KR20160124107A - 사전 세정 단계를 이용하는 면역글로불린 정제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역글로불린의 정제, 및 효율적이고 비용 효율적인 방식으로, 만족스러운 순도 및 수율로 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하는 것에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상당히 비용집약적인 크로마토그래피 재료의 재사용 측면, 특히 다운스트림 프로세스의 포획 단계에 이용되는 크로마토그래피 재료의 수명, 및 정제 프로세스의 기술적 복잡성을 감소시키면서 수명을 증가시킬 수 있는 방법을 다루고 있다.
Description
본 발명은 포획(capture) 단계 전에 사전 세정 단계(pre-cleaning step) 및/또는 포획 단계 후에 추가적인 폴리싱(polishing) 단계를 이용하여 세포 배양물-유래 조성물(cell culture-derived composition)로부터 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다.
재조합 DNA 기술에 의해 제조된 폴리펩타이드의 정제를 위한 효율적이고 경제적인 다운스트림 시퀀스의 선택은 치료 용도를 위해 의도된 모든 새로운 생물약제학적 제제의 개발에 있어서 결정적인 단계이다. 근래, 의학적 이용에 있어서 예외적으로 높은 그 치료 용량 때문에, 단일 클론 항체(mabs)를 위한 대규모 정제 과정에 대한 필요성이 높은 세포 밀도 및 높은 발현율에 이르는 향상된 세포 배양 방법의 이용에 의해 더 심화되었다. 생성물 및 오염물의 배양액에서의 증가하는 농도는 포획 크로마토그래피(capture chromatography)에 대하여, 그의 선행하는 샘플 정화(clarification) 단계에 대하여, 및 후속 폴리싱 크로마토그래피(polishing chromatographies)에 대하여 더 높은 요구를 설정한다. 전체 다운스트림 프로세스는 (i) 다량의 생성물을 관리하여야 하고, (ii) 증가된 공정-관련 불순물 및 제품-관련 불순물을 정의된 수용 기준 미만으로 효율적으로 제거하여야 하고, (iii) mab의 경제적인 수율 및 충분한 양을 유지하여야 한다. 일반적으로, 다운스트림 프로세스는 치료용 항체의 총 제조비용의 주된 부분을 차지한다.
조 분획 중의 mabs는 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA, 바이러스, 응집체, 다른 바람직하지 못한 생성물 변이체, 및 공정 재료로부터의 다양한 침출액과 같은 불순물과 결합되는 것이 전형적이다. 이러한 불순물의 존재는 환자에 대한 잠재적인 건강 위험이며, 따라서 최종 제품으로부터 이러한 불순물을 제거하는 것이 규제 조건이다. 매우 낮은 잔류량만이 용인된다.
세포-배양물 유래(cell-culture derived) 폴리펩타이드를 정제하기 위한 전통적인 방법은, 포획-중간-폴리싱 크로마토그래피의 순서를 따르며, 다운스트림 시퀀스의 다양한 위치에서 여과, 농축 또는 투석 단계가 수반된다. 최근, mab 정제 분야에서 플랫폼 접근이 성공적으로 수립되었다. mabs는 통상적인 물리화학적 특성을 갖는 잘 정의된 당단백질 종류이므로, 일반적인 플랫폼 프로세스의 이용이 합리적이다(Kelly B 2009). 어느 정도의 제품-특이적 적응이 이루어지는, 그러한 보편적인 프로세스는 많은 mabs에, 특히 동일한 분류 또는 하위 분류의 면역글로불린에 대하여, 예를 들어, IgG1에 대하여 적용될 수 있다.
mab 정제에 이용되는 가장 빈번한 포획 단계의 하나는, 단백질 A(Protein A)에 의한 친화성 크로마토그래피이다. 이 포획은 Fc-함유 분자에 대하여 예외적인 선택성을 제공함으로써, 단일 단계로 오염물을 99.5% 넘게 제거한다. 그러나, 그의 이점들 외에, 2개의 단점도 언급되어야 한다. 하나의 단점은 독성인 것으로 알려져 있는, 단백질 A 또는 단백질 A의 단편의 바람직하지 않은 침출(leaching)이다(Gagnon P 1996). 다른 단점은 특히 치료용 항체를 정제하는데 필요한 산업적 규모에서, 이러한 종류의 수지의 높은 비용이다. 단백질 A 수지는 이온교환 수지보다 약 30배 더 비싸다. 10 ㎥ 세포 배양의 다운스트림 프로세싱에 있어서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 대한 비용은 약 4백만~5백만 달러(USD)인 것으로 산출되었다(Farid SS 2009).
침출된 단백질 A의 문제를 극복하기 위하여 많은 해결방안들이 공개되었다(Gagnon P 1996; Fahrner RL 2001). 몇몇 접근 방식은 바인딩 모드(binding mode)(EP0345549) 또는 플로우-쓰루 모드(flow-through mode)(WO2004076485)에서 이용되는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피(WO2009058812), 소수성 상호작용 크로마토그래피(WO9522389), 또는 크로마토그래피의 조합, 예를 들면, 이온교환 크로마토그래피 이후 소수성 상호작용 크로마토그래피(WO2010141039), 음이온 교환 크로마토그래피 이후 양이온 교환 크로마토그래피(WO2011090720), 또는 임의의 순서인, 양이온 교환 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피(Mixed Mode chromatography)와 같은, 침출된 단백질 A를 제거하는 사후-단백질 A 크로마토그래피 단계에 관련된다. 치료용 항체에 대하여 요구되는 전체적인 순도가 극히 높기 때문에, 전형적인 플랫폼 정제 체계는 양이온 교환 크로마토그래피, 플로우-쓰루에서의 음이온 교환 크로마토그래피, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로부터 일반적으로 선택되는 적어도 2개의 사후-단백질 A 크로마토그래피로 이루어진다(Fahrner RL 2001, Kelly B 2009, WO9522389, WO2009138484, WO2010141039, WO2011017514, WO2011090720).
다른 접근 방식은 면역글로불린을 용리시키기 전에 침출된 단백질 A를 제거하는 특별한 세척 단계를 이용함으로써 단백질 A 친화성 크로마토그래피 중에 이미 침출액을 감소시킨다. 염 또는 추가적인 성분, 예를 들면, 테트라메틸암모늄 클로라이드와 같은 소수성 전해질을 함유하는, 많은 중간 세척 버퍼(intermediate wash buffers)가 개발되었다(Fahrner RL 2001).
몇몇 방법들은 샘플로부터 유래되는 단백질 가수분해 활성을 직접적으로 감소시킴으로써, 단백질 A 침출의 근원에 더 가깝게 효과를 발휘한다. 단백질 A 침출의 주된 부분은 단백질 가수분해에 의해 야기된다. 그러한 감소된 침출은 낮은 온도에 의해, 및/또는 버퍼에 프로테아제 억제제를 첨가함으로써 이루어졌다(WO2005016968).
단백질 A 침출을 피하거나 감소시키기 위한 특별한 방법은 표면 활성 화합물, 예를 들면, 우레아 또는 구아니딘-HCl과 같은 카오트로픽 물질로 단백질 A 수지를 사전 처리하는 것을 포함한다(WO03041859).
상이한 종류의 단백질 A 수지는 상이한 침출 정도를 나타내는 것으로 오랫동안 알려져 있었다(Fueglistaller P 1989). 따라서, 단백질 A 재료의 선택이 중요한 인자이다. 리간드 자체 이외에도, 백본 매트릭스(backbone matrix)가 침출, 결합능(binding capacity), 및 유량(flow rates)에 영향을 미친다(Fahrner RL 2001). 함께 취해진 이러한 파라미터는 컬럼 크기, 프로세스 시간, 및 이에 따라 친화성 포획 단계의 경제성을 정의한다. 또한, 이전 10년 동안, 크로마토그래피 공급자들은 천연 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ) 단백질 A 서열의 유전공학에 의해 제공되는 더욱 튼튼한 단백질 A 리간드를 개발하였다. 이와 같이 향상된 수지는 알칼리 내성, 높은 결합능 및 낮은 리간드 누출을 가능하게 하도록 특별하게 설계제작된 향상된 재조합 리간드 단백질과 결합된 단단한(rigid) 매트릭스로 이루어진다. 하나의 예는 GE Healthcare Life Sciences로부터의 MabSelect SuRe™이다(WO2009138484). 이 재료는 0.5 M 이하의 NaOH에 의해 동작한 후 신속하고 효율적으로 세정될 수 있다. 그러나, 이러한 이점은 상당한 비용이 든다. MabSelect SuRe 및 비슷한 현대적인 수지는 이전의 단백질 A 수지 세대에 비하여 더욱 많이 비싸다. 따라서, 이러한 새로운 친화성 매체에도 불구하고, 경제적 이점이 없으며, 오히려 그 반대인 것이 사실이다.
단백질 A-기반 친화성 포획에 관련되는 매우 높은 비용을 고려하여, 면역글로불린의 정제를 위하여 친화성 크로마토그래피의 어떠한 사용도 완전히 피하는 대안적인 전략이 개발되었음은 놀라운 일이 아니다. 하나의 예는, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피와 같은 비친화성 크로마토그래피와 결합된 고성능 접선 흐름 여과 여과(high-performance tangential flow filtration)의 이용이다(WO03102132).
많은 경우, 포획 단계는 조 투입(로드) 재료에 의해 수행되며, 이는 친화성 컬럼 수지(에 대한 불순물 축적)의 오염을 야기할 수 있다. 적절한 재생(regeneration) 단계가 없으면, 이러한 오염은 포획 수지의 성공적인 재사용을 막을 수 있다. 단백질 A에 의한 친화성 포획의 경우, 리간드 침출이 단백질 A 수지의 수명을 제한하는 주요 인자가 아님이 강조되어야 한다. 리피드, 산화제, 응집체 또는 입자, 금속 이온 및 다른 물질과 같은 조 배양액 중의 오염물은 수지의 파울링(fouling)을 촉진시킨다. 단백질 A 결합 모이어티(moieties)에 대한 직접적인 효과 외에, 매트릭스도 비가역적으로 오염될 수 있다. 그 결과, 동작 간에 결합능 및 유량이 감소한다. 이러한 문제는 단백질 A 수지에 제한되지 않으며, 그 동작 수명에 걸쳐 크로마토그래피 수지의 파울링은 상업적 생물분리에 대한 일반적인 중요한 문제이다. 세포 배양물-유래 면역글로불린에 대한 포획 단계로서 이용되는 경우, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피에 이용되는 소수성 리간드는 배양액으로부터의 친유성 오염물의 트래핑(trapping)에 특히 민감하다. 동작후 세정 단계를 위한 복잡한 프로토콜에도 불구하고, 포획 컬럼의 수명은 제한되며, 사이클의 수, 동작 및 세정에 있어서의 동작 조건 및 샘플의 순도에 따라 달라진다.
혼합 모드 크로마토그래피는 단백질 A에 대한 다운스트림에서 폴리싱 단계에 대한 선택사항으로서 주로 기술되었다(Kelly, B. 2009, WO03102132). mab의 정제를 위하여 바인딩 모드에서의 Capto MMC의 이용이 알려져 있다. 특별한 용리 조건이 개발되었다(WO2011049798). 유사하게, 바람직하게는 플로우-쓰루 모드에서의, CaptoAdhere가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후에 수행되는 플로우-쓰루 음이온 교환 크로마토그래피 후에 적합한 폴리싱 단계인 것으로 나타내어졌다(WO2013066707). 또한, 일부 상이한 혼합 모드 수지가 오버로드(overload) 및 용리(elution) 크로마토그래피 모드에서 연구되었으며, CaptoAdhere가 가장 바람직하였다(WO2013067301).
심하게 오염된 배양액을 정화하기 위하여, 세포 찌꺼기 및 응집체의 대부분을 제거하는 기계적 분리 단계가 채용되었다. 원심분리 및 여과는, 포획 수지에 샘플을 로딩하기 전에 수행되는 가장 일반적인 전처리 단계이다. 큰 부피에 대해서는, 세포 분리기에 의해 원심분리가 수행되며, 여과 단계는 뎁스 필터(depth filters) 및/또는 마이크로필터에 의해 수행된다. 수득된 배양액은 "정화된 세포 배양 상청액"으로 나타내어진다(Liu HF 2010). 단백질 A 수지에 대한 수확된 배양액의 직접적인 로딩이 자주 선택되는 방법이지만(Fahrner RL 2001), 다른 플랫폼 기술도 포획 컬럼을 보호하기 위하여 정화 단계, 즉, 원심분리, 뎁스(depth) 여과, 및/또는 마이크로여과를 이용한다(Liu HF 2010, WO9522389, WO2001150110).
원심분리/여과 대신에, 또는 원심분리/여과에 더하여 수행되는 사전 세정 크로마토그래피 단계는 단지 산발적으로 보고되었다. 바인딩 모드의 고정된 금속 (Zn2+) 킬레이트 크로마토그래피(IMAC)의 이용은 매우 작은 규모로 단백질 A 이전에 이용되었다 (VanDamme A.-M. 1990, Bulens F. 1991). 그에 반해, DEAE 셀룰로오스에서의 약 음이온 교환 크로마토그래피는 원심분리, 여과, 및 농측 후에 이용되었으며, 이어서, 수득된 통과액(flow-through)이 단백질 A 상에 로딩되었다(EP0550400). 마지막으로, 단백질 A 이전에 배양액의 사전 처리를 위한 뎁스 여과의 이점이 연구되었으며, 플로우-쓰루 모드의 TMAE Fractogel 상에서의 덜 효과적인 음이온 교환 크로마토그래피와 비교되었다(Yigsaw Y 2006).
본 발명은 면역글로불린의 정제, 및 만족스러운 순도 및 수율을 갖도록 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하는 과제에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보다 비용집약적인 크로마토그래피 재료의 재사용 측면, 특히 다운스트림 프로세스의 포획 단계에 이용되는 크로마토그래피 재료의 수명, 및 정제 프로세스의 기술적 복잡성을 감소시키면서 이를 증가시키는 방법을 다루고 있다.
세포 배양액으로부터의 면역글로불린의 정제를 위한 종래의 다운스트림 크로마토그래피 프로세스는, 불순물과 함께 면역글로불린을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린이 포획되는 포획 크로마토그래피 단계로 시작하는 것이 일반적이다. 면역글로불린은 대체로 포획 크로마토그래피 수지에 대한 면역글로불린의 선택적인 결합의 결과로서 불순물로부터 분리되며, 불순물은 수지에 결합하지 않고 이에 따라 통과액(flow-through)에서 수득되는 반면, 면역글로불린은 용출액(eluate)에서 수득된다.
이 포획 크로마토그래피 단계는 전체 다운스트림 프로세스 비용의 40 내지 50%를 차지하는, 면역글로불린 정제에 있어서 일반적으로 가장 비싼 단계이다. 포획 단계는 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 이용되는 경우 특히 비용이 높아진다. 이는, 면역글로불린 정제에 있어서 포획 크로마토그래피 단계로서 대안으로 이용될 수 있는 혼합 모드 크로마토그래피 컬럼에 대해서도 동일하게 적용된다.
다량의 세포 배양액 및 발효액으로부터, 및 그러한 배양액 또는 발효액으로부터 유래된 샘플로부터 면역글로불린을 비용 효율적으로 정제하기 위한 요구가 여전히 존재한다. 특히, 비용 효율적이고, 순도 및 수율 측면에서 여전히 효율적이며 만족스러운 정제 방법에 대한 요구가 존재한다.
포획 크로마토그래피 단계의 업스트림(upstream)에 추가적인 크로마토그래피 단계를 포함시킴으로써, 정제 프로세스의 전체 비용이 현저하게 감소될 수 있음이 밝혀졌다. 포획 크로마토그래피 단계의 업스트림에서의 추가적인 크로마토그래피 단계는 비용집약적 포획 크로마토그래피 재료가 노출되는 불순물 부담을 감소시킨다. 이러한 소위 "사전 세정" 단계는 후속 포획 단계에서 이용되는 크로마토그래피 재료에 비하여 덜 비싸고 더욱 튼튼하며, 재생되기 쉬운 크로마토그래피 재료를 이용하여 수행된다.
정제 프로세스를 가능한 한 단순하게 유지하기 위하여, 바람직한 실시예에서, 사전 세정 단계는 플로우-쓰루 모드(flow-through mode)에서 수행되며, 즉, 정제되어야 하는 면역글로불린은 수지에 의해 결합되지 않고, 이에 따라 통과액 분획(flow-through fraction)에서 수득되는 반면, 불순물은 상당한 정도로 수지에 보유되며, 이에 의해 면역글로불린으로부터 분리된다.
다른 바람직한 실시예에서, 사전 세정 단계 및 포획 단계는 연속적으로 연결되어, 사전 세정 단계의 통과액이 수집 용기에 일시적으로 저장되지 않고, 포획 크로마토그래피 수지로 즉시 보내지게 된다.
치료 용도를 위하여 요구되는 면역글로불린의 높은 순도를 이루기 위하여, 사전 세정 단계 및 포획 크로마토그래피 단계 이후에, 포획 크로마토그래피 단계 후 일 이상의 크로마토그래피 폴리싱(polishing) 단계가 이어진다.
본 발명의 기저를 이루는 과제는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하는 것에 의해 해결되며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
본 발명은 또한 면역글로불린의 제조 프로세스에서 바이러스 안정성을 증가시키는 과제를 해결한다.
도 1: 면역글로불린에 대한 종래 정제 방법의 공정도
도 1A는 다량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 보편적인 공정도를 나타낸다. 수확된 배양액의 원심분리 및/또는 여과 후에 얻어지는 정화된 벌크 재료로부터 출발하는 프로세스는, 단백질 A 포획 단계 및 2개의 후속적인 폴리싱 단계로 이루어진다. 이 체계는 2개의 전형적인 바이러스 안전성 단계를 포함한다. 바이러스 비활성화 단계는 단백질 A 용출액을 낮은 pH에서 유지시킴으로써 수행되며, 바이러스 제거를 위한 나노 여과 단계는 마지막 폴리싱 단계 후에 수행된다. 최종 단계는 일반적으로, 면역글로불린의 바람직한 농도 및 포뮬레이션 구성성분의 바람직한 농도를 설정하기 위한 접선 흐름 한외 여과(tangential flow ultrafiltration) 및/또는 정용 여과(diafiltration)(UF/DF-TFF)이다.
도 1B는 3개의 크로마토그래피로 이루어진, 다량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 전통적인 공정도를 나타낸다(예를 들어, Fahrner R.L. 2001 또는 Kelly B. 2009에 따름). 폴리싱 단계가 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1) 및 후속되는 음이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)인 것으로 개시된 점을 제외하고는 도 1A와 동일한 프로세스이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 바인딩 모드에서 수행되는 반면, 음이온 교환 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드에서 수행되는 것이 강조되어야 한다. 이러한 전통적인 체계의 자주 적용되는 동등한 변형은 단지 폴리싱 단계 1 및 2의 순서를 변경한 것임이 언급되어야 한다.
도 2: 사전 세정 단계를 이용하는 본 발명의 예시적인 공정도
도 2A는 단백질 A 포획 단계 전에 사전 세정 단계를 갖는 대규모 공정도를 나타낸다. 수확된 세포 배양액은 분리기를 이용한 예비 원심분리 및 후속되는 뎁스 여과와 마이크로 여과에 의해 정화된다. 사전 세정 크로마토그래피 단계는 플로우-쓰루 모드에서 음이온 교환 컬럼을 이용하여 수행된다. 바람직한 구성에서, 사전 세정 컬럼은 단백질 A인 포획 크로마토그래피 컬럼에 직접적으로 연결된다. 2개의 폴리싱 단계는 바인드 모드 및 용리(elute) 모드에서 이용되는 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1) 및 후속되는 혼합 모드 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)이다. 혼합 모드 수지는 양전하로 하전된 리간드를 가지며, 바인딩 모드 또는 플로우-쓰루 모드 중 어느 하나의 모드에서 수행될 수 있다. 이 2번째 폴리싱 단계는 선택적이다. 바이러스 안전성 단계 및 최종 UF/DF-TFF는 도 1A에 설명된 바와 같다.
