CN117279929A - 抗体组合物的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供去除抗体药物的糖链添加异构体的方法等。本发明例如提供抗体组合物的纯化方法，包括下述步骤：将上述抗体组合物负载于常规色谱，使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于色谱载体；及，通过用洗脱液对上述载体进行洗脱，从而将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物。

Description

抗体组合物的纯化方法
技术领域
本发明涉及抗体组合物的制造方法。更详细而言，涉及减少了在Fc区糖链结合共有区域以外添加有糖链的异构体的、抗体组合物的纯化方法。
背景技术
以单克隆抗体为有效成分的抗体药物有望成为有效利用了抗体分子所具有的、对抗原的高结合亲和性和结合特异性的分子靶向药之一，研究开发在不断推进。抗体药物已成为治疗癌症、本身免疫疾病所代表的各种疾病不可或缺的药物，目前，全球已有近100种制品获得批准并投入使用(非专利文献1、非专利文献2)。人们对于开发新的抗体药物以满足尚未得到满足的医疗需求的期望依然很高，预期将来将有许多新的抗体药物被研究、开发出来。
抗体(IgG)中，存在于重链的Fc部分的糖链添加共有区域(Asn297-X-Ser/Thr，X为Pro以外的氨基酸)中的第297位残基即Asn残基(Asn297)上具有N-键合型糖链。已知该存在于糖链添加共有区域的糖链有助于作为抗体分子的生物活性、血液动力学、安全性等(非专利文献3、非专利文献4)。例如，已知如果将添加在Asn297的N-键合型糖链的还原末端的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基上的Fuc残基(核心岩藻糖)去除则抗体依赖性细胞毒性(ADCC)将增强。同样，已知键合在Fc部分的糖链的非还原末端部分的半乳糖(Gal)残基数量越多则对补体第一成分(C1q)的结合越强，结果是补体依赖性细胞毒性(CDC)增强(非专利文献5)。
另一方面，也已知有很多在抗体的Fc区的糖链添加共有区域以外键合有糖链的抗体(糖链添加异构体)的例子。例如，已确认作为SP2/0细胞所产生的抗恶性肿瘤剂的西妥昔单抗(Cetuximab)在Fab部分键合有N-键合型糖链(非专利文献3)。除此以外，对于糖链添加异构体也进行了各种报道(非专利文献6、非专利文献7、非专利文献8)。
已知糖链添加异构体有可能对生物活性(非专利文献10、非专利文献11)、免疫原性(非专利文献8、非专利文献10)、血浆半衰期(非专利文献9)等各种抗体特性造成影响。特别是在Fab区或CDR区附近键合有糖链时，生物活性下降的可能性令人担忧。同样，在糖链添加共有区域以外键合有糖链的抗体这种糖链添加异构体也存在免疫原性等安全性的担忧。
由于在糖链添加共有区域以外添加糖链而使生物活性大幅下降或免疫原性大幅增加时，会产生作为抗体药物成分所不期望的负面影响，因此这些糖链添加异构体被视为源自目标物质的杂质。不期望含有这样的源自目标物质的杂质作为药物成分，从监管角度出发，也期望尽量去除(非专利文献12)。
作为药物开发候选分子，发现包含有可能在抗体的Fc区的糖链添加共有区域以外添加糖链的共有序列的抗体时，为了避免在该部位键合糖链，通常进行将共有序列变更为其它氨基酸序列等操作。此时，与原抗体性能相比，结合活性等有时会发生下降，有可能得不到有目标治疗效果的抗体。
在抗体的糖链添加共有区域以外的Fab或CDR等区域键合有糖链的糖链添加异构体可通过少量地、以高性能的分析水平分离糖链添加异构体来进行评价、区分。已知将高效液相色谱和质谱分析组合而评价肽片段的方法、评价从抗体切下的糖链本身的方法(非专利文献6、非专利文献9)。另外，已知通过疏水相互作用色谱(HIC)来分析在抗体的Fab区键合有糖链的抗体的例子(非专利文献13)。但是，这些例子均以分析为目的，使用极少量的抗体且使用分离性能极高的分析水平的方法，分离出的组合物不能作为抗体药物来加以利用。另外，HIC分析综述(非专利文献14)公开了很多抗体的分离性能的有用性，但是完全没有教导通过基于HIC的纯化方法能够分离糖链添加异构体这一点。
因此，将这样的糖链添加异构体分离·去除而制备不含或充分减少了在糖链添加共有区域以外添加有糖链的异构体的抗体组合物的方法尚属未知。即，现有技术止步于能够在分析水平评价糖链添加异构体的糖链添加情况，不存在将抗体的糖链添加异构体分离·去除而制造可作为药物来提供的量的抗体组合物的方法，这样的抗体组合物也尚属未知。
因此，通常在存在于抗体的Fc区的糖链添加共有区域以外添加糖链、包含这样的糖链添加异构体时，这些成分不被分离，而是作为抗体药物的一部分而含有。上述西妥昔单抗也是以在Fc部分的糖链添加共有区域及Fab内的非共有区域这两个区域添加有糖链的混合物的组成而进行开发的(非专利文献3)。糖链添加异构体暂且不具有生物活性时，则源自目标物质的杂质作为药物成分而包含，这是不期望的。
需要说明的是，利用使用与规定糖链特异性结合的凝集素的亲和色谱来分离糖链添加异构体的技术已有报道(非专利文献15、非专利文献16)。已知该技术使用伴刀豆球蛋白A作为配体，分离特性也高，但是是基于亲和性来进行分离，使用了天然物质，因此不适合于药物的制造，适合于抗体药物的制造的例子并不存在。
作为抗体以外的、实现了糖链成分的分离的技术，已知基于糖链个数差异通过色谱对基因重组抗凝血酶进行分离的例子(专利文献1)。另外，已知基于唾液酸添加数量的差异通过色谱对基因重组促红细胞生成素及其衍生物进行分离(专利文献2)。同样地，有使用等电点色谱对蛋清白蛋白、转铁蛋白进行分离的事例(专利文献3)。但是，这些技术不能直接用于抗体，将抗体组合物中的糖链添加异构体分离去除的制造方法尚无任何报道。
作为上述以外的技术，已知通过酶处理来去除糖链的方法(非专利文献17)。但是，从安全性的观点出发，酶的分离·去除、来源等都成为问题，因此难以作为药物制造技术来利用。在通过酶来去除抗体的糖链时，也不能将糖链添加共有区域和非共有区域的糖链加以区分并进行去除。
专利文献4中记载的抗hDLK-1抗体是其抗肿瘤活性备受期待的抗体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2008/120801号
专利文献2:日本特开2001-064300号公报
专利文献3:国际公开第2005/100379号
专利文献4:国际公开第2014/054820号
非专利文献
非专利文献1:YAKUGAKU ZASSHI 137(7),815-816(2017)
非专利文献2:Bull.Natl.Inst.Health Sci.,132,36-46(2014)
非专利文献3:CHROMATOGRAPHY,34(2),83-88(2013)
非专利文献4:Protein Cell,9,63-73(2018)
非专利文献5:Front.Immunol.,8(646),1-8(2017)
非专利文献6:J.Biol.Chem.,284(47),32493-32506(2009)
非专利文献7:Embo J.,10,2717-2723(1991)
非专利文献8:J.Immunol.,196,1435-1441(2016)
非专利文献9:Anal.Biochem.,349,197-207(2006)
非专利文献10:Nature Review|Immunology,published online,04Feb,(2019)
非专利文献11:Biochem.J.,338(2),529-538(1999)
非专利文献12:ICH Q6 B Guideline
非专利文献13:mAbs,6(4),852-858(2014)
非专利文献14:J.Pharm.Biomed.Anal.,130,3-18(2016)
非专利文献15:J.Biol.Chem.,285(21),16012-22(2010)
非专利文献16:Oncotarget,7(21),31166-76(2016)
非专利文献17:J.Immunol.Methods,467,58-62(2019)
发明内容
发明要解决的问题
键合于抗体的糖链添加共有区域以外的糖链从生物活性、安全性的观点出发也是不期望的，需要开发能够去除抗体药物所含有的糖链添加异构体至充分的水平、能够简便地制备均匀的纯化抗体组合物的技术。因此，本发明的课题在于，提供去除抗体药物中的糖链添加异构体的方法。
另一方式中，本发明的课题在于，得到更有效且更安全的抗hDLK-1抗体的纯化组合物。
用于解决问题的方案
如上述的现有技术所示，虽然报道了出于分析评价目的而通过精密且具有高分离性能的色谱对糖链添加异构体进行分离，但是通过色谱能够分离并去除抗体药物中的糖链添加异构体的制造技术或制备技术尚无报道。本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果惊讶地发现，通过使用常规的疏水相互作用色谱载体、特别是通过优化糖链添加异构体及目标物质的吸附及分离条件，能够制备减少了糖链添加异构体的纯化抗体组合物。
另外，本发明人们使用新发现的糖链添加异构体减少方法对于专利文献4记载的抗hDLK-1抗体进行了糖链添加异构体的分离、非糖链添加异构体的纯化。在抗体的CDR附近具有糖链的糖链添加异构体也许对抗体的结合活性有影响，但是其活性降低程度也与糖链的大小、键合位置有关，因此认为也可能不影响活性。令人惊讶的是，在专利文献4记载的抗hDLK-1抗体中，糖链添加异构体的活性是完全消失的，因此成为药物中的“杂质”。由此，本发明人们成功地确定糖链添加异构体为抗hDLK-1抗体粗纯化物中的新杂质，通过实现其的去除，从而实现了提供更有效且更安全的抗hDLK-1抗体的纯化组合物。
即，本发明涉及以下的(1)～(27)。
(1)一种抗hDLK-1抗体组合物的纯化方法，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，
所述纯化方法包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于常规色谱，使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于上述色谱的载体；及
通过用洗脱液对上述载体进行洗脱，从而将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，得到的上述纯化抗体组合物中的、在Fc区糖链添加共有区域以外的部位添加有糖链的糖链添加异构体的含量与上述抗体粗纯化物相比减少。
(2)根据(1)所述的纯化方法，其中，上述常规色谱的载体为疏水相互作用色谱载体或混合模式色谱载体。
(3)根据(1)或(2)所述的纯化方法，其中，上述常规色谱的载体的平均粒径为15μm以上。
(4)根据(1)或(2)所述的纯化方法，其中，上述常规色谱的载体的平均粒径为20～100μm。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的纯化方法，其中，上述常规色谱的载体具有苄基或丁基。
(6)根据(1)～(5)中任一项所述的纯化方法，其中，每单位量的上述常规色谱的载体的蛋白质负载量为20mg/mL以上。
(7)根据(1)～(6)中任一项所述的纯化方法，其中，上述常规色谱的载体为疏水相互作用色谱载体，并且所述纯化方法包括下述步骤：将上述抗体粗纯化物负载于上述载体后，在洗脱前用清洗液清洗该载体。
(8)根据(7)所述的纯化方法，其特征在于，上述清洗液的盐浓度比上述洗脱液的盐浓度高10mM以上。
(9)根据(7)或(8)所述的纯化方法，其特征在于，上述清洗液的盐浓度为0.5M以上。
(10)根据(7)或(8)所述的纯化方法，其特征在于，上述清洗液的盐浓度为1.0M以上。
(11)根据(7)～(10)中任一项所述的纯化方法，其中，上述清洗液的pH为比上述洗脱液的pH低0.2个pH单位以上的pH，并且在pH4～8的范围内。
(12)根据(7)～(11)中任一项所述的纯化方法，其中，上述清洗通过通入2倍载体容积以上的清洗液来进行。
(13)根据(7)～(12)中任一项所述的纯化方法，其特征在于，通过使用pH或/和盐浓度阶段性地或线性地变化的流动相来进行清洗及洗脱。
(14)根据(7)～(13)中任一项所述的纯化方法，其中，上述洗脱液的盐浓度为0.5M以下或不含盐，并且pH为5～7。
(15)根据(1)～(14)中任一项所述的纯化方法，其中，收率为20％以上。
(16)根据(1)～(15)中任一项所述的纯化方法，其中，上述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例为5％以下。
(17)根据(16)所述的纯化方法，其中，上述抗体粗纯化物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例大于5％。
(18)根据(1)所述的抗hDLK-1抗体组合物的纯化方法，其包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱；
使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于上述载体；
