｓ）（平均粒子径２０－９０μｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ　ＥＭＤ　Ｐｒｏｐｙｌ　（Ｓ）（平均粒子径２０－９０μｍ）（以上、メルク社製）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｐｈｅｎｙｌ（平均粒子径４０－１３０μｍ）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｐｈｅｎｙｌ　ＬＳ（平均粒子径４０－１３０μｍ）、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ　ＭＡＸ　Ｂｕｔｙｌ（平均粒子径４０－１３０μｍ）（以上、ＪＮＣ社製）、ブチル化キトパール、フェニル化キトパール（以上、富士紡ホールディングズ社製）等の担体が挙げられ、これらの担体からより適切な担体が選択され、使用される。より好ましくは、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ、ＰＯＲＯＳ　Ｂｕｔｙｌ　Ｕｌｔｒａなどの担体である。
　本発明の精製目的で使用されるクロマトグラフィ担体の平均粒子径は、１５μｍ以上、２０μｍ以上、３０μｍ以上、又は４０μｍ以上とすることができる。また、クロマトグラフィ担体が処理できる抗体粗精製物の液量としては、１００ｍＬ以上、１Ｌ以上、１０Ｌ以上、又は１００Ｌ以上とすることができる。この担体を充填したクロマトグラフィ用カラムは１００ｍＬ～１，０００Ｌ程度（直径５ｃｍ～２ｍ程度）までの容量のものが使用できる。クロマトグラフィ精製に供される抗体粗精製物の量は、少なくとも１Ｌ以上であり、望ましくは１０Ｌ以上、より望ましくは１００Ｌ以上、更に望ましくは５００Ｌ以上、最大２０，０００Ｌ程度までである。このような大量の抗体粗精製物を処理することが必要となるため、クロマトグラフィにおける線流速は１，０００ｃｍ／ｈｒ以下、望ましくは５００ｃｍ／ｈｒ以下である。精製に供される抗体の量としてはタンパク質量として１０ｇ以上であり、望ましくは１００ｇ以上、より望ましくは１ｋｇ以上、更に望ましくは１０ｋｇ以上である。本技術で除去又は低減すべき糖鎖付加異性体は、クロマトグラフィで溶出される抗体のうち前半の画分に含まれ、目的とする所望の抗体を後半の画分に溶出することで、糖鎖付加異性体を分別・除去するものである。
　糖鎖付加異性体を含む抗体粗精製物をコンベンショナルクロマトグラフィに負荷する条件としては、少なくとも目的の成分である糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が付加した抗体（非糖鎖付加異性体抗体）をクロマトグラフィ担体に吸着できる条件が必要である。抗体の吸着は抗体及びクロマトグラフィ担体の疎水性・親水性の程度からなる相互作用により生じる。緩衝液としては、疎水性相互作用クロマトグラフィ、疎水クロマトグラフィ、ミックスモードクロマトグラフィに通常使用する緩衝液を利用できる。抗体がクロマトグラフィの条件において安定であれば何れでも良く、たとえば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、アミノ酸緩衝液、及び、これらの混合緩衝液があげられる。これらの緩衝液の濃度は、０．１ｍＭ～３００ｍＭ程度の一般的に使用される範囲で任意に選択可能である。緩衝液のｐＨは、ｐＨ４～８の範囲で任意に選択できるが、ｐＨ４～６が望ましい。
　これらの緩衝液に、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの塩類を、抗体が沈殿を生成しない程度に必要に応じて適量加え、前記のクロマトグラフィ担体との相互作用を増強させることで、クロマトグラフィ担体への吸着を行うことができる。前記の塩類は任意に１種類以上から選択することができ、塩濃度としては、３００ｍＭ～２Ｍの範囲で抗体が安定に存在し、クロマトグラフィ担体に抗体が十分吸着できる濃度が使用される。１Ｍ程度の塩濃度が好ましく、抗体を吸着可能な低い塩濃度が好まれる。単位量あたりのクロマトグラフィ担体に吸着できる抗体の量は、クロマトグラフィ担体の種類や緩衝液の条件により様々であるが、担体１ｍｇあたり１０ｍｇ以上の抗体、好ましくは担体１ｍｇあたり２０ｍｇ以上の抗体を吸着させることができる。クロマトグラフィの操作は０℃～４０℃の任意の温度で実施可能である。室温での操作が望ましく、温度が管理された条件での操作がより望ましい。
　前述の条件において、糖鎖付加異性体を含む抗体粗精製物がクロマトグラフィに負荷された後、溶出により分離精製が行われる。クロマトグラフィによる糖鎖付加異性体の分離は、抗体をクロマトグラフィ担体に吸着させた後、段階的、連続的、又はそれらを組合せて、カラムに流す緩衝液の塩濃度を低下させるか、ｐＨを上げるか、導電率を低下させるか、又はこれらの組合せで行うことができる。クロマトグラフィ担体に抗体を吸着させた後、まず糖鎖付加異性体を主に溶出させ、次いで、糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が付加した抗体（非糖鎖付加異性体抗体）を溶出させることで、目的とする精製抗体組成物を調製することができる。「溶出」とはクロマトグラフィ担体に疎水性相互作用等で結合した抗体成分の担体への結合を弱め、クロマトグラフィ担体から当該抗体成分を排出することをいう。糖鎖付加異性体を溶出させる条件としては、糖鎖付加異性体とクロマトグラフィ担体との相互作用が、非糖鎖付加異性体抗体とクロマトグラフィ担体との相互作用と比較して十分弱い緩衝液の条件である。当該条件の当該緩衝液を十分量用いてクロマトグラフィ担体を洗浄することで、目的の抗体である非糖鎖付加異性体抗体のみをクロマトグラフィ担体に吸着させたまま糖鎖付加異性体のみを溶出除去することができる。
　糖鎖付加異性体を溶出除去する（洗浄する）ための緩衝液は、非糖鎖付加異性体抗体を溶出する緩衝液との間で、１０ｍＭ以上の塩濃度の違い、及び／又は、０．２ユニット以上のｐＨの違いがあれば何れの緩衝液も利用できる。非糖鎖付加異性体抗体をクロマトグラフィ担体に高塩濃度（通常３００ｍＭ～２Ｍの範囲となる）で吸着させた後、クロマトグラフィ担体を洗浄する洗浄液の塩濃度は、溶出させる塩濃度に対して同等以上の範囲とすることができる。例えば、抗体を溶出させる際の塩濃度に対して、同等又は同等から１Ｍ高い塩濃度までの範囲、若しくは、同等から０．５Ｍ高い塩濃度までの範囲、又は、抗体を溶出させる際の塩濃度よりも１０ｍＭ以上高い塩濃度とすることができ、例えば、０．５Ｍ以上又は１．０Ｍ以上とすることができる。洗浄液のｐＨは、抗体を吸着させる際のｐＨに対して、同等又は最大２ユニット高いｐＨまでの範囲、あるいは、溶出時のｐＨに対して、同等又は最大２ユニットまでの低い範囲とすることができる。例えば、洗浄液のｐＨは、溶出液のｐＨより０．２ユニット低いｐＨであってよい。洗浄液のｐＨは、ｐＨ４～８の範囲内であってよい。また、糖鎖付加異性体を溶出除去するための緩衝液（洗浄液）の通液量としては、クロマトグラフィ担体容量に対して２担体容量（ＣＶ）以上、３ＣＶ以上、４ＣＶ以上、５ＣＶ以上、１０ＣＶ以上、１５ＣＶ以上、又は２０ＣＶ以上、あるいは５～２０ＣＶ、５～１５ＣＶ、５～１０ＣＶ、又は１０～２０ＣＶとすることができる。
　抗体粗精製物の負荷から洗浄までのｐＨ及び／又は塩濃度の変化は段階的（一段階若しくはそれ以上、二段階若しくはそれ以上、三段階若しくはそれ以上、数段階など）であってもよいし、連続的であってもよい。抗体粗精製物の負荷から洗浄までのｐＨの範囲は通常４～６の範囲内である。