도 2B는 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피와 단백질 A 친화성 크로마토그래피 사이에, 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피가 삽입되는 점을 제외하고는, 도 2A의 프로세스와 유사한 대안적인 대규모 공정도를 나타낸다. 이 혼합 모드 크로마토그래피는 음전하로 하전된 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, Capto MMC) 또는 양전하로 하전된 리간드 또는 전하를 갖지 않는 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, MEP HyperCel)의 어느 하나에 의해 수행되며, 바인딩 모드에서 수행된다. 따라서, 혼합 모드 크로마토그래피는 이 프로세스에서 포획 단계로서 기능하는 반면, 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 이 체계 내에서 중간 단계로 더 잘 정의된다. 마지막 크로마토그래피로서의 2번째 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 선택적이다. 모든 다른 단계는 도 2A에 설명된 바와 같다.
도 2C는 단백질 A 포획 크로마토그래피가 혼합 모드 포획 크로마토그래피에 의해 대체되는 것을 제외하고는 도 2A의 프로세스와 유사한 다른 대안적인 대규모 공정도를 나타낸다. 이 혼합 모드 크로마토그래피는 음전하로 하전된 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, Capto MMC) 또는 양전하로 하전된 리간드 또는 전하를 갖지 않는 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, MEP HyperCel)의 어느 하나에 의해 수행되며, 바인딩 모드에서 수행된다. 도 2B에 나타내어진 프로세스와 달리, 이 프로세스는 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 없다. 모든 다른 단계는 도 2A에 설명된 바와 같다.
도 1A는 다량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 보편적인 공정도를 나타낸다. 수확된 배양액의 원심분리 및/또는 여과 후에 얻어지는 정화된 벌크 재료로부터 출발하는 프로세스는, 단백질 A 포획 단계 및 2개의 후속적인 폴리싱 단계로 이루어진다. 이 체계는 2개의 전형적인 바이러스 안전성 단계를 포함한다. 바이러스 비활성화 단계는 단백질 A 용출액을 낮은 pH에서 유지시킴으로써 수행되며, 바이러스 제거를 위한 나노 여과 단계는 마지막 폴리싱 단계 후에 수행된다. 최종 단계는 일반적으로, 면역글로불린의 바람직한 농도 및 포뮬레이션 구성성분의 바람직한 농도를 설정하기 위한 접선 흐름 한외 여과(tangential flow ultrafiltration) 및/또는 정용 여과(diafiltration)(UF/DF-TFF)이다.
도 1B는 3개의 크로마토그래피로 이루어진, 다량의 세포 배양물로부터 면역글로불린의 정제를 위한 전통적인 공정도를 나타낸다(예를 들어, Fahrner R.L. 2001 또는 Kelly B. 2009에 따름). 폴리싱 단계가 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1) 및 후속되는 음이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)인 것으로 개시된 점을 제외하고는 도 1A와 동일한 프로세스이다. 양이온 교환 크로마토그래피는 바인딩 모드에서 수행되는 반면, 음이온 교환 크로마토그래피는 플로우 쓰루 모드에서 수행되는 것이 강조되어야 한다. 이러한 전통적인 체계의 자주 적용되는 동등한 변형은 단지 폴리싱 단계 1 및 2의 순서를 변경한 것임이 언급되어야 한다.
도 2: 사전 세정 단계를 이용하는 본 발명의 예시적인 공정도
도 2A는 단백질 A 포획 단계 전에 사전 세정 단계를 갖는 대규모 공정도를 나타낸다. 수확된 세포 배양액은 분리기를 이용한 예비 원심분리 및 후속되는 뎁스 여과와 마이크로 여과에 의해 정화된다. 사전 세정 크로마토그래피 단계는 플로우-쓰루 모드에서 음이온 교환 컬럼을 이용하여 수행된다. 바람직한 구성에서, 사전 세정 컬럼은 단백질 A인 포획 크로마토그래피 컬럼에 직접적으로 연결된다. 2개의 폴리싱 단계는 바인드 모드 및 용리(elute) 모드에서 이용되는 양이온 교환 크로마토그래피(폴리싱 단계 1) 및 후속되는 혼합 모드 크로마토그래피(폴리싱 단계 2)이다. 혼합 모드 수지는 양전하로 하전된 리간드를 가지며, 바인딩 모드 또는 플로우-쓰루 모드 중 어느 하나의 모드에서 수행될 수 있다. 이 2번째 폴리싱 단계는 선택적이다. 바이러스 안전성 단계 및 최종 UF/DF-TFF는 도 1A에 설명된 바와 같다.
도 2B는 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피와 단백질 A 친화성 크로마토그래피 사이에, 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피가 삽입되는 점을 제외하고는, 도 2A의 프로세스와 유사한 대안적인 대규모 공정도를 나타낸다. 이 혼합 모드 크로마토그래피는 음전하로 하전된 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, Capto MMC) 또는 양전하로 하전된 리간드 또는 전하를 갖지 않는 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, MEP HyperCel)의 어느 하나에 의해 수행되며, 바인딩 모드에서 수행된다. 따라서, 혼합 모드 크로마토그래피는 이 프로세스에서 포획 단계로서 기능하는 반면, 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 이 체계 내에서 중간 단계로 더 잘 정의된다. 마지막 크로마토그래피로서의 2번째 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 선택적이다. 모든 다른 단계는 도 2A에 설명된 바와 같다.
도 2C는 단백질 A 포획 크로마토그래피가 혼합 모드 포획 크로마토그래피에 의해 대체되는 것을 제외하고는 도 2A의 프로세스와 유사한 다른 대안적인 대규모 공정도를 나타낸다. 이 혼합 모드 크로마토그래피는 음전하로 하전된 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, Capto MMC) 또는 양전하로 하전된 리간드 또는 전하를 갖지 않는 리간드를 함유하는 수지(예를 들어, MEP HyperCel)의 어느 하나에 의해 수행되며, 바인딩 모드에서 수행된다. 도 2B에 나타내어진 프로세스와 달리, 이 프로세스는 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 없다. 모든 다른 단계는 도 2A에 설명된 바와 같다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "샘플" 또는 "면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플"은 관심대상인 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함한다. 샘플은 면역글로불린을 생산하는 숙주 세포 또는 유기체로부터 직접적으로 얻어질 수 있다. 샘플은 수확된 세포 배양액, 세포 배양 상청액 또는 전처리된 세포 배양 상청액일 수 있다. 샘플은 원심분리 및/또는 여과, 예를 들면, 마이크로여과, 정용 여과, 한외 여과 및 뎁스 여과에 의해 부분적으로 정화되거나, 정제되었을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "전처리된 샘플"은 원하는 크로마토그래피 성능을 이루고, 면역글로불린을 안정화시키도록 pH 및/또는 전도도 범위 및/또는 완충능(buffering capacity)을 조정하기 위하여, 예를 들면 완충액 교환, 희석, 염의 첨가, 세제, 카오트로픽 물질, 또는 유기 화합물, pH 적정 또는 여과로 이루어진 일 이상의 조정(adjustments)을 샘플에 수행함으로써 본 발명의 방법에 이용되는 크로마토그래피 단계를 위하여 제조된 예를 들면 세포 배양 상청액이다. 포유류 세포로부터 발현된 면역글로불린은 일반적으로 배양 프로세스 중에 세포 배양액으로 분비되므로, 배양 프로세스의 마지막에 생성물 수확은 세포로부터 세포 배양액을 분리함으로써 일어난다. 세포 찌꺼기의 증가 및 면역글로불린 제품의 품질에 영향을 미칠 수 있는 다른 분자 및 프로테아제의 방출을 방지하기 위하여, 세포 파쇄를 최소화하도록 세포 분리 방법은 온화하여야 한다. 일반적으로, 포유류 세포 배양물로부터의 수확물은 원심분리에 이어서 여과를 거치게 된다. 팽창층 흡착 크로마토그래피는 원심분리/여과 방법을 피하기 위한 대안적인 방법이다. 크로마토그래피 단계를 통한 정제 전에 샘플에 대한 다른 처리는 세포 배양 상청액을 농축 및/또는 정용 여과하여 특정한 면역글로불린 농도, pH 범위, 전도도 및 버퍼종 농도로 하는 것일 수 있다.
용어 "불순물" 및 "오염물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 관심대상인 면역글로불린과 상이한 임의의 재료를 나타낸다. 그 예는, 세포 배양액 성분, 숙주 세포 단백질, 내독소, 바이러스, 리피드, DNA, RNA, 프로세스 재료로부터의 침출액, 및 그의 응집체 또는 단편일 수 있다. 또한, 정제되어야 하는 관심대상인 면역글로불린의 응집체, 전하 변형체(charge variants), 과오폴딩된(misfolded) 분자 또는 단편도 불순물로 여겨진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "크로마토그래피 매체들" 또는 "크로마토그래피 매체"는 비드, 플레이트, 크리스탈, 모노리스(monoliths), 멤브레인, 섬유, 섬유의 메쉬웍(meshwork) 또는 임의의 다른 고체상의 형태인, 크로마토그래피 재료 또는 매체로 이해되어야 한다. "매체"는 "매트릭스"로 나타내어지는 백본에 결합된 "리간드"로 나타내어지는 기능기를 포함한다. 예외는, 전형적으로 임의의 부착된 리간드를 갖지 않는 크기 배제 크로마토그래피를 위한 겔 크로마토그래피 수지이다. 따라서 용어 "매체"는 본 발명의 방법을 크로마토그래피 수지를 채용하는 컬럼 크로마토그래피에 한정하는 것이 아니라, 다른 종류의 크로마토그래피, 예를 들면, 멤브레인 흡착제를 채용하는 멤브레인 크로마토그래피를 포함한다. 특히, 음이온 교환 크로마토그래피에서, 음이온 크로마토그래피 교환 수지 또는 음이온 교환 크로마토그래피 멤브레인 흡착제는 모두 본 발명에 의해 포함된다.
"수지"는 단백질 또는 적어도 하나의 오염물과 상호작용할 수 있는 결합된 기능기(리간드)를 갖는 매트릭스를 포함하는 비드 형태의 임의의 크로마토그래피 재료 또는 매체를 의미한다. 예외는, 전형적으로 임의의 부착된 리간드를 갖지 않는 크기 배제 크로마토그래피를 위한 겔 크로마토그래피 수지이다. 수지는 상이한 크기의 비드로 공급되고 컬럼 내에 채워질 수 있다. 대안으로, 프리팩(pre-packed) 컬럼을 구입할 수 있다.
용어 "바인딩 모드" 또는 "바인드 및 용리 모드"는 정제되어야 하는 면역글로불린을 함유하는 샘플이 크로마토그래피 매체에 적용되는 크로마토그래피 조건을 나타내며, 여기에서, 면역글로불린은 크로마토그래피 매체에 결합된다. 따라서, 면역글로불린은 크로마토그래피 매체에 보유되는 반면, 샘플의 불순물은 비결합 분획, 소위 통과액 분획 내에 존재할 수 있다. 크로마토그래피 단계가 바인딩 모드에서 수행될 때, 크로마토그래피 매체에 대한 면역글로불린의 결합 후, 매체로부터 면역글로불린의 용리 전에, 일 이상의 세척 단계가 수행될 수 있다. 면역글로불린을 수득하기 위하여, 면역글로불린은 용리되고, 용출액에서 수득되며, 이는 원하는 경우, 추가적인 크로마토그래피 단계에서 더 정제될 수 있다. 면역글로불린의 용리는 오염물은 매체에 결합된 채로 유지되고, 반면 면역글로불린은 용리되도록 하는 선택적인 조건을 이용하여 수행될 수 있다.
"바인딩 모드"에서 크로마토그래피 단계를 수행하는 것은 반드시 관심대상인 면역글로불린의 100%가 결합되는 것을 의미하지는 않는다. 본 발명의 맥락에서, "크로마토그래피 수지에 결합된" 또는 "크로마토그래피 매체에 결합된"은 적어도 50%의 면역글로불린이, 바람직하게 적어도 75%의 면역글로불린이, 더욱 바람직하게 적어도 85%의 면역글로불린이, 가장 바람직하게 95%가 넘는 면역글로불린이 수지 또는 매체에 결합되는 것을 의미한다.
용어 "플로우-쓰루 모드", "통과액에서 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득", 및 "통과액에서 크로마토그래피 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득"은 관심대상인 면역글로불린을 함유하는 샘플이 크로마토그래피 수지 또는 매체에 적용되는 크로마토그래피 조건을 나타내며, 여기에서, 면역글로불린은 크로마토그래피 수지에 결합되지 않고, 수지 또는 매체에 결합되지 않은 분획에 주로 존재하며, 따라서 통과액에 함유된다.
"플로우-쓰루 모드"에서 크로마토그래피 단계를 수행하는 것은 반드시 관심대상인 면역글로불린의 100%가 결합되지 않고 통과액에 함유되는 것을 의미하지는 않는다. 본 발명의 맥락에서, "크로마토그래피 수지에 결합되지 않은" "크로마토그래피 매체에 결합되지 않은"은 적어도 50%의 면역글로불린이, 바람직하게 적어도 75%의 면역글로불린이, 더욱 바람직하게 적어도 85%의 면역글로불린이, 가장 바람직하게 95%가 넘는 면역글로불린이 수지 또는 매체에 결합되지 않은 것을 나타낸다. 불순물은 이 모드에서 수지 또는 매체에 결합될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명의 사전 세정 크로마토그래피 단계는 플로우-쓰루 모드에서 수행되는 반면, 포획 단계는 바인딩 모드에서 수행되는 제1 크로마토그래피 단계인 것으로 여겨지는 것으로 이해된다.
본 발명에 이르게 된 실험에서, 세포-무함유 수확 재료(정화된 상청액)이 정제되어야 하는 면역글로불린과 함께, 포획 수지에 강하게 결합된 몇몇 물질을 여전히 함유하는 것이 관찰되었다. 이는 수지의 재사용에 영향을 미친다. 본 발명의 발견에 따르면, 적합한 사전 세정 컬럼의 삽입은 정화된 배양액의 추가적인 신속한 정제를 위한 우수한 해결방안을 나타낸다. 추가적인 불순물을 결합함으로써, 사전 세정 컬럼은 샘플의 순도를 향상시키고, 중대한 오염을 감소시키며, 비용이 비싼 친화성 컬럼을 보호한다. 사전 세정 컬럼은 재사용가능하여야 하고, 그의 재생은 간단한 수단에 의해 가능하여야 한다. 가장 적합한 것은, 튼튼한 매트릭스를 갖고, 4급 아미노에틸, 4급 암모늄 또는 트리메틸암모늄 모이어티의 군으로부터 선택되는 리간드, 예를 들면, Nuvia Q에 의해 공급되는 리간드를 함유하는 강 음이온 교환 크로마토그래피 매체이다. 플로우-쓰루 모드에서 사전 세정 음이온 교환 컬럼을 이용하는 것은 몇몇 이점을 갖는다: 컬럼은 상대적으로 작게 유지될 수 있으며, 포획 컬럼에 직접적으로 연결될 수 있다. 이 구성은 음이온 교환 용출액의 일시적인 수집 및 저장을 방지하고, 단계의 수를 감소시키며, 프로세스 경제성을 향상시킨다. 음이온 교환 컬럼 후에, 단백질 A, 또는 혼합 모드 수지(예를 들어, Bakerbond ABx, Capto MMC, CaptoAdhere 또는 MEP HyperCel) 또는 재생되기 어려운 임의의 다른 고비용 수지의 어느 하나가 이어질 수 있다.
용어 "하기 순서로"는 언급된 프로세스 단계가 열거된 순서로 수행되는 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 추가적인 프로세스 단계는 열거된 프로세스 단계 전에, 후에 및 그 사이에 포함될 수 있다.
본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
용어 "추가적인 프로세싱 단계"는 여과, 투석, 바이러스 비활성화, 희석, 농축, pH 조정, 전도도 조정, 또는 중간 크로마토그래피 단계와 같이 단백질 정제 프로토콜 내에서 통상적으로 적용되는 임의의 단계를 나타낸다. 추가적인 프로세싱 단계는 본 발명의 모든 크로마토그래피 단계 사이에 적용될 수 있다. 중간 크로마토그래피 단계는, 샘플을 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키는 단계와 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단계 (b)의 크로마토그래피에 노출시키는 단계 사이를 제외하고, 임의의 크로마토그래피 단계 사이에 적용될 수 있다. 특히, 용어 "추가적인 프로세싱 단계"는 포획 크로마토그래피와 양이온 교환 크로마토그래피 사이에 적용되는 중간 크로마토그래피 단계를 나타낸다. 중간 크로마토그래피 단계는 임의의 크로마토그래피 매체에 의해 수행될 수 있다. 중간 크로마토그래피 단계는 컬럼 크로마토그래피 및 멤브레인 크로마토그래피를 포함하는 임의의 크로마토그래피 종류를 채용할 수 있다.
일 실시예에서, 샘플을 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키는 단계와 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단계 (b)의 크로마토그래피에 노출시키는 단계 사이에, 추가적인 프로세싱 단계가 적용되지 않는다.
다른 실시예에서, 샘플을 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키는 단계와 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단계 (b)의 크로마토그래피에 노출시키는 단계 사이에, 여과, 예를 들어 멸균 여과가 적용되지 않는다.
사전 세정 단계: 음이온 교환 크로마토그래피
본 발명의 방법은 사전 세정 단계로서, 포획 단계 전에 플로우-쓰루 모드의 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 음이온 교환 크로마토그래피 매체는 음이온 교환 멤브레인을 포함하는, 강 음이온 교환 크로마토그래피 매체 또는 약 음이온 교환 크로마토그래피 매체일 수 있다.
이 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피 단계가, 그렇지 않을 경우 산성 pH에서 침전을 야기할 수 있는 불순물을 효율적으로 보유할 수 있으며, DNA 및 RNa와 같은 숙주 핵산 분자와 결합할 수 있음이 밝혀졌다. 크로마토그래피 포획 컬럼에서 파울링을 촉진시키는 조 샘플로부터의 물질이 사전 세정 음이온 교환 컬럼에 의해 사전 포획되고, 후속 포획 컬럼에 들어가지 않고 보류되는 것이 밝혀졌다.
또한, 사전 세정 단계는 단백질 A 침출에 큰 효과를 가지며, 이는 사전 세정 크로마토그래피를 이용함으로써 크게 감소될 수 있다.
마지막으로, 침전 및/또는 탁도가 바이러스 비활성화를 위한 단백질 A 용출액의 유지 단계 중에 관찰되는 경우, 이러한 효과는 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피를 이용할 때 완전히 방지되는 것으로 관찰되었다. 사전 세정 단계의 크로마토그래피 매체가 크로마토그래피 프로세스에서 가장 높게 로딩된 불순물에 노출되기 때문에, 신속하고, 비용이 저렴하며, 효율적인 재생 및 세정 과정이 사전 세정 단계의 크로마토그래피 매체에 요구된다. 음이온 교환 크로마토그래피 매체(예를 들어, 수지 또는 멤브레인)의 재생은 단지 적은 단계를 포함하는 신속하고, 비용이 저렴하며 효율적인 프로토콜에 의해 효율적으로 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 음이온 교환 크로마토그래피 매체의 재생을 위하여, 가혹한 조건이 채용될 수 있으며, 이는 매체의 기능을 손상시키지 않고 짧은 시간 내에 크로마토그래피 매체의 세정을 가능하게 한다. 이온교환 크로마토그래피는 결합된 분자와 매트릭스에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 결합된 분자는 음전하로 하전되며, 고정된 기능기(리간드)는 양전하로 하전된다. 통상적으로 이용되는 음이온 교환 크로마토그래피 매체는 Q 매체(4급 아민리간드), TMAE 수지(트리메틸아미노에틸 리간드), 및 DEAE 수지(디에틸아미노에틸 리간드)이다. 그러나, 일반적으로, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 모든 통상적인 상업적으로 구입가능한 음이온 교환 매체에 의해 수행될 수 있다. 음이온 교환 매체는 프리팩 컬럼 또는 멤브레인의 형태로 이용될 수 있다. 대안으로, 수지는 벌크 재료 및 사용자에 의해 채워진 컬럼으로서 구입될 수 있다. 일반적인 사항들 외에 컬럼의 용량 및 크기에 대해서 특별한 제한은 없다. 당업자는 이용되어야 하는 음이온 교환 크로마토그래피 매체의 양 및 컬럼을 크기를 안다. 이는 프로세스의 전체 규모에 따라 달라진다.