通过用pH4～6的清洗液将上述载体清洗1次以上而去除糖链添加异构体；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，上述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与上述抗体粗纯化物相比降低。
(19)根据(1)所述的抗体组合物的纯化方法，其包括下述步骤：
将盐浓度已调整为0.5M以上的上述抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱，将糖链添加异构体去除到直接通过的级分中；
将上述载体用清洗液清洗；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，上述纯化抗体组合物中的、糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与上述抗体粗纯化物相比降低。
(20)根据(1)所述的抗体组合物的纯化方法，其包括下述步骤：
将已调节成pH4～6的上述抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱，将糖链添加异构体去除到直接通过的级分中；
将上述载体用清洗液清洗；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，上述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与上述抗体粗纯化物相比降低。
(21)根据(1)～(20)中任一项所述的方法，其中，每单位量的上述常规色谱的载体的蛋白质负载量为20g/L以上，并且上述清洗通过通入5倍载体容积以上的清洗液来进行。
(22)一种在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体相对于全部抗体的比例为95％以上的抗体组合物的制造方法，其包括(1)～(21)中任一项所述的纯化方法。
(23)一种抗hDLK-1抗体纯化组合物的制造方法，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，
所述制造方法包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱；
使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于上述载体；
用包含0.5M以上的盐的清洗液将上述载体清洗1次以上而去除糖链添加异构体；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，上述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与上述抗体粗纯化物相比降低。
(24)一种抗体组合物，其通过(22)或(23)所述的制造方法而制造。
(25)一种从抗hDLK-1抗体粗纯化物中去除在Fc区糖链添加共有区域以外的部位添加有糖链的糖链添加异构体的方法，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，
所述方法包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于疏水相互作用色谱载体，使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于上述载体；
将上述载体用清洗液清洗；及
通过用洗脱液进行洗脱，从而从上述载体上洗脱吸附于上述载体的上述抗体，得到纯化抗体组合物。
(26)一种抗hDLK-1抗体组合物，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，所述抗hDLK-1抗体组合物含有占全部抗体的95％以上的在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体。
(27)一种抗hDLK-1抗体，其重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，所述抗hDLK-1抗体在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链。
发明的效果
本发明能够减少/去除在抗体的糖链添加共有区域以外添加有糖链的糖链添加异构体。
作为本申请发明的第一效果，可以提供糖链添加异构体的比例减少的医疗用抗体组合物。由此，通过该方法进行纯化、糖链添加异构体减少的高纯度的抗体组合物能够成为纯度更高的药物制剂。
作为本申请发明的第二效果，能够提供去除了糖链添加异构体的医疗用抗体组合物。由此，能够作为活性主体的纯度非常高的组合物、即有效性和安全性优异的药物组合物而提供。
特别地，在本发明中，经纯化的抗hDLK-1抗体的纯化组合物由于已去除了不具有活性的作为杂质的糖链添加异构体，因此能够作为有效性和安全性优异的药物组合物而提供。
附图说明
图1为示出由产生人源化抗hDLK-1单克隆抗体的细胞的培养液获得的粗纯化物的HIC-HPLC分析图案的图。
图2为示出瞬时表达人源化抗hDLK-1单克隆抗体的CHO细胞的培养上清的蛋白A纯化后的SDS-PAGE分析结果的照片。
图3为示出利用Capto Butyl疏水相互作用色谱载体的抗体组合物的分离曲线的图。
图4为示出用Capto Butyl载体分离而得的纯化抗体组合物的基于HIC-HPLC的纯度分析试验结果的图及表。表中的峰1及峰2表示糖链添加异构体抗体(峰1为在4条多肽链的1个CDR键合有糖链，峰2是在2个CDR键合有糖链)，峰3表示仅在糖链添加共有区域键合有糖链的抗体的比例(％)。
图5A为示出利用Capto Butyl载体的抗体组合物的分离曲线的图。
图5B为示出利用Poros Benzyl Ultra载体的抗体组合物的分离曲线的图。
图6为示出利用实验设计法(design of experiments)，对于通过优化使用POROSBenzyl Ultra载体的色谱条件而控制糖链添加异构体含量进行分析而得到的结果的图。
图7为示出抗体组合物纯化工艺中的色谱步骤的顺序的图。
图8为示出疏水相互作用色谱中改变清洗液量时的洗脱图案以及收率和纯度的图(上图：清洗液1为6CV、清洗液2为5CV的条件，中图：清洗液1为8CV、清洗液2为5CV的条件，下图：清洗液1为15CV、清洗液2为5CV的条件)。
图9示出利用使用HIC-HPLC分析进行抗体粗纯化物的精密制备而得的离析成分的分析数据。(a)示出离析前的抗体粗纯化物的HIC-HPLC分析结果。(b)示出在(a)的HIC-HPLC中作为主峰而制备的级分的HIC-HPLC分析结果。(c)示出在(a)的HIC-HPLC中作为前沿峰而制备的级分的HIC-HPLC分析结果。
图10为示出糖链添加异构体的ADCC活性的评价结果的图。纵轴示出表示ADCC活性的荧光强度，横轴示出抗体浓度。圆形表示图9的(b)的作为主峰而制备的级分(不含糖链添加异构体的成分)，方形表示图9的(c)的作为前沿峰而制备的级分(糖链添加异构体)，三角形表示图9的(a)的离析前的抗体粗纯化物的结果。
图11示出HuBA-1-3D-1的H链(γ1链)的编码区的碱基(序列号37)和氨基酸序列(序列号38)。氨基酸以单字母符号来表示，终止子的位置用“·”来表示。
图12示出HuBA-1-3D-2的H链(γ1链)的编码区的碱基(序列号41)和氨基酸序列(序列号42)。氨基酸以单字母符号来表示，终止子的位置用“·”来表示。
图13示出L链(κ链)的编码区的碱基(序列号69)和氨基酸序列(序列号70)。图中，氨基酸以单字母符号来表示，终止子的位置用“·”来表示。
图14示出HuBA-1-3D-1T73K的H链(γ1链)的编码区的碱基(序列号53)和氨基酸序列(序列号54)。氨基酸以单字母符号来表示，终止子的位置用“·”来表示。上述HuBA-1-3D-1T73K的VH的推定氨基酸序列(序列号18)中，N末端起19个氨基酸所构成的肽为信号肽。HuBA-1-3D-1T73K的VH的成熟肽的cDNA碱基如序列号19所示，其推定氨基酸序列如序列号20所示。
图15示出HuBA-1-3D-1A24G/T73K的H链(γ1链)的编码区的碱基(序列号61)和氨基酸序列(序列号62)。氨基酸以单字母符号来表示，终止子的位置用“·”来表示。上述HuBA-1-3D-1A24G/T73K的VH的推定氨基酸序列(序列号22)中，N末端起19个氨基酸所构成的肽为信号肽。HuBA-1-3D-1A24G/T73K的VH的成熟肽的cDNA碱基如序列号23所示，其推定氨基酸序列如序列号24所示。
图16为示出HuBA-1-3D-VH1、HuBA-1-3D-VH1 A24G、HuBA-1-3D-VH1 T73K、HuBA-1-3D-VH1 A24G/T73K、HuBA-1-3D-VH2、HuBA-1-3D-VH2 A24G、HuBA-1-3D-VH2 T73K及HuBA-1-3D-VH2A24G/T73K的氨基酸序列比对的图。括号内示出序列表中的序列号。
具体实施方式
以下详细说明本发明。本发明的范围不受这些说明约束，对于以下的例示以外者，可以在不损害本发明的主旨的范围内适当变更而实施。需要说明的是，本说明书包括作为本申请优先权要求的基础的日本特愿2021-079977号说明书(令和3年(2021年)5月10日申请)的整体。本说明书中引用的全部或出版物、例如现有技术文献及公开公报、专利公报等专利文献作为参照而并入本说明书。
本说明书中，“糖链添加共有序列”或“糖链键合共有序列”是指：Asn-X-Ser/Thr(X为Pro以外的氨基酸)所示的氨基酸序列，该序列在抗体中的位置及Asn所在的位置没有限定。本说明书中，“Fc区糖链添加共有区域”、“糖链添加共有区域”或“糖链键合共有区域”是指：在抗体的Fc部分中存在的、通常包含Asn297的糖链添加共有序列(代表性的是Asn297-X-Ser/Thr(X为Pro以外的氨基酸))。编码糖链添加共有序列及糖链添加共有区域的碱基只要是编码该氨基酸序列的序列，则任何序列都包括在内。
本说明书中，“糖链添加异构体”是指：在糖链添加共有区域以外的氨基酸上添加有糖链的抗体。将添加在糖链添加共有区域以外的氨基酸上的糖链称为“非共有糖链”。作为糖链添加异构体中非共有糖链所键合的区域，包括Fab区、作为与抗原的结合区域的Fv(可变)区、互补决定区(complementarity determining region，CDR)、除糖链添加共有区域以外的Fc区及融合抗体中的融合序列部分，代表性的是CDR区域。作为非共有糖链与糖链添加共有区域以外的氨基酸的糖链键合方式，可以是作为糖链添加共有序列的Asn-X-Ser/Thr(X为Pro以外的氨基酸)上的N型糖链，也可以是Ser或Thr上的O型糖链。
抗体分子的结构通常是异四聚体，2种相同的多肽链各以2个键合而形成，因此，理论上在1分子抗体中非共有糖链的结合部位在每个位置以2的倍数存在。成为本发明的纯化对象的抗体粗纯化物只要包含具有1个以上的非共有糖链的抗体即可。每1分子抗体的非共有糖链的键合数可以为1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上。另外，抗体由4条(通常为重链2条及轻链2条)多肽链构成时，任意1条上键合的非共有糖链的键合数可以为1个以上、2个以上、3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上。作为抗体粗纯化物中的可键合非共有糖链的区域上的糖链键合比例率、即糖链添加异构体的存在比例，在将1分子抗体中的一个“重链与轻链的组合”或与其相当的结构上完全键合非共有糖链的情况设为100％时，每1分子抗体可以为0.1％以上且200％以下，通常在需要应用本发明的方法时，为1％以上且50％以下。在此，200％是指：在1分子抗体中，配对的“重链与轻链的组合”这两者(2处)上键合有非共有糖链。
本说明书中，“抗体”除了包括全长抗体以外，还包括抗体片段、全长抗体或抗体片段与其它物质的融合物，例如包括小鼠抗体、小鼠-人嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及他们的氨基酸变体、氨基酸添加体、氨基酸缺失体、氨基酸置换体、糖链变体等。抗体的免疫球蛋白类别没有特别限定，可以为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD或IgY中任意免疫球蛋白类别(同种型)，优选IgG。另外，在本发明的抗体为IgG时，可以为任意亚类(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。抗体片段优选抗原结合性片段，包括F(ab’)2、Fab’、Fab、Fab 3、单链Fv(以下称为“scFv”)、(串联)双特异性单链Fv(sc(Fv)2)、单链三抗体、纳米抗体、二价VHH、五价VHH、小抗体、(双链)双抗体、串联双抗体、双特异性三抗体、双特异性双抗体、双亲和重定向分子(DART)、三抗体(或tribody)、四抗体(或[sc(Fv)2]2、或(scFv-SA)4)、二硫键稳定性Fv(以下称为“dsFv”)、紧凑型IgG、重链抗体、或它们的聚合物。作为抗体片段与其它物质的融合物，可列举融合蛋白、特别是Fc融合蛋白等。
特别地，作为本说明书中的抗体，是指重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或12记载的氨基酸序列的抗hDLK-1抗体。优选重链具有选自序列号4、8、16、20、24、28、32及36的氨基酸序列、且轻链具有序列号12记载的氨基酸序列的抗hDLK-1抗体。