　上記塩濃度、ｐＨ、及び／又は洗浄液量の条件は原料として用いる抗体粗精製物中の糖鎖付加異性体の含量、及び、抗体の等電点やアミノ酸配列などの抗体そのものの特性などに応じて適宜設定することができる。
　本明細書における、クロマトグラフィによる糖鎖付加異性体の分離方法は、糖鎖付加異性体をクロマトグラフィ担体から素通り（フロースルー）させること、次いで、糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が付加した抗体を溶出させることを含んでいてもよく、これにより、非糖鎖付加異性体抗体の純度の高い精製抗体組成物を調製することも可能である。素通り（フロースルー）とは、クロマトグラフィ担体を充填したカラムに抗体粗精製物を負荷した際に、糖鎖付加異性体をクロマトグラフィ担体に吸着させずにそのままカラム外へ溶出させることをいう。この場合、抗体粗精製物中の糖鎖付加異性体はクロマトグラフィ担体との弱い相互作用を有する場合があるが、平衡化緩衝液（望ましくは１カラム容量以上）を連続あるいは断続的に通液することで、不要な糖鎖付加異性体を含む成分をカラム外に排除することができる。糖鎖付加異性体を特異的に素通りさせるための緩衝液としては、糖鎖付加異性体とクロマトグラフィ担体との相互作用が、糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が結合した抗体とクロマトグラフィ担体との相互作用と比較して十分弱い条件の緩衝液を選択する。十分量の当該緩衝液を用いてクロマトグラフィ担体から糖鎖付加異性体のみを素通りさせることで、目的の抗体のみをクロマトグラフィ担体に吸着させることができる。次いで、前記緩衝液とは塩濃度等の条件の異なる緩衝液を使用し、結合した抗体をクロマトグラフィ担体から溶出して所望の精製抗体組成物を調製する。
　糖鎖付加異性体のみを素通りさせる緩衝液としては、糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が結合した抗体を溶出する溶出液と比較して、１０ｍＭ以上の塩濃度の違い（１０ｍＭ以上高い塩濃度）、及び／又は、０．２ユニット以上のｐＨの違い（０．２以上低いｐＨ）があれば何れの緩衝液も素通り用洗浄液として利用できる。緩衝液の塩濃度は、非糖鎖付加異性体抗体を担体から溶出させる塩濃度に対して、同等又は１Ｍ高い塩濃度までの範囲（好ましくは０．５Ｍ高い塩濃度までの範囲）とすることができる。この際の塩濃度は、通常、抗体を溶出させる塩濃度に対して１００％以上の範囲となる。あるいは、抗体の吸着時のｐＨに対して同等又は最大２ユニットまでの高いｐＨの範囲での洗浄液、若しくは、溶出時のｐＨに対して同等又は最大２ユニットまでの低いｐＨの範囲の洗浄液で洗浄する。ｐＨ又は／及び塩濃度の変化は一段階でも数段階でもよく、連続的でもよい。また、通常、当該緩衝液の塩濃度やｐＨは、原料となる抗体粗精製物をクロマトグラフィ担体にかける前に適切な範囲に調製される。糖鎖付加異性体を素通りさせるための緩衝液（洗浄液）の通液量としては、クロマトグラフィ担体量の２倍以上、望ましくは５倍以上の条件を選択する。洗浄液の通液量として更に望ましくは１０～２０倍以上である。上記塩濃度、ｐＨ、又は／及び、洗浄液量は原料に用いる抗体粗精製物中の糖鎖付加異性体の含量に応じて適宜設定する。
　クロマトグラフィ担体への抗体粗精製物中の抗体の負荷量、すなわち、タンパク質の負荷量は、糖鎖付加異性体の分離能に影響するため、得られる精製抗体組成物が所望の収率及び純度（糖鎖付加異性体の含有量）になるように、クロマトグラフィ担体あたりのタンパク質負荷量を決定する。通常、クロマトグラフィ操作において、タンパク質を担体に吸着できる量には限界があり、最大動的吸着容量（ＤＢＣ：Ｄｙｎａｍｉｃ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｃａｐａｃｉｔｙ）などのパラメータを指標にしてクロマトグラフィ操作が管理される。一般的に、最大動的吸着容量以下のタンパク質負荷量とすることで、タンパク質の回収率及び分離能が良好となり所望のクロマトグラフィの分離効果が期待できる。また、本発明の方法では、不要な糖鎖付加異性体が吸着しないように、一定量以上の負荷量とすることが好ましく、少なくともクロマトグラフィ担体１ｇの単位量あたり又はクロマトグラフィ担体１ｍＬの単位量あたり、２０ｍｇ以上、２５ｍｇ以上、３０ｍｇ以上、又は３５ｍｇ以上、かつ最大動的吸着容量以下のタンパク質の負荷を行うことで糖鎖付加異性体の分離・除去を行う。タンパク質の負荷量は、精製しようとする抗体粗精製物中の糖鎖付加異性体の含量に応じて決定することができる。すなわち、クロマトグラフィ精製前の抗体粗精製物における糖鎖付加異性体の含量が多い場合には、最大動的吸着容量に近い負荷量とすることができる。
　一態様において本発明の方法は、使用するコンベンショナルクロマトグラフィ担体を分離に供する抗体の性質に応じて選択するステップ、選択したクロマトグラフィ担体による糖鎖付加異性体の分離除去を最適化するステップを含む。
　クロマトグラフィ担体を選択するステップは、まず、前述した塩濃度及びｐＨ条件下で、任意の２種類以上のクロマトグラフィ担体に精製対象となる抗体粗精製物を負荷し、糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が付加した抗体が吸着した量が多いクロマトグラフィ担体を選択することできる。更に、必要に応じて、塩濃度を段階的又は連続的に低下させた溶出液で溶出して、担体を通過した溶出液中の糖鎖付加異性体及び／又は糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が付加した抗体の量を測定し、糖鎖付加異性体の量が少なく、かつ糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が付加した抗体の量の多い溶出液が得られるクロマトグラフィ担体を、糖鎖付加異性体の分離がより優れたクロマトグラフィ担体として選択することができる。
　選択したクロマトグラフィ担体による糖鎖付加異性体の分離除去の最適化ステップは、負荷時に使用する緩衝液の組成、濃度、及びｐＨ、添加する塩の種類及び濃度、クロマトグラフィ担体への抗体粗精製物の負荷量、洗浄時の緩衝液の組成、濃度、ｐＨ、洗浄回数及び洗浄液量、溶出時の緩衝液の組成、濃度、及びｐＨ、添加する塩の種類及び塩濃度、並びにそれらの変更方法、糖鎖付加異性体の吸着又は素通りによる除去などの条件の検討と選択を行う。これらの最適化のステップは、各々のパラメータについて１つずつ最適化していくこともできるし、実験計画法等の統計解析手法を用いて複数のパラメータの相互作用を含めて最適条件を選定することもできる。