본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 전형적인 강 음이온 교환 크로마토그래피 매체는 하기와 같은 기능기를 포함한다: 4급 아미노에틸(QAE) 모이어티, 수지는 예를 들어, Toyopearl QAE(Tosoh Bioscience, Germany로부터 입수가능), Selectacel QAE(셀룰로오스의 4급 아미노에틸 유도체, Polysciences Inc., Pennsylvania USA로부터 입수가능), QAE Sephadex(GE Healthcare, Germany로부터 입수가능), 및 이외의 것들을 포함한다; 4급 암모늄(Q) 모이어티, 수지는 예를 들어, Q Sepharose XL, Q Sepharose FF, Q Sepharose HP, Q Sepharose CL-4B, Q Sepharose Big Beads, Source Q, Resource Q, Capto Q, Capto Q ImPres(전부 GE Healthcare, Germany로부터 입수가능), Poros HQ(Applied Biosystems, Germany), Q HyperCel, Biosepra Q 세라믹 HyperD(Pall, New York, USA로부터 입수가능), Macro Prep High Q(Bio-Rad, California, USA), Toyopearl Super Q(Tosoh Bioscience, Germany로부터 입수가능), UNOsphere Q(Bio-Rad, California, USA로부터 입수가능)를 포함하며, 트리메틸암모늄에틸(TMAE)은 예를 들어, Fractogel EMD TMAE(Merck KgaA, Germany)를 포함하며, 트리메틸암모늄 수지는 예를 들어, Nuvia Q(Bio-Rad, California, USA로부터 입수가능)를 포함한다.
특히, 강 음이온 교환 크로마토그래피 매체는, 그렇지 않은 경우 산성 pH에서 침전을 야기할 수 있는 불순물을 보유하고, DNA 및 RNA와 같은 숙주 핵산 분자에 결합하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
바람직하게, 4급 아미노에틸 (QAE) 모이어티, 4급 암모늄 모이어티, 및 메타크릴레이트 폴리머 매트릭스에 결합된 트리메틸암모늄 에틸을 제외한 트리메틸암모늄 모이어티로부터 선택된 리간드를 포함하는 강 음이온 교환 크로마토그래피 매체가 이용된다.
더욱 바람직하게, 음이온 교환 크로마토그래피는 -N(CH3)3 + (트리메틸암모늄; Nuvia Q, Bio-Rad, California, USA로부터 입수가능) 기능기(리간드)를 갖는 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 유사한 특성을 갖는 매체를 이용하여 수행되는 강 음이온 교환 크로마토그래피일 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
강 음이온 교환기 Nuvia Q의 특성은 하기와 같다:
기능기: -N(CH3)3 +
총 이온용량: 100-170 meq/ml
동적 결합능: ≥ 170 mg/ml
운반 카운터 이온: Cl-
중간값 입자 크기: 85 ± 15 ㎛
추천 선형 유량(linear flow rate) 범위: 50-600 cm/hr
화학적 안정성
1.0 M NaOH (20℃): 1주 이하
1.0 M HCl (20℃): 5주 이하
겔층 압축비: 1.10-1.15 (setteled bed volume/packed bed volume)
pH 안정성
단기: 2-14
장기: 4-12
운반 용액: 20% 에탄올 + NaCl
재생: 1-2 M NaCl
위생: 0.5-1.0 NaOH
저장 조건: 20% 에탄올 또는 0.01 NaOH
바람직한 실시예에서, 사전 세정 음이온 교환 컬럼의 직경은 포획 컬럼의 직경보다 더 크다. 다른 바람직한 실시예에서, 사전 세정 음이온 교환 컬럼의 층 높이(bed 높이)는 포획 컬럼의 층 높이보다 더 작다. 가장 바람직한 실시예에서, 사전 세정 컬럼의 직경은 포획 컬럼의 직경보다 더 크고, 사전 세정 음이온 교환 컬럼의 층 높이는 포획 컬럼의 층 높이보다 더 작다. 불순물의 최적 포획을 위해서, 사전 세정 음이온 교환 컬럼에 대하여 최소 약 10cm의 층 높이가 요구된다.
일부 종류의 불순물은 이온 상호작용뿐 아니라 소수성 상호작용을 통해서 매체에 결합할 수 있다. 착체 형성도 일어날 수 있다. 사전 세정 크로마토그래피 단계가 매체에 단단히 흡착되어 있는 원하지 않는 오염물에 대한 필터로 기능하므로, 효과적인 재생 및 세정 과정을 개발할 필요가 있다. 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지(예를 들어, Nuvia Q와 같이 -N(CH3)3+ 리간드를 갖는 것)로부터 불순물의 대부분을 제거하기 위하여, 그 사용 후에, 하기 재생 과정(제자리 세정)이 하기 순서로 이용될 수 있다: (a) 용액 A : 40mM Na 포스페이트, 2M 우레아, 1.5M NaCl, 10mM EDTA, pH 7-8. (b) 용액 B: 2M NaCl, 100mM 시트르산. (c) 용액 C: 물 (d) 용액 D: 1M NaOH. (e) 용액 E: 10mM NaOH. 용액 A 내지 E를 연속적으로 컬럼에 통과시킨다. 용액 E는 저장용으로 이용될 수 있다. 반대 흐름(reverse flow)으로 재생을 수행하는 것이 추천된다.
바람직하게, 사전 세정 및 포획 단계의 컬럼은 연속적으로 연결될 수 있다. 이는, 사전 세정 단계의 통과액이 일시적으로 수집 용기에 저장되는 것이 아니라, 포획 크로마토그래피 컬럼으로 즉시 이동되는 것을 의미한다. 바람직한 방법에서, 2개의 컬럼은 동작 후에 분리되며, 개별적으로 재생된다(제자리 세정). 가장 바람직한 재생 단계는 반대 흐름으로 수행된다.
포획 단계
용어 "포획 단계"는 바인딩 모드에서 수행되는 첫 번째 크로마토그래피 단계로 이해된다. 배양액으로부터 면역글로불린의 정제를 위한 포획 단계는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 단계로서 수행된다. 단백질 A 또는 그의 유도체는 친화성 포획으로서 주로 이용된다. 그러나, 다른 크로마토그래피 원리도 포획 단계로서 이용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 혼합 모드 크로마토그래피가 면역글로불린을 포획하는데 성공적으로 이용될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시예에서 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을, 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 -N(CH3)3 +임-;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
단백질 A 친화성 크로마토그래피
음이온 교환 사전 세정 크로마토그래피 단계 후 포획 단계로서 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계를 이용하는 것에 의해, 본 발명의 방법은 비용 효율적 면역글로불린 정제 방법을 제공하며, 면역글로불린 정제에 있어서 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 큰 결합 특이성을 이용한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피"는 리간드로서, 미생물 유래(예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus ), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 펩토스트렙토코쿠스 마그누스(Peptostreptococcus magnus ))의 재조합 단백질 또는 그로부터 유래된 변이체, 또는 면역글로불린에 결합할 수 있는 능력을 갖는 미생물 유래일 수 있는 합성 펩타이드를 채용하는 친화성 크로마토그래피를 나타낸다. 면역글로불린 결합 단백질의 예는 단백질 A, 단백질 G, 단백질 L, 또는 단백질 A/G일 수 있다. 바람직하게, 면역글로불린 결합 단백질 또는 펩타이드는 단백질 A이다. 리간드는 단백질 A의 E, D, A, B 및 C 도메인의 일 이상을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 리간드는 단백질 A의 도메인 B 또는 공학적으로 변형된 단백질 Z를 포함한다. 리간드로서 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 의해 재조합적으로 제조된 14 kD 펩타이드를 채용하는 수지의 예는 IgSelect(GE Healthcare)이다. 더 이상의 정보가 입수불가능한 이 리간드는 모든 종류의 인간 Fc에 대하여 높은 친화도를 갖도록 특별하게 설계되었다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피 재료를 가혹한 세정 조건에 더욱 저항성을 갖도록 만들고, 동작 간 교차 오염 효과(inter-run cross-contamination effects)에 대하여 보호를 제공하기 위하여, 알칼리 내성, 높은 결합능 및 낮은 리간드 누출을 보장하도록 특별하게 설계된 리간드를 함유하는 개선된 단백질 A 친화성 수지를 사용하는 것이 오늘날 일반적이다. 그러나, 이러한 개선된 수지의 하나의 주된 단점은 종래의 단백질 A 수지보다 매우 비싸다는 것이다. 종래의 단백질 A 수지 및 더 최근의 새로운 세대의 단백질 A 수지 제품이 모두 이용될 수 있다는 것이 본 발명의 방법의 중요한 이점이다. 단백질 A 수지가 낮은 불순물 부담에 노출되기 때문에, 종래의 더 싼 단백질 A 수지가 더욱 가벼운 재생 조건에 대한 그들의 제약에도 불구하고 허용가능하게 된다. 그러나, 선택된 단백질 A 수지와 무관하게 본 발명의 사전 세정 단계의 결과로서, 종래의 수지 및 새로운 세대의 수지가 모두 더 긴 수명에 걸쳐 이용될 수 있다. 또한, 단백질 A 컬럼의 세정이 더 쉬워진다는 사실에 기인하여, 프로세스도 더욱 경제성을 갖게 된다.
본 발명의 목적을 위하여 이용될 수 있는 통상적인 단백질 A 수지의 예는 Unosphere SUPrA(Bio-Rad), Protein A 세라믹 HyperD F(Pall Corporation), Poros MabCapture A(Applied Biosystems), ProSep HC, ProSep Ultra, 및 ProSep Ultra Plus(EMD Milli기공), Protein A Sepharose FF, rProtein A Sepharose FF, rmp Protein A Sepharose FF, MAbSelect, MAbSelect SuRe, MAbSelect SuRe LX, 및 MabSelect Xtra(GE Healthcare), 및 Toyopearl rProtein A(Tosoh Bioscience)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 경우, 용어 "단백질 A"는 그의 천연적 소스로부터 회수된 단백질 A, 합성적으로 또는 생물합성적으로(예를 들면, 펩타이드 합성에 의해, 또는 재조합 기술에 의해) 제조된 단백질 A, 및 CH2/CH3 영역을 갖는 단백질에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 그의 변이체를 포함한다. 바람직하게, 높은 결합능 및/또는 알칼리 안정성을 갖는 수지가 이용될 수 있다. 예를 들면, 단백질 A, 단백질 A 유도체, 알칼리-안정화된 단백질 A-유래 친화성 매체(E.coli)가 이용될 수 있다. 바람직하게, 알칼리-안정화된 단백질 A-유래(E.coli) 리간드가 이용될 수 있다. 알칼리-안정화된, 단백질 A-유래 리간드는 바람직하게 화학적으로 안정한 티오-에테르 결합에 의해 고정된, 고도로 가교결합된(highly-crosslinked) 아카로스 매트릭스에 커플링될 수 있다. 하나의 예는 동작 후에, 0.5 M 이하의 NaOH에 의해 신속하고 효율적으로 세정될 수 있는, GE Healthcare Life Sciences로부터의 MabSelect SuRe이다. MabSelect SuRe의 알칼리-안정화된 리간드는 단백질 A의 B-도메인으로부터 유래되며, 더 높은 용리 pH를 부여하는 VH3 결합 도메인이 본질적으로 없다. 바람직한 제품은 MabSelect SuRe LX이며, 이는 MabSelect SuRe보다 더 높은 결합능을 갖는다.
단백질 A 수지 MabSelect SuRe LX의 특성은 하기와 같다:
매트릭스: 단단하고, 고도로 가교결합된 아가로스
리간드: 알칼리-안정화된, 단백질 A-유래 (E.Coli)
리간드 커플링: 단일-지점 부착
리간드 커플링: 에폭시
평균 입자 크기((d50v)*: 85 ㎛
동적 결합능: 6 min 체류 시간에서 약 60 mg 인간 IgG/ml 매체
이동상 최대 속도: 500 cm/h
pH 동작 범위: 3-12
화학적 안정성: 단백질 A 크로마토그래피에 통상적으로 이용되는 모든 수성 버퍼에서 안정함
제자리 세정 안정성: 0.1-0.5 M NaOH
전달(delivery) 조건: 20% 에탄올
단백질 A 친화성 크로마토그래피와 단백질 A 컬럼으로부터의 면역글로불린의 용리 사이에, 특별한 세척 버퍼를 채용하는 하나의 또는 몇몇 세척 단계가 포함될수 있다. 세척 버퍼는 단백질 A에 결합된 관심대상인 면역글로불린의 상당량을 제거하지 않고 단백질 A 수지로부터 불순물을 제거하는데 이용되는 버퍼이다. 세척 버퍼는 염 및 세제(예를 들어, 폴리소르베이트); 염 및 용매(예를 들어, 헥실렌 글리콜); 고농도 염(예를 들어, 고 몰농도 Tris 버퍼); 또는 염 및 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)을 포함할 수 있다. 또한, 세척 버퍼는 카오트로픽 시약(예를 들어, 우레아 또는 아르기닌) 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.
단백질 A 컬럼으로부터 관심대상인 면역글로불린의 용리를 위하여 용리 버퍼가 적용된다. 바람직하게, 용리 버퍼는 낮은 pH를 가지며, 이에 의해, 단백질 구조를 변형시킴으로써 단백질 A와 관심대상인 면역글로불린 사이의 상호작용을 방해한다. 바람직하게, 낮은 pH 용리 버퍼는 약 2 내지 약 5의 pH 범위, 가장 바람직하게 약 3 내지 약 4의 pH 범위를 갖는다. 이 범위 내로 pH를 제어하는 버퍼의 예는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 글리신, 및 암모늄 버퍼, 및 그 조합을 포함한다. 그러한 바람직한 버퍼는 시트레이트 및 아세테이트 버퍼이며, 가장 바람직하게는 소듐 시트레이트 또는 소듐 아세테이트 버퍼이다. 높은 pH 버퍼(예를 들어, 9 이상의 pH를 갖는 버퍼) 또는 관심대상인 면역글로불린의 용리를 위하여, MgCI2 (2mM)와 같은 화합물 또는 조성물을 포함하는 버퍼를 포함하는 다른 용리 버퍼도 고려된다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지는 바람직하게 컬럼 내에서(제자리 세정), 0.1 내지 0.5 NaOH에 의해 재생될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체(예를 들어, MabSelect SuRe)임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체(예를 들어, MabSelect SuRe) 임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
포획 단계로서 혼합 모드 크로마토그래피
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b)단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
혼합 모드 크로마토그래피(MMC)는 리간드와 샘플의 분자 사이의 일 이상의 형태의 상호작용을 이용한다. 혼합 모드 수지로 나타내어지는 수지는 하전된 소수성 이온교환 리간드 또는 수산화인회석과 같은 결정질 미네랄의 어느 하나로 이루어진 기능기를 갖는 크로마토그래피 재료이다. "혼합 모드 크로마토그래피" 대신에, 용어 "다중 모드 크로마토그래피" 또는 "소수성 전하 유도 크로마토그래피"가 때때로 사용되었다. 혼합 모드 크로마토그래피는 일반적으로 적어도 2개의 원리의 상호 작용, 소수성 상호작용과 이온교환, 또는 금속 친화성 상호작용과 이온교환이다. 혼합 모드 크로마토그래피는 이온교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 각각과 같이 단일 모드 크로마토그래피 방법에 의해서 재현될 수 없는 덜 예측가능한 선택도를 제공한다. 양전하로 하전된 소수성 리간드는 음이온 교환기 혼합 모드(예를 들면, Capto MMC)의 군에 속하며, 음전하로 하전된 리간드는 양이온 교환기 혼합 모드(예를 들면, CaptoAdhere)의 군에 속한다. 일부 혼합 모드 수지는 쯔비터 이온 특성(zwitterionic character)을 갖는다(예를 들면, Bakerbond ABx). 다른 혼합 모드 수지는 이온화될 수 있으며, pH를 낮춤으로써 전하를 갖지 않는 상태로부터 양전하로 하전된 상태로 변환되는 소수성 리간드를 갖는다(예를 들면, MEP HyperCel). 마지막으로, 수산화인회석 수지는 양전하로 하전된 칼슘 이온과 음전하로 하전된 포스페이트기를 가짐으로써 더욱 복잡한 혼합 모드 기능을 갖는다.
바람직하게, 이온성 기능 및 소수성 기능을 나타내는 혼합 모드 수지, 예를 들어, Bakerbond ABx(J.T. Baker), Capto MMC, CaptoAdhere(GE Healthcare), PPA HyperCel, 또는 MEP Hypercel(Pall Corporation)가 채용된다. 더욱 바람직하게, 혼합 모드 크로마토그래피 수지 MEP HyperCel이 채용된다.
혼합 모드 크로마토그래피 수지 MEP HyperCel은 하기와 같다:
입자 크기(평균): 80-100 ㎛
인간 IgG에 대한 동적 결합능(10% 파과(breakthrough)): ≥20 mg/ml
리간드: 4-메르캅토-에틸-피리딘
리간드 농도:80-125 μmol/ml
동작 pH(장기): 2-12
세정 pH(6시간 미만): 2-14
압력 저항성: < 3 barg (44 psig)
전형적인 동작 압력: < 1 barg (14 psig)
리간드로서 4-메르캅토-에틸-피리딘을 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 수지(MEP HyperCel)는 약 6.5 내지 9.9의 pH를 갖는 버퍼, 예를 들면, pH 7.4의 PBS, 또는 pH 8의 50mM Tris-HCl에 의해 평형화될 수 있다.
리간드로서 4-메르캅토-에틸-피리딘을 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 수지(MEP HyperCel)로부터 관심대상인 면역글로불린의 용리를 위하여, 용리 버퍼가 적용된다. 바람직하게, 용리 버퍼는 관심대상인 면역글로불린과 MEP HyperCel 컬럼의 상호작용을 방해하는 pH를 갖는다. 바람직하게, 용리 버퍼는 약 pH 3 내지 약 pH 7 범위, 바람직하게 약 pH 3.5 내지 약 pH 6 범위, 더욱 바람직하게 약 pH 4 내지 약 pH 5.5 범위의 pH를 갖는다. 아르기닌(0.1 내지 1.0M, 0.2 내지 0.8M, 0.4 내지 0.6M)이 용리 버퍼(예를 들면, MEP HyperCel 용리 버퍼)에 첨가될 수 있으며, 이에 의해 면역글로불린의 응집이 감소되고, 산성 pH에서 용해도 감소를 방지할 수 있다.
혼합 모드 크로마토그래피의 이점은, 수지에 결합하는 면역글로불린이 예를 들면, 종래의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하는 경우 필요한, 다량의 염(예를 들면, 암모늄 설페이트)의 첨가를 필요로 하지 않는다는 점이다.
혼합 모드 크로마토그래피(리간드로서 4-메르캅토-에틸-피리딘을 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피와 같은)의 가벼운 용리 조건은 면역글로불린의 응집을 감소시킬 수 있으며, 면역글로불린의 생물학적 활성을 보존할 수 있다.
혼합 모드 크로마토그래피 수지는 10 내지 200mM 시트르산, 10mM HCl, 0.5 to 1.0M NaOH, 6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 2 내지 8M 우레아 또는 40% 프로판올에 의해 재생될 수 있다. 바람직하게, 사전 세정 단계를 적용함으로써, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 100mM 시트르산 및 이어서 0.5 내지 1.0M NaOH에 의해 간단하게 재생될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 여기에서, 리간드는 4-메르캅토-에틸-피리딘임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 리간드는 4-메르캅토-에틸-피리딘임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 리간드는 4-메르캅토-에틸-피리딘임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
바람직하게, 단계 (b)의 혼합 모드 크로마토그래피 단계를 위하여, 음전하로 하전된 리간드를 포함하는 혼합 모드 크로마토그래피 수지가 이용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 음전하로 하전된 리간드를 포함하는 수지는 하기 화학식을 갖는 다중 모드 약 양이온 교환기(Capto MMC)이다.
다중 모드 약 양이온 교환기 Capto MMC의 특성은 하기와 같다:
이온 용량: 0.07-0.09 mmol H+/ml 매체
화학적 안정성: 모든 상업적으로 이용되는 수성 버퍼, 1 M 아세트산, 1 M 소듐 하이드록사이드, 8 M 우레아, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 및 70% 에탄올1 )
저장 조건: 4-30℃, 20% 에탄올
pH 안정성 동작 범위: 2-12
매트릭스: 고도로 가교결합된 아가로스
pH 안정성 제자리 세정 (CIP): 2-14
이온교환기 종류: 다중 모드 약 양이온 교환기
결합능/ml 크로마토그래피 매체: 30 mS/cm에서 > 45 mg BSA/ml 매체2 )
다중 모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 관심대상인 면역글로불린의 용리를 위하여, 버퍼의 pH 및/또는 염농도가 증가될 수 있다. 바람직하게, pH와 염농도 양자 모두가 증가될 수 있다. 용리 버퍼의 염농도는 0.25M 내지 1.75M, 바람직하게 0.5M 내지 1M의 범위일 수 있다. 용리에 이용되는 염/버퍼의 예는 소듐 포스페이트, Tris-HCl, NaCl 및/또는 NH4Cl일 수 있다. 이온 강도는 0.02 - 0.3M 범위일 수 있다. 버퍼의 pH는 pH 6 내지 pH 9, 바람직하게 pH 7 내지 pH 8 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게 pH 5.5 내지 7.5의 추가적인 세척 단계가 용리 전에 적용된다.