本说明书中，将成为纯化对象的包含糖链添加异构体的抗体组合物称为“抗体粗纯化物”。抗体粗纯化物只要包含糖链添加异构体，则可以使用任何物质。例如，作为抗体粗纯化物，可列举血浆等生物体来源组合物或其处理物、及整合有抗体基因的转化细胞的培养液(可以为培养上清，以下同样)或其处理物。作为生物体来源组合物，可列举从转基因非人动物或植物等得到的包含抗体的组合物等。作为转化细胞，只要是能够键合糖链的细胞则任一者均可，具体而言，可列举动物细胞、植物细胞或酵母细胞等具有能键合糖链的性质的细胞株，进一步具体而言，可列举中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、作为小鼠骨髓瘤细胞的NS0细胞、SP2/0细胞、作为大鼠骨髓瘤细胞的YB2/0细胞、IR983F细胞、源自叙利亚仓鼠肾脏的BHK细胞、源自人胎儿肾脏的293细胞、作为人骨髓瘤细胞的NAMALWA细胞、向胚胎干细胞或受精卵细胞等中导入抗体基因而得的细胞。作为上述细胞株，也可以利用由原代永生化细胞株衍生的各种亚种。例如，CHO细胞的情况下可以利用CHO K1株、CHO DG44株、CHO S株及它们的衍生株等(Palsson等、Nature Biotechnology 31(8),759-765,2013)。通过用适合于生产蛋白质的培养基培养这些细胞，由此可以以培养液形式得到抗体粗纯化物。作为使用的培养基，使用例如含有血清的培养基、不含血清白蛋白或血清分级物等动物源成分的培养基、无血清培养基或无蛋白质培养基等任意培养基，优选使用无血清培养基、不含动物源原料的培养基、无蛋白质培养基、完全化学合成培养基。
进而，作为上述抗体粗纯化物，也可以利用下述：进行过过滤、盐析、1种以上色谱、pH调节、缓冲液置换、浓缩、稀释等处理的生物体来源组合物或培养液；对生物体来源组合物、培养液进行过纯化等操作而得的中间体组合物等组合物。作为进行过纯化操作的中间体组合物，也可以利用用于构建抗体药物制造工艺的一些单元操作后的溶液。例如，期望为蛋白A亲和色谱后、阳离子交换色谱后、阴离子交换色谱后、缓冲液交换后、低pH处理后、过滤后的组合物等。
N型糖链的情况下，可以由该抗体的氨基酸序列或基因序列推测糖链添加异构体的存在可能性。另外，不论糖链类型如何，通过抗体的肽谱及质谱分析均可以推测糖链键合位置。作为更简便的方法，可以通过对经肽-N-糖苷酶(PNGase)处理的抗体与未经该处理的抗体进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并比较，以蛋白质的电泳条带的变化形式来观察糖链的键合。
抗体的种类如上所述，本方法适合作为抗体生产中的纯化方法，所述抗体为包含治疗用抗体、诊断用抗体或预防用抗体的抗体药物形式。这是由于，抗体药物在所含抗体的异构体含量方面需要具有稳定性，需要尽量减少源自目标物质的杂质(ICH Q6B指南)。作为治疗用抗体或预防用抗体的例子，可列举与配体结合而对配体的活性进行中和的抗体、与细胞表面的受体结合而对配体的结合进行中和的抗体、与细胞表面结合而显示对细胞本身的杀伤活性的抗体。作为诊断用抗体的例子，可列举与配体或细胞表面的受体结合的抗体。作为对细胞的杀伤活性，可列举抗体依赖性细胞毒活性(Antibody-dependent CellularCytotoxicity)、补体依赖性细胞毒活性(Complement-Dependent Cytotoxicity)、抗体依赖性细胞吞噬(Antibody dependent cellular phagocytosis)活性等。另外，如果是抗体-药物复合体(Antibody Drug Conjugate)、放射性标记抗体(Radioisotope-labelledAntibody)等化学修饰抗体、与细胞因子等的融合抗体、多特异性抗体(Multi-specificAntibody)(Nature,580(16),330-338(2020))等具有糖链的抗体衍生物，则也能利用本发明的技术。
更具体而言，在针对下述蛋白抗原(优选源自人的蛋白抗原)的抗体的纯化中可利用本方法，所述蛋白抗原为CD3、EGF受体、CD20、RS病毒、TNFα、CD25、IL-6受体、CD33、VEGF、IgE、补体C5、IL-12、IL-23、IL-1β、RANKL、CCR4、HER2、CD30、IL-5、IL-5受体、α4整联蛋白、α4β7整联蛋白、PD-1、CD52、IL-17、IL-17A、IL-17受体、CTLA-4、PCSK9、SLAMF7、BlyS、CD38、PD-L1、IL-4α受体、CD22、CD23、第IXa因子、X因子、CD19、骨硬化蛋白、DLK-1等。作为融合蛋白，可列举可溶性TNF受体Fc融合蛋白、CTLA4改变Fc融合蛋白、Fc-TPOR激动肽融合蛋白、VEGF受体-Fc融合蛋白等。在这些中的任一抗体或融合蛋白等的纯化中可利用本方法。
最理想的例子之一是抗DLK-1抗体的纯化。具体而言，可列举上述专利文献4(WO2014/054820)中记载的人源化抗人DLK-1抗体，例如包含具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列的重链(特别是具有这些氨基酸序列作为可变区的重链，在本段落中，以下同样)及具有序列号10或12记载的氨基酸序列的轻链(特别是具有这些氨基酸序列作为可变区的轻链，在本段落中，以下同样)的抗体，优选包含具有选自序列号4、8、16、20、24、28、32及36中的氨基酸序列的重链及具有序列号12记载的氨基酸序列的轻链的抗体。这样的人源化抗人DLK-1单克隆抗体在其轻链的可变区具有糖链键合共有序列。
以下的表1及2包含了上述专利文献4(WO2014/054820)中记载的抗人DLK-1抗体的全长序列(下划线表示信号序列。成熟蛋白中不含下划线部的序列。)，例如，在该抗体中，方框包围的NSS序列的N为糖链键合共有序列。因此，在动物细胞等中表达该基因时，可能会生成包含糖链添加异构体的糖链组合物。同样，具有与该抗DLK-1抗体的序列类似的序列的DLK-1抗体也具有同样的可能性。作为从这样的包含糖链添加异构体的抗体粗纯化物中去除或减少糖链添加异构体的方法，本方法是有用的。需要说明的是，以下的表格中记载的HuBA-1-3D-1的H链、HuBA-1-3D-2的H链、HuBA-1-3D-1A24G的H链、HuBA-1-3D-2A24G的H链、HuBA-1-3D-1T73K的H链、HuBA-1-3D-2T73K的H链、HuBA-1-3D-1A24G/T73K的H链、HuBA-1-3D-2A24G/T73K的H链及HuBA-1-3D的L链的氨基酸序列分别依次记载于序列号38、42、46、50、54、58、62、66及70。另外，从这些序列中除去信号序列的成熟蛋白的氨基酸序列分别依次记载于序列号40、44、48、52、56、60、64、68及72。本申请说明书等中，“H链”表示重链，“L链”表示轻链。
HuBA-1-3D VH1及HuBA-1-3D VH2的CDR1的氨基酸序列为“DYAMH”(序列号73)、CDR2的氨基酸序列为“VISTYYGNTNYNQKFKG”(序列号74)及CDR3的氨基酸序列为“GGLREYYYAMDY”(序列号75)。另外，HuBA-1-3D VL的CDR1的氨基酸序列为“KSSQSLLNSSNQKNYLA”(序列号76)、CDR2的氨基酸序列为“FASTRES”(序列号77)及CDR3的氨基酸序列为“QQHYSTPPT”(序列号78)。本发明的抗体可以为具有这些CDR的全部或一部分的抗体。需要说明的是，这些CDR序列按照Kabat等人(Sequences of Proteins ofImmunological Interests,Fifth edition,NIH PublicationNo.91-3242,U.S.Department of Health and Human Services,1991)中的定义。本申请说明书等中，“VH”表示重链可变区，“VL”表示轻链可变区。
[表1]
HuBA-1-3D-1重链
HuBA-1-3D-1A24G重链
HuBA-1-3D-1T73K重链
HuBA-1-3D-1A24G/T73K重链
[表2]
HuBA-1-3D-2重链
HuBA-1-3D-2A24G重链
HuBA-1-3D-2T73K重链
HuBA-1-3D-2A24G/T73K重链
HuBA-VH1-3D LC轻链
与抗体粗纯化物相比糖链添加异构体的含量减少的抗体组合物(本说明书中称为“纯化抗体组合物”)通过将包含糖链添加异构体的抗体粗纯化物作为起始原料、将其供于常规色谱而得到。因此，本发明涉及抗体粗纯化物的纯化方法，所述纯化方法包括下述步骤：将上述抗体粗纯化物负载于常规色谱，使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于上述载体；及，通过用洗脱液对上述载体进行洗脱而将吸附于上述载体的上述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，得到的纯化抗体组合物中的、在Fc区糖链添加共有区域以外的部位添加有糖链的糖链添加异构体的含量与纯化前的抗体粗纯化物相比减少。
作为常规色谱中使用的载体，可以利用疏水相互作用色谱载体、疏水色谱载体、或混合模式色谱载体(也称为多模式色谱载体，优选具有疏水色谱的性质的混合模式色谱载体)。作为疏水相互作用色谱载体，可以使用在基质基材上键合有甲基、乙基、丙基、丁基、辛基、己基、丙二醇基、苯基、烷基苯基、苄基、烷基苄基等疏水性官能团的载体。作为混合模式色谱载体，可列举以任意比例混合有上述疏水性官能团和离子交换性官能团的载体。例如，可以利用N-苄基-N-甲基乙醇胺等作为官能团。作为阳离子交换性官能团的代表例，可列举CM(羧甲基、-O-CH2-COOH)、SP(磺丙基、-O-C 3H 6-SO 3H)等，作为阴离子交换性的代表例，可列举DEAE(二乙基氨基乙基、-O-C 2H 4-N-(C 2H 5)2)、QAE(季铵化氨基乙基或二乙基-(2-羟丙基)-氨基乙基、-O-C 2H 4-N-(C 2H 5)2(CH 2-CH(OH)-CH 2))等，可以利用这些。作为载体的基材，可列举纤维素、琼脂糖胶、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯及各种合成聚合物。载体有无细孔均可以利用。作为混合模式色谱载体的另一方式，可列举羟磷灰石(Ca10(PO 4)6(OH)2)、氟磷灰石(Ca 10(PO 4)6F 2)之类具有磷酸钙等官能团的方式。
色谱载体可以以市售品形式获得和利用。具体而言，可列举Butyl-Sepharose(注册商标)4Fast Flow(平均粒径90μm)、Butyl-S Sepharose6Fast Flow(平均粒径90μm)、Octyl Sepharose(注册商标)4Fast Flow(平均粒径90μm)、Phenyl Sepharose(注册商标)6Fast Flow(high sub)(平均粒径90μm)、Phenyl Sepharose(注册商标)6Fast Flow(lowsub)(平均粒径90μm)、Butyl Sepharose(注册商标)High Performance(平均粒径90μm)、Phenyl Sepharose High Performance(平均粒径90μm)、SOURCE 15ETH(平均粒径15μm)、SOURCE 15ISO(平均粒径15μm)、SOURCE 15PHE(平均粒径15μm)、Capto Phenyl(High Sub)(平均粒径90μm)、Capto Butyl(平均粒径90μm)、Capto Octyl(平均粒径90μm)、CaptoPhenyl ImpRes(平均粒径36-44μm)、Capto Butyl ImpRes(平均粒径36-44μm)、Captoadhere(平均粒径90μm)、Capto adhere ImpRes(平均粒径36-44μm)、Capto MMC(平均粒径90μm)、Capto MMC ImpRes(平均粒径36-44μm)、Capto Core700(平均粒径90μm)、ReadyToProcess Adsorber Phenyl(以上为Cytiva公司,英国)；TOYOPEARL(注册商标)Butyl-600(平均粒径40-90μm)、TOYOPEARL(注册商标)Phenyl-600(平均粒径40-90μm)、TOYOPEARL(注册商标)PPG-600(平均粒径40-90μm)、TOYOPEARL(注册商标)Butyl-650(平均粒径40-90μm)、TOYOPEARL(注册商标)Phenyl-650(平均粒径40-90μm)、TOYOPEARL(注册商标)SuperButyl-550(平均粒径40-90μm)、TOYOPEARL(注册商标)Hexyl-650(平均粒径50-150μm)、TOYOPEARL(注册商标)Ether-650(平均粒径40-90μm)(以上为东曹公司制)；POROSEthyl(平均粒径50μm)、POROS Benzyl(平均粒径50μm)、POROS Benzyl Ultra(平均粒径50μm)(以上为Thermo Fisher公司制)；Macro-Prep t-Butyl HIC(平均粒径50μm)、Macro-PrepMethyl HIC(平均粒径50μm)、陶瓷羟磷灰石(平均粒径20-80μm)、陶瓷氟磷灰石(平均粒径20-80μm)、生物凝胶HT(平均粒径20-80μm)(以上为BIO RAD公司制)；QMA Spherosil(平均粒径50μm)、Methyl Ceramic Hyper D(平均粒径50μm)(以上为POUL公司制)；FractogelEMD Phenyl(S)(平均粒径20-90μm)、Fractogel EMD Propyl(S)(平均粒径20-90μm)(以上为默克公司制)；Cellufine MAX Phenyl(平均粒径40-130μm)、Cellufine MAX Phenyl LS(平均粒径40-130μm)、Cellufine MAX Butyl(平均粒径40-130μm)(以上为JNC公司制)；丁基化CHITO PEAEL、苯基化CHITO PEAEL(以上为FUJIBO HOLDINGS,INC.制)等载体，可从这些载体中选择更合适的载体来使用。更优选Capto Butyl、POROS Benzyl Ultra、POROSButyl Ultra等载体。