　抗体の精製方法には様々なステップがある。多くの抗体の精製プロセスは２ステップ以上の異なるクロマトグラフィのモードで行われているが、通常、３ステップのクロマトグラフィを利用して精製プロセスが構築されることが多い。例えば、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、ミックスモードクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィなどのうち、２種類以上が組合せて利用されている。本発明の方法は、これらの抗体の精製プロセス中のコンベンショナルクロマトグラフィを利用した抗体のクロマトグラフィの何れのステップにも組み込むことができる。具体的には、第１ステップにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、第２ステップに陽イオン交換クロマトグラフィ、第３ステップに疎水性相互作用クロマトグラフィを利用した精製プロセスにおいて、第３ステップの疎水性相互作用クロマトグラフィを本発明の方法とすることができる。また、第１ステップにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、第２ステップにミックスモードクロマトグラフィ、第３ステップに疎水性相互作用クロマトグラフィを利用した精製プロセスの場合、第３ステップの疎水性相互作用クロマトグラフィを本発明の方法とすることができる。また、第１ステップにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、第二ステップに疎水性相互作用クロマトグラフィ、第三ステップにミックスモードクロマトグラフィを利用した精製プロセスの場合、第２ステップの疎水性相互作用クロマトグラフィを本発明の方法とすることができる。更に、第１ステップにプロテインＡアフィニティクロマトグラフィ、第２ステップに陰イオン交換クロマトグラフィ、第３ステップに疎水性相互作用クロマトグラフィを利用した精製プロセスであれば、第３ステップの疎水性相互作用クロマトグラフィを本発明の方法とすることができる。また、これらのクロマトグラフィのシークエンスにおいて、疎水性相互作用クロマトグラフィと共に、又は疎水性相互作用クロマトグラフィではなく、ミックスモードクロマトグラフィのステップを本発明の方法としてもよい。
　本発明の方法により、糖鎖付加異性体は効率的に除去され、所望の含量にまで低減された量の糖鎖付加異性体を含む精製抗体組成物を提供可能である。本発明の方法により精製後の精製抗体組成物における糖鎖付加異性体の量の全抗体量に対する割合は、１０％以下とすることができ、より望ましくは５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、又は０．２％以下とすることができる。また、精製前の抗体粗精製物が含有する糖鎖付加異性体の量の全抗体量に対する割合は、５０％以上、２０％以上、１０％以上、又は５％以上であってもよい。本発明の方法は、糖鎖付加異性体量が低減された抗体を２０％以上、４０％以上、又は５０％以上のステップ収率で得る方法であってもよい。
　最終精製抗体組成物又は精製後の抗体組成物における、糖鎖付加異性体の含有量及び含有割合、及び精製収率は、前述したクロマトグラフィのパラメータを調整することにより達成することができ、好ましくは、糖鎖付加異性体が任意の量まで低減され、抗体の生産に許容可能な精製収率が得られるように最適化される。
　糖鎖付加異性体の除去状況の確認は、分析評価用の高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）又は超高速液体クロマトグラフィ（ＵＨＰＬＣ：　Ｕｌｔｒａ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により行うことができる。これらの分析には、平均粒子径が１５μｍ以下の担体が使用され、超高流速かつ超高圧でのクロマトグラフィにより糖鎖付加異性体の分離が可能である。例えば、ＴＳＫｇｅｌ　Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲカラム（平均粒子径２．５μｍ、東ソー社）、ＴＳＫｇｅｌ　Ｐｈｅｎｙｌ－５ＰＲカラム（平均粒子径１０又は１３μｍ、東ソー社）、ＴＳＫｇｅｌ　Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷカラム（平均粒子径１０μｍ、東ソー社）、ＴＳＫｇｅｌ　ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ　Ｐｈｅｎｙｌカラム（平均粒子径１０μｍ、東ソー社）、Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐａｋ　Ｈｉ　Ｒｅｓ　ＨＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ社）、ＢｉｏＰｒｏ　ＨＩＣカラム（平均粒子径２．３又は４μｍ、ワイエムシー社）、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｘ　ＨＩＣカラム（平均粒子径１．７又は５μｍ、エムエス機器社）、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ　ＨＩＣカラム（平均粒子径３．５μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ社）、ＭＡｂＰａｃ　ＨＩＣ－１０ＬＣカラム（平均粒子径５μｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＭＡｂＰａｃ　ＨＩＣ－２０ＬＣカラム（平均粒子径５μｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＭＡｂＰａｃ　ＨＩＣ－Ｂｕｔｙｌ　ＬＣカラム（平均粒子径５　μｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ　Ｂｉｏ－ＨＩＣカラム（平均粒子径４μｍ、島津製作所社）、Ｓｈｏｄｅｘ　ＨＩＣ　ＰＨ－８１４（平均粒子径１０μｍ、昭光通商社）、ＣＯＳＭＯＳＩＬ　ＨＩＣ（平均粒子径５μｍ、ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ社）などが適している。
　本発明の方法により精製された精製抗体組成物は、抗体医薬品の活性成分として、ヒト及び動物における種々の疾患の治療薬、予防薬又は診断薬として用いることができる。
　以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが，これは本発明の範囲を限定するものではない。
抗体の糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が結合した抗体粗精製物（培養上清）の調製と組成比の評価
　糖鎖付加抗体として、国際公開第２０１４／０５４８２０号に記載された、Ｈ鎖、及びＬ鎖（本願におけるＨ鎖：配列番号６４、Ｌ鎖：配列番号７２）を有するヒト化抗ヒトＤＬＫ－１モノクローナル抗体（以下、「抗ｈＤＬＫ－１抗体」という）を使用した。この抗体は、その軽鎖の可変領域に糖鎖付加コンセンサス配列を有するため、動物細胞等にこの遺伝子を発現させた場合、糖鎖付加異性体を含む糖鎖組成物が生成・混入する可能性がある。
　抗ｈＤＬＫ－１抗体のアミノ酸配列をコードする遺伝子を有する発現ベクターでＣＨＯ細胞ＤＧ４４株を形質転換し、安定発現細胞株プールＤＧＣ８－Ｒ－Ｔ１１－１４．２ｄを調製した。この細胞株プールを用いて、１ＬスケールのＤＡＳＧＩＰ（登録商標）　Ｐａｒａｌｌｅｌ　Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）バイオリアクタで培養を行った。培養は無血清の完全化学合成培地を用い、１３日間のフェドバッチ法によりｐＨ７、３４℃～３７℃の条件で実施した。この培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａクロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ担体（Ｃｙｔｉｖａ社））で精製し、抗体組成物を得た。
＜抗体組成物のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析＞