대안적인 실시예에서, 추가적인 폴리싱 단계가 채용될 수 있다. 추가적인 폴리싱 단계는 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피와 같은 폴리싱 단계에 적합한 임의의 크로마토그래피 방법일 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 음전하로 하전됨 -;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을, 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
여기에서, 단계 (b)의 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 하기 화학식을 갖는다.
폴리싱
단계로서 양이온 교환 크로마토그래피
양이온 교환 크로마토그래피는 샘플의 단백질과 수지에 고정된 전하 사이의 전하-전하 상호작용에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 결합되어야 하는 분자는 양전하로 하전되며, 고정된 기능기(리간드)는 음전하로 하전된다. 통상적으로 이용되는 양이온 교환 수지는 S-수지(설포네이트), SP 수지(설포프로필), SE 수지(설포에틸), 및 CM 수지(카르복시메틸)이다.
그러나, 일반적으로, 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 모든 상업적으로 구입가능한 양이온 교환 수지 또는 멤브레인에 의해 수행될 수 있다. 양이온 교환 수지는 기능기, 예를 들어, 설폰산이 고정된, 프리팩 컬럼 또는 멤브레인의 형태로 이용될 수 있다. 대안으로, 수지는 벌크 재료 및 사용자에 의해 채워지는 컬럼으로 구입될 수 있다. 일반적인 것 외에, 컬럼의 용량 및 치수에 대한 특별한 제한은 없다. 당업자는 이용되어야 하는 양이온 교환 수지의 양 및 컬럼의 크기를 알고 있다. 이는 프로세스의 전체 규모에 따라 달라진다.
전형적인 상업적으로 구입가능한 제품은 예를 들면, Macro-Prep High S, Macro-Prep CM, Unosphere Rapid S, Unosphere Rapid S40, Nuvia S, 및 Nuvia HR-S(Bio-Rad, California, USA), Toyopearl CM, Toyopearl SP, 및 Toyopearl GigaCap S(Tosoh Bioscience, Germany), Milli기공 ProRes S, Fractogel EMD COO-, Fractogel EMD SO3-(Merck KGaA, Germany), Biosepra CM 세라믹 HyperD, Biosepra S 세라믹 HyperD, S HyperCel(Pall Corperation, New York, USA), Poros HS, Poros XS(Applied Biosystems, Germany), YMC BioPro 30S, YMC BioPro 70S(YMC Europe) CM-Sepharose FF, SP-Sepharose FF, S-Sepharose FF, SP-Sepharose HP, SP-Sepharose XL, SP-Sepharose Big Beads, CM-Sephadex, Capto S, Capto SP ImpRes, 및 Source S(모두 GE Healthcare, Germany)를 포함한다.
통상적으로, 양이온 교환 크로마토그래피는 4 내지 7의 pH에서 버퍼를 이용하여 수행된다.
본 발명의 바람직한 양이온 교환 수지는 설포네이트 또는 설포프로필 리간드를 이용하는 강 양이온 교환기이다. 가장 바람직한 것은 고도로 가교결합된 아가로스, 예를 들어, Nuvia HR-S, 또는 폴리(스티렌비닐벤젠), 예를 들어, Poros 50 HS와 같이 단단한 매트릭스에 결합된 설포네이트 또는 설포프로필 리간드이다.
양이온 교환기 Poros 50 HS의 특성은 하기와 같다:
지지 매트릭스: 가교결합된 폴리(스티렌디비닐벤젠)
표면 기능성: 설포프포필(-CH2CH2CH2SO3 -)
동적 결합능 @1000 cm/hr: 라이소자임, pH 6.2, 55 mg/ml
수축/팽창: 0-100% 용매로부터 <1%
입자 크기: 50 ㎛
10 cm 층 길이에서 추천 최대 유량: 1,000 cm/hr
기계적 저항성: 100 bar(1500 psi, 10 MPa)
매체 배압(backpressure): 1,000 cm/hr에서 <3 bar (10 cm 층 높이)
Poros 50 HS에 대한 대안적인 바람직한 재료는 설포네이트 기 및 고도로 가교결합된 아가로스 매트릭스에 기반하는 강 양이온 교환기인 Nuvia HR-S이다.
양이온 교환 크로마토그래피는 약 pH 4 내지 약 pH 8의 pH를 갖는 버퍼로 평형화될 수 있다. 버퍼 농도는 10mM 내지 100mM의 범위, 바람직하게 20mM 내지 50mM의 범위이다.
양이온 교환 크로마토그래피에 이용되는 버퍼의 예는 시트르산, 락트산, 포름산, 석신산, 아세트산, 말론산, 글리신, MES, 포스페이트, HEPES, 또는 그 혼합물이다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계는 면역글로불린의 전하 변형체(charge variants)를 분리할 수 있으며, 잔류 숙주 세포 단백질, 응집체 및 침출된 단백질 A를 제거할 수 있다.
면역글로불린은 면역글로불린의 등전점(pI) 아래의 pH 값에서 낮은 전도도에서 수지와 결합할 수 있다.
용리를 위하여, 단일 단계에 의해, 또는 경사에 의해 제공되는, 용리 버퍼의 이온 강도의 증가가 이용될 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피의 용리에 이용되는 염의 예는 NaCl, KCl, 설페이트 염, 포스페이트 염, 포르메이트 염, 또는 아세테이트 염이다. 바람직하게, NaCl 또는 KCl이 이용된다. 이온 강도는 1M까지 증가될 수 있다.
대안으로, 단일 단계에 의해, 또는 경사에 의해 제공되는, 용리 버퍼의 pH 증가가 이용될 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 수행을 위한 바람직한 실시예는 4 내지 6의 범위, 더욱 바람직하게 4.5 내지 5.5 범위의 pH 동작 범위이다. 버퍼 물질로 탄산이 이용될 수 있으며, 시트르산이 가장 바람직하다.
다른 바람직한 실시예에서, 양이온 교환 수지에 결합된 면역글로불린의 용리는 pH 값의 변화, 즉 pH 증가에 의해 수행된다. 이는, 2종의 상이한 버퍼 용액을 혼합함으로써 제공되는, 낮은 pH로부터 높은 pH로의 경사에 의해 이루어질 수 있다. 낮은 pH에 대하여 바람직하는 것은 시트레이트 버퍼이고, 높은 pH에 대하여 바람직한 것은 포스페이트 버퍼이다. 가장 바람직한 실시예에서, pH 경사는 pH 약 5 내지 6의 시트레이트 버퍼와 pH 약 7 내지 9의 포스페이트 버퍼를 혼합함으로써 형성된다. 버퍼는 10 내지 50mM의 농도의 산의 Na 염을 이용함으로써 제조될 수 있다.
대안으로, 단일 단계에 의해, 또는 경사에 의해 제공되는, 용리 버퍼의 pH 및 이온 강도 양자 모두의 증가가 용리에 있어서 이용될 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 수지는 3 내지 5개 컬럼 부피에 대하여 1M NaCl에 의해 재생될 수 있다. 또한, 하기 단계를 포함하는 제자리 세정 과정이 적용될 수 있다: (a) 1M NaOH, 1M NaCl의 1 내지 5개 컬럼 부피에 의한 세척, (b) 1M 아세트산 또는 TFA의 1 내지 5개 컬럼 부피에 의한 세척, (c) 재평형화(re-equilbration).
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 설포프로필임-.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 설포프로필임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 설포프로필임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 강 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 강 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체(예를 들어, MabSelect SuRe)임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 설포프로필임 -.
다른 실시예에서, 본 발명의 사전 세정 단계 후에, 바인딩 모드에서 수행되는 혼합 모드 크로마토그래피가 이어지고, 이후, 바인딩 모드에서 수행되는 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피가 후속된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 사전 세정 단계 후에, 바인딩 모드에서 수행되는 혼합 모드 크로마토그래피가 이어지고, 이후, 바인딩 모드에서 수행되는 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 후속된다.
단백질 A 친화성 크로마토그래피에 대한 상세사항은 상기에 제공되며, 혼합 모드 크로마토그래피에 이어지는 단백질 A 크로마토그래피에 대해서도 적용된다.
면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 대한 상세사항은 상기에 제공되며, 혼합 모드 크로마토그래피에 이어지는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 대해서도 적용된다.
추가적인
폴리싱
단계로서 혼합
모드
크로마토그래피
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나,;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린이 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계,;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고,통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고,통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고,통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 다중 모드 강 음이온 교환기임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계,;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고,통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 리간드는 4-메르캅토-에틸-피리딘임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 리간드는 4-메르캅토-에틸-피리딘임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고,통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계.
혼합 모드 매체 또는 수지로 나타내어지는 매체는 전하를 갖는 소수성 이온교환 리간드 또는 수산화인회석과 같은 결정질 미네랄의 어느 하나로 이루어진 기능기를 갖는 크로마토그래피 매체이다. "혼합 모드 크로마토그래피" 대신에, 용어 "다중 모드 크로마토그래피" 또는 "소수성 전하 유도 크로마토그래피"가 때때로 이용되었다. 혼합 모드 크로마토그래피는 적어도 2개 원리의 상호작용, 소수성 상호작용과 이온교환, 또는 금속 친화성 상호작용과 이온교환이다. 혼합 모드 크로마토그래피는 각각 이온교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 같이 단일 모드 크로마토그래피 방법에 의해 재현될 수 없는 덜 예측가능한 선택도를 제공한다. 양전하로 하전된 소수성 리간드는 음이온 교환기 혼합 모드의 군에 속하고(예를 들면, Capto MMC), 음전하로 하전된 리간드는 양이온 교환기 혼합 모드의 군에 속한다(예를 들면, CaptoAdhere). 일부 혼합 모드 매체는 쯔비터이온 특성을 갖는다(예를 들면, Bakerbond ABx). 다른 혼합 모드 매체는 pH를 낮춤으로써 이온화가능하고, 전하를 갖지 않은 상태에서 양전하로 하전된 상태로 변환되는 소수성 리간드를 갖는다(예를 들면, MEP HyperCel). 마지막으로, 수산화인회석 매체는 양전하로 하전된 칼슘 이온 및 음전하로 하전된 포스페이트기를 가짐으로써 더욱 복잡한 혼합 모드 기능을 갖는다.
바람직하게, 양이온 교환 크로마토그래피에 이어지는 혼합 모드 크로마토그래피 단계는 양전하로 하전된 리간드를 포함하는 매체에 의해 수행된다. 더욱 바람직하게, 양전하로 하전된 리간드는 하기 식을 갖는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민이다:
(예를 들면, GE Healthcare, Germany로부터의 CaptoAdhere)
혼합 모드 크로마토그래피 수지 CaptoAdhere의 특성은 하기와 같다:
매트릭스: 고도로 가교결합된 아가로스
기능기: 다중 모드 강 음이온 교환기
총 이온용량: 0.09 - 0.12 mmol Cl-/ml 매체
입자 크기: 75 ㎛(d50v)
유속: < 3 bar (0.3 MPa)에서, 물과 동일한 점도를 갖는 프로세스 버퍼를 이용하여, 20℃에서 20 cm 층 높이를 갖는 1m 직경 컬럼에서 적어도 600 cm/h
pH 안정성
- 단기: 2-14
- 장기: 3-12
동작 온도: 4 내지 30℃
화학적 안정성: 모든 통상적으로 이용되는 수성 버퍼, 1 M 아세트산, 1 M 소듐 하이드록사이드
회피(avoid): 산화제, 음이온성 세제
바인딩 및 용리 모드에서 혼합 모드 크로마토그래피 수지 CaptoAdhere를 로딩할 때 하기 조건이 적용될 수 있다: pH 6 내지 pH 9, 바람직하게 pH 7.0 내지 8.5; 전도도 0.5 내지 10mS/cm, 바람직하게 1 내지 4mS/cm. 일 이상의 세척 단계가 이용될 수 있다. 조건은 면역글로불린의 pI에 따라 달라진다.
CaptoAdhere 크로마토그래피에 대한 바람직한 로딩 조건은 하기와 같다: 수지는 pH 8.2의 0.5M Na-포스페이트, 이어서 pH 8.2의 20mM Na-포스페이트에 의해 평형화된다. 샘플(양이온 교환 풀)은 pH 8.0-8.5 및 1-4 mS/cm의 전도도로 조정되고, 컬럼에 로딩된다. pH 8.2의 평형 버퍼 20mM Na-포스페이트에 의한 세척 후에, 관심대상인 면역글로불린은 예를 들면, pH 5 내지 7, 바람직하게는 pH 5.5 내지 6.5의 20mM Na-포스페이트에 의해 CaptoAdhere 수지로부터 용리될 수 있다.
플로우-쓰루 모드에서, pH 및 이온 강도는 면역글로불린이 혼합 모드 리간드에 결합하지 않는 반면, 세정되어야 하는 잔류 오염물(DNA, 응집체, 침출된 단백질 A, 숙주 세포 단백질)은 결합된 채로 유지되도록 조정되어야 한다. 조건은 면역글로불린의 pI에 따라 달라진다. 바람직하게, 포스페이트 또는 Tris 버퍼가 6.5 내지 8.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게 pH 7 내지 8 범위로 이용된다. 전도도는 NaCl과 같은 염에 의해, 또는 버퍼 농도에 의해 조정된다. 가장 바람직한 것은, 50 내지 200mM 농도 범위의 NaCl이 보충된 10 내지 50mM 농도 범위의 Na-포스페이트 버퍼이다. 높은 염농도는 이온 상호작용을 제거하기는 하지만, 소수성 상호작용을 촉진시키는 것으로 여겨져야 한다. 바람직한 방법에서, 양이온 교환 크로마토그래피로부터의 용출액은 pH 7.5 내지 8로 조정되고, 전도도는 NaCl에 의해 10-12mS/cm로 증가하였다.
혼합 모드 수지를 위한 재생(제자리 세정)은 낮은 pH, 높은 염, 및 높은 pH, 예를 들면, 10 내지 200mM 시트르산, 0.5-2M NaCl, 및 10mM 내지 1M NaOH에 의해 수행될 수 있다.
바람직한 재생 과정은 용액 A 내지 D에 의해 연속적으로 세척함으로써 수행된다: 용액 A: 100mM 시트르산, 2M NaCl; 용액 B: 2M NaCl; 용액 C: 1M NaOH; 용액 D: 10mM NaOH. 수지의 저장은 용액 D에서 수행될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +임 -;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 음이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 -N(CH3)3 +;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 ;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체임 -;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민임 -.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 매체에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 면역글로불린 결합 단백질/펩타이드 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 양이온 교환 크로마토그래피의 리간드는 설포프로필임 -;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계 - 여기에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지의 리간드는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민임 -.
폴리싱 단계로서, 다른 크로마토그래피 형태로 채용될 수 있다. 예를 들면, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 및 음이온 교환 멤브레인 크로마토그래피가 폴리싱 단계로서 채용될 수 있으며, 가장 바람직한 것은 플로우-쓰루 모드인 것이다.
단백질의 등전점 또는 pI는 단백질이 0인 실제 전체 전하(net overall charge)를 갖는 pH, 즉, 단백질이 동일한 수의 양전하 및 음전하를 갖는 pH를 나타낸다. pI의 결정은 등전점 전기영동과 같은, 종래 기술에서 수립된 기술에 따라 이루어질 수 있다.
다른 실시예에서, 정제는 첫 번째 크로마토그래피 단계에 앞서 일 이상의 원심분리 단계를 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, 정제는 첫 번째 크로마토그래피 단계에 앞서 일 이상의 여과 단계를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 정제는 하나의 원심분리 단계 및 일 이상의 여과 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 첫 번째 크로마토그래피 단계 전에, 뎁스 여과 및 마이크로여과 단계가 선행된다. 더욱 바람직한 실시예에서, 첫 번째 크로마토그래피 단계 전에, 세포 분리 단계, 뎁스 여과 단계 및 마이크로여과 단계가 선행된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(i) 샘플을 원심분리하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 상청액에서 수득됨 -;
(ii) 단계 (i)에서 수득된 상청액을 뎁스 여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 -;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 면역글로불린을 마이크로여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 -;
(a) 단계 (iii)의 여과액을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합e됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(i) 샘플을 원심분리하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 상청액에서 수득됨 -;
(ii) 단계 (i)에서 수득된 상청액을 뎁스 여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 -;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 면역글로불린을 마이크로여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 -;
(a) 단계 (iii)의 여과액을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계.
다른 실시예에서, 본 발명은 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법을 제공하며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(i) 샘플을 원심분리하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 상청액에서 수득됨 -;
(ii) 단계 (i)에서 수득된 상청액을 뎁스 여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 -;
(iii) 단계 (ii)에서 수득된 면역글로불린을 마이크로여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 -;
(a) 단계 (iii)의 여과액을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계.
뎁스 여과
또한, 본 발명의 방법은 일 이상의 뎁스 여과 단계를 포함할 수 있다. 입자를 멤브레인 표면에 보유함으로써 분리하는 멤브레인 필터와 달리, 뎁스 필터는 섬유 또는 비드의 매트릭스로 이루어져 있으며, 분리는 그 표면보다는 매트릭스 전체에서 일어난다.
뎁스 필터의 예는 SXLP700416 및 SXLPDE2408SP 필터 캡슐(Pall Corporation), Millistak+ XOHC, FOHC, DOHC, AlHC, 및 BlHC Pod 필터(EMD Milli기공), 또는 Zeta 20 Plus 30ZA/60ZA, 60ZN90ZA, delipid, VR07, 및 VR05 필터(3M)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 뎁스 필터는 예를 들면, United Kingdom, 3M으로부터의 Zeta Plus와 같이, 사전추출된 무기 여과 보조제, 셀룰로오스 및 필터 매트리스에 강한 양전하를 부여하는 수지 시스템으로 구성된다.
본 발명에 이용되는 가장 바람직한 뎁스 필터는 Pall Corporation으로부터의 PDE2 및 P700 시리즈 필터 캡슐이다.
한외 여과, 바이러스 여과, 마이크로여과
또한, 본 발명의 방법은 일 이상의 마이크로여과, 한외 여과 및/또는 나노 여과 단계를 포함할 수 있다. 한외 여과는 유체 정역학적 압력이 액체를 반투과성 멤브레인에 대하여 강제적으로 미는 멤브레인 여과의 형태이다. 고분자량의 현탁된 고체 및 용질은 보유되는 반면, 물 및 저분자량의 용질은 멤브레인을 통과한다. 한외 여과는 거대분자 용액, 특히 단백질 용액의 분리, 정제 및 농축을 위하여 통상적으로 사용되는 방법이다. 한외 여과는 정용 여과와 결합될 수 있다. 이 모드는 반복적인 또는 연속적인 희석 및 재농축을 통하여 용액으로부터 염 및 다른 미세종을 제거하기 위하여 완충액 교환에 있어서 적합하다. 한외 여과는 특히, 큰 부피의 샘플 여과를 위한, 접선 흐름 여과 또는 직교류 여과 시스템(tangential flow or cross flow filtration system, TFF 또는 TF-UF)에서 적층된 멤브레인에 의해 수행될 수 있다. 대안으로, 중공 섬유 시스템이 한외 여과에 있어서 통상적으로 이용된다. 멤브레인 컷오프 크기는 약 1 내지 300kD의 범위이다. 면역글로불린에 있어서, 한외 여과 멤브레인에 대한 전형적인 컷오프는 10-100kD이다. 본 발명의 체계에서, UF 멤브레인에 대하여 30 또는 50kD의 분획분자량(molecular weight cut off)이 바람직하다.
마이크로여과는 약 0.1 내지 10㎛의 기공 크기를 갖는 멤브레인을 이용하는 입자 여과 방법이다. 환경에 대하여 특별한 요구조건을 부여하는 멸균 여과에 있어서, 약 0.2㎛의 기공 크기를 갖는 멸균 마이크로필터가 이용된다. 더 큰 기공 크기(0.45㎛, 3㎛)를 갖는 추가적인 사전 필터의 이용이 통상적이다. 이에 의해, 작은 기공 필터의 급속한 차단에 의해 흐름이 감소하는 것이 방지된다.