本发明的纯化目的下所使用的色谱载体的平均粒径可以设为15μm以上、20μm以上、30μm以上或40μm以上。另外，作为色谱载体所能处理的抗体粗纯化物的液体量，可以设为100mL以上、1L以上、10L以上或100L以上。填充有该载体的色谱用柱可以使用容积为100mL～1,000L左右(直径5cm～2m左右)为止的柱。供于色谱纯化的抗体粗纯化物的量为至少1L以上，期望为10L以上、更期望为100L以上、进一步期望为500L以上、最大为20,000L左右。由于需要处理如此大量的抗体粗纯化物，因此色谱中的线流速为1,000cm/hr以下、期望为500cm/hr以下。作为供于纯化的抗体的量，以蛋白量计为10g以上，期望为100g以上、更期望为1kg以上、进一步期望为10kg以上。通过使本技术中应去除或减少的糖链添加异构体在色谱中所洗脱的抗体中包含在前一半级分中、使作为目标的期望抗体洗脱到后一半级分中，从而区分并去除糖链添加异构体。
作为将包含糖链添加异构体的抗体粗纯化物负载于常规色谱的条件，需要为至少目标成分、即仅在糖链添加共有区域添加有糖链的抗体(非糖链添加异构体抗体)能够吸附于色谱载体的条件。抗体的吸附由于包括抗体及色谱载体的疏水性·亲水性的程度在内的相互作用而发生的。作为缓冲液，可以利用疏水相互作用色谱、疏水色谱、混合模式色谱通常使用的缓冲液。只要抗体在色谱条件下稳定则任意者均可，可列举例如磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、MOPS缓冲液、氨基酸缓冲液及这些的混合缓冲液。这些缓冲液的浓度可以在0.1mM～300mM左右的常规使用范围内任意选择。缓冲液的pH可以在pH4～8的范围内任意选择，期望为pH4～6。
这些缓冲液中，可以以抗体不会生成沉淀的程度根据需要适量加入硫酸钠、硫酸铵、氯化钠、柠檬酸钠等盐类，增强与上述色谱载体的相互作用，从而能够进行向色谱载体的吸附。上述盐类可以从1种以上中任意选择，作为盐浓度，使用300mM～2M的范围内的、抗体稳定地存在且抗体能充分吸附于色谱载体的浓度。优选1M左右的盐浓度，优选抗体能够吸附的低盐浓度。每单位量的色谱载体能吸附的抗体量根据色谱载体的种类、缓冲液的条件而不同，每1mg载体可以吸附10mg以上的抗体、优选每1mg载体可以吸附20mg以上的抗体。色谱的操作可在0℃～40℃内的任意温度下实施。期望在室温下操作，更期望在温度得到管理的条件下操作。
在上述条件下将包含糖链添加异构体的抗体粗纯化物负载于色谱后，通过洗脱进行分离纯化。利用色谱来分离糖链添加异构体可以通过下述来进行：使抗体吸附于色谱载体后，阶段性地、连续地、或将它们组合而降低通入柱中的缓冲液的盐浓度、或者升高pH、或者降低电导率、或者将这些组合。使抗体吸附于色谱载体后，首先主要将糖链添加异构体洗脱，接着洗脱仅在糖链添加共有区域添加有糖链的抗体(非糖链添加异构体抗体)，由此可以制备作为目标的纯化抗体组合物。“洗脱”是指：使已通过疏水性相互作用等与色谱载体结合的抗体成分对载体的结合减弱，使该抗体成分从色谱载体排出。作为洗脱糖链添加异构体的条件，为使糖链添加异构体与色谱载体的相互作用和非糖链添加异构体抗体与色谱载体的相互作用相比足够弱的缓冲液条件。通过使用足够量的该条件的该缓冲液清洗色谱载体，能够在仅使目标抗体、即非糖链添加异构体抗体吸附于色谱载体的状态下仅将糖链添加异构体洗脱去除。
用于将糖链添加异构体洗脱去除(清洗)的缓冲液只要与洗脱非糖链添加异构体抗体的缓冲液之间具有10mM以上的盐浓度差异和/或0.2个pH单位以上的pH差异，则任何缓冲液均可以利用。在高盐浓度(通常为300mM～2M的范围)下使非糖链添加异构体抗体吸附于色谱载体后，清洗色谱载体的清洗液的盐浓度可以相对于进行洗脱的盐浓度设为同等以上的范围。例如，相对于洗脱抗体时的盐浓度，可以设为同等或从同等起至高1M的盐浓度的范围、或从同等起至高0.5M的盐浓度的范围、或比洗脱抗体时的盐浓度高10mM以上的盐浓度，例如可以设为0.5M以上或1.0M以上。关于清洗液的pH，相对于使抗体吸附时的pH可以设为同等或最多高2个pH单位的pH范围、或者相对于洗脱时的pH可以设为同等或最多低2个pH单位的范围。例如，清洗液的pH可以为比洗脱液的pH低0.2个pH单位的pH。清洗液的pH可以在pH4～8的范围内。另外，作为用于将糖链添加异构体洗脱去除的缓冲液(清洗液)的通液量，相对于色谱载体容积可以设为2倍载体容积(CV)以上、3CV以上、4CV以上、5CV以上、10CV以上、15CV以上、或20CV以上、或5～20CV、5～15CV、5～10CV、或10～20CV。
从抗体粗纯化物的负载至清洗为止的pH和/或盐浓度的变化可以是阶段性的(一阶段或一阶段以上、两阶段或两阶段以上、三阶段或三阶段以上、多阶段等)，也可以是连续的。从抗体粗纯化物的负载至清洗的pH范围通常在4～6的范围内。
上述盐浓度、pH和/或清洗液量的条件可以根据用作原料的抗体粗纯化物中的糖链添加异构体的含量及抗体的等电点、氨基酸序列等抗体自身特性等来适当设定。
本说明书中的、基于色谱的糖链添加异构体的分离方法可以包括使糖链添加异构体从色谱载体直接通过(flow-through，流穿)、接着洗脱仅在糖链添加共有区域添加有糖链的抗体的步骤，由此也能够制备非糖链添加异构体抗体的纯度高的纯化抗体组合物。直接通过(流穿)是指：在将抗体粗纯化物负载于填充有色谱载体的柱时，使糖链添加异构体不吸附于色谱载体而是直接被洗脱到柱外。此时，抗体粗纯化物中的糖链添加异构体有时与色谱载体具有弱相互作用，但是通过连续或间歇地通入平衡化缓冲液(期望为1倍柱容积以上)而能够将不需要的包含糖链添加异构体的成分排除到柱外。作为用于使糖链添加异构体特异性地直接通过的缓冲液，选择糖链添加异构体与色谱载体的相互作用和仅在糖链添加共有区域键合有糖链的抗体与色谱载体的相互作用相比足够弱的条件的缓冲液。通过使用足够量的该缓冲液仅使糖链添加异构体从色谱载体直接通过，从而能够仅使目标抗体吸附于色谱载体。接着，使用盐浓度等条件与上述缓冲液不同的缓冲液将所结合的抗体从色谱载体洗脱，从而制备期望的纯化抗体组合物。
作为仅使糖链添加异构体直接通过的缓冲液，只要与洗脱仅在糖链添加共有区域键合有糖链的抗体的洗脱液相比相差10mM以上的盐浓度(高10mM以上的盐浓度)和/或相差0.2个pH单位以上的pH(低0.2以上的pH)，则任意缓冲液均可以用作直接通过用清洗液。缓冲液的盐浓度可以相对于将非糖链添加异构体抗体从载体洗脱的盐浓度设为同等或高1M的盐浓度的范围(优选高0.5M的盐浓度的范围)。此时的盐浓度通常相对于洗脱抗体的盐浓度为100％以上的范围。或者，用相对于吸附抗体时的pH而言同等或最多高2个pH单位的pH范围的清洗液或相对于洗脱时的pH而言同等或最多低2个pH单位的pH范围的清洗液进行清洗。pH或/和盐浓度的变化可以是一个阶段也可以是多个阶段，还可以是连续的。另外，通常在将成为原料的抗体粗纯化物上样至色谱载体之前将该缓冲液的盐浓度、pH调节到合适的范围。作为用于使糖链添加异构体直接通过的缓冲液(清洗液)的通液量，选择为色谱载体量的2倍以上、期望为5倍以上的条件。作为清洗液的通液量，进一步期望为10～20倍以上。上述盐浓度、pH或/和清洗液量可根据用作原料的抗体粗纯化物中的糖链添加异构体的含量来适当设定。
对色谱载体的、抗体粗纯化物中的抗体的负载量即蛋白质负载量会影响到糖链添加异构体的分离能力，因此以使得到的纯化抗体组合物达到期望的收率及纯度(糖链添加异构体的含量)的方式来确定单位色谱载体的蛋白质负载量。通常，在色谱操作中，载体所能吸附的蛋白量有极限，以最大动态结合载量(DBC：Dynamic Binding Capacity)等参数为指标来管理色谱操作。通常，通过设为最大动态结合载量以下的蛋白质负载量，蛋白质的回收率及分离能力更为良好，可期待期望的色谱分离效果。另外，本发明的方法中，为了避免吸附不需要的糖链添加异构体，优选设为一定量以上的负载量，通过至少使每1g色谱载体的单位量或每1mL色谱载体的单位量负载20mg以上、25mg以上、30mg以上或35mg以上、且最大动态结合载量以下的蛋白质，由此来进行糖链添加异构体的分离·去除。蛋白质的负载量可以根据想要纯化的抗体粗纯化物中的糖链添加异构体的含量来决定。即，当色谱纯化前的抗体粗纯化物中的糖链添加异构体的含量多时，可以设为接近最大动态结合载量的负载量。
一方式中，本发明的方法包括下述步骤：根据供于分离的抗体的性质来选择所使用的常规色谱载体的步骤；对基于所选择的色谱载体的糖链添加异构体的分离去除进行优化的步骤。
选择色谱载体的步骤中，可以首先在上述的盐浓度及pH条件下使成为纯化对象的抗体粗纯化物负载于任意的2种以上色谱载体，并且选择仅在糖链添加共有区域添加有糖链的抗体的吸附量多的色谱载体。进而，可以根据需要用盐浓度阶段性降低或连续降低的洗脱液进行洗脱，测定通过载体的洗脱液中的糖链添加异构体和/或仅在糖链添加共有区域添加有糖链的抗体的量，选择得到糖链添加异构体的量少且仅在糖链添加共有区域添加有糖链的抗体的量多的洗脱液的色谱载体，作为糖链添加异构体的分离更为优异的色谱载体。
对基于所选择的色谱载体的糖链添加异构体的分离去除进行优化的步骤中，对负载时使用的缓冲液的组成、浓度及pH、添加的盐的种类及浓度、色谱载体的抗体粗纯化物负载量、清洗时的缓冲液的组成、浓度、pH、清洗次数及清洗液量、洗脱时的缓冲液的组成、浓度及pH、添加的盐的种类及盐浓度、以及它们的变更方法、糖链添加异构体的吸附或基于直接通过的去除等条件进行研究和选择。对这些进行优化的步骤可以对于各参数逐一进行优化，也可以使用实验设计法等统计分析方法在包括多个参数的相互作用的情况下选择最佳条件。
抗体的纯化方法有各种步骤。多种抗体的纯化工艺是通过两步以上的不同色谱模式来进行的，通常大多利用三步色谱来构建纯化工艺。例如，可以组合利用蛋白A亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、混合模式色谱、疏水相互作用色谱等中的2种以上。本发明的方法可以整合在这些抗体纯化工艺中的、利用常规色谱的抗体的色谱中的任意步骤中。具体而言，在第1步骤利用蛋白A亲和色谱、第2步骤利用阳离子交换色谱、第3步骤利用疏水相互作用色谱的纯化工艺中，可以将第3步骤的疏水相互作用色谱设为本发明的方法。另外，在第1步骤利用蛋白A亲和色谱、第2步骤利用混合模式色谱、第3步骤利用疏水相互作用色谱的纯化工艺的情况下，可以将第3步骤的疏水相互作用色谱设为本发明的方法。另外，在第1步骤利用蛋白A亲和色谱、第二步骤利用疏水相互作用色谱、第三步骤利用混合模式色谱的纯化工艺的情况下，可以将第2步骤的疏水相互作用色谱设为本发明的方法。进而，如果是第1步骤利用蛋白A亲和色谱、第2步骤利用阴离子交换色谱、第3步骤利用疏水相互作用色谱的纯化工艺，则可以将第3步骤的疏水相互作用色谱设为本发明的方法。另外，在这些色谱序列中，也可以将混合模式色谱的步骤与疏水相互作用色谱一起设为本发明的方法，或者不是将疏水相互作用色谱、而是将混合模式色谱的步骤设为本发明的方法。
根据本发明的方法，能够提供糖链添加异构体被有效去除、包含已减少至期望含量的量的糖链添加异构体的纯化抗体组合物。根据本发明的方法，能够使纯化后的纯化抗体组合物中的糖链添加异构体的量相对于全部抗体量的比例达到10％以下，更期望达到5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下或0.2％以下。另外，纯化前的抗体粗纯化物所含有的糖链添加异构体的量相对于全部抗体量的比例可以为50％以上、20％以上、10％以上或5％以上。本发明的方法可以是以20％以上、40％以上或50％以上的步骤收率得到减少了糖链添加异构体量的抗体的方法。
最终纯化抗体组合物或纯化后的抗体组合物中的、糖链添加异构体的含量及含有比例及纯化收率可以通过调整上述的色谱参数来达到，优选以糖链添加异构体被减少至任意的量、可得到抗体生产中可接受的纯化收率的方式来进行优化。