　得られた抗体組成物を以下の条件でＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析を行った。
　ＨＰＬＣ装置：Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ　ＨＰＬＣ　Ｓｙｓｔｅｍ（島津製作所）
　分析カラム：ＴＳＫｇｅｌ　Ｂｕｔｙｌ－ＮＰＲカラム（東ソー、００１４９４７；４．６ｍｍ×３．５ｃｍ、平均粒子径２．５μｍ）
　移動相Ａ：２．３Ｍ硫酸アンモニウムを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
　移動相Ｂ：０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
　分析条件：タンパク質濃度２ｍｇ／ｍＬ×１０μＬ注入、グラジエント０～３分；０％
　Ｂ、３～１５分；０～１００％　Ｂ、１５～２０分；１００％　Ｂ、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、検出波長２２０ｎｍ又は２８０ｎｍ
　図１に示す通り、三つのピークが分離され、１３分付近の溶出時間にメインピーク（ピーク３）、１２．５分及び１２．０分付近の溶出時間にそれぞれピーク２及びピーク１が検出された。ピーク３は糖鎖付加コンセンサス領域のみに糖鎖が結合した抗体、ピーク２はピーク３の抗体に糖鎖がもう１か所結合した糖鎖付加異性体、ピーク１はピーク３の抗体に糖鎖がもう２か所結合した糖鎖付加異性体と考えられた（実施例２参照）。この分析結果より、上記プール株細胞を培養して得られた抗体粗精製物には、糖鎖付加異性体が約１０％含まれていることが確認された。
抗体の糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が結合した抗体粗精製物の調製
（培養上清）と糖鎖付加状況の確認
　抗ｈＤＬＫ－１抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列を有する発現ベクター（ｐＦＵＳＥ）、並びに、同抗体の軽鎖の糖鎖結合コンセンサス配列（Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ）の三つ目のアミノ酸に点変異に入れた変異配列（Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ａｌａ）及び重鎖のアミノ酸配列をコードする発現ベクター（ｐＦＵＳＥ）を用いて、それぞれＥｘｐｉＣＨＯ細胞を形質転換し抗体タンパク質の一過性発現を行った。その培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィで精製し、得られた抗体粗精製物をペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ　Ｆ）処理、又は、ＰＮＧａｓｅ　Ｆ非処理後、還元ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（銀染色）で分析した。変異前の抗ｈＤＬＫ－１抗体をＮＳＳ抗体、及び軽鎖の糖鎖結合コンセンサス配列変異後の抗ｈＤＬＫ－１抗体をＮＳＡ抗体と表す。
　その結果、図２に示すように、ＮＳＳ抗体において、ＰＮＧａｓｅ　Ｆで処理しない条件では２５ｋＤａの軽鎖バンドの上に２５ｋＤａより大きい分子量を持つバンドが見られたが、ＰＮＧａｓｅ　Ｆの処理によりそのバンドが消失した。このことから、ＮＳＳ抗体には抗体の糖鎖付加コンセンサス領域以外のコンセンサス配列を有する軽鎖に糖鎖が結合していることが確認された。一方、ＮＳＡにおいてＰＮＧａｓｅ　Ｆの処理の有無にかかわらずそのバンドが見られなかった。これらの結果から、一過性発現由来のヒト化抗ＤＬＫ－１モノクローナル抗体（ＮＳＳ抗体）の粗精製物には軽鎖にも糖鎖が付加した糖鎖付加異性体が含まれることが分かった。
疎水性相互作用クロマトグラフィ担体による糖鎖付加異性体の分離１
　実施例１と同様にして、調製した抗ｈＤＬＫ－１抗体を含む培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィで精製し、糖鎖付加異性体を約１０％含む同抗体の粗精製物を得た。この抗体粗精製物に終濃度１．０Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加した後、ｐＨ５．０に調整しクロマトグラフィ担体への負荷用試料とした。
　当該抗体粗精製物を用い、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ（平均粒子径９０μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）を充填した疎水性相互作用クロマトグラフィカラム（担体容量５ｍＬ）への吸着特性を吸－脱着モードで評価した。カラムへの試料の負荷量は担体あたりのタンパク質量として１５ｍｇ／ｍＬとし、流速は３００ｃｍ／ｈとした。以下の移動相の条件でクロマトグラフィを実施した。
　移動相Ａ：１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム－１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．０）
　移動相Ｂ：２０ｍＭクエン酸ナトリウム－１５ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ５．０）
　１．平衡化：１００％移動相Ａ；１０カラム容量（ＣＶ）
　２．負荷：抗体粗精製物の試料
　３．洗浄：１００％移動相Ａ；１０ＣＶ
　４．線型グラジエント溶出：４０ＣＶで０％移動相Ｂから１００％移動相Ｂまで
　５．カラム洗浄：１Ｍ水酸化ナトリウム；５ＣＶ
　図３に溶出クロマトグラム（ＨＩＣ３８９）を示す。この結果から、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ担体を用いた線形グラジエントの条件で担体への抗体成分の吸着が認められた。カラムへの負荷試料、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌカラムからの素通り画分、及び、同カラムへの吸着画分について、実施例１のＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析法で評価した結果を図４に示す。負荷試料中に２．１％（Ｐｅａｋ１）及び１２．１％（Ｐｅａｋ２）含まれる糖鎖付加異性体は素通り画分（ＨＩＣ３８９　Ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）に除去され、カラムの吸着画分（ＨＩＣ３８９　Ｅｌｕｔｅ）には糖鎖付加異性体が除去された純度１００％の抗体（糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加していない抗体）（Ｐｅａｋ３）組成物が得られた。
　以上の結果から、疎水性相互作用クロマトグラフィ担体（Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ）を使用することで、糖鎖付加異性体を分離可能であることが分かった。選定されたクロマトグラフィ担体を用いると、糖鎖付加異性体が効率的に素通り画分に除去され、吸着画分に高純度の精製抗体組成物を得られることが分かった。
疎水性相互作用クロマトグラフィ担体による糖鎖付加異性体の分離２