마지막으로, 생물약학적 제품에서, 나노 여과가 바이러스 여과에 대부분 이용되고, 포유류 세포 배양물에서 제조된 치료용 단백질의 안전성을 위하여 요구된다. 나노 여과 단계는 정제된 면역글로불린의 벌크를 충진하는 것에 가까운 다운스트림의 마지막에 수행되는 것이 일반적이다. 자주 이용되는 나노필터의 기공 크기는 15 내지 35 nm이다(Planova, Asahi Kasei, Japan; 또는 Viresolve, EMD-Milli기공, Germany).
본 발명의 바람직한 실시예에서, 정제 프로세스는 일 이상의 한외 여과/정용 여과 및/또는 나노 여과 단계를 포함한다. 이러한 여과 단계는 예를 들어, Pall Corporation, GE Healthcare, EMD-Milli기공, 또는 Sartorius로부터 입수가능한 상업적으로 구입가능한 여과 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 방법은 2.5 내지 4.5, 바람직하게 pH 3 내지 4의 낮은 pH에서, 소정 시간 동안, 바람직하게 30 내지 90분 동안, 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 용출액을 배양하는 추가적인 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 방법은 2.5 내지 4.5, 바람직하게 pH 3 내지 4의 낮은 pH에서, 소정 시간 동안, 바람직하게 30 내지 90분 동안, 혼합 모드 크로마토그래피의 용출액을 배양하는 추가적인 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고, 양이온 교환 크로마토그래피 단계 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 얻어지는 조성물을 나노 여과에 노출시키는 추가적인 단계를 포함한다. 바람직하게, 15 내지 35 nm, 가장 바람직하게 20 nm의 기공 크기를 갖는 필터가 나노 여과에 있어서 적용될 수 있다.
플로우-쓰루 모드의 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해, 바이러스에 대하여 적어도 5, 적어도 5.5, 적어도 6, 적어도 6.5의 log10 감소 인수(reduction factor)에 이를 수 있다.
낮은 pH에서의 용출액(단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수득된)의 배양 단계에 의해, 외피 보유(enveloped) 바이러스에 대하여 적어도 5, 바람직하게 적어도 5.5의 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 5의 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
나노 여과 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 4의 log10 감소 인수 및/또는 외피 비보유(non-enveloped) 바이러스에 대하여 적어도 5의 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피 단계 및 낮은 pH에서의 용출액(단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수득된)의 배양 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계 및 낮은 pH에서의 용출액(단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수득된)의 배양 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 10, 바람직하게 적어도 11, 더욱 바람직하게 적어도 12의 누적 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계, 낮은 pH에서의 용출액(단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수득된)의 배양 단계, 및 나노 여과 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15, 바람직하게 적어도 16의 누적 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계, 낮은 pH에서의 용출액(단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수득된)의 배양 단계, 및 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15, 바람직하게 적어도 16, 더욱 바람직하게 적어도 17의 누적 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계, 낮은 pH에서의 용출액(단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수득된)의 배양 단계, 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 나노 여과 단계에 의해, 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 20, 바람직하게 적어도 21의 누적 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계, 양이온 교환 크로마토그래피 단계, 및 나노 여과 단계에 의해, 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 12, 바람직하게 적어도 13의 누적 log10 감소 인수에 이를 수 있다.
특정 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합e됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 단계;
여기에서, 본 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 단계 (a) 및 (c)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 된다.
다른 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 단계;
(d) 단계 (c)의 배양 후의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계;
여기에서, 본 방법은 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 단계 (a) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되고, 및/또는 본 방법은 외피 비보유 바이러스 및/또는 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 단계 (a), (c) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 된다.
다른 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 단계;
(c2) 단계 (c)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
여기에서, 본 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 단계 (a), (c) 및 (c2)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 된다.
다른 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 수득된 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 단계;
(c2) 단계 (c)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(d) 단계 (c2)의 배양 후의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (c2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계;
여기에서, 본 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 단계 (a), (c) 및 (c2)에 대한 누적 log10 감소 인수, 및/또는 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 20의 단계 (a), (c), (c2) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수, 및/또는 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 12의 단계 (a), (c2) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 된다.
다른 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계; 및
단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계;
여기에서, 본 방법은 외피 보유 바이러스 및/또는 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 단계 a) 및 d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 된다.
다른 실시예는 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 하기 단계를 하기 순서로 포함한다:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c2) 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
및 단계 (c2)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (c2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 나노 여과에 노출시키는 단계;
여기에서, 본 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 단계 a), c2) 및 d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되고, 및/또는 본 방법은 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 13의 단계 (a), (c2) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 된다.
또한, 전술한 방법은 면역글로불린의 제조 프로세스에서 바이러스 안전성을 높이기 위하여 작용한다.
본 명세서에 사용된 용어 "소정 시간 동안" 배양은 적어도 30분, 적어도 40분, 적어도 50분, 적어도 60분 동안 배양, 바람직하게 30분 내지 90분 동안 배양, 더욱 바람직하게 45분 내지 75분 동안 배양, 가장 바람직하게 60분 동안 배양하는 것을 나타낸다.
단계 "낮은 pH에서 배양"의 pH는 2.5 내지 4.5의 pH뿐 아니라, 3 내지 4의 pH, 바람직하게 3.25 내지 3.75의 pH, 더욱 바람직하게 3.5의 pH를 나타낸다.
용어 "외피 보유 바이러스"는 바이러스의 핵단백질 코어를 둘러싸는 리포단백질 외피를 갖는 임의의 바이러스를 나타내며, 예를 들어, 인간 병원체 및 실험에서 사용되었던 모델 바이러스인 쥐 백혈병 바이러스(MuLV)를 포함하는, 헤르페스 바이러스, 사이토 바이러스, 폭스 바이러스, 아레나 바이러스, 아테리 바이러스, 헤파드나 바이러스, 플라비 바이러스, 토가 바이러스, 코로나 바이러스, 오르토믹소 바이러스, 파라믹소 바이러스, 라브도 바이러스, 분야 바이러스, 필로 바이러스, 바큘로 바이러스, 이리도 바이러스, 및 레트로 바이러스를 나타낸다.
용어 "외피 비보유 바이러스"는 바이러스 외피를 갖지 않는 임의의 바이러스를 나타내며, 예를 들어, 인간 병원체 및 실험에서 사용되었던 모델 바이러스인 미세 생쥐 바이러스(MVM)을 포함하는, 아데노 바이러스, 칼리모 바이러스, 미오 바이러스, 피코드나 바이러스, 텍티 바이러스, 파포바 바이러스, 서코 바이러스, 파보 바이러스, 버나 바이러스, 레오 바이러스, 아스트로 바이러스, 칼리시 바이러스, 피코르나 바이러스, 포티 바이러스, 토바마 바이러스, 칼라 바이러스, 아넬로 바이러스, 및 헤페 바이러스를 나타낸다.
출발 재료에서의 바이러스 역가(viral titer)와 관련 생성물 분획에서의 바이러스 역가의 계산된 비율은 log10 감소 인수(LRF), log10 감소 값(LRV) 또는 때때로 단순하게 log10 제거(clearance)로 부리는 바이러스 감소를 정의한다. LRF 산출 모드는 바이러스 제거 연구(예를 들어, Appendix II of EMA guideline CPMP/BWP/268/95 (1996) "Note for guidance on virus 확인 studies: the design, contribution and interpretation of studies validating the 비활성화 and removal of viruses")에 대한 관련 가이드라인에 개요가 설명되어 있다.
"세척(wash) 단계"는 샘플이 크로마토그래피 컬럼에 로딩된 후, 단백질이 컬럼으로부터 용리되기 전에 수행되는 단계이다. 또한, 세척 단계는 수지로부터 관심대상인 면역글로불린을 상당히 용리시키지 않고, 매트릭스, 면역글로불린 및/또는 리간드에 덜 단단하게 또는 비특이적으로 결합된 오염물을 제거한다. 세척 단계에서, 수지는 원하는 세척 버퍼로 세척된다(예를 들어, 컬럼의 출구에서 측정된 UV 흡수가 기준선으로 되돌아올 때까지 세척 버퍼가 크로마토그래피 컬럼을 통과한다).
용어 "용리"는 용액 조건을 버퍼 성분이 크로마토그래피 수지 상의 리간드 자리에 대하여 관심대상인 분자와 경쟁하도록 변경시킴으로써, 크로마토그래피 수지로부터 관심대상인 면역글로불린을 탈착시키는 프로세스로서 이해된다. 용리의 다른 모드는 예를 들어, 단백질 A를 이용하는 친화성 크로마토그래피에서 이어난다. 이 경우, 용리 버퍼는 리간드 또는 면역글로불린의 구조를 변경시킬 수 있으며, 이에 의해 결합을 느슨하게 만든다. 관심대상인 면역글로불린은 이동상의 버퍼 이온이 이온교환 수지의 하전된 이온 자리에 대하여 분자와 경쟁하도록 이온교환 재료를 둘러싸는 버퍼의 이온 강도를 변경시킴으로써 이온교환 수지로부터 용리될 수 있다. 대안으로, pH 변화는 양쪽성 단백질에 영향을 미치며, 그 이후로 단백질의 pI를 넘는 pH 증가는 양이온 교환 수지에 대한 그의 결합 및 단백질 용리를 방지한다. pH가 단백질의 pI 아래로 감소하는 경우, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에서 동일한 효과가 발생한다.
본 명세서에서 이해되는 바와 같이, 용어 "용리"는 선행하는 세척 단계를 갖거나 갖지 않는, 등용매 용리, 단일 단계 용리 및 경사 용리를 포함한다. 관심대상인 면역글로불린의 용리는 버퍼 용액의 염농도를 증가시킴으로써 영향받는, 이동상에서의 이온 강도 또는 전도도를 증가시킴으로써 수행될 수 있다. 대안으로, pH 값의 증가 또는 감소가 적합할 수 있다. 불연속 단계적 경사, 선형 경사, 비선형 경사 또는 그러한 경사의 적합한 조합이 채용될 수 있다.
세척 및 용리에 대하여 적합한 버퍼는 아세테이트, 시트레이트, Tris /HCl, Tris/아세테이트, 포스페이트, 석시네이트, 말로네이트, MES, HEPES, Bistris, 글리신, 및 포스페이트, 설페이트, NaCl 또는 KCl과 같은 클로라이드와 같은 염이 첨가된 다른 적합한 버퍼로부터 선택될 수 있다. 용리가 수행되는, 이온 강도 및 염농도는 버퍼 용액의 pH 값 및 단백질의 pI에 따라 달라진다. 세척 버퍼는 세제(예를 들어, 폴리소르베이트), 용매(예를 들어, 헥실렌 글리콜, 이소프로판올, 또는 에탄올), 또는 폴리머(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 더 포함할 수 있다. 또한, 세척 버퍼는 카오트로픽 시약(예를 들어, 우레아 또는 아르기닌) 및/또는 프로테아제 억제제(예를 들어, EDTA)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "버퍼"는 산-염기 컨주게이트 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액을 나타낸다.
용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 면역글로불린은 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 다중 특이성 항체(예를 들어, 이중 특이성 항체) 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 그의 단편일 수 있다. 자연 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들면, 네이티브 IgG 항체는 다이설파이드 결합으로 연결되어 있는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로 4분자체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 중 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VH), 및 이어서 3개 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 경 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인 (VL), 및 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2종류 중 하나에 할당될 수 있다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 단쇄 항체 분자; 다이어바디(diabodies); 선형 항체; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체를 포함한다.
바람직하게 면역글로불린은 단일 클론 항체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 클론 항체"는 실질적으로 균일 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 나타내며, 즉 집단을 포함하는 개별적인 항체는 미량 존재할 수 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 상이한 결정 요인(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 종래의 (다중 클론) 항체 제제와 달리, 각각의 단일 클론 항체는 항원 상의 단일 결정 요인에 대한 것이다. 한정어 "단일 클론"은 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 요구하는 것으로 이해되어서는 안된다.
면역글로불린은 쥐 클래스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM, IgA, IgD 또는 IgE, 인간 클래스 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE, 또는 그의 조합 또는 단편일 수 있다.
면역글로불린은 하기 항원을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 하나의 단백질 또는 그 조합을 인식할 수 있다: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, CD152, IL-1a, IL-1β, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, IL-2 수용체, IL-4 수용체, IL-6 수용체, IL-12 수용체, IL-13 수용체, IL-18 수용체 서브유닛, PDGF-β, 및 및 그의 유사체, PLGF, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-p1, EGF 수용체, PLGF 수용체, VEGF 수용체, 혈소판 수용체 gpIIb/IIIa, 트롬보포이에틴 수용체, 아포토시스 수용체 PD-1, 간세포 성장 인자, 오스테로프로테게린 리간드, 인터페론 감마, B 림프구 자극제, T-세포 활성 조절제 CTLA-4, C5 보체, IgE, 종양 항원 CA125, 종양 항원 MUC1, PEM 항원, ErbB2/HER-2, 환자의 혈청에 높은 수준으로 존재하는 종양-관련 에피토프, 유방암 세포, 결장암 세포, 편평 세포, 전립선암 세포, 췌장암 세포, 폐암 세포 및/또는 신장암 세포에서, 및/또는 흑색종 세포, 신경교종 세포 또는 신경아세포종 세포에서 발현되는 암-관련 에피토프 또는 단백질, 종양의 괴사성 핵, 인테그린 알파 4 베타 7, 인테그린 VLA-4, B2 인테그린, α4β1 및 α4β7 인테그린, TRAIL 수용체 1,2,3, 및 4, RANK, RANK 리간드(RANKL), TNF-α, 부착 분자 VAP-1, 상피세포 부착 분자(EpCAM), 세포간 부착 분자-3 (ICAM-3), 류코인테그린 부착 분자, 혈소판 당단백질 gp IIb/IIIa, 심장 미오신 중쇄, 부갑상선 호르몬, 스클러로스틴(sclerostin), MHC I, 발암배아성 항원(CEA), 알파-태아 단백질 (AFP), 종양 괴사 인자 (TNF), Fc-y-1 수용체, HLA-DR 10 베타, HLA-DR 항원, L-셀렉틴, 및 IFN-γ.
면역글로불린은 예를 들면, 아펠리모맙(afelimomab), 압식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 아르시투모맙(arcitumomab), 벨리무맙(belimumab), 카나기누맙(canakinumab), 세투시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 임시로맙(imciromab), 카프로맙(capromab), 인필시맙(infliximab), 이필리무맙(ipilimumab), 압식시맙(abciximab), 리투시맙(rituximab), 바실리시맙(basiliximab), 팔리비주맙(palivizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 니볼루맙(nivolumab), 노페투모맙(nofetumomab), 오말리주맙(omalizumab), 다클리주맙(daclizumab), 이브리주모맙(ibritumomab), 무로모납(muromonab)-CD3, 에데레콜로맙(edrecolomab), 겜투주맙(gemtuzumab), 골리무맙(golimumab), 세르놀리주맙(certolizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 파니투무맙(panitumumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라니비주맙(ranibizumab), 로모소주맙(romosozumab), 토실리주맙(tocilizumab), 토시투모맙(tositumomab), 클레놀리시맙(clenoliximab), 켈리시맙(keliximab), 갈리시맙(galiximab), 포라비루맙(foravirumab), 렉사누무맙(lexatumumab), 베바시주맙(bevacizumab), 및 베돌리주맙(vedolizumab)일 수 있다.
본 발명의 면역글로불린은 바람직하게 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 분자와 같은 IgG 분자이다. 더욱 바람직하게, 면역글로불린은 IgG1이다. 더욱 더 바람직하게, 면역글로불린은 적어도 Fc 부분이 인간인 IgG1이다. 면역글로불린은 IgG1의 Fc 부분이 인간인 쥐-인간 키메라 IgG1일 수 있다. 가장 바람직하게, 키메라 면역글로불린은 리투시맙(rituximab) 또는 인플리시맙(infliximab)이다.
리투시맙은 예를 들면, WO9411026에 상세하게 기재되어 있는 키메라 항-cd20 항체이다.
인플리시맙은 예를 들면, WO9216553에 상세하게 기재되어 있는 키메라 항-TNFα 항체이다.
면역글로불린은 인간화 IgG1 형태 쥐 프로제니터일 수 있다. 가장 바람직하게, 인간화 항체는 트라스투주맙 또는 베바시주맙이다.
트라스투주맙은 예를 들면, WO9222653에 상세하게 기재되어 있는 인간화 항-HER2 항체이다.
베바시주맙은 예를 들면, WO9845331에 상세하게 기재되어 있는 인간화 항-VEGF 항체이다.
면역글로불린은 완전히 인간 IgG1 항체일 수 있다. 가장 바람직하게, 인간 항체는 아달리무맙 또는 데노수맙이다.
아달리무맙은 예를 들면, WO9729131에 상세하게 기재되어 있는 인간 항-TNFα 항체이다.
데노수맙은 예를 들면, WO03002713에 기재되어 있는 인간 항-RANKL 항체이다.
일 실시예에서, 항체는 리투시맙 또는 아달리무맙일 수 있다.
본 명세서에서 단일 클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래되거나 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동이며, 사슬의 잔기는 다른 종으로부터 유래되거나 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동인 "키메라" 항체(면역글로불린), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 하면, 그러한 항체의 단편을 포함한다.
또한, 본 명세서에서 단일 클론 항체는 "인간화" 항체를 포함한다. 그러한 항체는 비-인간(예를 들면, 쥐)의 "인간화"에 의해 수득되고, 동물 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열만을 포함한다. 그러한 분자의 대부분은 인간 서열이다. 인간 수용자 항체의 초가변 영역으로부터의 잔기는 원하는 결합 특성을 갖는 비-인간 도너 항체의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 대체된다.
마지막으로, 본 명세서에서 단일 클론 항체는 인간 항체 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있는 완전히 인간 항체를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 샘플은 재조합 CHO 세포 배양물로부터 얻어지는 세포 배양 상청액으로부터 유래된다. 바람직하게, 샘플은 성장기인 재조합 세포 배양물로부터 얻어진다.
크로마토그래피 매체는 일회용이거나 또는 재사용할 수 있다. 일 실시예에서, 크로마토그래피 매체는 재사용할 수 있다.
특정 실시예에서, 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 재사용할 수 있다.
재사용가능한 크로마토그래피 매체는 일회용으로서 구성되는 크로마토그래피 매체에 비하여 비용 효율적이다. 특히, 첫 번째 사전 세정 단계에 있어서, 다량의 크로마토그래피 매체가 이용된다. 따라서, 사전 세정 단계를 위하여 재사용할 수 있는 크로마토그래피 매체, 예를 들어, 재사용할 수 있는 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 이용하는 것이 특히 유리하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "재사용할 수 있는"은, 매체 또는 수지가 1회보다 많은 정제 사이클, 즉 적어도 2회, 5회, 10회, 50회, 100회, 200회, 300회, 400회, 500회 이상의 정제 사이클에 재사용되도록 구상되는 것을 의미한다. 각각의 사이클 사이에, 크로마토그래피 매체 또는 수지는 세척 및/또는 재생 및/또는 저장될 수 있다.
다른 특정 실시예에서, 모든 크로마토그래피 단계의 크로마토그래피 매체는 재사용할 수 있다.
용어 "매트릭스" 또는 "고체상"은 리간드가 부착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본 명세서에서 관심대상인 매트릭스는 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌을 포함하는 것이 일반적이다.
"리간드"는 단백질 또는 적어도 하나의 오염물과 상호작용하며, "매트릭스"에 공유결합되는 임의의 기능기를 의미한다.
"수지"는 단백질 또는 적어도 하나의 오염물과 상호작용할 수 있는 결합 기능기(리간드)를 포함하는 비드 형태의 임의의 크로마토그래피 재료를 의미한다. 예외는, 전형적으로 부착된 리간드가 없는 크기 배제 크로마토그래피를 위한 겔 크로마토그래피 수지이다. 수지는 상이한 크기를 갖는 비드로서 공급될 수 있으며, 컬럼에 채워질 수 있다. 대안으로, 프리팩 컬럼을 구입할 수 있다.
본 발명의 방법은 소규모 및 대규모의 면역글로불린 정제에 이용될 수 있다. 바람직하게, 본 방법은 대규모로 수행된다.
"실험실 규모"로도 나타내어지는 "소규모"는 50g 미만의 면역글로불린, 10g 미만의 면역글로불린 또는 1g 미만의 면역글로불린을 함유하는 샘플의 정제를 나타낸다. 또한, "소규모"는 포획 단계의 컬럼으로부터 용리된 단백질이 50g 미만의 면역글로불린, 10g 미만의 면역글로불린 또는 1g 미만의 면역글로불린에 달하는 정제 프로세스를 나타낸다.
