TW202340249A - 生物活性降低之抗體變體 - Google Patents

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原愛
増田宗太
髙城美智
南部周介
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Abstract

在非限定的一態樣中，本揭示提供奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的結構變異體（抗體變體），特別是生物活性較奈莫利珠單株抗體低的結構變異體。又，本揭示也提供包含該變異體的含奈莫利珠單株抗體組合物、該變異體的減少方法、及分析方法。

Description

生物活性降低之抗體變體
本發明關於奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，例如生物活性較奈莫利珠單株抗體低的抗體變體。本發明也關於如此的抗體變體的含量比低的醫藥組合物。本發明更關於該抗體變體的偵測方法及分析方法。
抗體因為在血漿中的安定性高、副作用也少，作為醫藥品受到注目。其中IgG型的抗體藥物多數已上市，目前也有為數眾多的抗體藥物正在開發。一般而言，關於抗體藥物，除了有效成分的目標物質（抗體）以外，包括含有來自目標物質的結構變異體（抗體變體）之各種的構成成分。如此的結構變異體可分類為有效性及安全性與目標物質相等的目標物質相關物質、以及與目標物質不同的來自目標物質的雜質，也有因原料藥的製作過程的條件而使產率變動者。如此，由於抗體藥物存在不一致性，因此對於各構成成分設定原料藥及製劑的出貨規格及有效期間內的規格，要求管理抗體藥物的品質。
近年來，發現具有與介白素－31（IL－31）受體A（IL－31RA）結合、抑制IL－31向IL－31RA結合的功能的單株抗體（專利文獻1～3）。其中，由於抗IL－31RA抗體奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab；CIM331）經由作用為IL－31拮抗劑，抑制搔癢誘發性細胞激素的IL－31的功能，因此以異位性皮膚炎患者作為對象進行的臨床試驗，其結果最近被報導（非專利文獻1）。然而，在奈莫利珠單株抗體的原料藥及製劑的製造中，是否產生生物活性較奈莫利珠單株抗體降低的抗體變體、以及其含量比，皆未有報導。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：WO2007／142325 專利文獻2：WO2009／072604 專利文獻3：WO2010／064697 非專利文獻
非專利文獻1：N Engl J Med 2020; 383:141－150
發明所欲解決的問題
本發明鑒於如上之狀況所完成，以提供奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的結構變異體（抗體變體）、含該抗體變體的含奈莫利珠單株抗體組合物及其製造方法、該抗體變體的減少方法、及該抗體變體的分析方法為目的。 用以解決問題的手段
為了達成上述目的而致力研究的結果，本發明人等成功地確認含有奈莫利珠單株抗體為有效成分的醫藥組合物中所含的複數種抗體變體（奈莫利珠單株抗體的結構變異體）。又發現在這些抗體變體之中，包含生物活性（經由與IL－31受體結合而抑制IL－31訊息傳遞的活性）較奈莫利珠單株抗體低的抗體變體。更進一步地發現有效地偵測及分析該抗體變體的方法。
本揭示基於如此知識，在非限定的一實施態樣中，關於下述者： ［1］一種抗體變體，其為具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體的變體， （a）在從前述序列的N端側的第1位的位置的胺基酸殘基D、 （b）在從前述序列的N端側的第4位的位置的胺基酸殘基D、或 （c）在從前述序列的N端側的第5位的位置的胺基酸殘基D 為琥珀醯亞胺殘基或異天冬胺酸殘基。 ［2］如［1］之抗體變體，前述序列為CDR序列。 ［2.2］如［1］之抗體變體，前述序列為CDR3序列。 ［3］如［1］之抗體變體，前述序列為包含於重鏈的序列。 ［4］如［1］之抗體變體，具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體為下列任一者： （1）包含含有序列識別號1所載之CDR1、序列識別號2所載之CDR2、及序列識別號3所載之CDR3的重鏈可變區，以及含有序列識別號4所載之CDR1、序列識別號5所載之CDR2、及序列識別號6所載之CDR3的輕鏈可變區之抗體， （2）包含序列識別號7所載之重鏈可變區，以及序列識別號8所載之輕鏈可變區的抗體，或者 （3）包含序列識別號9所載之重鏈，以及序列識別號10所載之輕鏈的抗體。 ［5］如［1］之抗體變體，具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體為奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）。 ［6］如［1］至［5］任一項之抗體變體，在使用陰離子交換層析法進行分離的情形，滯留時間（retention time）較具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體短。 ［7］如［1］至［6］任一項之抗體變體，生物活性較具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體低。 ［1.2.0］一種醫藥組合物，包含如［1］至［7］任一項之抗體變體。 ［1.2.1］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，該醫藥組合物中，含異天冬胺酸殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為36%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含異天冬胺酸殘基的胜肽相對於該含異天冬胺酸殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為20%以下。 ［1.2.2］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，該醫藥組合物中，含異天冬胺酸殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為27.8%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含異天冬胺酸殘基的胜肽相對於該含異天冬胺酸殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為15%以下。 ［1.2.3］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，該醫藥組合物中，含異天冬胺酸殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為17.9%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含異天冬胺酸殘基的胜肽相對於該含異天冬胺酸殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為9.4%以下。 ［1.2.4］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，在使用陰離子交換層析法分離該醫藥組合物的情形，含有含異天冬胺酸殘基的抗體變體的峰面積相對於總峰面積的比例為40.3面積%以下、30.4面積%以下、或19.3面積%以下。 ［1.2.5］如［1.2.1］至［1.2.4］任一項之醫藥組合物，包含奈莫利珠單株抗體。 ［1.2.6］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，該醫藥組合物中，含琥珀醯亞胺殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為36%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含琥珀醯亞胺殘基的胜肽相對於該含琥珀醯亞胺殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為20%以下。 ［1.2.7］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，該醫藥組合物中，含琥珀醯亞胺殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為27.8%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含琥珀醯亞胺殘基的胜肽相對於該含琥珀醯亞胺殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為15%以下。 ［1.2.8］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，該醫藥組合物中，含琥珀醯亞胺殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為18.7%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含琥珀醯亞胺殘基的胜肽相對於該含琥珀醯亞胺殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為9.8%以下。 ［1.2.9］一種醫藥組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的醫藥組合物，在使用陰離子交換層析法分離該醫藥組合物的情形，含有含琥珀醯亞胺酸殘基的抗體變體的峰面積相對於總峰面積的比例為29.1面積%以下、21.6面積%以下、或13.8面積%以下。 ［1.2.10］如［1.2.6］至［1.2.9］任一項之醫藥組合物，包含奈莫利珠單株抗體。 ［1.2.11］如［1.2.0］至［1.2.9］任一項之醫藥組合物，其為用於異位性皮膚炎、透析搔癢症、及其他搔癢症之中的至少一種的治療及預防之中的一者或兩者的醫藥組合物。 ［1.2.12］一種治療或預防異位性皮膚炎、透析搔癢症、及其他搔癢症之中的至少一種之方法，包含投予如［1.2.0］至［1.2.9］任一項之醫藥組合物之步驟。 ［1.3.1］一種如［1］至［7］任一項之抗體變體的偵測方法，包括經由親和性層析法、離子交換層析法、順相層析法、逆相層析法、親水性交互作用層析法（HILIC）、疏水性交互作用層析法（HIC）、基於電荷的分離、粒徑排阻層析法（SEC）、凝膠滲透層析法（GPC）、或該等之組合，分離包含具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體或經酵素處理的該抗體的樣本之步驟。 ［1.3.2］如［1.3.1］之偵測方法，其特徵在於，該離子交換層析法為陰離子交換層析法。 ［1.3.3］如［1.3.2］之偵測方法，其特徵在於，該陰離子交換層析法使用內徑4.6～7.5mm、長度35～150mm、粒徑2.5～10μm的管柱，在管柱溫度25～50℃，經由pH6.0～10.0的移動相進行溶出。 ［1.3.4］如［1.3.2］或［1.3.3］之偵測方法，其特徵在於，該陰離子交換層析法使用內徑7.5mm、長度75mm、粒徑2.5μm的管柱，在管柱溫度40℃，經由含有250mmol／L氯化鈉的pH7.5的移動相進行溶出。 ［1.3.5］如［1.3.1］至［1.3.4］任一項之偵測方法，包括在分離含有經酵素處理的前述抗體的樣本的前述步驟之後，經由質量分析及／或紫外線吸收測量，定量胜肽之步驟。 ［1.3.6］如［1.3.1］至［1.3.5］任一項之偵測方法，其特徵在於，使用如［1］至［7］任一項之抗體變體作為標準物質（標準品）使用。 ［1.4.1］一種含有奈莫利珠單株抗體的組合物之製造方法，包括實施如［1.3.1］至［1.3.6］任一項之偵測方法之步驟。 ［1.4.2］一種含有奈莫利珠單株抗體的組合物之製造方法，包括經由親和性層析法、離子交換層析法、親水性交互作用層析法（HILIC）、疏水性交互作用層析法（HIC）、基於電荷的分離、粒徑排阻層析法（SEC）、凝膠滲透層析法（GPC）、或該等之組合，純化含有奈莫利珠單株抗體的溶液之步驟。 ［1.4.3］如［1.4.2］之製造方法，前述的純化步驟包括經由親和性層析法純化含有從產生奈莫利珠單株抗體的細胞所獲得的奈莫利珠單株抗體的組合物。 ［1.4.4］如［1.4.3］之製造方法，其特徵在於，經由前述親和性層析法純化後的含有奈莫利珠單株抗體的溶液的保持時間（hold time）為72小時以內，與較該保持時間長的情形相比，組合物中的如［1］至［7］任一項之抗體變體的含量比低。 ［1.4.5］如［1.4.4］之製造方法，其特徵在於，經由前述親和性層析法純化後的含有奈莫利珠單株抗體的溶液的保持時間為約24小時以內。 ［1.4.6］如［1.4.1］至［1.4.5］任一項之製造方法，其特徵在於，使用如［1］至［7］任一項之抗體變體作為標準物質（標準品）。 ［1.5.1.1］一種抑制如［1］至［7］任一項之抗體變體的含量比之方法，包括經由親和性層析法純化含有從產生具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體的細胞所獲得的抗體的組合物之步驟，與未包含該純化步驟的情形相比，組合物中的如［1］至［7］任一項之抗體變體的含量比低。 ［1.5.1.2］如［1.5.1.1］之方法，其特徵在於，經由前述親和性層析法純化後的含有奈莫利珠單株抗體的溶液的保持時間為48小時以內，與較該保持時間長的情形相比，組合物中的如［1］至［7］任一項之抗體變體的含量比低。 ［1.5.1.3］如［1.5.1.2］之方法，其特徵在於，經由前述親和性層析法純化後的含有奈莫利珠單株抗體的溶液的保持時間為約24小時以內。 ［1.5.1.4］如［1.5.1.1］至［1.5.1.3］任一項之方法，其特徵在於，使用如［1］至［7］任一項之抗體變體作為標準物質（標準品）。 ［1.6.1.1］一種組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的組合物，該抗體變體在使用陰離子交換層析法進行分離的情形，滯留時間（retention time）較奈莫利珠單株抗體短，且含有較奈莫利珠單株抗體多的異天冬胺酸殘基。 ［1.6.1.2］如［1.6.1.1］之組合物，前述抗體變體的含量率為40.3面積%以下、30.4面積%以下、或19.3面積%以下，且前述組合物含有奈莫利珠單株抗體。 ［1.6.2.1］一種組合物，其為包含如［1］至［7］任一項之抗體變體的組合物，該抗體變體在使用陰離子交換層析法進行分離的情形，滯留時間（retention time）較奈莫利珠單株抗體短，且含有較奈莫利珠單株抗體多的琥珀醯亞胺殘基。 ［1.6.2.2］如［1.6.2.1］之組合物，前述抗體變體的含量率為29.1面積%以下、21.6面積%以下、或13.8面積%以下，且前述組合物含有奈莫利珠單株抗體。 ［2.1.1.1］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，具有較由2個重鏈與2個輕鏈所構成的奈莫利珠單株抗體小的分子量。 ［2.1.1.2］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸彼此結合的2個重鏈所形成的結構。 ［2.1.1.3］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸彼此結合的2個輕鏈所形成的結構。 ［2.1.1.4］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸、與奈莫利珠單株抗體的重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸結合、而且重鏈的EU編號第227位及第230位的半胱胺酸在1個重鏈內結合的1個輕鏈與1個重鏈所形成的結構。 ［2.1.1.5］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸與游離的半胱胺酸結合的1個輕鏈所形成的結構。 ［2.1.1.6］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，其特徵在於，具有由奈莫利珠單株抗體的2個重鏈與1個輕鏈所構成，2個重鏈在EU編號第227位及第230位之2處的半胱胺酸彼此各自結合，而且在第1個重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸與在輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸結合，而且在第2個重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸與游離的半胱胺酸結合的結構。 ［2.1.2］一種醫藥組合物，其為包含［2.1.1.1］至［2.1.1.6］任一項之抗體變體的醫藥組合物，在該醫藥組合物中的全部抗體分子中，該抗體變體的比例為11.0 CPA%以下。 ［2.2.1］一種奈莫利珠單株抗體的抗體變體，其特徵在於，在奈莫利珠單株抗體的重鏈的Kabat編號第55位的天冬醯胺脫醯胺化。 ［2.2.2］一種醫藥組合物，其為包含［2.2.1］之抗體變體的醫藥組合物，來自該醫藥組合物經酵素分解後的該抗體變體的含脫醯胺化胜肽，相對於該含脫醯胺化胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為2.0%以下。 發明功效
本發明人等成功地確認生物活性較奈莫利珠單株抗體顯著地低的結構變異體（抗體變體）。如此的抗體變體有用於在含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物的品質評估上作為該變體的偵測／分析用的標準物質（標準品）。 又本發明人等找出控制（維持較低的）如此的抗體變體之天冬胺酸異構化變體的產生之方法，以及測量該變體的含量之方法（變體偵測／分析方法）。這些方法與習知方法相比生產率高，在奈莫利珠單株抗體的品質提升及品質管理上為重要技術。又，該抗體變體的含量比低的本發明之含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物有用於作為用於異位性皮膚炎、透析搔癢症及其他搔癢症之治療及／或預防的手段。
用以實施發明的形態
本發明之一實施態樣關於生物活性（例如，經由與IL－31受體結合而抑制IL－31訊息傳遞的活性）降低的抗體變體。這些抗體變體在經由本發明人等進行奈莫利珠單株抗體原料藥的分析中，被確認為天冬胺酸異構化變體（在奈莫利珠單株抗體中的至少一個天冬胺酸殘基改變成琥珀醯亞胺殘基的變體（Asu體）及改變為異天冬胺酸殘基的變體（isoAsp體））。本說明書中，「抗體變體」也稱為原抗體的結構變異體、或異構化體、異構性變體、或異構體。
奈莫利珠單株抗體是經由與IL－31受體結合而顯示抑制IL－31訊息傳遞的活性的人源化IgG2抗體，由辨識IL－31受體的重鏈與輕鏈所構成。具體地說，奈莫利珠單株抗體包含含有序列識別號1所載之CDR1、序列識別號2所載之CDR2、及序列識別號3所載之CDR3的H鏈可變區，以及含有序列識別號4所載之CDR1、序列識別號5所載之CDR2、及序列識別號6所載之CDR3的L鏈可變區。更具體地說，奈莫利珠單株抗體包含序列識別號7所載之H鏈可變區，以及序列識別號8所載之L鏈可變區的抗體。再更具體地說，奈莫利珠單株抗體包含序列識別號9所載之H鏈，以及序列識別號10所載之L鏈。又，在本說明書，奈莫利珠單株抗體與其變體分別記載，因此，用語「奈莫利珠單株抗體」不包含奈莫利珠單株抗體的變體（例如天冬胺酸異構化變體）。
CDR的定義之方法已知有Kabat等人的方法（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed （1991）, Bethesda, MD）、Chothia等人的方法（Science （1986） 233, 755－758）、基於抗原－抗體的接觸（Contact）領域的方法（J Mol Biol （1996） 262, 732－745）等。具體地，經由各方法的CDR定義如下。 CDR　  Kabat　　　     Chothia　　　        Contact L1　　  L24－L34　　  L24－L34　　　    L30－L36 L2　　  L50－L56　　  L50－L56　　　    L46－L55 L3　　  L89－L97　　  L89－L97　　　    L89－L96 H1　　 H31－H35B　   H26－H32／34　    H30－H35B （Kabat編號） H1　　 H31－H35　　  H26－H32　　　    H30－H35 （Chothia編號） H2　　 H50－H65　　  H52－H56　　　    H47－H58 H3　　 H95－H102　    H95－H102　　      H93－H101
在本揭示，所謂的抗體變體的生物活性降低，是指該生物活性與作為比較對象的抗體（例如，奈莫利珠單株抗體）的生物活性相比為低，較佳為統計學上顯著地低。在一態樣，本發明之抗體變體的生物活性，與作為比較對象的抗體（例如，奈莫利珠單株抗體）的生物活性相比，低10%以上，例如低15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、59%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、79%以上、80%以上、85%以上、或90%以上。在一態樣，本發明之抗體變體的生物活性（相對生物活性）相對於作為比較對象的抗體（例如，CIM331標準物質，即奈莫利珠單株抗體）的生物活性，為90%以下，例如85%以下、80%以下、75%以下、70%以下、65%以下、60%以下、55%以下、50%以下、45%以下、41%以下、40%以下、35%以下、30%以下、25%以下、21%以下、20%以下、15%以下、10%以下、或5%以下。
在一態樣，奈莫利珠單株抗體或其抗體變體的生物活性為對IL－31受體的中和活性。在一態樣，對IL－31受體的中和活性為抑制IL－31與IL－31受體結合的活性。在一態樣，對IL－31受體的中和活性為經由與IL－31受體結合而抑制IL－31訊息傳遞的活性（例如抑制IL－31依賴性的細胞增殖的活性）。如WO2010／064697所記載，奈莫利珠單株抗體（CIM331）對人IL－31RA及食蟹猴IL－31RA具有中和活性。如此的中和活性可經由例如WO2010／064697所記載的方法進行評估。