　実施例１と同様にして、調製したヒト化抗ヒトＤＬＫ－１モノクローナル抗体を含む培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィで精製し、糖鎖付加異性体を約１０％含む同抗体の粗精製物を得た。この抗体粗精製物に終濃度１．０Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加した後、ｐＨを４．５、４．７、又は５．０に、導電率を７０ｍＳ／ｃｍ以下とし、クロマトグラフィ担体への負荷用試料とした。
　当該抗体粗精製物を用い、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ（平均粒子径９０μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社製）、及び、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ（平均粒子径５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社製）の各々の疎水性相互作用クロマトグラフィカラム（担体容量５ｍＬ）への吸着特性を吸－脱着モードで評価した。各カラムへのタンパク質試料の負荷量は担体あたりのタンパク質量として２０ｍｇ／ｍＬで実施し、流速は３００ｃｍ／ｈとした。以下の移動相の条件でクロマトグラフィを実施した。
　移動相Ａ：１Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、４．７、又は５．０）
　移動相Ｂ：２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、４．７、又は５．０）
　１．平衡化：１００％移動相Ａ；５ＣＶ
　２．負荷：試料溶液
　３．洗浄：１００％移動相Ａ；８ＣＶ
　４．洗浄１：１００％移動相Ａ；５ＣＶ
　５．洗浄２：１００％移動相Ｂ＋０．８Ｍ塩化ナトリウム；５ＣＶ
　６．溶出：１００％移動相Ｂ；１０ＣＶ
　７．カラム洗浄：水（適量）
　８．カラム洗浄：１Ｍ水酸化ナトリウム（適量）
　Ｃａｐｔｏ　ＢｕｔｙｌとＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａの溶出クロマトグラムを、それぞれ図５Ａ及び図５Ｂに示す。いずれのｐＨ条件においても、抗体組成物はＣａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ担体に吸着し、その後溶出可能であった。ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａについても良好な吸着と溶出が認められた。具体的には、図５Ａ及び図５Ｂのグラフにおいて、横軸０～５０ｍＬ付近のピークは吸着されずにカラムから素通りして溶出された抗体（糖鎖付加異性体）であり、５０～３００ｍＬのピークとして溶出された抗体は糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加していない抗体がカラムから徐々に溶出されていることを示す。Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌでは、ｐＨにかかわらず洗浄／溶出の全域にわたって抗体が溶出しており、溶出の中間層を回収することにより糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加していない抗体を純度高く得られることが示された。また、Ｐｏｒｏｓ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａでは、ｐＨに応じてピークが変動する（ｐＨ４．５では抗体が良く吸着して溶出後半にカラムから溶出されるが、ｐＨ５．０では８０％程度が吸着せず洗浄中に抗体が溶出する）ことから、ｐＨに応じて溶出成分をコントロール可能であることが示された。以上の結果から、Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ及びＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａのいずれを用いても糖鎖付加異性体を分離可能であることから、疎水性相互作用クロマトグラフィ担体を用いた糖鎖付加異性体の分離が可能であることが示された。また、この結果から、疎水性相互作用クロマトグラフィにおいて、洗浄／溶出液のｐＨ、塩濃度、及び、液量を最適化することで、抗体組成物を吸着でき、糖鎖付加異性体の除去を達成できることが示された。
疎水性相互作用クロマトグラフィ担体における、負荷時の塩濃度、洗浄時の塩濃度及びｐＨ、溶出緩衝液の種類による、糖鎖付加異性体の除去効率（純度及び収率）の検討
　Ｃａｐｔｏ　ＢｕｔｙｌとＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａクロマトグラフィ担体について、段階的溶出により糖鎖付加異性体が除去可能であるか否かを検討した。負荷液としてはＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィで精製した実施例１の抗体粗精製物を０．５Ｍ　ＴｒｉｓでｐＨ４．５又はｐＨ５．０に調整したものを使用した。パラメータとして、試料負荷液の塩濃度、洗浄液（洗浄液Ｉ、洗浄液ＩＩ）のｐＨ及び塩濃度、並びに、溶出緩衝液の種類及びｐＨを検討し、抗体の収率及び精製画分の非糖鎖付加異性体抗体純度（糖鎖付加コンセンサス領域以外に糖鎖が付加していない抗体の純度）（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析法による糖鎖付加異性体の含量）を測定した。試験結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　各条件で実施したＣａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ担体による精製収率は２３％～７３％であり、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析による精製抗体組成物の純度（糖鎖付加異性体を含まない抗体成分）は９７．１％～９９．３％であった。一方、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体の精製収率はやや低いものの（３３％～６７％）、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析による精製抗体組成物の純度はすべて１００％であった。特に、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体を使用した条件において、０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む試料を負荷し、０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む洗浄液Ｉ、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む洗浄液ＩＩの順で洗浄し、ｐＨ６のクエン酸ナトリウム緩衝液で溶出する条件が、純度及び収率の観点で最適であった。
　また、一連の試験の結果、以下のことが明らかとなった。
（ｉ）洗浄液（洗浄液Ｉ及び／又は洗浄液ＩＩ）のｐＨを上げると純度が向上する。
（ｉｉ）洗浄液（洗浄液Ｉ及び／又は洗浄液ＩＩ）のｐＨを上げると収率が低下する。
（ｉｉｉ）溶出液のｐＨを上げると純度が向上する。
