KR20240021151A - 합성 흡착제, 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법 - Google Patents

합성 흡착제, 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법 Download PDF

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쇼헤이 오하라
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신스케 기쿠치
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Abstract

이하의 방법으로 측정되는 0.5psia부터 30.0psia의 압력 조건하에서의 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 0.05mL/g을 초과하는 합성 흡착제. <차분 세공 용적(mL/g)의 측정 방법> 1. 건조한 해당 합성 흡착제를 넣은 시료 용기를 10Pa 이하까지 감압하고, 해당 시료 용기에, JIS K8572에 규정하는 수은을 10Pa 이하까지 감압해서 탈포 후, 0.5psia의 압력으로 충전한다. 2. 해당 수은이 충전된 시료 용기를 0.5psia부터 30.0psia까지 단계적으로 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량을 측정한다. 3. 상기 2에서 측정된 수은 압입량에 기초하여 산출한 1단계 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량의 증가량을, 측정 합성 흡착제량으로 나눈 차분 세공 용적(mL/g)을 구한다.

Description

합성 흡착제, 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법
본 발명은, 합성 흡착제, 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
근년, 바이오 의약품은, 유전자 재조합 기술의 발달에 의해, 급속히 진전하고 있다. 그 중에서도, 항체 의약품은, 생산량이 해마다 증가하고 있는 의약품이다. 항체 의약품은, 다른 저분자 의약품과 비교해서 매우 고가인 의약품이다. 항체 의약품이 고가인 이유의 하나로서, 항체의 정제 비용이 막대한 것을 들 수 있다.
항체와 같은 단백질은, 일반적으로, 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 삽입된 재조합 세포를 배양하는 것에 의해 산생된다. 배양액에는, 목적으로 하는 단백질 외에, 다종다양의 배지 유래 성분, 숙주 세포 유래 성분, 단백질 유래의 부생성물 등의 불순물이 포함되어 있다. 이 때문에, 의약품으로서 요구되는 순도까지 불순물을 분리해서 제거하여, 목적하는 단백질을 정제할 필요가 있다.
항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 분해하면, 항체의 특정 장소가 절단되어, Fab 영역과 Fc 영역이라고 불리는 부분으로 나뉘어진다. Fc 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질로서 프로테인 A를 들 수 있다. 이 단백질의 특이성을 이용하여 항체만을 흡착시켜 항체와 불순물을 분리하는 방법이, 프로테인 A를 이용한 어피니티 크로마토그래피이다. 이 분리 방법은, 다종다양한 불순물을 포함하는 배양액으로부터, 목적으로 하는 항체만을 선택적으로 포착하는 것이 가능하다. 이 때문에, 대부분의 항체 의약품의 정제에 이용되고 있다.
특허문헌 1에는, 어피니티 크로마토그래피를 이용한 항체의 정제 방법이 개시되어 있다. 한편, 특허문헌 2에는, 어피니티 크로마토그래피를 이용하지 않고, 활성탄을 이용한 정제 방법이 개시되어 있다.
일본 특허공표 평5-504579호 공보 국제 공개 제2014/024514호
특허문헌 1에 개시되어 있는, 프로테인 A 등을 이용한 어피니티 크로마토그래피의 어피니티 분리제는, 일반적인 이온 교환 작용이나 소수성 상호작용을 이용한 분리제에 비해, 매우 고가인 것이다. 그 때문에, 어피니티 분리제를 대량으로 사용하여 생산되는 항체 의약품도 고가가 된다.
특허문헌 2에 개시되어 있는 바와 같이, 어피니티 크로마토그래피를 이용하지 않고, 활성탄을 이용한 정제 방법으로 함으로써 항체의 제조 비용을 저감할 수도 있다. 그러나, 이 방법에서는, 목적으로 하는 항체의 회수율이 어피니티 크로마토그래피와 비교해서 대폭으로 낮다.
상기한 대로, 종래의 항체의 정제 방법에서는, 저비용이면서 또한 고생산을 실현하는 것이 곤란했다.
본 발명의 목적은, 항체의 제조 비용을 저감하고, 또한 공업 스케일에서도 효율적으로 항체의 생산을 가능하게 하는 합성 흡착제를 제공하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 목적은, 항체의 제조 비용을 저감하고, 또한 공업 스케일에서도 효율적으로 항체의 생산을 가능하게 하는 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 소정치를 초과하는 합성 흡착제를 항체의 정제에 이용함으로써, 저비용이면서 또한 고생산의 항체의 정제 방법을 실현할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 요지는, 이하와 같다.
[1] 이하의 방법으로 측정되는 0.5psia부터 30.0psia의 압력 조건하에서의 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 0.05mL/g을 초과하는 합성 흡착제.
<차분 세공 용적(mL/g)의 측정 방법>
1. 건조한 해당 합성 흡착제를 넣은 시료 용기를 10Pa 이하까지 감압하고, 해당 시료 용기에, JIS K8572에 규정하는 수은을 10Pa 이하까지 감압해서 탈포 후, 0.5psia의 압력으로 충전한다.
2. 해당 수은이 충전된 시료 용기를 0.5psia부터 30.0psia까지 단계적으로 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량을 측정한다.