奈莫利珠單株抗體或其抗體變體是否抑制IL－31訊息傳遞，一方法為經由調查奈莫利珠單株抗體或其抗體變體是否抑制IL－31與IL－31受體的結合而確認。為了進行如此測量的方法可例如利用ELISA或流式細胞術的分析、利用表面電漿共振的分析等。例如利用ELISA的情形，將IL－31受體（或IL－31RA）蛋白質固定在盤上，準備經酵素標記的抗IL－31抗體等的次級抗體偵測在此處結合的IL－31蛋白質的量的系統，在該處添加奈莫利珠單株抗體或其抗體變體的情形時，經由測量被偵測的IL－31蛋白質的量是否減少，可評估奈莫利珠單株抗體或其抗體變體是否抑制IL－31與IL－31受體的結合。 又，另一方法為，奈莫利珠單株抗體或其抗體變體是否抑制IL－31訊息傳遞，也可調查經由IL－31作用於細胞所引發的生理活性是否因奈莫利珠單株抗體或其抗體變體而受到抑制來確認。前述的生理活性只要是可以經由任何方法定量或定性地測量的活性，沒有特別限制，可例如細胞增殖活性或蛋白質磷酸化活性、基因／蛋白質表現誘導活性等。例如，準備表面表現IL－31受體、對來自外部的IL－31刺激反應而誘導增殖活性的細胞，在該處添加奈莫利珠單株抗體或其抗體變體的情形時，經由測量因IL－31而被誘導的細胞增殖活性是否降低，可評估奈莫利珠單株抗體或其抗體變體是否抑制IL－31訊號。如此的細胞可使用自然表現IL－31受體的天然細胞，也可使用人工表現IL－31受體的基因重組細胞。基因重組細胞的較佳例如表現IL－31受體的Ba／F3細胞。又，也可使用Dillon等人的文獻（Nat Immunol （2004） 5, 752－760）的其他方法。
在本揭示，奈莫利珠單株抗體或其抗體變體抑制IL－31訊息傳遞的程度沒有特別限定，也可抑制例如10%以上，較佳為20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、或98%以上。
所謂「抗體」之用語以最廣義的意義使用，只要是顯示所欲的生物活性（例如，與抗原的結合活性），可為單株抗體、多株抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、抗體衍生物及抗體修飾物（Miller K et al. J Immunol. 2003, 170（9）, 4854－61）。抗體可為小鼠抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體，或者也可來自其他物種，也可人工合成。本說明書中所揭示之抗體可為免疫球蛋白分子的任意型（例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA）、型別（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2）或次型別。免疫球蛋白可來自任意物種（例如人、小鼠或兔）。又，「抗體」、「免疫球蛋白」及「免疫球蛋白」的用語具有互換性，以廣義的意思使用。 又，抗體不限於由2個重鏈與2個輕鏈所構成的抗體分子，也可為具有較小分子量的抗體片段。例如，具有以2個重鏈所形成的結構、以2個輕鏈所形成的結構、以1個輕鏈與1個重鏈所形成的結構、與游離的半胱胺酸結合的1個輕鏈所形成的結構、及以2個重鏈與1個輕鏈所形成的結構的分子，也包含於本說明書之抗體的定義。根據如此廣的定義，本發明之抗體變體也包含於抗體。因此，本說明書中之「醫藥組合物中的（全部）抗體分子」可包含抗體及其變體兩者。
作為抗體可使用以基因重組技術所生成的重組型抗體。重組型抗體可從融合瘤或產生抗體的致敏淋巴球等的產生抗體細胞，選殖編碼該等的DNA、插入載體、將此等導入宿主（宿主細胞）而使其產生。
在本發明，抗體可經由該技術領域之人士以公知方法而製造。具體地說，將編碼目標抗體的DNA插入表現載體。此時，插入表現載體使在控制表現區域例如促進子、啟動子的控制下表現。之後，經由此表現載體使宿主細胞轉形，表現抗體。此時可使用適當的宿主與表現載體的組合。
如此所得的抗體可從宿主細胞內或細胞外（培養基等）分離、純化。抗體的分離、純化可使用一般抗體純化所使用的分離、純化方法，不受限制。關於本發明之抗體及抗體變體的分離、純化，可適當選擇、組合例如層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、溶劑沉澱、溶劑萃取、蒸餾、免疫沉澱、SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電位電泳法、透析、再結晶等，分離、純化抗體。例如，在使用層析管柱的分離、純化中，可使用陰離子交換基質、陽離子交換基質、抗人IgG親和性基質、及蛋白質L基質等的多種基質。
雖不限於特定理論，但本發明之抗體變體可為在具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）的製造過程（例如純化步驟）中所產生的該抗體分子的結構變異體。在一方面，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，有至少1個（例如1個、2個、或3個）的胺基酸殘基改變。在一態樣，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，有1個以上3個以下、亦即1個、2個、或3個的胺基酸殘基改變。在特定的態樣中，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，在胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）中的至少1個（例如1個、2個、或3個）的胺基酸殘基改變。在特定的態樣中，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，在胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）中的1個以上3個以下、亦即1個、2個、或3個的胺基酸殘基改變。
在另一方面，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，SS鍵（半胱胺酸殘基彼此的結合或半胱胺酸殘基與游離的半胱胺酸的結合）的組合不同。在該方面的一態樣，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，胺基酸序列相同，但SS鍵（半胱胺酸殘基彼此的結合或半胱胺酸殘基與游離的半胱胺酸的結合）的組合不同，分子量也不同。在另一態樣，本發明之抗體變體與具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體分子（例如奈莫利珠單株抗體）相比，胺基酸序列不同，且SS鍵（半胱胺酸殘基彼此的結合或半胱胺酸殘基與游離的半胱胺酸的結合）的組合不同，分子量也不同。
在一方面，本發明關於具有下列特徵的抗體變體： •具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體（例如奈莫利珠單株抗體）的重鏈CDR內的1個或複數個天冬胺酸（Asp）殘基，改變為琥珀醯亞胺（Asu）殘基或異天冬胺酸（isoAsp）殘基； •與前述抗體（例如奈莫利珠單株抗體）相比，生物活性（經由與IL－31受體結合而抑制IL－31訊息傳遞的活性）極低； •生成量依賴經由親和性層析法純化前述抗體（例如奈莫利珠單株抗體）後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間（hold time）而增加。 在本說明書，具有如此特徵的抗體變體有稱為天冬胺酸異構化變體或天冬胺酸異構體。在特定的態樣，前述抗體為奈莫利珠單株抗體，前述胺基酸序列為奈莫利珠單株抗體的重鏈CDR3的序列。
在一態樣，本發明之天冬胺酸異構化變體為具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體的變體，其為 （a）在從前述序列的N端側的第1位的位置的胺基酸殘基D（Asp）、或 （b）在從前述序列的N端側的第4位的位置的胺基酸殘基D（Asp）、或 （c）在從前述序列的N端側的第5位的位置的胺基酸殘基D（Asp） 為琥珀醯亞胺殘基的抗體變體（在本說明書，稱為琥珀醯亞胺體或Asu體），或者為異天冬胺酸殘基的抗體變體（在本說明書，稱為異天冬胺酸體或isoAsp體）。琥珀醯亞胺體的琥珀醯亞胺殘基的位置較佳為從前述序列（序列識別號3）的N端側的第1位或第5位，特佳為從前述序列的N端側的第5位。 在特定的態樣，本發明之天冬胺酸異構化變體為具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體的變體，其為 （a2）在從前述序列的N端側的第1位及第5位的位置的胺基酸殘基D（Asp）、或 （b2）在從前述序列的N端側的第4位及第5位的位置的胺基酸殘基D（Asp）、或 （c2）在從前述序列的N端側的第1位及第4位的位置的胺基酸殘基D（Asp） 為琥珀醯亞胺（Asu）殘基或異天冬胺酸（isoAsp）殘基的抗體變體。如此的抗體變體之例為，從前述胺基酸序列（序列識別號3）的N端側的 第1位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的抗體變體； 第1位的位置為Asu殘基，且第5位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第1位及第5位的位置為Asu殘基的抗體變體； 第1位及第5位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第4位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的抗體變體； 第4位的位置為Asu殘基，且第5位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第4位及第5位的位置為Asu殘基的抗體變體； 第4位及第5位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第1位的位置為isoAsp殘基，且第4位的位置為Asu殘基的抗體變體； 第1位的位置為Asu殘基，且第4位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第1位及第4位的位置為Asu殘基的抗體變體；或者 第1位及第4位的位置為isoAsp殘基的抗體變體，較佳為， 第1位及第4位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第1位及第5位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第4位及第5位的位置為isoAsp殘基的抗體變體； 第1位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的抗體變體；或者 第4位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的抗體變體。 在特定的態樣，前述抗體為奈莫利珠單株抗體，前述胺基酸序列為奈莫利珠單株抗體的重鏈CDR3的序列。
在另一方面，本發明也關於天冬胺酸異構化變體的偵測方法及分析方法。在一態樣，本發明之方法包括經由親和性層析法、離子交換層析法、順相層析法、逆相層析法、親水性交互作用層析法（HILIC）、疏水性交互作用層析法（HIC）、基於電荷的分離、粒徑排阻層析法（SEC）、凝膠滲透層析法（GPC）、或該等之組合，分離含有具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體或經酵素處理的該抗體的樣本之步驟。在特定的態樣，本發明之方法包括在前述分離步驟之前，將含有抗體的樣本進行酵素處理之步驟。處理含有抗體的樣本之酵素例如胰蛋白酶、Lys－C，但不限於此等。在特定的態樣，本發明之方法包括在分離含有經酵素處理的前述抗體的樣本的前述步驟之後，經由質量分析及／或紫外線吸收測量，確認及／或定量胜肽之步驟。
在本發明之方法中，可將在具有序列識別號3的胺基酸序列的CDR中的天冬胺酸的結構有無改變作為指標進行偵測及分析。該結構的改變可將例如在LCMS分析中因為該結構改變所導致的分子量偏移或滯留時間（retention time）的偏移作為指標進行偵測。或者也可將經由離子交換層析法的分離度的差異作為指標，偵測前述的結構改變，例如在經由陰離子交換層析法進行分離的情形，與主成分奈莫利珠單株抗體的主要波峰（Main peak）相比，在鹼性側的區域（與主要波峰相比，滯留時間（retention time）短的區域）分離本發明之天冬胺酸異構化變體。