（ｉｖ）溶出液のｐＨを上げると収率が低下する。
（ｖ）負荷液及び／又は洗浄液の塩濃度を下げると収率が低下する。
（ｖｉ）抗体組成物の純度として９５％以上、理想的には９９％以上を達成可能な条件を設定できる。
　以上の結果が示す通り、疎水性相互作用クロマトグラフィ担体（例えば、Ｃａｐｔｏ　ＢｕｔｙｌとＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ）において、負荷液の塩濃度及びｐＨ、洗浄液の塩濃度及びｐＨ、洗浄液量、洗浄回数、溶出時のｐＨ及び緩衝液の種類を最適化することにより、収率及び糖鎖付加異性体の混入量を最適化できることが分かった。
糖鎖付加異性体の混入率及び目的物質の純度及び収率を制御するための洗浄条件の最適化
　実施例１と同様にして調製した抗ｈＤＬＫ－１抗体を含む培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィで精製し、糖鎖付加異性体を約１０％含む同抗体の粗精製物を得た。この抗体粗精製物に終濃度１．０Ｍとなるように塩化ナトリウムを添加した後、ｐＨ及び導電率を適宜調整し、クロマトグラフィ担体への負荷用試料とした。当該抗体粗精製物を用い、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体を用いて、試料の負荷量、洗浄液Ｉ及び洗浄液ＩＩの液量をインプットパラメータとして、アウトプットパラメータである収率及びＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析による純度を評価した。
　その結果、クロマトグラフィ担体単位量あたりのタンパク質負荷量を２５ｇ／Ｌ以上、洗浄液Ｉ及び洗浄液ＩＩを５～１５カラム容量（ＣＶ）に調整することで、９７～１００％の純度で収率を４０～８０％に制御できることが分かった（表４）。特に、タンパク質の負荷量は２５ｇ／Ｌよりも３０ｇ／Ｌ又は３５ｇ／Ｌのほうが得られる精製抗体組成物の純度は高い傾向があった。また、洗浄液量を増大させることで、得られる精製抗体組成物の収率は低下するが純度が向上する傾向があった。この結果は、タンパク質の負荷量が低い条件では、洗浄液量を増やすことで、精製抗体組成物の純度を高められることを示した。
　すなわち、この結果から、クロマトグラフィにおけるタンパク質負荷量を一定以上にすること、及び／又は、洗浄液量を適切に管理することにより、糖鎖付加異性体の含有量を約１０％から３～０％の範囲へ低減し管理できることが明らかとなった。実験計画法（ＤｏＥ：Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）により当該結果を解析した結果を図６に示す。洗浄液Ｉ及び洗浄液ＩＩの液量と収率及び純度への影響が等高線図として現わされ、任意の収率及び純度を洗浄液量で管理できることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
精製プロセス内の糖鎖付加異性体の除去ステップの位置、及び、洗浄液量の純度への影響
　実施例１と同様にして調製した抗ｈＤＬＫ－１抗体を含む培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィで精製し、糖鎖付加異性体を約１０％含む同抗体の粗精製物を得た。この抗体粗精製物をｐＨ３～４に一定時間保持し、中和したものをクロマトグラフィ担体への負荷用試料とした。
　この抗体粗精製物について、図７に示す２種類のフローで疎水性相互作用クロマトグラフィの後にミックスモードクロマトグラフィ、又は、ミックスモードクロマトグラフィの後に疎水性相互作用クロマトグラフィの順で精製した。疎水性相互作用クロマトグラフィ担体はＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ、ミックスモードクロマトグラフィ担体はＣａｐｔｏ　ＭＭＣを用いた。疎水性相互作用クロマトグラフィの条件は以下の通りとした。ＩＤ　Ｎｏ．ＨＩＣ４４６、ＨＩＣ４５７、及びＨＩＣ４６３は、疎水クロマトグラフィ後にミックスモードクロマトグラフィを行い、ＩＤ　Ｎｏ．ＨＩＣ４４７はミックスモードクロマトグラフィ後に疎水クロマトグラフィを行った。
＜疎水性相互作用クロマトグラフィの条件＞
　担体：ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ
　カラムサイズ：２６０ｍＬ、ベッド高１３．３ｃｍ
　流速：３００ｃｍ／ｈ
　担体当たりのタンパク質負荷量：３０ｇ／Ｌ
　クロマトグラフィ条件：
　　１．平衡化：０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；５ＣＶ
　　２．負荷：抗体粗精製物の試料
　　３．洗浄１：０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；６ＣＶ（ＨＩＣ４４６／ＨＩＣ４４７）、８ＣＶ（ＨＩＣ４５７）、又は、１５ＣＶ（ＨＩＣ４６３）
　　４．洗浄２：０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）；５ＣＶ
　　５．溶出：２０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）；６．３ＣＶ
　　６．カラム洗浄：１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液；３ＣＶ
　疎水性相互作用クロマトグラフィのステップで得られた精製抗体組成物の収率及び純度を表５及び図８に示す。何れの精製フローにおいても、収率は６０％以上であり、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析による純度（糖鎖付加異性体の混入量を示す）は９９％以上が得られた。また、洗浄１の液量（６～１５ＣＶ）に応じて、収率及び純度を制御できることが明らかになった。すなわち、抗体の純度約９０％の組成物は５ＣＶの洗浄では９８％程度、８ＣＶの洗浄では９９％程度、１５ＣＶの洗浄では９９．５％程度に向上することが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
糖鎖付加異性体の除去ステップを含む精製プロセス（ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ）
　実施例１と同様にして調製した抗ｈＤＬＫ－１抗体を含む培養上清を約２００Ｌ得た。糖鎖付加異性体が抗体粗精製物中に約１０％含まれることを確認した。
　培養上清をろ過し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィ（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ　１０Ｌ；Ｃｙｔｉｖａ社）、低ｐＨウイルス不活化、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ社、１０Ｌ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィ、Ｃａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ担体（Ｃｙｔｉｖａ社、１０Ｌ）を用いたミックスモードクロマトグラフィ、ウイルスろ過、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）による処方緩衝液への置換、滅菌ろ過等の工程を経て高純度の精製抗体組成物を得た。
　ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａクロマトグラフィは担体単位量あたりのタンパク質負荷量を３５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌに調整し、３回のクロマトグラフィを実施した。ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａクロマトグラフィステップの条件、及びＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａクロマトグラフィステップの結果を、各々表６、及び表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　Ｒｕｎ１及びＲｕｎ２の負荷量は規定量以上の適切な範囲内であったが、Ｒｕｎ３の負荷量は１６ｇ／Ｌと低い条件であった。その結果、収率は７７％となったものの糖鎖付加異性体混入量を示すＨＩＣ－ＨＰＬＣ純度は８９．７４％と低い値が得られた。そのため、Ｒｕｎ１及びＲｕｎ２の分画液のみを統合し、次のクロマトグラフィステップへ供した。
　全ステップを経て最終的に得られた精製抗体組成物は４６％の総収率であった。また、ＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析による精製抗体組成物の純度は１００％であり、糖鎖付加異性体は含まれていなかった。このように、抗体のクロマトグラフィ条件下においても、糖鎖付加異性体を十分に低減した精製抗体組成物を得ることが可能であった。また、クロマトグラフィ担体へのタンパク質負荷量が糖鎖付加異性体の除去率に重要であることも示された。
糖鎖付加異性体の除去ステップを含む精製プロセス（Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ）
　実施例１と同様にして調製した抗ｈＤＬＫ－１抗体を含む培養上清を得た。糖鎖付加異性体が抗体粗精製物中に約１０％含まれることを確認した。
　この培養液を用いてＰｒｏｔｅｉｎ　Ａアフィニティクロマトグラフィステップ（担体：ＭａｂＳｅｌｅｃｔ　ＳｕＲｅ）、低ｐＨウイスル不活化ステップ、疎水性相互作用クロマトグラフィステップ（Ｃａｐｔｏ　Ｂｕｔｙｌ担体）、ミックスモードクロマトグラフィステップ（Ｃａｐｔｏ　ａｄｈｅｒｅ）の順に精製した。
　表８に示す結果の通り、疎水性クロマトグラフィステップにより糖鎖付加異性体の非含有率を純度９９．８％まで向上させ、精製抗体組成物を総収率２５％で取得することができた。
　この結果に示すように、ＰＯＲＯＳ　Ｂｅｎｚｙｌ　Ｕｌｔｒａ担体以外の疎水性相互作用クロマトグラフィ担体を用いても高純度の精製抗体組成物を得られることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
糖鎖付加異性体の分取と生物活性の測定
　実施例１と同様にして取得した糖鎖付加異性体を約１０％含む抗ｈＤＬＫ－１抗体粗精製物について、実施例１に記載したＨＩＣ－ＨＰＬＣ分析系を用いて各ピークを精密に分取した。分取は約１０回に分けて実施し、各ピークを統合した後、等張リン酸緩衝液に緩衝液交換した。なお、分取に使用したＨＩＣ－ＨＰＬＣの移動相の条件は以下に変更した。
　移動相Ａ：２．３Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７
　移動相Ｂ：５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７
　分取前の抗体粗精製物（ａ）、分取後の精製抗体組成物（ｂ、ｃ）について、実施例１に示したＨＩＣ－ＨＰＬＣを用いて分析した結果を図９に示す。
　これらの試料について、１０μｇ／ｍＬから３倍公比で希釈し、ＡＤＣＣ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７０１０）でＥ：Ｔ比率６：１（ターゲット細胞はＤＬＫ１を高発現するＨＥＫ２９３細胞株）、反応時間６時間の条件でＡＤＣＣ活性を測った。その結果を図１０に示す。分取前の抗体粗精製物及び分取後のメインピーク（図９における（ｂ））はほぼ同様のシグモイド曲線が得られ、同等の生物活性を有することが確認された。一方、分取により単離された糖鎖付加異性体（図９における（ｃ））は、何れの濃度においてもシグナルが殆ど得られず、生物活性が無いことが分かった。この結果から、糖鎖付加異性体は不純物であり、バイオ医薬品の成分として可能な限り除去する必要のある成分であることが確認された。
　本発明により、Ｆｃ領域糖鎖結合コンセンサス領域以外の糖鎖付加異性体が低減された精製抗体組成物を調製し利用することができる。

Claims (27)

  1. 　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体組成物の精製方法であって、
    　抗体粗精製物をコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を前記クロマトグラフィの担体に吸着させること、及び
    　前記担体を溶出液で溶出させることにより、前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
    　ここで、得られた前記精製抗体組成物における、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加した糖鎖付加異性体の含有量が、前記抗体粗精製物と比較して減少している、
    前記方法。
  2. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体が、疎水性相互作用クロマトグラフィ担体、又は、ミックスモードクロマトグラフィ担体である、請求項１に記載の精製方法。
  3. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の平均粒子径が１５μｍ以上である、請求項１又は２に記載の精製方法。
  4. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の平均粒子径が２０～１００μｍである、請求項１又は２に記載の精製方法。
  5. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体が、ベンジル基又はブチル基を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の精製方法。
  6. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の単位量あたりのタンパク質負荷量が、２０ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１～５のいずれか１項に記載の精製方法。
  7. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体が疎水性相互作用クロマトグラフィ担体であり、かつ、前記抗体粗精製物を前記担体に負荷した後、溶出前に当該担体を洗浄液で洗浄することを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の精製方法。
  8. 　前記洗浄液の塩濃度が、前記溶出液の塩濃度より１０ｍＭ以上高いことを特徴とする、請求項７に記載の精製方法。
  9. 　前記洗浄液の塩濃度が、０．５Ｍ以上であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の精製方法。