"생산 규모" 또는 "제조 규모"로도 불리는 "대규모"는 50g이 넘는 면역글로불린, 100g이 넘는 면역글로불린, 200g이 넘는 면역글로불린 또는 300g이 넘는 면역글로불린을 함유하는 샘플의 정제를 나타낸다. 또한, "대규모"는 포획 단계의 컬럼으로부터 용리된 단백질이 50g이 넘는 면역글로불린, 100g이 넘는 면역글로불린, 200g이 넘는 면역글로불린 또는 300g이 넘는 면역글로불린에 달하는 정제 프로세스를 나타낸다.
실시예
면역글로불린 정제를 위한 본 발명의 방법은 하기 실시예를 참조함으로써 뒷받침되고 실증된다. 이러한 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 여겨져서는 안된다는 것이 강조되어야 한다.
실시예
1:
면역글로불린
및 세포 배양
본 발명의 방법은 특정한 항체나 면역글로불린의 발현에 이용되는 특정 숙주 세포에 따라 달라지지 않는다. 또한, 이는, 수확물의 최대 수율을 위하여 최적화된 발현 모드 및 선택된 배양 조건에 대해서도 마찬가지이다. 상이한 단일 클론 항체가 본 발명의 방법 개발 중에 이용되었다. 이들은 본 방법에 따라 다양한 규모에서 성공적으로 정제되었다. 표에 나타내어진 선택된 실험의 대부분은 쥐-인간 키메라 항-CD20, IgG1 항체인 리투시맙에 의해 수행되었다. 또한, 일부 다른 실험은 완전히 인간 항-TNFα, IgG1 항체인 아달리무맙에 의해 수행되었다. 두 항체 모두 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되었으며, 상이한 규모의 유가 배양물에서 증식되었다. 발달기에서의 실험은 100 L의 실험실 규모로부터 수확된 배양액에 의해 주로 수행되었다. 실시예에 이용된 생산 규모 및 최대 배양 부피는 1000 L이었다. 다르게 특정되지 않으면, 규모는 항상 배양 부피를 나타낸다.
실시예
2: 세포 배양액의 수확 및 사전 세정 여과 단계
하기 방법은 1000 L 규모에 대해 기재된다. 세포 및 세포 찌꺼기는 100 L/h의 유량, 9600 rpm에서, LAPX404 분리기(Alfa Laval)를 이용하여 분리함으로써 제거되었다. 분리된 배양액을 하기 필터(Pall Corporation)를 통하여 연속적으로 여과하였다: (i) 필터 Capsule SXLP700416SP, (ii) 필터 Capsule SXLPDE2408SP, 및 (iii) 다시 필터 Capsule SXLPDE2408SP. 이 필터 구성에 의해 뎁스 여과 및 마이크로여과 원리가 달성된다. 첫 번째 크로마토그래피 전에, 여과된 배양액을 Sartopore 2/0.2㎛ 멤브레인 필터 장치(Sartorius)를 이용하여 마이크로여과하였다.
실시예
3: 크로마토그래피 수지의 선택(표 1 및 표 2)
상이한 공급자로부터의 통상적이고 잠재적으로 유용한 프로세스 크로마토그래피 수지의 상대적으로 많은 수집물을 사전 세정 단계, 포획 단계, 및 폴리싱 단계로서 넓은 스크리닝 프로그램으로 그 효율성에 대하여 테스트하였다(도 2A 및 2C 참조). 이는 본 발명 개발의 초기 단계 동안 수행되었다. 수지를 작은 컬럼(10-20 ml)에 채우고, 리투시맙을 포함하는 샘플을 분리 및 여과(사전 세정 및 포획 단계) 후에 직접적으로, 또는 단백질 A 용출액으로부터(바인딩 모드의 폴리싱 단계) 100L 실험실 규모로 취했다. 단백질 A 및 사전 세정 크로마토그래피 후에 얻어진 양이온 교환 크로마토그래피 풀이 플로우-쓰루 모드의 폴리싱 단계에 이용되었다. 크로마토그래피 동작은 Aekta Purifier System(GE Healthcare)에 의해 수행되었다.
사전 세정 수지: 8종의 상이한 음이온 교환 크로마토그래피 수지가 플로우-쓰루 모드에서 테스트 및 비교되었다. 수지는 Capto Q, Q-Sepharose FF, Unosphere Q, Nuvia Q, Fractogel TMAE, Poros HQ, Q HyperCel, 및 Toyopearl Super Q 650이었다. 채워진 컬럼을 10mM Tris-HCl, pH 8.0에 의해 평형화하였다. 테스트 기준은 (i) 오염물의 파과(breakthrough)까지 통과된 샘플량 측면에서의 최대 용량, (ii) 재생(변색 포함), 및 (iii) pH 5.0 미만으로 수집된 통과액의 산성화 후 침전의 정도. 4종의 수지가 사전 세정 단계에서 이용되기에 가장 적합한 것으로 밝혀졌으며(표 1), Nuvia Q를 제외하고, 이들은 유사한 결과를 나타내었다. 그러나, Nuvia Q는 우수한 것으로 명백하게 증명되었고, 바람직한 수지이다(표 2).
단백질 A를 갖는 친화성 포획 크로마토그래피 수지: 총 9종의 상이한 단백질 A 수지가 세척 단계의 적용 없이 바인드 및 용리 모드에서 테스트되고 비교되었다. 컬럼 크기, 유량, 및 체류 시간에 대하여 동일한 조건이 이용되었다. 컬럼 평형화 버퍼는 40mM Na-포스페이트, 150mM NaCl, pH 7.4이었다. 용리는 100mM Na-시트레이트, pH 3.5에 의해 수행되었다. 테스트된 수지는 MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect SuRe, MabSelect SuRe LX, Unosphere Supra, ProSep Ultra Plus, Protein A Ceramic HyperD F, Poros MabCapture A, 및 Toyopearl rProtein A이었다. 기준은 (i) 동적 및 특이적 결합능(파과 결정), (ii) 요구되는 재생 과정, (iii) 가혹한 세정(NaOH, 우레아, Gu-HCl)에 대한 민감도, (iv) 용출액의 순도(잔류 HCP, 침출된 단백질 A), 및 (iv) 비용 산출이었다. 종합하면, 3종의 수지가 우수하고 가장 유용한 것으로 밝혀졌다(표 1). Poros MabCapture A, 및 GE Healthcare로부터의 2종의 MabSelect SuRe 수지가 대규모 프로세스에 대하여 가장 유망한 수지 후보이었다. MabCapture A는 MabSelect SuRe에 비해 15% 더 낮은 HCP 제거 용량을 가졌으며, 2번째 선택이었다. 가장 바람직한 수지는 MabSelect SuRe보다 어느 정도 더 높은 결합능을 갖는 MabSelect SuRe LX이었다(표 2).
비-친화성 포획 크로마토그래피 수지: 총 5개의 상이한 수지가 이 카테고리에서 테스트되었다. 수지는 Capto MMC(혼합 모드), Capto S(양이온 교환기), MEP HyperCel(혼합 모드), PPA HyperCel(혼합 모드), 및 Toyopearl AF Red(Procion Red HE-3B에 기초하는 염료 리간드)이었다. 기준은 (i) 동적 및 특이적 결합능(파과 결정), (ii) 요구되는 용리 기준, (iii) 재생 과정(0.5M NaOH), 및 (iv) 용출액의 순도(HCP)이었다. 이들 모든 수지(표 1)는 효율적인 포획 능력을 나타내었으나, 정제력은 상이하였다. 용출액에서의 HCP는 정성적 및 정량적으로 상이하였다. 비-친화성 포획 단계는 후속 단백질 A 친화성 크로마토그래피 전에 적용될 수 있으며(도 2B 참조), 원칙적으로 가치 있는 단백질 A 컬럼의 부담을 더 덜어주기 위하여 두 번째 사전 세정 단계로서 기능한다. 그러나, 2종의 혼합 모드 수지가 우수한 것으로 밝혀졌으며, 단백질 A 친화성 단계가 전혀 없는 다운스트림 시퀀스에서 포획 단계로서 이용될 수 있다(도 2C 참조). 이러한 유망한 수지는 Capto MMC 및 MEP HyperCel이었다(표 2).
바인딩 모드에서의 폴리싱 크로마토그래피를 위한 수지: 하나의 혼합 모드 크로마토그래피 수지를 제외하고, 양이온 교환기만이 이 카테고리에 있어서 고려되었다. 다수의(n = 14) 통상적인 양이온 교환기가 테스트되었다: Poros HS, Poros XS, SP Sepharose HP, Capto SP Impres, YMC BioPro 30S, YMC BioPro 70S, Unosphere Rapid S, Unosphere Rapid S40, Nuvia S, Nuvia HR-S, Toyopearl SP 650S, Toyopearl GigaCap S 650S, Milli기공 ProRes S, 및 Fractogel EMD SO3. 컬럼에, 리투시맙 및 소량의 오염물을 포함하는 단백질 A (MabSelect SuRe) 용출액을 로딩하고, 평형화 버퍼에 의해 10 mg/ml 단백질 농도로 조정하였다. 모든 수지가 동일한 정도로 테스트되지 않았다. 동적 및 특이적 결합능(파과 결정) 외에, 잔류 HCP 및 생성물-관련 불순물(응집체, 원하지 않는 전하 변형체)을 분리하는 능력이 조사되었다. 용리는 증가하는 염 및/또는 pH 경사에 의해 수행되었다. 수지는 산성 분획(전하 변형체) 및 염기성 분획(응집체)의 분리에 대하여 큰 차이를 나타내었다. 이는 면역글로불린 폴리싱 단계의 의도된 목적이기 때문에, 이 기준은 가중치가 부여되었다. 총 6종의 수지가 폴리싱 단계에 적합한 것으로 밝혀졌다(표 1). Poros 50 HS, SP Sepharose HP, Capto SP Impres, Nuvia HR-S, Toyopearl SP 650S, 및 Fractogel EMD SO3 중에서, Applied Biosystems으로부터의 양이온 교환기인Poros HS 50, 및 and Bio-Rad로부터의 하나의 수지인 Nuvia HR-S가 오염물 HCP, 응집체, 원하지 않는 전하 변형체, 및 침출된 단백질 A에 대하여 최고의 제거 가능성을 나타내었다. 또한, GE Healthcare로부터의 양전하로 하전된 혼합 모드 수지인 CaptoAdhere가 바인딩 모드에서의 폴리싱 단계로서의 유용성에 대하여 조사되었다. 동일한 샘플, 컬럼 크기 및 기준이 양이온 교환기에 대한 것과 동일한 방식으로 적용되었다. 평형 버퍼는 20mM Na-포스페이트, pH 8.2이었고, 샘플의 pH는 NaOH에 의해 8.2로 조정되었으며, 평형화 버퍼에 의해 더 희석되었다. 수지는 더 많은 양을 결합할 수 있었으나, 리투시맙 20-23 mg/ml의 로딩이 효율적인 분리를 위하여 요구되었다. 결합 단백질의 용리는 20mM Na-포스페이트, pH 6.0에 의해 수행되었다. 바인딩 모드에서의 CaptoAdhere 수지는 오염물에 대한 매우 유망한 제거력을 나타내었으며, 폴리싱 단계에 대하여 바람직한 수지로 선택되었다(표 2).
비-바인딩 모드에서의 폴리싱 크로마토그래피: 이 카테고리에서, 음이온 교환기 및 하나의 혼합 모드 수지가 테스트되었다. 총 7종의 상이한 통상적인 음이온 교환기가 테스트되었다: Poros HQ, Capto Q, Unosphere Q, Nuvia Q, Toyopearl GigaCap Q 650, Q HyperCel, 및 Fractogel EMD TMAE. 기준은: 잔류 응집체, HCDNA 및 HCP에 특히 초점을 맞춘, 수득된 통과액에서 리투시맙의 최대 순도이었다. 컬럼에, 단백질 A (MabSelect SuRe) 단계 후의 양이온 교환기(Poros HS) 풀을 로딩하였다. 3종의 음이온 교환 크로마토그래피 수지, Poros HQ, Capto Q, 및Nuvia Q가 플로우-쓰루 모드의 폴리싱 단계에 이용되기에 가장 적합한 것으로 밝혀졌다(표 1). 또한, GE Healthcare로부터의 양전하로 하전된 혼합 모드 수지인 CaptoAdhere가 플로우-쓰루 모드에서의 폴리싱 단계에 있어서의 유용성에 대하여 조사되었다. 동일한 샘플, 컬럼 크기 및 기준이 음이온 교환기에 대한 것과 동일한 방식으로 적용되었다. 평형 버퍼는 20mM Na-포스페이트, 100mM NaCl, pH 7.8이었다. CaptoAdhere 수지는 플로우-쓰루 모드에서도 오염물에 대하여 현저한 제거력을 나타내었으며, 음이온 교환 크로마토그래피 수지보다 약간 우수하였다. 이는, 음이온 교환 기능을 보완하는 추가적인 소수성 상호작용에 의해 쉽게 설명된다. 따라서, CaptoAdhere가 플로우-쓰루 모드에서의 폴리싱 단계에 대하여 바람직한 수지로 선택되었다(표 2).
| 형태 및 모드 | 수지 | 공급자 | 적합성 |
| 사전 세정 단계 AEX 통과액 | Poros HQ | Applied Biosystems | + |
| Fractogel TMAE | EMD Milli기공 | + | |
| Capto Q | GE Healthcare | + | |
| Nuvia Q | Bio-Rad | ++ | |
| 단백질 A 친화성 포획 단계 |
Poros MabCapture | Applied Biosystems | + |
| MabSelect SuRe | GE Healthcare | ++ | |
| MabSelect SuRe LX | GE Healthcare | ++ | |
| 비-친화성 포획 단계 |
Toyopearl AF Red | Tosoh Biosciences | + |
| PPA Hypercel | Pall Corporation | + | |
| MEP Hypercel | Pall Corporation | ++ | |
| Capto MMC | GE Healthcare | ++ | |
| Capto S | GE Healthcare | + | |
| 폴리싱 단계 바인딩 모드 (CEX 또는 MMC) |
Capto SP ImpRes | GE Healthcare | + |
| Fractogel EMD SO3 | EMD Milli기공 | + | |
| Toyopearl SP 650S | Tosoh Biosciences | + | |
| Sepharose SP HR | GE Healthcare | + | |
| Nuvia HR-S | Bio-Rad | ++ | |
| Poros 50 HS | Applied Biosystems | ++ | |
| CaptoAdhere | GE Healthcare | ++ | |
| 폴리싱 단계 플로우-쓰루 (AEX 또는 MMC) |
Poros 50 HQ | Applied Biosystems | + |
| Capto Q | GE Healthcare | + | |
| CaptoAdhere | GE Healthcare | ++ | |
| Nuvia Q | Bio-Rad | + |
+ = 적합한 수지; ++ = 바람직한 수지
| 프로세스 단계 | 수지 | 형태 | 리간드 | 공급자 |
| 사전 세정 | Nuvia Q | AEX | 트리메틸암모늄 | Bio-Rad |
| 포획 | MabSelect SuRe LX | 친화성 | 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체 | GE Healthcare |
| 포획 | MEP HyperCel | MMC | 4-메르캅토-에틸-피리딘 | Pall Corporation |
| 포획 | Capto MMC | MMC | 다중 모드 약 양이온 교환기 | GE Healthcare |
| 폴리싱 | Poros 50 HS | CEX | 설포프로필 | Applied Biosystems |
| 폴리싱 | Nuvia HR-S | CEX | 설포네이트 | Bio-Rad |
| 폴리싱 | CaptoAdhere | MMC | N-벤질-N-메틸 에탄올 아민 | GE Healthcare |
실시예
4: 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피 단계
100 L 규모(리투시맙 또는 아달리무맙) 및 1000 L 규모(리투시맙)가 도 2A 내지 C에 도시된 다운스트림 시퀀스 동안 정제되었다. 사전 세정 크로마토그래피 단계에 있어서 바람직한 수지는 플로우-쓰루 모드에서 수행되는 Nuvia Q이었다. 이 프로세스 단계는 실시예 2에 기재된 사전 세정 여과 과정 후에 수득된 배양액에 의해 수행되었다. 후속 포획 단계에 있어서 불순물 로드(HCP, HCDNA, 응집체, 리피드, 안료 등)를 감소시키기 위하여, 사전 세정 크로마토그래피는 Nuvia Q 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 의해 플로우-쓰루 모드에서 수행되었다. 수지가 채워진 컬럼(1000 L 규모에 대한 치수 = 60cm 직경 x 16cm 높이, 압축 용적(packed volume) 약 45 L; 100 L 규모에 대한 치수 = 14cm 직경 x 27cm 높이, 압축 용적 약 4.1 L)은 WFI(2 CV), 1M Tris-아세트산 pH 6.0(3 CV) 및 20mM Tris-아세트산 pH 7.2(4 CV)에 의해 평형화되었다. 생성물 용액을 컬럼에 통과시키고(17 g/L 수지), 이어서 약 200 cm/h의 유량으로 WFI(2 CV)를 통과시켰다. Nuvia Q 수지의 재생은 (i) 40mM NaH2PO4, 10mM EDTA, 2M 우레아, 1.5M NaCl, pH 7.2 (4 CV), (ii) 100mM 시트르산, 2M NaCl (10 CV), (iii) WFI (4 CV), (iv) 1M NaOH (4 CV), 및 (v) 10mM NaOH (2 CV)에 의해 연속적으로 반대 방향으로 세척함으로써 이루어졌다. 이후, 컬럼을 10 mN NaOH 용액에서 저장하였다.
실시예
5: 포획
수지로서 이용된
MEP
HyperCel의
재사용에 대한 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피 단계의 효과(표 3)
MEP HyperCel는 후속적인 단배질 A 친화성 단계를 포함하는(도 2B), 또는 포함하지 않는(도 2C), 대규모 프로세스에 적용될 수 있는 포획 단계에 대하여 바람직한 비-친화성 수지이다. MEP HyperCel 컬럼의 오염(파울링)은 심각한 단점인 것으로 밝혀졌다. 그러나, 이는, 이 실시예에서 Nuvia Q이었던, 사전 세정 음이온 교환 컬럼을 적용함으로써 방지되거나 또는 크게 감소될 수 있다. Nuvia Q 전치 컬럼 없이, MEP HyperCel의 재사용은 엄격하고, 오래 지속되며, 비용이 비싼 재생 과정을 요구하며, 그 경우에도 수명이 제한된다. 표 2의 실험은 각각 Nuvia Q 및 MEP HyperCel이 채워진 소형 모델 컬럼(20 ml)에 의해 수행되었다. Nuvia Q 크로마토그래피의 샘플 로드 및 성능은 실시예 4에 기재되어 있다. 통과액은 조정 없이 MEP HyperCel에 즉시 로딩되었다. 동시에, 두 번째 포획 컬럼에 실시예 2에 따른 배양액을 직접적으로 로딩, 즉 Nuvia Q 단계를 우회하였다. 최대 용량에 도달하고, 통과액에서 생성물이 나타났을 때까지 포획 컬럼에 로딩하였다(파과). 결합된 IgG는 pH 감소(pH 4)에 의해 MEP HyperCel 컬럼으로부터 용리되었다. 파과까지의 부피로부터 결합능이 산출되었다. 혼합 모드 수지는 간단하게 재생되었으며, 다음 동작을 위하여 재평형화되었다. MEP Hypercel의 재생은 100mM 시트르산 용액, 이어서 1M NaOH를 통과시킴으로써 반대 흐름에서 수행되었다. NaOH와의 접촉 시간은, 컬럼이 재평형화 및 NaOH의 완전한 제거(pH 제어)에 의해 다음 사용을 위하여 준비된 후 60분이었다. Nuvia Q 컬럼은 실시예 4에 기재된 바와 같이 재생되었다. 총 8회의 사이클이 수행되었다(7회 재사용). 결과는 표 3에 요약되어 있으며, Nuvia Q 단계의 우수성을 뒷받침하는 것이다. Nuvia Q 사전 세정이 적용된 경우 결합능에는 변화가 없었다. 그에 반해, 그러한 단계가 없으면, 동작 간 결합능이 감소되었으며, 이는 8회 사이클 후 64%로 줄어들었다.
| 사이클 번호 | MEP HyperCel | AEX→MEP HyperCel |
| 1 | 16.5 mg/ml | 16.1 mg/ml |
| 2 | 13.2 mg/ml | 16.0 mg/ml |
| 3 | 12.6 mg/ml | 15.9 mg/ml |
| 4 | 11.9 mg/ml | 16.2 mg/ml |
| 5 | 11.5 mg/ml | 16.1 mg/ml |
| 6 | 11.0 mg/ml | 15.9 mg/ml |
| 7 | 10.7 mg/ml | 16.0 mg/ml |
| 8 | 10.5 mg/ml | 15.9 mg/ml |
실시예
6:
Capto
MMC
포획 크로마토그래피
Capto MMC 수지는 음전하로 하전된 혼합 모드 크로마토그래피 매체이며(표 2 참조), 도 2B(5개의 컬럼 프로세스) 및 도 2C(4개의 컬럼 프로세스)의 프로세스 공정도에 도시된 다운스트림 시퀀스에 적용되었다. 이러한 시퀀스에서, Capto MMC는 원칙적으로 샘플을 정제하고, 후속되는 단백질 A 크로마토그래피 수지에 해를 미칠 수 있는 프로테아제와 같은 중대한 오염물을 제거하기 위한 두 번째 사전 세정 단계로서 기능한다. 또한, 이 단계는 상당한 샘플 농도를 가능하게 하며, 이에 따라 단백질 A 크로마토그래피의 프로세스 시간을 감소시킨다. Capto MMC 크로마토그래피는 바인딩 모드에서 수행되었으며, 아세트산에 의해 pH 4로 조정된 실시예 4에 기재된 Nuvia Q 통과액이 로딩되었다. 100 L 규모 리투시맙 및 1000 L 규모 리투시맙이 모두 이 방법에 따라 정제되었다. 1000 L 규모에 대한 컬럼 치수는 60cm 직경 x 15cm 높이(압축 용적 약 42 L)이었으며, 100 L 규모에 대한 컬럼 치수는 20 x 14cm(압축 용적 약 4.4 L)이었다. 수지는 20mM Na-아세테이트, pH 5.0에 의해 평형화되었으며, 결합된 리투시맙을 포함하는 컬럼은 40mM Na-포스페이트, pH 6.5에 의해 세척되었다. 용리는 최대 회수를 위하여 최적화되었으며, 40mM Na-포스페이트, 250mM NaCl, pH 7.5에 의해 수행되었다. 유량은 150-200 cm/h이었다. 용출액은 단백질 A 컬럼에 직접적으로 로딩되었다.