糖链添加异构体的去除情况可以通过分析评价用高效液相色谱(HPLC：HighPerformance Liquid Chromatography)或超高效液相色谱(UHPLC：Ultra HighPerformance Liquid Chromatography)来进行确认。这些分析中使用平均粒径为15μm以下的载体，通过超高流速且超高压下的色谱能够分离糖链添加异构体。例如TSKgel Butyl-NPR柱(平均粒径2.5μm、东曹公司)、TSKgel Phenyl-5PR柱(平均粒径10或13μm、东曹公司)、TSKgel Ether-5PW柱(平均粒径10μm、东曹公司)、TSKgel BioAssist Phenyl柱(平均粒径10μm、东曹公司)、Protein-Pak Hi Res HIC柱(Waters公司)、BioPro HIC柱(平均粒径2.3或4μm、YMC公司)、Proteomix HIC柱(平均粒径1.7或5μm、M&S Instruments Inc.)、AdvanceBio HIC柱(平均粒径3.5μm、Agilent公司)、MAbPac HIC-10LC柱(平均粒径5μm、ThermoFisher公司)、MAbPac HIC-20LC柱(平均粒径5μm、ThermoFisher公司)、MAbPac HIC-Butyl LC柱(平均粒径5μm、ThermoFisher公司)、Shim-pack Bio-HIC柱(平均粒径4μm、岛津制作所公司)、Shodex HIC PH-814(平均粒径10μm、昭光通商公司)、COSMOSIL HIC(平均粒径5μm、nacalai tesque公司)等是适合的。
通过本发明的方法纯化而得的纯化抗体组合物可以作为抗体药物的活性成分，作为人及动物的各种疾病的治疗药、预防药或诊断药来使用。
以下使用实施例更详细地说明本发明，但是其并非对本发明的范围进行限定。
实施例1
在抗体的糖链添加共有区域以外键合有糖链的抗体粗纯化物(培养上清)的制备和组成比的评价
作为糖链添加抗体，使用国际公开第2014/054820号中记载的、具有H链及L链(本申请中的H链：序列号64、L链：序列号72)的人源化抗人DLK-1单克隆抗体(以下称为“抗hDLK-1抗体”)。该抗体在其轻链可变区具有糖链添加共有序列，因此在与动物细胞等中表达该基因时，可能生成、混入包含糖链添加异构体的糖链组合物。
用具有编码抗hDLK-1抗体的氨基酸序列的基因的表达载体转化CHO细胞DG44株，制备稳定表达细胞株池DGC8-R-T11-14.2d。使用该细胞株池，用1L级别的DASGIP(注册商标)平行生物反应器系统(Eppendorf公司制)生物反应器进行培养。培养使用无血清的完全化学合成培养基，通过13天的补料分批法在pH7、34℃～37℃的条件下实施。将该培养上清用蛋白A色谱(MabSelect SuRe载体(Cytiva公司))进行纯化，得到抗体组合物。
＜抗体组合物的HIC-HPLC分析＞
按照以下条件对得到的抗体组合物进行HIC-HPLC分析。
HPLC装置：Prominence HPLC系统(岛津制作所)
分析柱：TSKgel Butyl-NPR柱(东曹、0014947；4.6mm×3.5cm、平均粒径2.5μm)
流动相A：包含2.3M硫酸铵的0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)
流动相B：0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.0)
分析条件：以蛋白质浓度2mg/mL×10μL注入、梯度为0～3分钟时0％ B、3～15分钟时0～100％ B、15～20分钟时100％ B、流速0.5mL/min、检测波长220nm或280nm
如图1所示，分离出三个峰，在洗脱时间13分钟附近检测到主峰(峰3)，在洗脱时间12.5分钟及12.0分钟附近分别检测到峰2及峰1。认为：峰3是仅在糖链添加共有区域键合有糖链的抗体，峰2是峰3的抗体上的另一位置也键合有糖链的糖链添加异构体，峰1是在峰3的抗体上的另外两个位置键合有糖链的糖链添加异构体(参照实施例2)。由该分析结果可确认，培养上述池株细胞而得到的抗体粗纯化物中包含约10％的糖链添加异构体。
实施例2
在抗体的糖链添加共有区域以外键合有糖链的抗体粗纯化物的制备
(培养上清)和糖链添加情况的确认
使用具有编码抗hDLK-1抗体的重链及轻链的氨基酸序列的基因序列的表达载体(pFUSE)、以及编码在该抗体的轻链的糖链键合共有序列(Asn-Ser-Ser)的第三个氨基酸上引入了点突变的变异序列(Asn-Ser-Ala)及重链的氨基酸序列的表达载体(pFUSE)，分别转化ExpiCHO细胞，进行抗体蛋白的瞬时表达。将其培养上清用蛋白A亲和色谱纯化，对于得到的抗体粗纯化物，在肽-N-糖苷酶F(PNGase F)处理或PNGase F非处理后用还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(银染色)进行分析。将变异前的抗hDLK-1抗体记作NSS抗体，将轻链的糖链键合共有序列变异后的抗hDLK-1抗体记作NSA抗体。
其结果如图2所示，NSS抗体的情况下，未经PNGase F处理的条件下在25kDa的轻链条带的上方观察到具有大于25kDa的分子量的条带，通过PNGase F处理，该条带消失。由此可确认，NSS抗体中，在具有除抗体的糖链添加共有区域以外的共有序列的轻链上键合有糖链。另一方面，NSA的情况下无论有无PNGase F处理均未观察到该条带。由这些结果可知，在源自瞬时表达的人源化抗DLK-1单克隆抗体(NSS抗体)的粗纯化物中，包含轻链上也添加有糖链的糖链添加异构体。
实施例3
基于疏水相互作用色谱载体的糖链添加异构体的分离1
与实施例1同样地将制备的包含抗hDLK-1抗体的培养上清用蛋白A亲和色谱纯化，得到包含约10％糖链添加异构体的该抗体的粗纯化物。向该抗体粗纯化物中以终浓度为1.0M的方式添加氯化钠后调节为pH5.0，作为用于负载于色谱载体的试样。
使用该抗体粗纯化物，通过吸附-脱附模式评价在填充有Capto Butyl(平均粒径90μm、Cytiva公司制)的疏水相互作用色谱柱(载体容量5mL)上的吸附特性。试样在柱上的负载量以单位载体的蛋白量计设为15mg/mL，流速设为300cm/h。通过以下的流动相条件实施色谱。
流动相A：包含1M氯化钠的20mM柠檬酸钠-15mM Tris缓冲液(pH5.0)
流动相B：20mM柠檬酸钠-15mM Tris缓冲液(pH5.0)
1.平衡化：100％流动相A；10倍柱容积(CV)
2.负载：抗体粗纯化物的试样
3.清洗：100％流动相A；10CV
4.线性梯度洗脱：40CV，0％流动相B至100％流动相B
5.柱清洗：1M氢氧化钠；5CV
图3示出洗脱色谱图(HIC389)。根据该结果，使用Capto Butyl载体且线性梯度条件下，确认到抗体成分向载体的吸附。对于负载于柱的试样、从Capto Butyl柱直接通过的级分及该柱上的吸附级分，通过实施例1的HIC-HPLC分析法进行评价，将结果示于图4。负载试样中以2.1％(峰1)及12.1％(峰2)包含的糖链添加异构体被去除到直接通过的级分(HIC389Flow-through)中，作为柱上的吸附级分(HIC389 Elute)，得到糖链添加异构体被去除的纯度100％的抗体(在糖链添加共有区域以外没有添加糖链的抗体)(峰3)组合物。
由以上的结果可知，通过使用疏水相互作用色谱载体(Capto Butyl)能够分离糖链添加异构体。可知，使用所选择的色谱载体时，糖链添加异构体被有效地去除到直接通过的级分中，作为吸附级分，得到了高纯度的纯化抗体组合物。
实施例4
基于疏水相互作用色谱载体的糖链添加异构体的分离2
与实施例1同样地将制备的包含人源化抗人DLK-1单克隆抗体的培养上清用蛋白A亲和色谱纯化，得到包含约10％的糖链添加异构体的该抗体的粗纯化物。向该抗体粗纯化物中以终浓度为1.0M的方式添加氯化钠后，将pH调节为4.5、4.7或5.0，将电导率设为70mS/cm以下，作为用于负载于色谱载体的试样。
使用该抗体粗纯化物，通过吸附-脱附模式评价在Capto Butyl(平均粒径90μm、Cytiva公司制)及POROS Benzyl Ultra(平均粒径50μm、Thermo Fisher公司制)各疏水相互作用色谱柱(载体容积5mL)上的吸附特性。在各柱上的蛋白质试样负载量以单位载体的蛋白量计为20mg/mL条件下实施，流速设为300cm/h。在以下的流动相条件下实施色谱。
流动相A：包含1M氯化钠的20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.5、4.7、或5.0)
流动相B：20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.5、4.7、或5.0)
1.平衡化：100％流动相A；5CV
2.负载：试样溶液
3.清洗：100％流动相A；8CV
4.清洗1：100％流动相A；5CV
5.清洗2：100％流动相B+0.8M氯化钠；5CV
6.洗脱：100％流动相B；10CV
7.柱清洗：水(适量)
8.柱清洗：1M氢氧化钠(适量)
将Capto Butyl和POROS Benzyl Ultra的洗脱色谱图分别示于图5A及图5B。任一pH条件下，抗体组合物均能够吸附于Capto Butyl载体、并且在其后能够洗脱。关于POROSBenzyl Ultra，也观察到良好的吸附和洗脱。具体而言，在图5A及图5B的图中，横轴0～50mL附近的峰是未被吸附的、从柱中直接通过而被洗脱的抗体(糖链添加异构体)，作为50～300mL的峰而洗脱出的抗体表示在糖链添加共有区域以外未添加糖链的抗体从柱中逐渐洗脱下来。Capto Butyl的情况下，不论pH如何，在清洗/洗脱的整个过程中均有抗体被洗脱，表明通过回收洗脱的中间组分能高纯度地得到在糖链添加共有区域以外未添加糖链的抗体。另外，Poros Benzyl Ultra的情况下，峰根据pH而变化(pH4.5时，抗体良好地吸附且在洗脱后半程从柱洗脱下来，pH5.0时，80％左右不吸附，抗体会在清洗中被洗脱)，因此表明可以根据pH来控制洗脱成分。根据以上结果，使用Capto Butyl及POROS Benzyl Ultra中任一者均能够分离糖链添加异构体，因此表明使用疏水相互作用色谱载体能够分离糖链添加异构体。另外，该结果表明，在疏水相互作用色谱中，通过优化清洗/洗脱液的pH、盐浓度及液体量，能够吸附抗体组合物，实现糖链添加异构体的去除。
实施例5
基于疏水相互作用色谱载体的负载时的盐浓度、清洗时的盐浓度及pH、洗脱缓冲液的种类的、糖链添加异构体去除效率(纯度及收率)的研究
对于Capto Butyl和POROS Benzyl Ultra色谱载体，研究通过分阶段洗脱能否去除糖链添加异构体。作为负载液，使用利用0.5M Tris将用蛋白A亲和色谱纯化而得的实施例1的抗体粗纯化物调整为pH4.5或pH5.0而得的液体。对作为参数的试样负载液的盐浓度、清洗液(清洗液I、清洗液II)的pH及盐浓度、以及洗脱缓冲液的种类及pH进行研究，测定抗体的收率及纯化级分的非糖链添加异构体抗体纯度(在糖链添加共有区域以外未添加糖链的抗体的纯度)(通过HIC-HPLC分析法测定糖链添加异构体的含量)。将试验结果示于表3。
[表3]
在各条件下实施的、利用Capto Butyl载体的纯化收率为23％～73％，通过HIC-HPLC分析得到的纯化抗体组合物的纯度(不含糖链添加异构体的抗体成分)为97.1％～99.3％。另一方面，POROS Benzyl Ultra载体的纯化收率稍低(33％～67％)，但是通过HIC-HPLC分析得到的纯化抗体组合物的纯度全部为100％。特别地，从纯度及收率的观点出发，在使用POROS Benzyl Ultra载体的条件下，负载包含0.8M氯化钠的试样且用包含0.8M氯化钠的清洗液I、包含0.6M氯化钠的清洗液II依次清洗、用pH6的柠檬酸钠缓冲液进行洗脱的条件最为适宜。
另外，根据一系列试验的结果可知以下结论。
(i)如果提高清洗液(清洗液I和/或清洗液II)的pH，则纯度会提高。
(ii)如果提高清洗液(清洗液I和/或清洗液II)的pH，则收率会降低。
(iii)如果提高洗脱液的pH，则纯度会提高。
(iv)如果提高洗脱液的pH，则收率会降低。
(v)如果降低负载液和/或清洗液的盐浓度，则收率会降低。
(vi)可以设定能够实现抗体组合物的纯度为95％以上、理想情况下为99％以上的条件。
如以上结果所示，可知在疏水相互作用色谱载体(例如Capto Butyl和POROSBenzyl Ultra)的情况下，通过对负载液的盐浓度及pH、清洗液的盐浓度及pH、清洗液量、清洗次数、洗脱时的pH及缓冲液的种类进行优化可以实现收率及糖链添加异构体的混入量的优化。
实施例6
用于控制糖链添加异构体的混入率及目标物质的纯度及收率的清洗条件的优化
与实施例1同样地将制备的包含抗hDLK-1抗体的培养上清用蛋白A亲和色谱纯化，得到包含约10％糖链添加异构体的该抗体的粗纯化物。向该抗体粗纯化物中以终浓度1.0M的方式添加氯化钠后，适当调整pH及导电率，作为用于负载于色谱载体的试样。使用该抗体粗纯化物，利用POROS Benzyl Ultra载体，将试样的负载量、清洗液I及清洗液II的液量作为输入参数，评价作为输出参数的收率及基于HIC-HPLC分析的纯度。
结果获知，通过将每单位量色谱载体的蛋白负载量调整为25g/L以上、将清洗液I及清洗液II调整为5～15倍柱容积(CV)，能够以97～100％的纯度将收率控制在40～80％(表4)。特别地，蛋白质的负载量为30g/L或35g/L的方式与为25g/L的方式相比，有得到的纯化抗体组合物的纯度高的倾向。另外，通过增加清洗液量，有得到的纯化抗体组合物的收率降低、但纯度提高的倾向。该结果表明，在蛋白质的负载量低的条件下，通过增加清洗液量可提高纯化抗体组合物的纯度。