在本發明之方法的一態樣，離子交換層析法為陰離子（陰離子）交換層析法。在一態樣中，陰離子交換層析法以使用內徑4.6～7.5mm、長度35～150mm、粒徑2.5～10μm的管柱，在管柱溫度25～50℃，經由pH6.0～10.0的移動相進行溶出為特徵。在特定的態樣，陰離子交換層析法以使用內徑7.5mm、長度75mm、粒徑2.5μm的管柱，在管柱溫度40℃，經由含有250mmol／L氯化鈉的pH7.5的移動相進行溶出為特徵。
又，在一態樣，本發明之方法包括，以（i）本發明之天冬胺酸異構性變體，（ii）含有酵素分解該等所得的isoAsp殘基或Asu殘基的胜肽，或（iii）含有胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的胜肽，在從該序列的N端側的第1位、第4位、及第5位的位置之中的1個、2個、或3個的天冬胺酸（Asp、D）殘基改變為琥珀醯亞胺（Asu）殘基或異天冬胺酸（isoAsp）殘基的胜肽作為標準品使用，進行選自定量分析、定性分析、及結構分析所組成的群組之1個或複數個分析之步驟。（iii）的胜肽之例為，在從序列識別號3的胺基酸序列的N端側的第1位、第4位、及第5位的位置之中的1個改變為Asu殘基或isoAsp殘基的胜肽。（iii）的胜肽之另一例為，在從序列識別號3的胺基酸序列的N端側的第1位、第4位、及第5位的位置之中的2個改變為Asu殘基或isoAsp殘基的胜肽， 第1位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的胜肽； 第1位的位置為Asu殘基，且第5位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第1位及第5位的位置為Asu殘基的胜肽； 第1位及第5位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第4位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的胜肽； 第4位的位置為Asu殘基，且第5位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第4位及第5位的位置為Asu殘基的胜肽； 第4位及第5位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第1位的位置為isoAsp殘基，且第4位的位置為Asu殘基的胜肽； 第1位的位置為Asu殘基，且第4位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第1位及第4位的位置為Asu殘基的胜肽；或者 第1位及第4位的位置為isoAsp殘基的胜肽，較佳為， 第1位及第4位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第1位及第5位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第4位及第5位的位置為isoAsp殘基的胜肽； 第1位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的胜肽；或者 第4位的位置為isoAsp殘基，且第5位的位置為Asu殘基的胜肽。
在另一方面，本發明可經由實施上述之偵測方法及分析方法之中的1個或該等的組合，進行含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物的製造及品質管理。因此，本發明關於包含上述的偵測方法及分析方法的實施、或組合該等方法之步驟的含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物的品質管理方法。又，本發明也關於包含實施如此之偵測方法、分析方法、及品質管理方法之中的1個或複數個之步驟的含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物的製造方法。
在本發明之製造方法中，可經由親和性層析法、離子交換層析法、親水性交互作用層析法（HILIC）、疏水性交互作用層析法（HIC）、基於電荷的分離、粒徑排阻層析法（SEC）、凝膠滲透層析法（GPC）、或該等之組合，純化含有奈莫利珠單株抗體的溶液，製造天冬胺酸異構化變體的含量比低的含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物。天冬胺酸異構化變體的含量比低的如此的含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物，有用於作為用於奈莫利珠單株抗體發揮治療及／或預防效果的疾病，例如異位性皮膚炎、透析搔癢症及其他的搔癢症的治療及／或預防之手段。 在一態樣中，本發明之製造方法包括，培養插入編碼奈莫利珠單株抗體的基因的產生奈莫利珠單株抗體的細胞（例如CHO細胞）之步驟。該培養步驟可以適合產生奈莫利珠單株抗體的細胞（例如CHO細胞）培養的該技術領域之人士以公知條件來實施，例如可使用市售的基礎培養基（動物細胞培養用基礎培養基）。 在一態樣中，本發明之製造方法包括，離心及過濾產生奈莫利珠單株抗體的細胞的培養液、獲得含有奈莫利珠單株抗體的溶液（捕獲細胞培養液（Harvest Cell Culture Fluid：HCCF））之步驟。從所得的含有奈莫利珠單株抗體的溶液之奈莫利珠單株抗體的純化可經由一般的管柱層析法例如親和性層析法、離子交換層析法、疏水層析法等之組合而進行。在特定的態樣中，本發明之製造方法包括，經由親和性層析法（例如蛋白質A親和性層析法）純化從產生奈莫利珠單株抗體的細胞獲得的含有奈莫利珠單株抗體的溶液之步驟。經由親和性層析法純化後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間（hold time）沒有特別限定，但縮短該時間，可降低天冬胺酸異構化變體的含量比。因此，根據本發明之製造方法，為了維持在所得的含有奈莫利珠單株抗體的醫藥組合物中的抗體及抗體變體的生物活性在可容許的程度，經由親和性層析法純化後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間較佳在指定範圍內（例如約138小時以內、約72小時以內、約48小時以內、或約24小時以內）。
在另一方面，本發明關於一種醫藥組合物，其為包含具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體（例如奈莫利珠單株抗體）及其變體（例如天冬胺酸異構化變體）之醫藥組合物，在該醫藥組合物中的全部抗體分子（包含前述抗體及其變體）中，該變體的比例維持較低。如此的變體比例維持較低的本發明之醫藥組合物可較佳使用於異位性皮膚炎、透析搔癢症及其他搔癢症的治療及／或預防。在一態樣中，本發明之醫藥組合物為用於異位性皮膚炎、透析搔癢症及其他搔癢症之中的至少1個的治療及預防之中的一者或兩者之醫藥組合物。又，本發明也關於治療或預防異位性皮膚炎、透析搔癢症、及其他搔癢症之中的至少1個之方法，包括投予本發明之醫藥組合物之步驟。 在一態樣中，本發明之醫藥組合物可經由包括經由親和性層析法（例如蛋白質A親和性層析法）的純化之純化步驟所獲得。如前所述，例如將含有前述抗體（例如奈莫利珠單株抗體）的抗體溶液經由蛋白質A親和性層析法純化之後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間（例如18～28℃或18～23℃，較佳為室溫、18℃或23℃的保持時間）設定為短時間，可使在所得的組合物中的全部抗體分子中的天冬胺酸異構化變體的比例維持較低。
在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，天冬胺酸異構化變體的比例可經由包含上述的天冬胺酸異構化變體的偵測／分析方法之多種方法來評估。抗體等的蛋白質的分析方法已知例如透過經由酵素分解等使蛋白質分解為胜肽片段，以多種的層析法分離該等，進行質量分析或紫外線測量，獲得蛋白質的胺基酸序列或轉譯後修飾的資訊之胜肽圖譜（peptide mapping）法。亦如本案實施例所載，可經由胜肽圖譜法分析本發明之天冬胺酸異構化變體的結構及含量。
在一態樣中，在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，天冬胺酸異構化變體的比例可表示為，來自本發明之醫藥組合物經酵素分解所得的天冬胺酸異構化變體之含有琥珀醯亞胺殘基的胜肽及含有異天冬胺酸殘基的胜肽，相對於來自該變體的胜肽及對應的未經修飾的胜肽（具有修飾為琥珀醯亞胺殘基或異天冬胺酸殘基的修飾部位為天冬胺酸、其他與來自該變體的胜肽相同的胺基酸序列的未修飾胜肽）的總和的比例（在本說明書中，也稱為在胜肽單位的天冬胺酸異構化變體的比例）。分解酵素可使用例如胰蛋白酶、Lys－C等。本發明之醫藥組合物中在胜肽單位的異天冬胺酸體（isoAsp體）的比例（與在胜肽單位的天冬胺酸體相比的比例）為，例如25%以下、20%以下、15%以下、或9.4%以下。又本發明之醫藥組合物中，在胜肽單位的琥珀醯亞胺體（Asu體）的比例（與在胜肽單位的天冬胺酸體相比的比例）為，例如25%以下、20%以下、15%以下、或9.8%以下。
又，如本案實施例6所記載，來自經酵素分解後所得的天冬胺酸異構化變體之含有琥珀醯亞胺殘基的胜肽及含有異天冬胺酸殘基的胜肽，相對於來自該變體的胜肽及對應的未經修飾的胜肽（具有修飾為琥珀醯亞胺殘基或異天冬胺酸殘基的修飾部位為天冬胺酸、其他與來自該變體的胜肽相同的胺基酸序列的未修飾胜肽）的總和之比例（在胜肽單位的天冬胺酸異構化變體的比例），與以陰離子交換層析法（AE－HPLC）的天冬胺酸異構化變體溶出峰群的峰面積相對於總峰面積的比例（峰面積比）有相關性（第3圖）。因此，在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，天冬胺酸異構化變體的比例，可以陰離子交換層析法（AE－HPLC）分析本發明之醫藥組合物時的琥珀醯亞胺體（Asu體）或異天冬胺酸體（isoAsp體）溶出峰群的峰面積之總和，相對於總峰面積的比例（峰面積比）來表示。此評估方法相較於經由胜肽圖譜法的偵測／分析，生產率高，在奈莫利珠單株抗體的品質管理上有利。
在一態樣中，以陰離子交換層析法（AE－HPLC）分析本發明之醫藥組合物時的異天冬胺酸體（isoAsp體）及琥珀醯亞胺體（Asu體）的溶出分劃，與含有本發明之醫藥組合物的主成分奈莫利珠單株抗體的主要波峰相比，為鹼性側的區域（滯留時間（retention time）較主要波峰短的區域），在本說明書中也稱為前區域（Pre－Region）。在包含此區域（前區域）所含的8個波峰的區域中，在包含靠近含有奈莫利珠單株抗體的主要波峰的3個波峰的區域（在本說明書也稱為前區域 1），主要溶出異天冬胺酸體（isoAsp體），在包含其餘的5個波峰的區域（在本說明書也稱為前區域 2），主要溶出琥珀醯亞胺體（Asu體）。因此，在經由使用陰離子交換層析法（AE－HPLC）的本發明之分析方法進行評估的情形，在本發明之醫藥組合物中的全部抗體分子中，異天冬胺酸體（isoAsp體）、琥珀醯亞胺體（Asu體）的比例（在抗體單位的比例）可分別以前區域 1、前區域 2的峰面積的比例來表示。
在一態樣中，在經由使用陰離子交換層析法（AE－HPLC）的本發明之分析方法進行評估的情形，在本發明之醫藥組合物中的全部抗體分子中，異天冬胺酸體（isoAsp體）的比例（前區域 1的面積比例）為例如50.2面積%以下、40.3面積%以下、30.4面積%以下、或19.3面積%以下。在一態樣中，在經由使用陰離子交換層析法（AE－HPLC）的本發明之分析方法進行評估的情形，在本發明之醫藥組合物中的全部抗體分子中，琥珀醯亞胺體（Asu體）的比例（前區域 2的面積比例）為例如36.6面積%以下、29.1面積%以下、21.6面積%以下、或13.8面積%以下。