  10. 　前記洗浄液の塩濃度が、１．０Ｍ以上であることを特徴とする、請求項７又は８に記載の精製方法。
  11. 　前記洗浄液のｐＨが、前記溶出液のｐＨより０．２ユニット以上低いｐＨであり、かつ、ｐＨ４～８の範囲内である、請求項７～１０のいずれか１項に記載の精製方法。
  12. 　前記洗浄が、２担体容量以上の洗浄液を流すことにより行われる、請求項７～１１のいずれか１項に記載の精製方法。
  13. 　段階的又は直線的にｐＨ又は／及び塩濃度が変化する移動相を使用することにより、洗浄及び溶出を行うことを特徴とする、請求項７～１２のいずれか１項に記載の精製方法。
  14. 　前記溶出液が０．５Ｍ以下の塩濃度であるか又は塩を含まず、かつ、ｐＨ５～７である、請求項７～１３のいずれか１項に記載の精製方法。
  15. 　収率が２０％以上である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の精製方法。
  16. 　前記精製抗体組成物中の全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が５％以下である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の精製方法。
  17. 　前記抗体粗精製物中の全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が５％より大きい、請求項１６に記載の精製方法。
  18. 　請求項１に記載の抗ｈＤＬＫ－１抗体組成物の精製方法であって、
    　抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷すること、
    　前記担体に、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を吸着させること、
    　ｐＨ４～６の洗浄液で前記担体を１回以上洗浄することにより糖鎖付加異性体を除去すること、及び、
    　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まないｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
    　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
    前記方法。
  19. 　請求項１に記載の抗体組成物の精製方法であって、
    　０．５Ｍ以上の塩濃度に調整された前記抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して糖鎖付加異性体を素通り画分に除去すること、
    　前記担体を洗浄液で洗浄すること、及び、
    　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まない、ｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
    　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
    前記方法。
  20. 　請求項１に記載の抗体組成物の精製方法であって、
    　ｐＨ４～６に調整された前記抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷して糖鎖付加異性体を素通り画分に除去すること、
    　前記担体を洗浄液で洗浄すること、及び、
    　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まない、ｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み
    　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
    前記方法。
  21. 　前記コンベンショナルクロマトグラフィの担体の単位量あたりのタンパク質負荷量が２０ｇ／Ｌ以上であり、かつ、前記洗浄が、５担体容量以上の洗浄液を流すことにより行われる、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　請求項１～２１のいずれか１項に記載の精製方法を含む、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体の、全抗体に対する割合が９５％以上である抗体組成物の製造方法。
  23. 　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体精製組成物の製造方法であって、
    　抗体粗精製物を、ベンジル基若しくはブチル基を有する粒子径２０～１００μｍの担体を用いたコンベンショナルクロマトグラフィに負荷すること、
    　前記担体に、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を吸着させること、
    　０．５Ｍ以上の塩を含む洗浄液で前記担体を１回以上洗浄することにより糖鎖付加異性体を除去すること、及び
    　０．５Ｍ以下の塩濃度又は塩を含まないｐＨ５～７の溶出液で前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含み、
    　ここで、前記精製抗体組成物における、全抗体に対する糖鎖付加異性体の割合が、前記抗体粗精製物と比較して低減している、
    前記方法。
  24. 　請求項２２又は２３に記載の製造方法により製造された抗体組成物。
  25. 　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する抗ｈＤＬＫ－１抗体粗精製物から、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加した糖鎖付加異性体を除去する方法であって、
    　抗体粗精製物を疎水性相互作用クロマトグラフィ担体に負荷して、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を前記担体に吸着させること、
    　前記担体を洗浄液で洗浄すること、及び、
    　前記担体から溶出液で溶出させることにより、前記担体に吸着した前記抗体を溶出させて精製抗体組成物を得ることを含む、
    前記方法。
  26. 　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体組成物であって、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない抗体を、全抗体の９５％以上含有する、前記抗体組成物。
  27. 　重鎖が配列番号２、４、６、８、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、及び３６から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖が配列番号１０又は配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、抗ｈＤＬＫ－１抗体であって、Ｆｃ領域糖鎖付加コンセンサス領域以外の部位に糖鎖が付加していない、前記抗体。
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