即，该结果表明，通过在色谱中将蛋白质负载量设为一定量以上和/或适当地管理清洗液量，能够将糖链添加异构体的含量从约10％降低、管理到3～0％的范围。将通过实验设计法(DoE：Design of Experiment)来分析该结果而得的结果示于图6。以等高线图形式示出清洗液I及清洗液II的液量以及对收率及纯度的影响，可知可通过清洗液量实现任意的收率及纯度的管理。
[表4]
评价设计和缓冲液，用于疏水相互作用色谱的观察，使用Poros Benzyl Ultra
*运行重复进行三次
实施例7
糖链添加异构体去除步骤在纯化工艺中的位置及清洗液量对纯度的影响
与实施例1同样地将制备的包含抗hDLK-1抗体的培养上清用蛋白A亲和色谱进行纯化，得到包含约10％糖链添加异构体的该抗体的粗纯化物。将该抗体粗纯化物在pH3～4下保持一定时间并中和后作为用于负载于色谱载体的试样。
对于该抗体粗纯化物，通过图7所示的两种流程，按照在疏水相互作用色谱之后为混合模式色谱或者在混合模式色谱之后为疏水相互作用色谱的顺序进行纯化。疏水相互作用色谱载体使用POROS Benzyl Ultra，混合模式色谱载体使用Capto MMC。疏水相互作用色谱的条件如下所述。IDNo.HIC446、HIC457及HIC463在疏水色谱之后进行混合模式色谱，IDNo.HIC447在混合模式色谱后进行疏水色谱。
＜疏水相互作用色谱的条件＞
载体：POROS Benzyl Ultra
柱尺寸：260mL、柱床高13.3cm
流速：300cm/h
单位载体的蛋白负载量：30g/L
色谱条件：
1.平衡化：包含0.8M氯化钠的20mM柠檬酸钠(pH5.0)；5CV
2.负载：抗体粗纯化物的试样
3.清洗1：包含0.8M氯化钠的20mM柠檬酸钠(pH5.0)；6CV(HIC446/HIC447)、8CV(HIC457)或15CV(HIC463)
4.清洗2：包含0.6M氯化钠的20mM柠檬酸钠(pH5.0)；5CV
5.洗脱：20mM柠檬酸钠(pH6.0)；6.3CV
6.柱清洗：1M氢氧化钠水溶液；3CV
将疏水相互作用色谱步骤中得到的纯化抗体组合物的收率及纯度示于表5及图8。任一纯化流程中收率均为60％以上，基于HIC-HPLC分析的纯度(表示糖链添加异构体的混入量)得到了99％以上。另外获知，可以通过清洗1的液体量(6～15CV)来控制收率及纯度。即，可知抗体纯度为约90％的组合物在5CV的清洗时提高到98％左右、在8CV的清洗时提高到99％左右、在15CV的清洗时提高到99.5％左右。
[表5]
HIC色谱放大运行的结果
实施例8
包括糖链添加异构体去除步骤的纯化工艺(POROS Benzyl Ultra)
得到与实施例1同样制备的包含抗hDLK-1抗体的培养上清约200L。确认抗体粗纯化物中包含约10％糖链添加异构体。
将培养上清过滤，经过蛋白A亲和色谱(MabSelect SuRe 10L；Cytiva公司)、低pH病毒灭活、使用POROS Benzyl Ultra载体(Thermo Fisher公司、10L)的疏水相互作用色谱、使用Capto adhere载体(Cytiva公司、10L)的混合模式色谱、病毒过滤、置换为基于切向流过滤(TFF)的配方缓冲液、灭菌过滤等工序，得到高纯度的纯化抗体组合物。
POROS Benzyl Ultra色谱中，将每单位量载体的蛋白负载量调整为35g/L、30g/L、16g/L，实施3次色谱。将POROS Benzyl Ultra色谱步骤的条件及POROS Benzyl Ultra色谱步骤的结果分别示于表6及表7。
[表6]
[表7]
运行1 运行2 运行3
负载量 35g/L 30g/L 16g/L
收率 54％ 58％ 77％
纯度 100％ 100％ 89.74％
运行1及运行2的负载量在规定量以上的合适范围内，运行3的负载量为低至16g/L的条件。其结果是，虽然收率达到77％，但是表示糖链添加异构体混入量的HIC-HPLC纯度得到了低至89.74％的值。因此，仅将运行1及运行2的分级液合并供于之后的色谱步骤。
经过全部步骤最终得到的纯化抗体组合物的总收率为46％。另外，基于HIC-HPLC分析的纯化抗体组合物的纯度为100％，不含糖链添加异构体。由此，在抗体的色谱条件下也能够得到充分减少了糖链添加异构体的纯化抗体组合物。另外，还表明色谱载体的蛋白质负载量对糖链添加异构体的去除率而言是重要的。
实施例9
包括糖链添加异构体去除步骤的纯化工艺(Capto Butyl)
得到与实施例1同样制备的包含抗hDLK-1抗体的培养上清。确认抗体粗纯化物中包含约10％糖链添加异构体。
使用该培养液，按照蛋白A亲和色谱步骤(载体：MabSelect SuRe)、低pH病毒灭活步骤、疏水相互作用色谱步骤(Capto Butyl载体)、混合模式色谱步骤(Capto adhere)的顺序进行纯化。
如表8所示的结果，通过疏水性色谱步骤，提高了糖链添加异构体的非含有率，纯度为99.8％，以总收率25％获得纯化抗体组合物。
如该结果所示，可知即使使用POROS Benzyl Ultra载体以外的疏水相互作用色谱载体也能得到高纯度的纯化抗体组合物。
[表8]
实施例10
糖链添加异构体的制备和生物活性测定
对于与实施例1同样获得的包含约10％糖链添加异构体的抗hDLK-1抗体粗纯化物，使用实施例1中记载的HIC-HPLC分析系统精密制备各峰。分为约10次而实施制备，将各峰合并后，进行缓冲液交换而交换为等渗磷酸缓冲液。需要说明的是，制备中使用的HIC-HPLC的流动相条件变更为以下条件。
流动相A：包含2.3M硫酸铵的50mM磷酸缓冲液、pH7
流动相B：50mM磷酸缓冲液、pH7
对于制备前的抗体粗纯化物(a)、制备后的纯化抗体组合物(b、c)，使用实施例1所示的HIC-HPLC进行分析，将结果示于图9。
对于这些试样，从10μg/mL起以3倍公比进行稀释，用ADCC Reporter Bioassay试剂盒(Promega、G7010)在E：T比率为6：1(靶细胞为高表达DLK1的HEK293细胞株)、反应时间6小时的条件下测定ADCC活性。将其结果示于图10。制备前的抗体粗纯化物及制备后的主峰(图9中的(b))得到了几乎同样的sigmoid曲线，确认具有同等的生物活性。另一方面，通过制备而离析出的糖链添加异构体(图9中的(c))在任一浓度下均几乎未得到信号，可知无生物活性。由该结果可确认，糖链添加异构体为杂质，是作为生物药物的成分而言需要尽量去除的成分。
产业上的可利用性
根据本发明，能够制备Fc区糖链键合共有区域以外的糖链添加异构体减少的纯化抗体组合物并加以利用。
序列表
<110> 凯奥目生物科学株式会社（CHIOME Bioscience Inc.）
<120> 抗体组合物的纯化方法
<130> G2920WO
<150> JP 2021-079977
<151> 2021-05-10
<160> 78
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 重组DNA
<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 重组DNA
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(363)
<400> 35
caa gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gaa gtg aag aag cct ggg gcc 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
tca gtg aaa gtc tcc tgc aag ggt tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336
Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca 363
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 36
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
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gag tgg att gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac 240
Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
cag aag ttt aag ggc aag gcc aca atg act gtc gac aca tcc acc agc 288
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
aca gcc tat atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg 336
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
tat tac tgt gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac 384
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1356)
<400> 39
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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<400> 40
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser
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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg 480
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
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210 215 220
gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc 720
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa 768
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac 816
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 864
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
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agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg 1008
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca 1056
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa 1104
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac 1152
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc 1200
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc 1248
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag 1296
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc 1344
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1392
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 42
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 42
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1 5 10 15
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85 90 95
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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1 5 10 15