再者，如本案之實施例6所載，根據在胜肽單位的天冬胺酸異構化變體的比例，可基於二項分布計算理論上在抗體單位的天冬胺酸異構化變體的最大比例。 基於在胜肽單位的天冬胺酸異構化變體的比例所計算，在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中的異天冬胺酸體（isoAsp體），相對於該isoAsp體及未經修飾的抗體的總和之比例（在抗體單位的比例）為例如43.8%以下、36.0%以下、27.8%以下、或17.9%以下。又，在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，2個重鏈含有isoAsp殘基的isoAsp體在抗體單位的比例，為例如6.3%以下、4.0%以下、2.3%以下、或0.9%以下。在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，2個之中的1個重鏈含有isoAsp殘基的isoAsp體在抗體單位的比例，為例如37.5%以下、32.0%以下、25.5%以下、或17.0%以下。 相同地，在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中的琥珀醯亞胺體（Asu體），相對於該Asu體及未經修飾的抗體的總和之比例（在抗體單位的比例），為例如43.8%以下、36.0%以下、27.8%以下、或18.7%以下。又，在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，2個重鏈含有Asu殘基的Asu體，相對於該Asu體及未經修飾的抗體的總和之比例，為例如6.3%以下、4.0%以下、2.3%以下、或1.0%以下。在本發明之醫藥組合物中的抗體分子中，2個之中的1個重鏈含有Asu殘基的Asu體，相對於該Asu體及未經修飾的抗體的總和之比例，為例如37.5%以下、32.0%以下、25.5%以下、或17.7%以下。
在另一方面，本發明關於天冬胺酸異構化變體的含量比維持較低的醫藥組合物之製造方法；以及抑制天冬胺酸異構化變體的生成之方法。經由設定含有具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體（例如奈莫利珠單株抗體）之抗體溶液以親和性層析法（例如蛋白質A親和性層析法）純化後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間（hold time）短，可使天冬胺酸異構化變體的生成量維持較低。因此，上述方法包括，經由親和性層析法（例如蛋白質A親和性層析法）純化含有來自產生具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體（例如奈莫利珠單株抗體）的細胞所得的抗體的組合物之步驟，經由該親和性層析法純化後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間短為特徵。在一態樣中，經由親和性層析法純化後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間（例如18～28℃或18～23℃，較佳為室溫、18℃或23℃的保持時間）為約138小時以內，例如約72小時以內、約48小時以內、或約24小時以內，較佳為約48小時以內，更佳為約24小時以內。
在另一方面，本發明關於一種純化方法，其為含抗體組合物的純化方法，包括經由親和性層析法（例如蛋白質A親和性層析法）純化含抗體組合物（例如離心及過濾產生抗體細胞的培養液所得的HCCF（捕獲細胞培養液（Harvest Cell Culture Fluid））之步驟。在該方法的一態樣中，抗體為具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體。在特定的態樣中，抗體為奈莫利珠單株抗體。在該方法的一態樣中，經由親和性層析法純化後的含抗體溶液到下一步驟的保持時間（例如18～28℃或18～23℃，較佳為室溫、18℃或23℃的保持時間）為約138小時以內，例如約72小時以內、約48小時以內、或約24小時以內，較佳為約72小時以內，更佳為約48小時以內，再更佳為約24小時以內。
在另一方面，本發明關於具有下列任一結構的抗體變體： （1）以奈莫利珠單株抗體的重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸彼此結合的2個重鏈所形成的結構（HH二聚體）； （2）以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸彼此結合的2個輕鏈所形成的結構（LL二聚體）； （3）以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸、與奈莫利珠單株抗體的重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸結合，而且重鏈EU編號第227位及230位的半胱胺酸在1個重鏈內結合之1個輕鏈與1個重鏈所形成的結構（HL體）； （4）以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸與游離的半胱胺酸結合的1個輕鏈所形成的結構（半胱胺酸化輕鏈（Cysteinylated light chain））；或者 （5）由奈莫利珠單株抗體的2個重鏈與1個輕鏈所構成，2個重鏈在EU編號第227位及第230位2處的半胱胺酸彼此各自結合，而且第1個重鏈EU編號第224位的半胱胺酸與輕鏈EU編號第214位的半胱胺酸結合，而且第2個重鏈EU編號第224位的半胱胺酸與游離的半胱胺酸結合的結構（半胱胺酸化HHL體（Cysteinylated HHL））。 具有如此結構的抗體變體為，具有分子量較由2個重鏈與2個輕鏈所構成的奈莫利珠單株抗體小的低分子量變體（LMWS：Low molecular weight species），在本說明書也稱為奈莫利珠單株抗體的低分子量變體。更在另一方面，本發明關於一種醫藥組合物，其為含有奈莫利珠單株抗體及其低分子量變體（LMWS）之醫藥組合物，在該醫藥組合物中的全部抗體分子中，該低分子量變體的比例維持較低（例如，該比例為11.0CPA（校正峰面積（Corrected Peak Area））%以下）。
在另一方面，本發明關於在奈莫利珠單株抗體的重鏈的Kabat編號第55位的天冬醯胺脫醯胺化的抗體變體，以及含有該抗體變體的醫藥組合物。在一態樣中，來自該醫藥組合物經酵素分解後的該抗體變體之含脫醯胺化胜肽，相對於該含脫醯胺化胜肽及對應的未經修飾的胜肽的總和之比例為2.0%以下。
在本說明書使用時，「包括（comprising）…」所表的態樣包含「實質上由…所構成（essentially consisting of）」所表的態樣、以及「由…所構成（consisting of）」所表的態樣。
本說明書所載之數值為因為例如機器、測量條件、該技術領域之人士的技術可在一定範圍內變動者，只要是能夠達成本發明之目的的範圍內，例如約10%的變動是可能的。
本說明書中明確引用的所有的專利及參考文獻之內容全部併入本說明書作為參照。 本發明根據下列實施例進一步舉例，但不限於下述實施例。 實施例
［實施例1］含奈莫利珠單株抗體溶液經由陰離子交換高效液相層析法（AE－HPLC）的分離 ［1.1］含奈莫利珠單株抗體溶液的調製 亦記載於WO2010／064697的抗人IL－31RA抗體之奈莫利珠單株抗體（別名：CIM331；H鏈：序列識別號9，L鏈：序列識別號10），根據前述的專利文獻的記載，以此技術領域之人士公知方法製作。簡單地說，經由包括培養含有導入編碼奈莫利珠單株抗體的基因之載體的宿主細胞之步驟，以及純化含有培養步驟所得的奈莫利珠單株抗體的溶液之步驟的方法，製作含奈莫利珠單株抗體溶液（原料藥）。又，使用此原料藥，根據WO2021／100794記載之方法，製作奈莫利珠單株抗體製劑。
［1.2］含奈莫利珠單株抗體溶液經由陰離子交換高效液相層析法的分離 取含奈莫利珠單株抗體溶液，加入移動相A，調製成奈莫利珠單株抗體0.5mg／mL（奈莫利珠單株抗體及其變體的總和濃度），作為樣本溶液。移動相A為空白試驗液。對於樣本溶液及空白試驗液20μL（在使用TSK DEAE NPR（内徑4.6mm，長度35mm，粒徑2.5μm）及鹽濃度梯度條件1的情形，為10μL），以下列條件經由陰離子交換高效液相層析法進行分離試驗。
［試驗條件］ 偵測器：紫外／可見光分光光度計（測量波長280nm） 管柱：TSK DEAE NPR（内徑4.6mm，長度35mm，粒徑2.5μm）、TSK DEAE NPR（内徑7.5mm，長度75mm，粒徑2.5μm）或該等的同等品 保護管柱：TSK guard column DEAE NPR（内徑4.6mm，長度5mm，粒徑5.0μm） 管柱溫度：40℃左右的固定溫度 移動相A：25mmol／L Tris緩衝液，pH7.5±0.1 移動相B：含250mmol／L氯化鈉的25mmol／L Tris緩衝液，pH7.5±0.1 流量：1.0mL／分鐘 移動相的輸送液：使移動相A及移動相B的混合比如下述變動進行濃度梯度控制。
［表1］ 鹽濃度梯度條件1
時間 (分鐘) 0 5 45
移動相A (vol%) 60 60 0
移動相B (vol%) 40 40 100
［表2］ 鹽濃度梯度條件2
時間 (分鐘) 0 5 45 55 65
移動相A (vol%) 60 60 30 0 0
移動相B (vol%) 40 40 70 100 100
使用TSK DEAE NPR（内徑4.6mm，長度35mm，粒徑2.5μm）作為管柱，以上述濃度調整條件1進行分離之結果，獲得第1A圖所示之層析圖。另一方面，使用TSK DEAE NPR（内徑7.5mm，長度75mm，粒徑2.5μm），以上述濃度調整條件2進行分離之結果，獲得第1B圖所示之層析圖。
如第1A～B圖所示，滯留時間（retention time）較含有主要波峰（Main peak）的主要區域（Main Region）早（滯留時間短）的區域（包含以較主要區域低的鹽濃度溶出的分劃的區域）定義為前區域（Pre－Region），滯留時間較主要區域晚（滯留時間長）的區域（包含以較主要區域高的鹽濃度溶出的分劃的區域）定義為後區域（Post－Region）。又將前區域中的各峰依照接近主要區域的順序（即依照滯留時間晚的順序）定義為b1～b8峰，將後區域中的各峰依照接近主要區域的順序（即依照滯留時間早的順序）定義為a1～a6峰。對於前區域，依照滯留時間晚的順序，分別定義為前區域 1（包含b1～b3峰的區域）與前區域 2（包含b4～b8峰的區域）。
比較第1A圖及第1B圖時，第1B圖的b1峰與主要波峰的分離良好。所以，下述的分離條件使用第1B圖的條件（管柱：TSK DEAE NPR（内徑7.5mm，長度75mm，粒徑2.5μm），鹽濃度梯度條件：表2）。
第1B圖所示的前區域 1、前區域 2、後區域的各峰所含的奈莫利珠單株抗體的變體的資訊整理如下列表3。表3所記載的生物活性是如實施例5所記載評估的結果。
［表3］
區域名 峰名 與CIM331標準物質相比之相對生物活性(%) 與主要波峰相比之相對生物活性(%) 特徵
前區域2 b8 23±18 21±17 Asu103於HC
b4+b5+b6+b7 89±5 80±4 Asu103於HC
前區域1 b2+b3 73±12 66±11 Asu103於LMWS之HC（HH二聚體、LL二聚體（樞紐二硫化物錯接結構(Hinge disulfide scrambling structure)）等）
b1 45±7 41±6 IsoAsp於CDR (Asp99/102/103)於LMWS之 HC
後區域 a1 110±6 100±6 於LMWS之HC中的Asn384的脫醯胺化（HHL-Cys、L-Ccys等）