실시예
7: 단백질 A 포획 크로마토그래피
단백질 A 포획 크로마토그래피는 MabSelect SuRe(100 L 규모) 또는 MabSelect SuRe LX(1000 L)에 의해 수행되었다. 컬럼의 규모를 제외하고, 공정 파라미터는 동일하였다. 샘플은 실시예 4에 적용된 방법(도 2A의 프로세스, Nuvia Q 통과액) 후에, 또는 실시예 6에 적용된 방법(도 2B의 프로세스, Capto MMC 용출액) 후에 취해졌다. 1000 L 규모에 대한 컬럼 치수는 40cm 직경 x 30cm 높이(압축 용적 약 38 L)이었고, 100 L 규모에 대한 컬럼 치수는 20 x 10.4cm(압축 용적 약 3.2 L)이었다. 단백질 A 컬럼은 40mM Na-포스페이트, 150mM NaCl, pH 7.4에 의해 평형화되었다. 다르게 특정되지 않으면, 생성물 용액은 20g 단백질/L 수지(100 L 규모) 또는 35g 단백질/L 수지(1000 L 규모)로 로딩되었다. 컬럼은 평형화 버퍼 (2 CV), 이어서 40mM Na-포스페이트, 1.5M NaCl, 2M 우레아, 10mM EDTA, pH 7.4에 의해 세척되었다. 용리는 100mM Na-시트레이트, pH 3.5에 의해 수행되었다. 유량은 140cm/h이었다. Mabselect SuRe 또는 MabSelect SuRe LX 수지의 재생은 (i) 0.2M NaOH (2 CV), (ii) WFI (2 CV), 3.5% 아세트산, 100mM Na-설페이트 (2 CV) 및 (iii) WFI (2 CV)에 의해 연속적으로 반대 방향으로 세척함으로써 수행되었다. 컬럼은 다음 동작을 위하여 재평형화되거나, 또는 20% 에탄올에 저장되었다.
실시예
8: 침출된 단백질 A에 대한 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피의 효과(표 4)
단백질 A(MabSelect SuRe LX)의 침출에 대한 사전 세정 크로마토그래피(Nuvia Q) 및 온도의 효과를 조사하기 위하여, 일련의 실험이 규모가 줄어든 단백질 A 친화성 크로마토그래피에서 수행되었다. 이용된 컬럼은 12 ml의 부피를 가졌다. Aekta Purifier System(GE Healthcare)이 크로마토그래피 동작에 적용되었다. 샘플은 리투시맙 1000 L 배치로부터 취해진 작은 앨리쿼트이었다. 샘플은 실시예 2에 기재된 과정 후에(Nuvia Q 사전 세정 단계 전에), 또는 실시예 3에 기재된 과정 후에(Nuvia Q 사전 세정 단계 후에) 수득된 프로세스 단계로부터 취해졌다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피의 방법은 실시예 7에 따라 수행되었다. 컬럼에 25-30 mg 단백질/ml 수지를 로딩하였다. 샘플 및 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 실온에서(20-25℃) 유지하거나, 또는 냉각 챔버(2-8℃)에 두었다. 2개의 유사한 샘플이 2개의 상이한 앨리쿼트로부터 각각 취해졌고, 동시에 테스트되었다. 결과를 표 4에 나타낸다. 선행하는 Nuvia Q 단계 없이 실온에서 2개의 병행하는 침출 동작의 평균값은 23.4 ng/mg이었다(IgG mg당 단백질 A 등가물). 사전 세정 단계의 효과는 분명하다(표 4). 실온에서, 단백질 A 단계 전에 샘플이 Nuvia Q 컬럼을 통과한 경우, 9.1 ng/mg (= 39%)의 침출만 발생하였다. 그 자체가 침출에 상당한 효과를 나타내는 저온에서도, 효과가 나타났다. 평균하여, Nuvia Q 없는 침출은 5.0 ng/mg이었고, Nuvia Q 있는 침출은 3.4 ng/mg(68%)이었다(표 4). Nuvia Q 단계는 단백질 A 침출을 크게 감소시키며, 이용되는 친화성 크로마토그래피 단계에 대하여 더욱 바람직한 실온을 가능하게 한다. 단백질 A 침출에 대한 Nuvia Q의 효과는 Nuvia Q 수지에 결합하는 단백질 가수분해 활성의 포획에 의해 가장 잘 설명된다.
| 단백질 A 침출 | |||
| 온도 | 샘플 | 사전 세정 없음 | 사전 세정 있음 |
| 실온 (20 - 25℃) |
1 | 25.1 ng/mg | 10.3 ng/mg |
| 2 | 21.6 ng/mg | 7.8 ng/mg | |
| 냉각 (2 - 8℃) |
3 | 4.9 ng/mg | 3.1 ng/mg |
| 4 | 5.0 ng/mg | 3.6 ng/mg | |
실시예
9: 연결된 사전 세정 및 포획
컬럼
Nuvia Q에 의한 사전 세정 음이온 교환 단계는 통과액에서 수행되며, 후속 단백질 A 친화성 수지(MabSelect SuRe LX)는 이 통과액으로부터 면역글로불린을 효율적으로 포획할 수 있기 때문에, Nuvia Q 컬럼을 MabSelect SuRe LX 컬럼에 직접적으로 연결할 수 있었다. 도 2A 및 2B에 요약된 다운스트림 프로세스는 그러한 연결된 사정 세정 및 포획 컬럼에 의해 1000 L 규모(리투시맙)로부터 동작하였다. 그러나, 다르게 특정되지 않으면, 100 L 규모 프로세스도 연결된 컬럼에 의해 수행되었다. 2개의 컬럼은 개별적으로 평형화된 후, 밸브 스위칭에 의해 연결되었다. Nuvia Q에 대하여, 실시예 4에 기재된 상향류 방향(up-flow direction)으로 연결된 컬럼 상에 생성물 용액이 약 100 L/h (1000 L 규모) 또는 약 10 L/h (100 L 규모)로 로딩되었다. WFI (2 CV)에 의한 세척 후에, Nuvia Q 컬럼은 크로마토그래피 스키드에서 밸브 스위칭에 의해 우회되었고, 실시예 4에 기재된 바와 같이 반대 흐름으로 재생되었다. 추가적인 프로세싱, 즉, 세척, 용리, 단백질 A 컬럼의 재생이 실시예 7에 기재된 바와 같이 비연결 구성으로 수행되었다.
실시예
10: 바이러스 비활성화
도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 바이러스 비활성화 단계가 단백질 A 친화성 크로마토그래피 후에 이루어진다. 친화성 매트릭스로부터 낮은 pH 용리의 이점이 얻어진다. 이와 같은 수성 산성 환경에서, 많은 바이러스, 특히 외피 보유형의 바이러스는 불안정하고, 해체된다. 본 발명에 있어서 개발된 단백질 A 방법은 3.5의 pH를 갖는 용출액을 생성한다(실시예 7 참조). 유사하게, 혼합 모드 포획 컬럼(MEP HyperCel 또는 Capto MMC)의 용출액은 4의 낮은 pH를 갖는다(실시예 5 및 6 참조). 이하, MabSelect SuRe LX 용출액(1000 L 규모, 리투시맙)의 비활성화를 설명한다. 단일 클론 항체가 pH 3.5의 100mM Na-시트레이트 버퍼에서 단백질 A 컬럼으로부터 용리되어 바이러스 비활성화 탱크 A로 들어갔다. 용출액은 탱크 A에서 WFI에 의해 직접적으로 약 2배 희석되었다. 용액의 pH는 필요한 경우 100mM 시트르산에 의해 제어되고, 3.5로 재조정되었으며, 이어서, 용액은 바이러스 비활성화 탱크 B로 이송되어, 여기에서 60분 동안 20-24℃의 온도에서 65rpm으로 교반되었다. 이어서, 용액의 pH를 50mM NaOH에 의해 pH 4.5로 조정하여, 후속 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 위한 출발 조건을 제공하였다.
실시예
11:
Poros
50 HS에 의한 양이온 교환 크로마토그래피(
폴리싱
1)
오염물, 및 전하 변형체와 같은 생성물-관련 물질의 분리는 첫 번째 폴리싱 단계인 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수행되었다. 이 단계는, 모든 정제 시퀀스에 포함되었다(100 L 리투시맙 및 아달리무맙, 1000 L 리투시맙). Poros 50 HS 수지가 채워진 컬럼(1000 L 규모에 대한 치수 = 60cm 직경 x 32cm 높이, 압축 용적 약 90 L; 100 L 규모에 대한 치수 = 25cm 직경 x 15cm 높이, 압축 용적 약 7.3 L)은 (i) WFI(주사용 물, 2 CV) 및 (ii) 20mM Na-시트레이트, pH 5.5(4 CV)에 의해 연속적으로 평형화되었다. 실시예 10에 기재된 바이러스 비활성화 및 샘플 조정(pH 4.5) 후에 수득된 생성물 용액은 약 8 g 단백질/L 수지를 갖는 컬럼에 로딩되고, 이에 의해 0.45 ㎛ Kleenpak Nova 전치 필터(Pall Corporation)를 통과하였다. 컬럼은 이어지는 경사 용리 전에 WFI(1 CV)에 의해 세적되었다. 경사는 20mM Na-시트레이트, pH 5.5(버퍼 A) 및 40mM Na-포스페이트, pH 7.8(버퍼 B)를 하기 비율 및 순서로 혼합함으로써 형성되었다: (i) 100% A (0.2 CV), (ii) 40% A + 60% B에 대한 선형 경사 (2 CV); (iii) 100% B에 대한 선형 경사 (6 CV); (iv) 100% B (2 CV). 유량은 150cm/h이었다. 용출액은 분획으로 분리되어 특이적 풀링(poolling)을 가능하게 하였다. Poros 50 HS 수지의 재생은 (i) 2M NaCl (1 CV) 및 (ii) 1M NaOH (2 CV)에 의해 연속적으로 세척함으로써 수행되었다. 이후, 컬럼은 10mM NaOH에 저장되었다.
실시예
12:
CaptoAdhere에
의한 혼합
모드
크로마토그래피(
폴리싱
2)
두 번째 폴리싱 단계는 선택적이며, 리투시맙 100 L 규모 및 리투시맙 1000 L 규모에 대하여 적용되었다. 2개의 폴리싱 단계(도 2A 및 2B)를 갖는 프로세스에서 최종 단계에 대하여 선택된 수지는 CaptoAdhere이었으며, 이는 리간드 N-벤질-N-메틸 에탄올아민을 이용한다. 이 리간드는 양전하로 하전된 기를 함유하므로, 소수성 상호작용 외에, 음이온 교환기 기능을 제공한다. 크로마토그래피는 HCDNA 및 HCP와 같은 잔류하는 미량의 오염울을 더 감소시킬 수 있다. 잔류하는 침출된 단백질 A, 생성물 응집체 및 생성물 단편도 이 단계에 의해 제거될 수 있다. CaptoAdhere 폴리싱 단계는 플로우-쓰루 모드 및 바인딩 모드에서 수행되었다.
플로우 - 쓰루 모드에서의 CaptoAdhere 크로마토그래피: 이 마지막 크로마토그래피에 있어서 샘플은 실시예 11에 기재된 과정에 이어지는 Poros 50 HS 풀이었다. 1000 L 규모에 대한 채워진 컬럼의 크기는 14cm 직경 x 13cm 높이 (압축 용적 약 2 L)이었으며, 100 L 규모에 대한 채워진 컬럼의 크기는 5 x 13cm (압축 용적 약 0.2 L)이었다. 컬럼은 20mM Na-포스페이트, 100mM NaCl, pH 7.8에 의해 평형화되었다. 모아진 분획의 pH는 0.2M NaOH에 의해 7.8로 조정되었으며, 전도도는 1M NaCl에 의해 10-12 mS/cm로 높아졌다. 조정된 풀을 250-275g 단백질/L 수지의 로드를 갖는 CaptoAdhere 컬럼에 통과시켰고, 전체 통과액을 수집하였다. 유량은 300cm/h이었다. CaptoAdhere 수지의 재생은 (i) 100mM 시트르산, 2M NaCl (2 CV), (ii) 2M NaCl (1 CV), (iii) 1M NaOH (2 CV), 및nd (iv) 10mM NaOH (2 CV)로 연속적으로 세척함으로써 수행되었다. 이후, 컬럼은 10mM NaOH에 저장되었다.
바인딩 모드에서의 CaptoAdhere 크로마토그래피: 실시예 11에 기재된 과정 다음에 얻어진 Poros 50 HS 풀의 pH 및 전도도는 각각 pH 8.2 및 3.2 mS/cm로 조정되었다. 1000 L 규모에 대한 채워진 컬럼의 크기는 40cm 직경 x 28cm 높이 (압축 용적 약 35 L)이었으며, 100 L 규모에 대한 채워진 컬럼의 크기는 14 x 27cm (압축 용적 약 4.1 L)이었다. 수지는 20mM Na-포스페이트, pH 8.2에 의해 평형화되었다. 생성물 용액은 15-20 g 단백질/L 수지를 갖는 컬럼에 로딩되었다. 용리는 20mM Na-포스페이트, pH 6.0에 의해 수행되었다. 유량은 300cm/h이었다. 컬럼은 플로우-쓰루 모드의 방법에 대하여 설명된 바와 같이 재생되었다.
실시예
13: 최종 여과 단계
마지막 크로마토그래피와 약물 물질의 최종 벌크의 충진 사이에, 선택된 저장 버퍼로 포뮬레이트하고, 원하는 농도를 정하고, 바이러스를 제거하기 위하여 요구되는 몇몇 여과 단계가 있다. 면역글로불린을 위한 본 발명의 정제 방법은 이러한 여과 방법에 따라 달라지지 않는다. 따라서, 이 실시예에서의 방법, 장치 및 선택된 멤브레인은 단지 하나의 선택사항으로 이해되어야 하며, 자유재량에 의한 변화가 가능하다. 2개의 폴리싱 단계를 갖는 프로세스에 있어서 1000 L 규모에 대한 방법이 하기에 요약하여 기술된다.
접선 흐름 한외 여과/정용 여과 ( UF /DF)에 의한 버퍼 교환: CaptoAdhere 컬럼으로부터의 용출액을 UF/DF 스키드의 탱크에 수집하고, Omega Centrasette 멤브레인 카세트(Pall Corporation, 30kD cutoff)를 이용하여 8 g/L로 농축하였다. 농축물을 10 부피의 포뮬레이션 버퍼(25mM Na-시트레이트, 154mM NaCl, pH 6.5)를 이용하여 정용여과하였다.
나노 여과에 의한 바이러스 제거: 나노 여과는 나노미터 범위의 크기 배제에 기초하여 동작하는 가장 요구가 많고 가장 신뢰성 있는 바이러스 제거 단계이다. 정용여과된 생성물 용액은 이동가능한 탱크로 이송된 후, Viresolve Pro Modus 1.3 필터(Milli기공, 20nm 기공 크기)를 이용하여 나노 여과되었다. 생성물 용액 여과 전에, 필터를 25mM Na-시트레이트, 154mM NaCl, pH 6.5에 의해 컨디셔닝하였다. 나노필터의 보호를 위하여, Sartopore 2 MidiCaps 전치 필터(Sartorius, 0.2 ㎛ 기공 크기)가 적용되었다. 여과는 최대 2 bar의 과압에 의해 수행되었다.
접선 흐름 한외 여과/정용 여과 ( UF /DF)에 의한 농축 및 최종 포뮬레이션 : 나노 여과된 생성물 용액을 UF/DF 스키드의 탱크에 수집하고, Omega Centrasette 멤브레인 카세트(Pall Corporation, 30kD cutoff)를 이용하여 약 10.2 g/L로 농축하였다. 농축된 생성물 용액을 이동가능한 탱크로 이송하였다. 탱크를 층류(laminar airflow) 하에 두고, Tween 80을 첨가하여 최종 농도를 0.09 %(w/w)로 하였다.
최종 마이크로여과(멸균 여과): 0.2㎛ Mini Kleenpak 필터 캡슐(Pall Corporation)에 의해 최종 마이크로여과를 수행하였다.
실시예
14: 상이한 프로세스에 의해 얻어진 배치의 최종 순도(표 5)
도 1B의 종래 프로세스(예를 들어, Fahrner RL 2001에 따른) 및 도 2B의 신규 프로세스에 의해 제조된 2개의 대표적인 배치의 최종 순도에 대한 결과를 표 5에 요약한다. 면역글로불린은 리투시맙이었으며, 100 L 규모로부터 정제되었다. 종래 정제 방법(프로세스 1B)의 프로세스 단계는 3개의 크로마토그래피, (i) MabSelect SuRe (포획), (ii) Poros 50 HS (바인딩 모드), 및 (iii) Poros 50 HQ (플로우-쓰루 모드)로 이루어진다. 신규 프로세스(프로세스 2B)의 크로마토그래피 시퀀스는 (i) Nuvia Q (사전 세정), (ii) Capto MMC (포획), (iii) MabSelect SuRe (중간), (iv) Poros 50 HS (바인딩 모드, 폴리싱 1), 및 (v) CaptoAdhere (플로우-쓰루 모드, 폴리싱 2)로 이루어진다. 개별적인 단계는 실시예 1, 2, 4, 6, 7, 및 10-13에 기재된 바와 같이 수행되었다. 표 5에 있어서 선택된 순도 파라미터는 다음과 같다: (i) IgG 모노머의 상대량(%), (ii) 잔류 숙주 세포 단백질(HCP, ng/mg IgG) 및 (iii) 잔류 숙주 세포 DNA(HCDNA, pg/g IgG). 분석 방법은 하기 실시예 15에 기재되어 있다. 모든 3개의 파라미터에 의해 확인할 수 있는 바와 같이, 신규 프로세스 2B에 따라 정제된 배치는 전통적인 프로세스 1B에 따라 정제된 배치에 비하여 더 높은 순도를 가졌다(표 5).
| 테스트 방법 | 파라미터 | 프로세스 1B | 프로세스 2B |
| SEC-HPLC | 모노머 (%) | 99.6 | 99.7 |
| ELISA | HCP (ng/mg) | 4.3 | 1.1 |
| qPCR | HCDNA (pg/g) | 289 | 142 |
실시예
15: 분석 방법
프로세스 중에, 및 프로세스 끝에, 정제된 면역글로불린의 품질을 특성화하기 위하여 몇몇 분석 방법이 적용되었다. 이 방법은 표준 방법이었으며, 문헌, 예를 들어, Eur. Pharm.에 기재되어 있었다. 표에 있어서 결과를 낳는 이 방법의 원칙들은 하기에 요약하여 기술된다:
고성능 크기-배제 크로마토그래피(SEC- HPLC ): SEC-HPLC 방법이 면역글로불린과 상이한 분자 질량을 갖는 불순물의 결정에 있어서 적용되었다. 크기-배제 크로마토그래피(SEC)는 그 크기에 비례하는 유체역학적 직경에 기초하여 분자를 분리하는 것에 기반하는 기술이다. 종래의 SEC에 비하여 훨씬 더 우수한 분리능을 갖는 SEC에 대한 고성능 액체 크로마토그래피 시스템(SE-HPLC)이 이용되었다. 크로마토그래피는 면역글로불린의 모노머, 다이머, 응집체 및 단편을 정량화하기 위하여 문헌(예를 들어, WO2013067301)에 기재된 바와 같이 수행되었다. 단백질 검출은 UV 흡수에 기초하였다. 상대 순도는 모든 피크의 총면적 중 통합된 모노머 피크의 면적(%)을 나타낸다. 테스트 결과는 반복 측정의 평균으로부터 산출되었다.