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gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144
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gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192
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cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct 1344
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
ccg ggt aaa tga 1356
Pro Gly Lys
450
<210> 44
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1413)
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Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
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tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc 1392
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450 455 460
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Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 46
<211> 470
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 46
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<220>
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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
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<220>
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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
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Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
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Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
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Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
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tac tgg ggt caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag 432
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<223> 人工构建体
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465 470
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<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1356)
<400> 55
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工构建体
<400> 56
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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
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<223> 人工构建体
<400> 58
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
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290 295 300
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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
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355 360 365
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 59
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1356)
<400> 59
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1 5 10 15
tca gtg aaa gtc tcc tgc aag gct tcc ggc tac aca ttc act gat tat 96
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20 25 30
gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggc ctg gag tgg att 144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
gga gtt att agt act tac tat ggt aat aca aac tac aac cag aag ttt 192
Gly Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
aag ggc cga gcc aca atg act gtc gac aaa tcc acc agc aca gcc tat 240
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65 70 75 80
atg gaa ctt agg agc ttg aga tct gac gat act gcc gtg tat tac tgt 288
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85 90 95
gca aga gga gga ttg cga gag tat tac tat gct atg gac tac tgg ggt 336
Ala Arg Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384
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115 120 125
gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg 432
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450
<210> 60
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 60
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Pro Gly Lys
450
<210> 61
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1413)
<400> 61
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
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<222> (1)..(1356)
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caa gga acc atg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg 384
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tac tgt cag caa cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc 384
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
aag ctg gag atc aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc 432
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc 480
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg 528
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag 576
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc 624
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat 672
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt 720
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
tag 723
<210> 70
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 70
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Leu Met Phe Leu Leu Leu Trp Val Ser
1 5 10 15
Gly Ala Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20 25 30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg
65 70 75 80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe
130 135 140
Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys
145 150 155 160
Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val
165 170 175
Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln
180 185 190
Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser
195 200 205
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
210 215 220
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235 240
<210> 71
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 抗体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(663)
<400> 71
gac att gtc atg aca cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tca ctg gga 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