a2+a3 110±7 100±6 LMWS (HL)等
a4 90±5 82±5 結構變異體
a5 88±6 79±6 於HMWS之HC中的Asn55的脫醯胺化
a6 94±4 85±4 於HMWS之HC中的Asn55的脫醯胺化
HC：重鏈；LMWS：低分子量物種 (Low molecular weight species)；HMWS：高分子量物種 (High molecular weight species)
［實施例2］在前區域 2的天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）的評估 以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以含有鹽酸胍的pH5.5的改性劑溶液稀釋後，以三（2－羧乙基） 膦進行還原。之後，以含有2－嗎啉乙烷磺酸及尿素的pH5.5的分解緩衝液進行緩衝液置換後，以胰蛋白酶進行分解反應。 在所得的分解反應液加入甲酸，注入逆相高效液相層析法進行分離，以質量分析器進行胜肽的確認及在胜肽單位的修飾比例的計算。在胜肽單位的關注對象的修飾比例是從MS層析圖中的峰面積所求得，此等作為在胜肽單位的關注對象的變體的比例。由於證實在MS層析圖上未修飾胜肽的波峰與部分含有isoAsp殘基的胜肽的波峰重疊，因此在胜肽單位的修飾比例由下列算式求得。 在胜肽單位的修飾比例（%）=（關注對象的已修飾胜肽 *1的峰面積）÷{（關注對象的已修飾胜肽的峰面積）+（對應關注對象的已修飾胜肽的未修飾胜肽 *2的峰面積）－（部分含有isoAsp殘基的胜肽的峰面積）}×100 （*1：表示來自天冬胺酸異構化變體的含有isoAsp殘基的胜肽或含有琥珀醯亞胺殘基的胜肽） （*2：表示在已修飾胜肽的修飾位置外與已修飾胜肽具有相同的胺基酸序列之未經修飾的原始(Native)體的胜肽）
分析結果為，在全部的AE－HPLC的波峰中，在含有前區域 2的部分波峰的b8峰的分劃中，偵測出最高水平的含有琥珀醯亞胺殘基的胜肽。具體地說，偵測出在b8峰的Asp103（Kabat編號第99位的Asp殘基）改變（修飾）為琥珀醯亞胺殘基（Asu103）的比例為54.0%。另一方面，Asp99（Kabat編號第95位的Asp殘基）修飾為琥珀醯亞胺殘基的修飾率低（2.7%），又未偵測到（Not detected）Asp102（Kabat編號第98位的Asp殘基）修飾為琥珀醯亞胺殘基的修飾以及Asp99、Asp102、Asp103修飾為isoAsp殘基的修飾。
如此證實，與以實施例1所載的管柱及移動相所分離、獲得的含有主成分奈莫利珠單株抗體的主要波峰（Asu99及Asu102：未偵測到，Asu103：3.4%）相比，天冬胺酸異構化變體（Asu體）主要在前區域 2溶出。
［實施例3］在前區域 1的天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）的評估 同實施例2，以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以含有鹽酸胍的pH5.5的改性劑溶液稀釋後，以三（2－羧乙基） 膦進行還原。之後，以含有2－嗎啉乙烷磺酸及尿素的pH5.5的分解緩衝液進行緩衝液置換後，以胰蛋白酶進行分解反應。 在所得的分解反應液加入甲酸，注入逆相高效液相層析法進行分離，以質量分析器進行胜肽的確認及在胜肽單位的修飾比例的計算。在胜肽單位的關注對象的修飾比例是從MS層析圖中的峰面積所求得，此等作為在胜肽單位的關注對象的變體的比例。由於證實在MS層析圖上未修飾胜肽的波峰與部分含有isoAsp殘基的胜肽的波峰重疊，因此在胜肽單位的修飾比例由下列算式求得。 在胜肽單位的修飾比例（%）=（關注對象的已修飾胜肽 *1的峰面積）÷{（關注對象的已修飾胜肽的峰面積）+（對應關注對象的已修飾胜肽的未修飾胜肽 *2的峰面積）－（部分含有isoAsp殘基的胜肽的峰面積）}×100 （*1：表示來自天冬胺酸異構化變體的含有isoAsp殘基的胜肽或含有琥珀醯亞胺殘基的胜肽） （*2：表示在已修飾胜肽的修飾位置外與已修飾胜肽具有相同的胺基酸序列之未經修飾的原始體的胜肽）
理論上IsoAsp體被認為有下列三種結構體（上段在Asp99修飾為isoAsp殘基，中段在Asp102修飾為isoAsp殘基，下段在Asp103修飾為isoAsp殘基），但是這些之中，並未確定異構化實際發生在哪一個Asp部位。在分子量隨著結構改變而改變的情形，經由胜肽圖譜的串聯質量分析（MSMS分析），可能確定結構改變的胺基酸部位，但是因為isoAsp與Asp具有相同的分子量，所以難以經由MSMS進行前述的確認。
分析的結果，在全部的AE－HPLC的波峰中，在含有前區域 1的部分波峰的b1峰的分劃中，偵測出最高水平的含有isoAsp殘基的胜肽（11.6%及2.7%之二種含有isoAsp殘基的胜肽）。又，在b1峰的Asp99改變為琥珀醯亞胺殘基（Asu99）的比例為1.1%，Asp102改變為琥珀醯亞胺殘基（Asu102）的比例為0.2%，Asp103改變為琥珀醯亞胺殘基（Asu103）的比例為4.7%。 如此證實，與以實施例1所記載的管柱及移動相所分離、獲得的含有主成分奈莫利珠單株抗體的主要波峰（在Asp99、Asp102、Asp103任一個修飾為isoAsp殘基的修飾為0.5%）相比，天冬胺酸異構化變體（isoAsp體）主要在前區域 1溶出。
［實施例4］在前區域 1的低分子量物種（LMWS）的評估 ［4.1］經由非還原型LC－ESI－MS的評估 以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以0.1%甲酸稀釋後，注入高效液相層析法，以脫鹽柱脫鹽後，以質量分析器進行LMWS的確認。 結果確定，在前區域 1的部分波峰之b2、b3峰，包含HH二聚體及LL二聚體。
［4.2］經由非還原型胰蛋白胜肽圖譜(mapping)的評估 以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以含有鹽酸胍的pH7.0的改性劑溶液稀釋，進行改性處理。之後，以碘乙酸進行半胱胺酸側鏈的加蓋（capping），以含有Tris、尿素、EDTA的pH7.0分解緩衝液進行緩衝液置換，以胰蛋白酶進行分解反應。在所得的分解反應溶液加入甲酸，注入逆相高效液相層析法進行分離，以質量分析器進行胜肽的確認。結果確定HH二聚體具有通常與輕鏈的C214形成雙硫鍵的重鏈C224在重鏈之間彼此結合的結構。又推測LL二聚體具有通常與重鏈的C224形成雙硫鍵的輕鏈C214在輕鏈之間彼此結合的結構（第2圖）。
［4.3］經由非還原型CE－SDS的評估 將以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，緩衝液置換為0.1mol／L的磷酸鈉緩衝液後，與含有N－乙基順丁烯二醯亞胺的SDS溶液混合，進行加熱變性及半胱胺酸側鏈的加蓋。之後，在溶液加入含有氰化鉀及FQ－dye的色素反應液，加熱進行螢光色素標記。在所得溶液加入SDS溶液，經毛細管電泳－SDS進行分析。 結果為，在b2、b3峰的HH二聚體及LL二聚體的含量分別為18.4 CPA（校正峰面積（Corrected Peak Area））%及8.6 CPA%。
［實施例5］天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）的生物活性的評估 經由測量IL－31依賴性增殖的BaF／hIL－31R細胞（表現人IL－31R的BaF細胞）的增殖抑制活性，評估各變體的生物學活性。 具體為，在以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，加入含IL－31的FBS RPMI培養基，調製各種濃度的稀釋液。在96孔微孔盤的各孔分別加入稀釋液，將BaF／hIL－31R細胞懸浮液添加於各孔後，在37℃的CO 2培養箱培養24小時。之後，加入已過濾的alamarBlue，再於37℃的CO 2培養箱培養3小時後，經由微孔盤讀取機測量吸光度（OD 570－OD 600）。
結果為，以主要波峰為基準（主要波峰：標準化為100%）時，b8峰的生物活性相對於主要波峰為21%，顯示b8峰主要包含的琥珀醯亞胺體（相當於54.0%的Asu103變異體）的生物活性顯著減弱。 又，顯示b1峰（isoAsp體的含量為11.6%）的生物活性相對於主要波峰減弱為41%。由於此isoAsp體的Asp異構化為在CDR的化學變化，強烈地暗示會影響生物活性（Harris RJ. Heterogeneity of recombinant antibodies: linking structure to function. Dev Biol （Basel） 2005; 122:117－27; Dick, LWJ, et al, Identification and measurement of isoaspartic acid formation in the complementarity determining region of a fully human monoclonal antibody. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2009;877:3841－9）。
［實施例6］AE－HPLC成為天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）的管理分析法的評估 為了確認在表現奈莫利珠單株抗體的宿主細胞的培養步驟所獲得的含有奈莫利珠單株抗體的溶液的純化步驟中，經由生產培養後的離心、過濾的捕獲步驟後（HCCF）以及之後經蛋白質A親和性層析法的純化步驟之後（親和性池（Affinity pool）），含抗體溶液到下一步驟的保持時間（各純化步驟的樣本保持時間）對天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）的含量的影響，對於各種樣本（HCCF（23℃，保持0／72小時後）、親和性池（23℃，保持0／24／48／72／138小時後））的isoAsp體及琥珀醯亞胺體的含量進行確認。與實施例2及實施例3相同地，進行經由胰蛋白酶分解各樣本及經HPLC的分離，之後使用經由MS分析的MS強度進行定量，求得在胜肽單位與未修飾體相比的變體的含量。在胜肽單位的變體的含量由下列算式求得。 在胜肽單位的變體的含量（強度%）=（關注對象的已修飾胜肽 *1的MS強度 *2）÷{（關注對象的已修飾胜肽的MS強度）+（對應關注對象的已修飾胜肽的未修飾胜肽 *3的MS強度）}×100 （*1：表示來自天冬胺酸異構化變體的含有isoAsp殘基的胜肽或含有琥珀醯亞胺殘基的胜肽） （*2：MS強度為來自該胜肽的MS光譜的強度） （*3：表示在已修飾胜肽的修飾位置外與已修飾胜肽具有相同的胺基酸序列之未經修飾的原始體的胜肽） 結果認為，在親和性池中，天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）有時間依賴性有意義地增加的現象（表4）。
又，將上述樣本（HCCF（23℃，保持0／72小時後））、親和性池（23℃，保持0／24／48／72／138小時後）同實施例1經AE－HPLC分離，求得在HPLC層析圖的各區域的面積比例。分別確認這些分析所得的在胜肽單位的isoAsp體含量與AE－HPLC的前區域 1的面積比例，以及在胜肽單位的琥珀醯亞胺體含量與AE－HPLC的前區域 2的面積比例的相關性時，發現isoAsp體含量與前區域 1的面積比例相關（第3圖）。又發現琥珀醯亞胺體含量與前區域 2的面積比例相關（第3圖），顯示AE－HPLC為此等變體的含量的管理分析法。
又，在親和性池每1小時的前區域 2的面積增加率為0.0552面積%／h，前區域 1的面積增加率為0.0448面積%／小時（表4），每小時的面積增加率高，可知在奈莫利珠單株抗體的品質擔保上，經由親和性層析法的純化步驟後、到下一步驟之適當的樣本保持時間的設定是重要的。