숙주 세포 단백질( HCP )을 정량화하기 위한 효소결합면역흡착분석(ELISA): 측정은 샌드위치 ELISA 방법에 의해 수행되었다. CHO 숙주 세포 단백질은 표준 96-웰 마이크로테스트 플레이트의 폴리스티렌 표면에 고정된 특이적 항-CHO 항체에 결합되고, 이어서 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 의해 라벨링된 2차 항체에 결합된다. 그 후에, 3,3',5,5' 테트라메틸벤진딘(TMB) 기재를 웰에 첨가함으로써 효소 반응을 수행하였으며, 이에 의해, 항체-과산화효소 컨주게이트의 존재에 따라, VIS 광 흡수에 의해 검출가능한 착색된 생성물에 이르게 되었다. 마이크로테스트 플레이트는 450nm에서 판독되었다(기준 파장 620nm).
침출된 단백질 A를 정량화하기 위한 효소결합면역흡착분석(ELISA): 측정은 Repligen으로부터 상업적으로 구입가능한 MabSelect Sure ligand ELISA 키트를 이용하여 수행되었다. 침출된 MabSelect Sure 리간드는 표준 96-웰 마이크로테스트 플레이트의 폴리스티렌 표면에 고정된 특이적 항-단백질 A 토끼 항체에 결합되고, 이어서, 비오틴으로 라벨링된 2차 항체에 결합된다. 결합된 비오틴의 존재는 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 컨주게이트에 의해 웰을 배양함으로써 검출되었다. 그 후에, 3,3',5,5' 테트라메틸벤진딘(TMB) 기재를 웰에 첨가함으로써 효소 반응을 수행하였으며, 이에 의해, 항체-과산화효소 컨주게이트의 존재에 따라, VIS 광 ㅎ흡수에 의해 검출가능한 착색된 생성물에 이르게 되었다. 마이크로테스트 플레이트는 450nm에서 판독되었다(기준 파장 620nm). 분석 감도는 0.1 ng/ml 샘플이었다.
숙주 세포 DNA( HCDNA )를 정량화하기 위한 정량적 중합효소 연쇄 반응( qPCR ): 측정은 TaqMan chemistry (Applied Biosystems)에 기초하는 실시간 정량적 PCR 방법에 의해 수행되었다. 이 방법은 DNA 오염을 검출하는데 있어서 매우 민감하고 특이적이다. 분석은 서열-특이적 프라이머(SSP) 및 형광 표지된 하이브리디제이션 프로브(TaqMan®)를 이용하는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한, 잘 정의된 DNA 단편의 서열-특이적 증폭 및 실시간 형광 검출에 기초한다. 장치, 시약, 샘플링 및 소프트웨어-기반 계산을 포함하는 전체 방법은 공급자의 지시사항에 따라 수행되었다. PCR 반응에서, 다량의 이중 가닥 DNA가 특이적 프라이머에 의해 결정되는 출발 DNA 영역으로부터 합성되었다. 리포터 염료 및 켄처 염료로 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 증식되어야 하는 템플릿 DNA의 영역에 결합된다. PCR 반응 중, DNA 중합효소는 프로브를 분해하여, 2종 염료의 물리적 근접성이 끝나고, 리포터 염료가 PCR 반응의 합성 생성물에 비례하는 형광을 방출한다. CHO-특이적 프로브 및 프라이머가 측정에 이용되며, 이는 CHO 숙주 세포 DNA의 적합한 영역의 양을 증식시킨다. 이 단계 중에, 형광 신호가 증가하고, 어느 정도 횟수의 사이클 후에, 형광은 역치를 초과한다. 이 사이클 수는 DNA의 출발량에 비례한다. 샘플에 의해 얻어진 사이클 수를 보정 곡선과 비교함으로써, 샘플에서의 숙주 세포 DNA 양을 결정할 수 있다.
실시예
16: 바이러스의 제거 및 비활성화의 확인
원재료 또는 제조 단계로부터의 바이러스에 의한 오염에 대한 염려 때문에, 바이러스 제거 및/또는 비활성화는 세포 배양에 의해 제조되는 단일 클론 항체와 같은 재조합 단백질 의약의 제조 프로세스에서 요구된다. 결과적으로, 세포 배양으로부터 유래되는 생물학적 치료용 단백질에 이르게 되는 모든 제조 프로세스의 바이러스 안정성에 대한 상당한 규제 요구가 있다. 다운스트림 프로세스는 각각의 규제 기관, 예를 들어, European Medicine Agency(EMA) 및 US Food And Drug Administration(FDA)로부터의 현재의 가이드라인에 따라 잠재적인 바이러스 오염물을 제거 및/또는 비활성화하는 그의 능력에 대하여 확인을 받아야 한다. 수행된 바이러스 제거 연구의 목적은 세포 배양 소스로부터의 재조합 단백질 의약의 전체적인 안전성 입증의 일부로서, 제조 프로세스 중 바이러스의 효과적인 제거 및 비활성화를 입증하기 위한 것이다.
프로세스 단계의 선택: IgG1 항체 리투시맙의 다운스트림 프로세스가 선택된 단계에 대하여 확인되었다. 분석된 프로세스 단계는 전술한 실시예에 기재된 바와 같은 상응하는 대규모 단계의 대표적인 규모를 줄인 형태이었다. 4개의 프로세스 단계가 선택되었다:
a) Nuvia Q에 의한 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피(실시예 4 참조)
b) 낮은 pH에서 단백질 A 용출액의 바이러스 비활성화(실시예 10 참조)
c) Poros HS에 의한 양이온 교환 크로마토그래피(실시예 11 참조)
d) Viresolve Pro에 의한 나노 여과(실시예 13 참조)
바이러스의 선택: 2종의 자주 이용되는 모델 바이러스가 선택되었다:
a) 쥐 백혈병 바이러스(MuLV)
b) 미세 생쥐 바이러스(MVM)
MuLV는 외피를 보유하며 크기가 약 80-100 nm인 단일 가닥 RNA 바이러스인 레트로바이러스의 일원이다. MVM는 외피를 보유하지 않는 단일 가닥 DNA 바이러스인 파르보바이러스의 일원이다. 파르보바이러스는 크기가 20-24 nm인 알려진 가장 작은 바이러스에 속한다. 양 바이러스 모두 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 얻어진다.
실험의 수행: 하나의 대규모 배치로부터의 기준 중간 프로세스 샘플은 동결 저장하였다(≤ -15℃). 실험 전에 20 ml의 앨리쿼트를 해동하였고, 각각 높은 바이러스 역가의 MuLV 또는 MVM와 스파이크하였다. 프로세스 단계 b) "낮은 pH에서 단백질 A 용출액의 바이러스 비활성화"(실시예 10 참조)는 MuLV에 대해서만 테스트되었다. 외피가 없는 바이러스 캡시드의 형태 때문에, 파르보바이러스는 낮은 pH 처리에 대하여 저항성을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서, MVM는 낮은 pH 배양에 대하여 테스트되지 않았다. 스파이크 출발 재료 및 프로세싱된 샘플은 바이러스-특이적 세포-기반 감염성 분석 및 qPCR을 이용하여 정량적으로 분석되었으며, 감소 인수는 log10 값으로 계산되었다. 모든 테스트 재료는 분석의 방해에 대하여 사전 조사되었으며, 병행하는 컨트롤 배양이 실험 지속 중 바이러스의 안정성을 증명하였다. 감염성 분석은 감염성 바이러스만을 검출하는 반면, qPCR은 감염성 및 비활성화 바이러스 모두를 포함한다. 모든 프로세스 단계 및 바이러스 종류에 대하여, 복제 동작이 수행되었다. 프로세싱된 샘플이 검출가능한 바이러스 역가를 함유한 경우, 계산된 분석의 검출 한계는 최대 역가로서 이용되었다. 감소 인수는 적어도 log10 "≥"으로서 표현되었다.
바이러스 제거 연구의 결과: 개별적인 실험의 결과가 표 6에 각각의 동작 및바이러스에 대하여 나타내어졌다. 플로우-쓰루 모드에서의 간단한 음이온 교환 크로마토그래피(수지 Nuvia Q)에 기초하는 사전 세정 단계의 높은 감소 인수는 놀라웠다. MuLV에 대하여 적어도 6.5 내지 6.7의 Log10 감소 인수 및 MVM에 대하여 적어도 6.6의 Log10 감소 인수가 확인되었다. 이 단계는 테스트된 4개의 단계 중 가장 우수하였다. 특히, 상이한 파르보바이러스 MVM의 경우, 이는 예측되지 않았다. 또한, 사전 세정 음이온 교환 크로마토그래피 및 단백질 A 용출액(pH 3.5)에 대한 간단한 60분 유지 단계의 조합을 이용함으로써, MuLV와 같은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 12.3의 누적 감소 인수가 얻어졌다. MuLV 및 4개의 단계에 대한 총 누적 log10 감소 인수는 21.7이었고, MVM 및 3개의 단계에 대한 총 누적 log10 감소 인수는 적어도 13.3이었다.
| 프로세스 단계 | MuLV Run 1 / Run 2 |
MVM Run 1 / Run 2 |
| 사전 세정 AEX (Nuvia Q) | ≥ 6.74 / ≥ 6.51 | 6.57 / 6.63 |
| 단백질 A 용출액 유지 단계 (pH 3.5) | 6.30 / 5.81 | 미수행 |
| 폴리싱 CEX (Poros HS) | 5.55 / 5.06 | 1.57 / 1.33 |
| 나노 여과 (Viresolve Pro) | ≥ 4.53 / ≥ 4.35 | ≥ 5.53 / ≥ 5.41 |
| 누적 감소 | ≥ 21.7 - ≥ 23.1 | ≥ 13.3 - 13.7 |
참조문헌 목록
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2. R.L. Fahrner et al., 2001 "Industrial Purification of Pharmaceutical Antibodies: Development, Operation, and Validation of Chromatography Processes", Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 18, 301-327
3. S.S. Farid, 2009 "Economic Drivers and Trade-Offs in Antibody Purification Processes: The future of therapeutic MAbs lies in the development of economically feasible downstream processes", BioPharm Int. Supplements, October 2, 2009
4. P. Fueglistaller, 1989 "Comparison of immunoglobulin binding capacities and ligand leakage using eight different protein A affinity chromatography matrices", J. Immunol. Meth. 124, 171-177
5. P. Gagnon, 1996 "Purification Tools for Monoclonal Antibodies", Validated Biosystems, Inc., 1-253
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13. WO03041859
14. WO03102132
15. WO2001150110
16. WO2004076485
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21. WO2011017514
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23. WO2011090720
24. WO2011150110
25. WO2013066707
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27. WO9216553
28. WO9222653
29. WO9411026
30. WO9522389
31. WO9729131
32. WO9845331
33. EMA Committee for proprietary medical products (CPMP) 14 February 1996, "Note for guidance on virus validation studies: the design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses"; CPMP/BWP/268/95 Appendix II
Claims (42)
- 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법으로서,
상기 방법은 하기 순서로 하기 단계:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액(flow-through)에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액(eluate)에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 수득된 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고, 상기 단계 (b) 이후 수행된 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득된 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계를 포함하는
방법.
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피는 강 음이온 교환 크로마토그래피인
방법.
- 제2항에 있어서,
상기 강 음이온 교환 크로마토그래피는 메타크릴레이트 폴리머 매트릭스에 결합된 트리메틸암모늄에틸을 제외한 강 음이온 교환 크로마토그래피 리간드인 리간드를 포함하는
방법.
- 제3항에 있어서,
강 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 4급 아미노에틸 (QAE) 모이어티, 4급 암모늄 모이어티 및 트리메틸암모늄 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되는
방법.
- 제4항에 있어서,
강 음이온 교환 크로마토그래피 수지의 리간드는 트리메틸암모늄(-N(CH3)3 +)인
방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 리간드로서 설포프로필(-CH2CH2CH2SO3-)을 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지는 고도로 가교결합된(highly cross-linked) 아가로스에 결합된 알칼리-안정화된 단백질 A 유도체를 포함하는
방법.
- 제항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)의 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 리간드로서 4-메르캅토-에틸-피리딘을 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a)의 통과액은 수집 용기에 일시적으로 저장되지 않고, 상기 단계 (b)의 크로마토그래피 수지로 즉시 이동되는
방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
추가적인 혼합 모드 크로마토그래피가 수행되는
방법.
- 제10항에 있어서,
상기 방법은 하기 순서로 하기 단계:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b2) 상기 단계 (b)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b2)에서 수득된 용출액 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 상기 단계 (b2) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계를 포함하는
방법.
- 제11항에 있어서,
상기 단계 (b)의 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 음전하로 하전된 리간드를 포함하는
방법.
- 제12항에 있어서,
상기 음전하로 하전된 리간드는 하기 화학식:
을 갖는 다중 모드 약 음이온 교환 모이어티인
방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c) 후에, 하기 단계:
(d) 상기 단계 (c)에서 수득된 용출액을 혼합 모드 크로토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계가 후속되는
방법.
- 제14항에 있어서,
상기 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 양전하로 하전된 리간드를 포함하는
방법.
- 제15항에 있어서,
상기 양전하로 하전된 리간드는 하기 화학식:
.
을 갖는 N-벤질-N-메틸 에탄올 아민 모이어티인
방법.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 면역글로불린이 크로마토그래피 수지에 결합된 후, 수지로부터 면역글로불린을 용리시키기 전에, 하나의 또는 몇몇 세척 단계가 포함되는
방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)에서, 면역글로불린이 크로마토그래피 수지에 결합된 후, 수지로부터 면역글로불린을 용리시키기 전에, 하나의 또는 몇몇 세척 단계가 포함되는
방법.
- 제11항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b2)에서, 면역글로불린이 크로마토그래피 수지에 결합된 후, 수지로부터 면역글로불린을 용리시키기 전에, 하나의 또는 몇몇 세척 단계가 포함되는
방법.
- 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)에서, 면역글로불린이 크로마토그래피 수지에 결합된 후, 수지로부터 면역글로불린을 용리시키기 전에, 하나의 또는 몇몇 세척 단계가 포함되는
방법.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)에서의 용리는 면역글로불린을 용리시키는 pH 쉬프트 또는 pH 경사를 적용시킴으로써 수행되는
방법.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)에서의 용리는 면역글로불린을 용리시키는 pH 쉬프트 또는 pH 경사를 적용시킴으로써 수행되는
방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a) 전에, 하기 단계:
(i) 샘플을 원심분리하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 상청액에서 수득됨 -;
(ii) 상기 단계 (i)에서 수득된 상청액을 여과하는 단계 - 여기에서, 면역글로불린은 여과액에서 수득됨 - 가 선행되는
방법.
- 제23항에 있어서,
상기 단계 (ii)에서의 여과는 뎁스 여과 및/또는 멸균 여과인
방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 재사용할 수 있는
방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a)에 이용되는 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스를 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b)에 이용되는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스를 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (c)에서 이용되는 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스를 포함하는
방법.
- 제11항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (b2)에서 이용되는 단백질 A 크로마토그래피 수지는 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스를 포함하는
방법.
- 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (d)에서 이용되는 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 유리, 세라믹, 실리카, 셀룰로오스, 아가로스, 메타크릴레이트 폴리머 또는 폴리스티렌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 매트릭스를 포함하는
방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 면역글로불린은 IgG1인
방법.
- 제31항에 있어서,
상기 IgG1의 Fc 부분은 인간인
방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 샘플은 재조합 CHO 세포 배양으로부터 수득된 세포 배양액인
방법.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 단계 (b)의 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 추가적인 단계를 포함하며,
상기 단계 (a), 낮은 pH에서 단계 (b)의 용출액을 배양하는 상기 단계 및 상기 단계 (c)는 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 누적 log10 감소 인수(cumulative log10 reduction factor)에 이르게 되는
방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 방법은 단계 (c)의 용출액, 또는 상기 용출액으로부터 유래되고 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 나노 여과에 노출시키는 추가적인 단계를 포함하며,
상기 단계 (a), 상기 단계 (c) 및 상기 나노 여과 단계는 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 12의 누적 log10 감소 인수에 이르게 되며, 및/또는
상기 단계 (a), 상기 단계 (c) 및 상기 나노 여과 단계는 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 제34항에 있어서,
상기 방법은 단계 (c)의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 나노 여과에 노출시키는 추가적인 단계를 포함하며,
상기 단계 (a), 낮은 pH에서 단계 (b)의 용출액을 배양하는 상기 단계, 상기 단계 (c) 및 상기 나노 여과 단계는 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 20의 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 면역글로불린 및 적어도 하나의 불순물을 포함하는 샘플로부터 면역글로불린을 정제하는 방법으로서,
상기 방법은 하기 순서로 하기 단계:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 - 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 수득된 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 단계를 포함하며,
상기 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 단계 (a) 및 단계 (c)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 면역글로불린의 제조 프로세스에서 바이러스 안전성을 증가시키는 방법으로서,
상기 방법은 하기 순서로 하기 단계:
(a) 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고, 통과액에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합되지 않은 면역글로불린을 수득하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하거나, 또는 상기 단계 (a)에서 수득된 통과액을 혼합 모드 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)에서 수득된 용출액을 소정 시간 동안 2.5 내지 4.5의 낮은 pH에서 배양하는 단계를 포함하며,
상기 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 단계 (a) 및 단계 (c)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 제37항 또는 제38항에 있어서,
하기 단계:
(d) 상기 단계 (c)의 배양 후의 용출액, 또는 그로부터 유래되고 상기 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을, 나노 여과에 노출시키는 단계를 더 포함하며,
상기 방법은 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 10의 단계 (a) 및 단계 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되며, 및/또는
상기 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 단계 (a), (c) 및 (d)의 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 제37항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
하기 단계:
(c2) 상기 단계 (c)에서 수득된 용출액, 또는 그로부터 유래되고, 상기 단계 (c) 후에 수행되는 일 이상의 추가적인 프로세싱 단계 후에 수득되는 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피에 노출시키고 - 여기에서, 면역글로불린은 양이온 교환 크로마토그래피 수지에 결합됨 -, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 단백질을 용리시킴으로써, 용출액에서 면역글로불린을 수득하는 단계를 더 포함하며,
상기 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 15의 단계 (a), (c) 및 (c2)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 제40항에 있어서,
상기 방법은 외피 보유 바이러스에 대하여 적어도 20의 단계 (a), (c), (c2) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되며, 및/또는
상기 방법은 외피 비보유 바이러스에 대하여 적어도 12의 단계 (a), (c2) 및 (d)에 대한 누적 log10 감소 인수에 이르게 되는
방법.
- 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a)의 음이온 교환 크로마토그래피는 메타크릴레이트 폴리머 매트릭스에 결합된 트리메틸암모늄에틸을 제외한 강 음이온 교환 크로마토그래피 리간드인 리간드를 포함하는 강 음이온 크로마토그래피이며,
상기 리간드는 4급 아미노에틸 (QAE) 모이어티, 4급 암모늄 모이어티 및 트리메틸암모늄 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 리간드는 바람직하게직 트리메틸암모늄(-N(CH3)3 +)인
방법.
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