gag agg gcc act atc aac tgc aag tcc agt cag agc ctt ctg aat agt 96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
agc aat caa aag aac tat ttg gcc tgg tac cag cag aaa cca gga cag 144
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
cct cct aaa ctt ctg gtc tac ttt gca tcc act agg gaa tct ggg gtc 192
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
cct gat cgc ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctt acc 240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
atc agc agt ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tac tac tgt cag caa 288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
cat tat agc act cct ccc aca ttc ggt cag ggg acc aag ctg gag atc 336
His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
aaa cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat 384
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac 432
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc 480
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac 528
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac 576
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc 624
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 663
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 72
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工构建体
<400> 72
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 73
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CDRH1
<400> 73
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CDRH2
<400> 74
Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CDRH3
<400> 75
Gly Gly Leu Arg Glu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CDRL1
<400> 76
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CDRL2
<400> 77
Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CDRL3
<400> 78
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Pro Thr
1 5

Claims (27)

1.一种抗hDLK-1抗体组合物的纯化方法，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，
所述纯化方法包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于常规色谱，使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于所述色谱的载体；及
通过用洗脱液对所述载体进行洗脱，从而将吸附于所述载体的所述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，得到的所述纯化抗体组合物中的、在Fc区糖链添加共有区域以外的部位添加有糖链的糖链添加异构体的含量与所述抗体粗纯化物相比减少。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述常规色谱的载体为疏水相互作用色谱载体或混合模式色谱载体。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，所述常规色谱的载体的平均粒径为15μm以上。
4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，所述常规色谱的载体的平均粒径为20～100μm。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的纯化方法，其中，所述常规色谱的载体具有苄基或丁基。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的纯化方法，其中，每单位量的所述常规色谱的载体的蛋白质负载量为20mg/mL以上。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的纯化方法，其中，所述常规色谱的载体为疏水相互作用色谱载体，并且所述纯化方法包括下述步骤：将所述抗体粗纯化物负载于所述载体后，在洗脱前用清洗液清洗该载体。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述清洗液的盐浓度比所述洗脱液的盐浓度高10mM以上。
9.根据权利要求7或8所述的纯化方法，其特征在于，所述清洗液的盐浓度为0.5M以上。
10.根据权利要求7或8所述的纯化方法，其特征在于，所述清洗液的盐浓度为1.0M以上。
11.根据权利要求7～10中任一项所述的纯化方法，其中，所述清洗液的pH为比所述洗脱液的pH低0.2个pH单位以上的pH，并且在pH4～8的范围内。
12.根据权利要求7～11中任一项所述的纯化方法，其中，所述清洗通过通入2倍载体容积以上的清洗液来进行。
13.根据权利要求7～12中任一项所述的纯化方法，其特征在于，通过使用pH或/和盐浓度阶段性地或线性地变化的流动相来进行清洗及洗脱。
14.根据权利要求7～13中任一项所述的纯化方法，其中，所述洗脱液的盐浓度为0.5M以下或不含盐，并且pH为5～7。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的纯化方法，其中，收率为20％以上。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的纯化方法，其中，所述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例为5％以下。
17.根据权利要求16所述的纯化方法，其中，所述抗体粗纯化物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例大于5％。
18.根据权利要求1所述的抗hDLK-1抗体组合物的纯化方法，其包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱；
使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于所述载体；
通过用pH4～6的清洗液将所述载体清洗1次以上而去除糖链添加异构体；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于所述载体的所述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，所述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与所述抗体粗纯化物相比降低。
19.根据权利要求1所述的抗体组合物的纯化方法，其包括下述步骤：
将盐浓度已调整为0.5M以上的所述抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱，将糖链添加异构体去除到直接通过的级分中；
将所述载体用清洗液清洗；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于所述载体的所述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，所述纯化抗体组合物中的、糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与所述抗体粗纯化物相比降低。
20.根据权利要求1所述的抗体组合物的纯化方法，其包括下述步骤：
将已调节成pH4～6的所述抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱，将糖链添加异构体去除到直接通过的级分中；
将所述载体用清洗液清洗；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于所述载体的所述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，所述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与所述抗体粗纯化物相比降低。
21.根据权利要求1～20中任一项所述的方法，其中，每单位量的所述常规色谱的载体的蛋白质负载量为20g/L以上，并且所述清洗通过通入5倍载体容积以上的清洗液来进行。
22.一种在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体相对于全部抗体的比例为95％以上的抗体组合物的制造方法，其包括权利要求1～21中任一项所述的纯化方法。
23.一种抗hDLK-1抗体纯化组合物的制造方法，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，
所述制造方法包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于使用具有苄基或丁基的粒径20～100μm的载体的常规色谱；
使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于所述载体；
用包含0.5M以上的盐的清洗液将所述载体清洗1次以上而去除糖链添加异构体；及
用盐浓度为0.5M以下或不含盐且pH5～7的洗脱液将吸附于所述载体的所述抗体洗脱，得到纯化抗体组合物，
在此，所述纯化抗体组合物中的糖链添加异构体相对于全部抗体的比例与所述抗体粗纯化物相比降低。
24.一种抗体组合物，其通过权利要求22或23所述的制造方法而制造。
25.一种从抗hDLK-1抗体粗纯化物中去除在Fc区糖链添加共有区域以外的部位添加有糖链的糖链添加异构体的方法，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，
所述方法包括下述步骤：
将抗体粗纯化物负载于疏水相互作用色谱载体，使在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体吸附于所述载体；
将所述载体用清洗液清洗；及
通过用洗脱液进行洗脱，从而从所述载体上洗脱吸附于所述载体的所述抗体，得到纯化抗体组合物。
26.一种抗hDLK-1抗体组合物，所述抗hDLK-1抗体的重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，所述抗hDLK-1抗体组合物含有占全部抗体的95％以上的在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链的抗体。
27.一种抗hDLK-1抗体，其重链具有选自序列号2、4、6、8、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34及36中的氨基酸序列、且轻链具有序列号10或序列号12记载的氨基酸序列，所述抗hDLK-1抗体在Fc区糖链添加共有区域以外的部位未添加糖链。
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