［表4］
DS lot 步驟 保持時間 (小時) 全部isoAsp (強度%) 經由AE-HPLC之前區域1 (面積%) 全部Asu (強度%) 經由AE-HPLC之前區域2 (面積%)
A HCCF (23℃) 0 3.856 7.711 4.142 4.647
72 4.150 7.849 4.755 4.412
親和性池 (23℃) 0 4.001 8.401 4.537 5.335
24 4.055 9.709 5.744 6.822
48 4.569 11.083 5.917 8.351
72 5.813 12.186 7.053 10.690
138 6.787 15.340 9.270 13.665
B HCCF (23℃) 0 3.492 7.851 4.249 5.130
72 3.729 8..165 4.391 4.728
親和性池 (23℃) 0 4.390 8.954 5.018 6.210
24 4.643 10.092 5.189 7.564
48 5.022 11.509 5.604 8.827
72 5.695 12.189 7.625 9.844
138 8.237 15.529 10.245 13.234
C HCCF (23℃) 0 3.839 7.746 4.454 5.231
72 3.729 7.919 2.930 5.134
親和性池 (23℃) 0 4.049 8.507 5.096 5.880
24 4.481 9.823 5.146 7.316
48 5.437 11.132 6.250 8.748
72 5.982 11.949 6.179 9.632
138 6.853 15.416 9.343 13.397
［實施例7］在原料藥的製造中抑制天冬胺酸異構化變體（isoAsp體及琥珀醯亞胺體）的生成的方法 ［7.1］前區域 1 根據預期對臨床表現、生物活性、PK、安全性及免疫源性的影響，奈莫利珠單株抗體製劑的有效期限內的規格設定AE－HPLC的前區域 1的面積比例為19.3%以下。IsoAsp體是普遍接受的抗體藥物的修飾體，被認為對安全性及免疫源性的影響低。關於生物活性，發現b1峰對CIM331標準物質（奈莫利珠單株抗體）具有45%的低生物活性（表3）。然而，AE－HPLC的前區域 1的面積比例增加至19.3%被認為對製劑整體的生物活性不會造成重大的影響。
其次，從奈莫利珠單株抗體的長期安定性試驗估算經過36個月保存的前區域 1的增加量。結果，在保存期間（M）及前區域 1的面積比例（面積%）所得的斜率的95%信賴區間的上限值為0.154面積%／M，因此，增加至36M的面積比例估算為5.5面積%（0.154面積%／M × 36M=5.544面積%）。所以，原料藥的出貨規格設定該面積比例為13.8面積%（19.3%－5.5%）以下。又如前述，在親和性池每1小時的前區域 1的面積增加率為0.0448面積%／小時（表4），在純化步驟中面積增加率最高，已知在品質擔保上，親和性池的適當保持時間（hold time）的設定是重要的。從此等安定性的結果可知，為了擔保適當的品質，在親和性池（18℃－28℃）的保持時間較佳為24小時（相當於1.08面積%的增加幅度）以內。
如上述，以在胜肽單位的isoAsp體含量為X軸，AE－HPLC的前區域 1的面積比例為Y軸作圖的數據（第3圖），得到近似直線。使用所得的近似直線，計算對應於前區域 1的面積比例19.3%的在胜肽單位的總isoAsp體含量時，isoAsp體相對於未修飾為isoAsp殘基及Asu殘基的對應的未修飾胜肽（具有修飾為isoAsp殘基及Asu殘基的修飾部位為天冬胺酸、其他與isoAsp體相同的胺基酸序列的未修飾胜肽）的總和的比例，可導出9.4%。根據此在胜肽單位的含量，基於來自二項分布的下式，計算理論上在抗體單位的isoAsp體的最大含量 *1。 *1：相當於Asu體為0%時。 在胜肽單位的含量：X（%）＜9.4%＞ 兩個重鏈異構化為isoAsp殘基的isoAsp體：X 2＜ （0.094） 2× 100 ＝ 0.00883 → 0.88%＞ 兩個重鏈未修飾的原始體：（1－X） 2＜（1－0.094） × （1－0.094） ＝ 0.8208 → 82.1%＞ 一個重鏈異構化為isoAsp殘基的isoAsp體：X（1－X） + （1－X）X ＝ 2X（1－X） ＜2 × 0.094 × （1－0.094） = 0.1703 → 17.0%＞
因此可知，在胜肽單位的總isoAsp體的含量9.4%（ AE－HPLC的前區域 1的面積比例19.3%）相當於最大含量為2個重鏈含有isoAsp殘基的isoAsp體：0.88%、與2個之中的1個重鏈含有isoAsp殘基的isoAsp體：17.0%的總和之在抗體單位的總isoAsp體的含量：17.9%。
［7.2］前區域 2 根據預期對臨床表現、生物活性、PK、安全性及免疫源性的影響，奈莫利珠單株抗體製劑的有效期限內的規格設定AE－HPLC的前區域 2的面積比例為13.8%以下。Asu體是普遍接受的抗體藥物的修飾體，被認為對安全性及免疫源性的影響低。關於生物活性，發現b8峰對CIM331標準物質（奈莫利珠單株抗體）具有23%的低生物活性（表3）。然而，AE－HPLC的前區域 2的面積比例增加至13.8%被認為對製劑整體的生物活性不會造成重大的影響。
其次，從奈莫利珠單株抗體的長期安定性試驗估算經過36個月保存的前區域 2的增加量。結果，在保存期間（M）及前區域 2的面積比例（面積%）所得的斜率的95%信賴區間的上限值為0.123面積%／M，因此，增加至36M的面積比例估算為4.4面積%（0.123面積%／M×36M=4.428面積%）。所以，原料藥的出貨規格設定該面積比例為9.4面積%（13.8%－4.4%）以下。又如前述，在親和性池每1小時的前區域 2的面積增加率為0.0552面積%／小時（表4），在純化步驟中面積增加率最高，已知在品質擔保上，親和性池的適當保持時間（hold time）的設定是重要的。從此等安定性的結果可知，為了擔保適當的品質，在親和性池（18℃－28℃）的保持時間較佳為24小時（相當於1.32面積%的增加幅度）以內。
如上述，以在胜肽單位的Asu體含量為X軸，AE－HPLC的前區域 2的面積比例為Y軸作圖的數據（第3圖），得到近似直線。使用所得的近似直線，計算對應於前區域 2的面積比例13.8%的在胜肽單位的總Asu體含量時，Asu體相對於未修飾為isoAsp殘基及Asu殘基的對應的未修飾胜肽（具有未修飾為isoAsp殘基及Asu殘基的修飾部位為天冬胺酸、其他與Asu體相同的胺基酸序列的未修飾胜肽）的總和的比例，可導出9.8%。根據此在胜肽單位的含量，基於來自二項分布的下式，計算理論上在抗體單位的Asu體的最大含量 *1。 *1：相當於isoAsp體為0%時。 在胜肽單位的含量：X（%）＜9.8%＞ 兩個重鏈異構化為Asu殘基的Asu體：X 2＜ （0.098） 2× 100 ＝ 0.00960 → 0.96%＞ 兩個重鏈未修飾的原始體：（1－X） 2＜（1－0.098） × （1－0.098） ＝ 0.8136 → 81.4%＞ 一個重鏈異構化為Asu殘基的Asu體：2X（1－X）＜2 × 0.098 × （1－0.098） = 0.1767 → 17.7%＞
因此可知，在胜肽單位的總Asu體的含量9.8%（ AE－HPLC的前區域 2的面積比例13.8%）相當於最大含量為2個重鏈含有Asu殘基的Asu體：0.96%、與2個之中的1個重鏈含有Asu殘基的Asu體：17.7%的總和之在抗體單位的總Asu體的含量：18.6%。
［實施例8］在後區域的CDR內的脫醯胺體的評估 以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以含有鹽酸胍的pH7.0的改性劑溶液稀釋後，以二硫蘇糖醇進行還原。之後，以碘乙酸進行半胱胺酸側鏈的加蓋，以含有Tris、尿素、EDTA的pH7.0分解緩衝液進行緩衝液置換，以胰蛋白酶進行分解反應。在所得的分解反應溶液加入甲酸，注入逆相高效液相層析法進行分離，以質量分析器進行胜肽的確認及變體的定量。
結果顯示，在全部的AE－HPLC的波峰中，在含有後區域的部分波峰的a6峰的分劃中，偵測出在奈莫利珠單株抗體重鏈的CDR內的Asn55的脫醯胺化為14.9%的最高水平。雖然因為在該波峰的脫醯胺化的水平低，無法經由生物活性偵測而直接評估因Asn55的脫醯胺化對生物活性的影響，但是CDR在與抗原的結合上扮演重要角色，因此強烈暗示在CDR內的Asn55的脫醯胺化影響生物活性。 Harris, R.J., et al., Identification of multiple sources of charge heterogeneity in a recombinant antibody. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 2001. 752（2）: p. 233－45 Yan B, Steen S, Hambly D, et al. Succinimide formation at Asn 55 in the complementarity determining region of a recombinant monoclonal antibody IgG1 heavy chain. J Pharm Sci 2009; 98:3509－21. Qi P, Volkin DB, Zhao H, et al. Characterization of the photodegradation of a human IgG1 monoclonal antibody formulated as a high－concentration liquid dosage form. J Pharm Sci 2009; 98:3117－30
再者，以相同手法分析在40℃保存12週的原料藥時，即使是在40℃保存12週的原料藥，上述脫醯胺化的含量在胜肽單位為1.6%，又推測即使是在30℃的製劑保管中，其含量也未大幅增加（例如，在胜肽單位為1.6%）。
［實施例9］在後區域的LMWS的評估 ［9.1］經由非還原型LC－ESI－MS的評估 以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以0.1%甲酸稀釋後，注入高效液相層析法，以脫鹽柱脫鹽後，以質量分析器進行LMWS的確認。
結果確定，在含有後區域的部分波峰的a2、a3峰的分劃包含HL體，在含有a1峰的分劃包含半胱胺酸化輕鏈（Cysteinylated light chain）及半胱胺酸化HHL體（Cysteinylated HHL）。
［9.2］經由非還原型胰蛋白胜肽圖譜的評估 以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，以含有鹽酸胍的pH7.0的改性劑溶液稀釋，進行改性處理。之後，以碘乙酸進行半胱胺酸側鏈的加蓋，以含有Tris、尿素、EDTA的pH7.0分解緩衝液進行緩衝液置換，以胰蛋白酶進行分解反應。在所得的分解反應溶液加入甲酸，注入逆相高效液相層析法進行分離，以質量分析器進行胜肽的確認。 結果做出結論為，a2、a3峰所含的HL體為在1個重鏈內的Cys227與Cys230形成雙硫鍵的結構（第4圖）。 另一方面，雖然至今未確定a1峰所含的半胱胺酸化輕鏈及半胱胺酸化HHL體之半胱胺酸化部位，但是推測為第5圖所載之結構體。
［9.3］經由非還原型CE－SDS的評估 將以實施例1所載的管柱及移動相分離、獲得的含有各峰的分劃，緩衝液置換為0.1mol／L的磷酸鈉緩衝液後，與含有N－乙基順丁烯二醯亞胺的SDS溶液混合，進行半胱胺酸側鏈的加蓋。之後，在溶液加入含有氰化鉀及FQ－dye的色素反應液，進行螢光色素標記。在所得溶液加入SDS溶液，經毛細管電泳－SDS進行分析。
結果為，在包含a2、a3峰的分劃中，HL體的含量為16.7 CPA%，在包含a1峰的分劃中，半胱胺酸化輕鏈的含量為14.5 CPA%。
［實施例10］LMWS的管理 ［10.1］低分子量物種的評估法（CE－SDS） 分別將奈莫利珠單株抗體的原料藥及製劑緩衝液置換為0.1mol／L的磷酸鈉緩衝液後，與含有N－乙基順丁烯二醯亞胺的SDS溶液混合，進行半胱胺酸側鏈的加蓋。之後，在溶液加入含有氰化鉀及FQ－dye的色素反應液，進行螢光色素標記。在所得溶液加入SDS溶液，經毛細管電泳－SDS（CE－SDS）進行分離，具有移動時間較奈莫利珠單株抗體的原料藥及製劑的主成分（奈莫利珠單株抗體）短的波峰群定義為具有分子量較奈莫利珠單株抗體小的波峰群。此波峰群設定為以LMWS管理分析法的評估對象。
［10.2］低分子量物種的含量管理（CE－SDS） 根據預期對臨床表現、生物活性、PK、安全性及免疫源性的影響，奈莫利珠單株抗體製劑的有效期限內的規格設定為經CE－SDS分析的LMWS（包括在含有經AE－HPLC的b2、b3峰的分劃及含有a1、a2、a3峰的分劃中所確認的LMWS）的含量為11.0 CPA%以下。由於在製劑的安定性試驗未觀察到LMWS的含量增加，所以原料藥及製劑的出貨規格也同樣設定在11.0 CPA%以下。 產業利用性
本發明人等找出了生物活性較奈莫利珠單株抗體低的抗體變體、及其分析方法。本發明之抗體變體及分析方法除了有用於奈莫利珠單株抗體的原料藥及製劑的品質評估外，也有用於降低本發明之抗體變體的含量比的奈莫利珠單株抗體製劑的開發、抑制本發明之抗體變體的生成之方法的開發。又，含有奈莫利珠單株抗體且維持較低的本發明之抗體變體的含量比之本發明的醫藥組合物，有效於作為用於異位性皮膚炎、透析搔癢症及其他搔癢症的治療及／或預防之手段。
無
［第1A圖］為顯示以實施例1所載之條件經由陰離子交換高效液相層析法分離含有奈莫利珠單株抗體的溶液之結果的層析圖。管柱使用TSK DEAE NPR（内徑4.6mm，長度35mm，粒徑2.5μm），以表1所示之鹽濃度調整條件1進行分離。 ［第1B圖］為顯示以實施例1所載之條件經由陰離子交換高效液相層析法分離含有奈莫利珠單株抗體的溶液之結果的層析圖。管柱使用TSK DEAE NPR（内徑7.5mm，長度75mm，粒徑2.5μm），以表2所示之鹽濃度調整條件2進行分離。 ［第2圖］為顯示奈莫利珠單株抗體的變體HH二聚體及LL二聚體之結構的示意圖。 ［第3圖］以在23℃保持HCCF或親和性池（Affinity pool）多個時間後的樣本中所含的isoAsp體（上圖）或Asu體（下圖）在胜肽單位的含量作為X軸，AE－HPLC的前區域 1（上圖）或前區域 2（下圖）的面積比例作為Y軸，所標繪的分布圖。 ［第4圖］為顯示奈莫利珠單株抗體的變體HL體的結構之示意圖。 ［第5圖］為顯示奈莫利珠單株抗體的變體半胱胺酸化HHL體（左圖）及半胱胺酸化輕鏈（右圖）的結構之示意圖。
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Claims (31)

  1. 一種抗體變體，其為具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體的變體，其中， （a）在從前述序列的N端側的第1位的位置的胺基酸殘基D、 （b）在從前述序列的N端側的第4位的位置的胺基酸殘基D、或 （c）在從前述序列的N端側的第5位的位置的胺基酸殘基D 為琥珀醯亞胺殘基或異天冬胺酸殘基。
  2. 如請求項1之抗體變體，其中，前述序列為CDR序列。
  3. 如請求項1之抗體變體，其中，前述序列為包含於重鏈的序列。
  4. 如請求項1之抗體變體，其中，具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體為下列任一者： （1）包含含有序列識別號1所載之CDR1、序列識別號2所載之CDR2、及序列識別號3所載之CDR3的重鏈可變區，以及含有序列識別號4所載之CDR1、序列識別號5所載之CDR2、及序列識別號6所載之CDR3的輕鏈可變區之抗體， （2）包含序列識別號7所載之重鏈可變區，以及序列識別號8所載之輕鏈可變區的抗體，或者 （3）包含序列識別號9所載之重鏈，以及序列識別號10所載之輕鏈的抗體。
  5. 如請求項1至4任一項之抗體變體，其中，具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體為奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）。
  6. 如請求項1至5任一項之抗體變體，其中，在使用陰離子交換層析法進行分離的情形，滯留時間（retention time）較具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體短。
  7. 如請求項1至6任一項之抗體變體，其生物活性較具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的前述抗體低。
  8. 一種醫藥組合物，包含如請求項1至7任一項之抗體變體。
  9. 一種醫藥組合物，其為包含如請求項1至7任一項之抗體變體的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物中，含異天冬胺酸殘基的抗體變體相對於該抗體變體及未經修飾的抗體之總和的比例為36%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含異天冬胺酸殘基的胜肽相對於該含異天冬胺酸殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為20%以下。
  10. 一種醫藥組合物，其為包含如請求項1至7任一項之抗體變體的醫藥組合物，其中，在使用陰離子交換層析法分離該醫藥組合物的情形，含有含異天冬胺酸殘基的抗體變體的峰面積相對於總峰面積的比例為40.3面積%以下。
  11. 一種醫藥組合物，其為包含如請求項1至7任一項之抗體變體的醫藥組合物，其中，該醫藥組合物中，含琥珀醯亞胺殘基的抗體變體相對於未經修飾的抗體的比例為36%以下，且／或在酵素分解後的該醫藥組合物中，來自該抗體變體的含琥珀醯亞胺殘基的胜肽相對於該含琥珀醯亞胺殘基的胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為20%以下。
  12. 一種醫藥組合物，其為包含如請求項1至7任一項之抗體變體的醫藥組合物，其中，在使用陰離子交換層析法分離該醫藥組合物的情形，含有含異天冬胺酸殘基的抗體變體的峰面積相對於總峰面積的比例為29.1面積%以下。
  13. 如請求項8至12任一項之醫藥組合物，包含奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）。
  14. 一種如請求項1至7任一項之抗體變體的偵測方法，包括經由親和性層析法、離子交換層析法、順相層析法、逆相層析法、親水性交互作用層析法（HILIC）、疏水性交互作用層析法（HIC）、基於電荷的分離、粒徑排阻層析法（SEC）、凝膠滲透層析法（GPC）、或該等之組合，分離包含具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體或經酵素處理的該抗體的樣本之步驟。
  15. 如請求項14之偵測方法，其中，該離子交換層析法為陰離子交換層析法。
  16. 如請求項15之偵測方法，其中，該陰離子交換層析法使用內徑4.6～7.5mm、長度35～150mm、粒徑2.5～10μm的管柱，在管柱溫度25～50℃，經由pH6.0～10.0的移動相進行溶出。
  17. 如請求項14至16任一項之偵測方法，包括在分離含有經酵素處理的前述抗體的樣本的前述步驟之後，經由質量分析及／或紫外線吸收測量，定量胜肽之步驟。
  18. 一種含有奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的組合物之製造方法，包括實施如請求項14至17任一項之偵測方法之步驟。
  19. 一種含有奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的組合物之製造方法，包括經由親和性層析法、離子交換層析法、親水性交互作用層析法（HILIC）、疏水性交互作用層析法（HIC）、基於電荷的分離、粒徑排阻層析法（SEC）、凝膠滲透層析法（GPC）、或該等之組合，純化含有奈莫利珠單株抗體的溶液之步驟。
  20. 如請求項19之製造方法，其中，前述的純化步驟包括經由親和性層析法純化含有從產生奈莫利珠單株抗體的細胞所獲得的奈莫利珠單株抗體的組合物。
  21. 如請求項20之製造方法，其特徵在於，經由前述親和性層析法純化後的含奈莫利珠單株抗體溶液的保持時間（hold time）為72小時以內，與較該保持時間長的情形相比，組合物中的如請求項1至7任一項之抗體變體的含量比低。
  22. 一種抑制如請求項1至7任一項之抗體變體的含量比之方法，包括經由親和性層析法純化含有從產生具有含胺基酸序列DGYDDGPYTLET（序列識別號3）的可變區的抗體的細胞所獲得的抗體的組合物之步驟。
  23. 如請求項22之方法，其特徵在於，經由前述親和性層析法純化後的含奈莫利珠單株抗體溶液的保持時間為72小時以內，與較該保持時間長的情形相比，組合物中的如請求項1至7任一項之抗體變體的含量比低。
  24. 一種奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸彼此結合的2個重鏈所形成的結構。
  25. 一種奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的輕鏈中EU編號第214位的半胱胺酸彼此結合的2個輕鏈所形成的結構。
  26. 一種奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸、與奈莫利珠單株抗體的重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸結合、而且重鏈的EU編號第227位及第230位的半胱胺酸在1個重鏈內結合的1個輕鏈與1個重鏈所形成的結構。
  27. 一種奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，其特徵在於，具有以奈莫利珠單株抗體的輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸與游離的半胱胺酸結合的1個輕鏈所形成的結構。
  28. 一種奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，其特徵在於，具有由奈莫利珠單株抗體的2個重鏈與1個輕鏈所構成，2個重鏈在EU編號第227位及第230位之2處的半胱胺酸彼此各自結合，而且第1個重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸與在輕鏈的EU編號第214位的半胱胺酸結合，而且在第2個重鏈的EU編號第224位的半胱胺酸與游離的半胱胺酸結合的結構。
  29. 一種醫藥組合物，其為包含請求項24至28任一項之抗體變體的醫藥組合物，其中，在該醫藥組合物中的全部抗體分子中，該抗體變體的比例為11.0 CPA%以下。
  30. 一種奈莫利珠單株抗體（Nemolizumab）的抗體變體，其特徵在於，在奈莫利珠單株抗體的重鏈的Kabat編號第55位的天冬醯胺脫醯胺化。
  31. 一種醫藥組合物，其為包含請求項30之抗體變體的醫藥組合物，其中，來自該醫藥組合物經酵素分解後的該抗體變體的含脫醯胺化胜肽，相對於該含脫醯胺化胜肽及對應的未經修飾的胜肽之總和的比例為2.0%以下。
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