3. 상기 2에서 측정된 수은 압입량에 기초하여 산출한 1단계 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량의 증가량을, 측정 합성 흡착제량으로 나눈 차분 세공 용적(mL/g)을 구한다.
[2] 항체 정제용의 합성 흡착제인, [1]에 기재된 합성 흡착제.
[3] 세공을 갖는, [1] 또는 [2]에 기재된 합성 흡착제.
[4] 상기 세공의 반경이, 3nm∼15nm인, [3]에 기재된 합성 흡착제.
[5] 소수성인, [1]∼[4] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
[6] 스타이렌계 수지 및 아크릴계 수지로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
[7] 체적 평균 입자경이, 1μm∼500μm인, [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
[8] 이하의 방법으로 구해지는 보정 진원도의 값이, 0.10을 초과하는, [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
<보정 진원도의 값의 측정·산출 방법>
1. 광학 현미경을 이용하여, 합성 흡착제를 촬영한다.
2. 화상 해석 소프트웨어 WinROOF2018을 이용하여, 촬영한 합성 흡착제의 근사 원을 작성한다.
3. JIS B0621에 따라, 당해 근사 원과 동심(同心)인, 2개의 동심의 기하학적 원(동심 2원)으로 협지한다.
4. 상기 3의 동심 2원의 간격이 최소가 되는 경우의 당해 동심 2원 중 외주측의 원의 반경과 내주측의 원의 반경의 차를 진원도로서 구한다.
5. 구한 진원도를, 당해 근사 원의 반경으로 나눈다.
6. 100점 이상, 상기 1∼5의 측정·산출을 행하여, 그 평균치를 보정 진원도로 한다.
[9] 압궤 강도가, 100gf/립(粒)∼2000gf/립인, [1]∼[8] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
[10] 상기 항체가, 모노클로날 항체인, [2]∼[9] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
[11] 상기 모노클로날 항체의 분자량이, 100,000 이상인, [10]에 기재된 합성 흡착제.
[12] 상기 모노클로날 항체가, 면역글로불린 G인, [10] 또는 [11]에 기재된 합성 흡착제.
[13] 항체 및 불순물을 포함하는 혼합물과, [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제를 혼합한 후에, 여과를 행하는 항체의 정제 방법.
[14] [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제에, 항체와 불순물을 포함하는 혼합물을 통과시켜, 합성 흡착제에 흡착되지 않은, 항체를 포함하는 비흡착 획분을 회수하는 공정을 포함하는, 항체의 정제 방법.
[15] 하기 공정(i) 및 (ii)를 갖는 항체의 정제 방법.
공정(i): 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과, [1]∼[12] 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제를 접촉시키는 접촉 공정
공정(ii): 상기 공정(i) 후에, 상기 혼합 용액과 상기 합성 흡착제를 분리하는 분리 공정
[16] 상기 공정(i)의 전단에 하기 공정(A)를 갖는, [15]에 기재된 항체의 정제 방법.
공정(A): 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과, 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 접촉시키는 이온 교환 수지 접촉 공정
[17] 상기 불순물이, 분자량 50,000 이하의 물질을 포함하는, [13]∼[16] 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법.
[18] 상기 불순물이, 숙주 세포 유래 단백질, 항체 유래의 중합체, 항체 유래의 분해물 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, [13]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법.
[19] 상기 혼합물과 합성 흡착제의 혼합, 상기 합성 흡착제로의 상기 혼합물의 통과, 또는 상기 혼합 용액과 합성 흡착제의 접촉을, pH 3∼8의 액체 중에서 행하는, [13]∼[18] 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법.
[20] [13]∼[19] 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법을 포함하는 항체의 제조 방법.
또한, 본 발명의 제2 요지는, 이하와 같다.
<1> 항체 정제용의 파쇄한 합성 흡착제.
<2> 세공을 갖는, <1>에 기재된 합성 흡착제.
<3> 상기 세공의 반경이, 3nm∼15nm인, <2>에 기재된 합성 흡착제.
<4> 소수성인, <1>∼<3> 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
<5> 스타이렌계 수지 및 아크릴계 수지로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, <1>∼<4> 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
<6> 체적 평균 입자경이, 1μm∼500μm인, <1>∼<5> 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
<7> 상기 항체가, 모노클로날 항체인, <1>∼<6> 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제.
<8> 상기 모노클로날 항체의 분자량이, 100,000 이상인, <7>에 기재된 합성 흡착제.
<9> 상기 모노클로날 항체가, 면역글로불린 G인, <7> 또는 <8>에 기재된 합성 흡착제.
<10> 항체 및 불순물을 포함하는 혼합물과, <1>∼<9> 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제를 혼합한 후에, 여과를 행하는 항체의 정제 방법.
<11> <1>∼<9> 중 어느 하나에 기재된 합성 흡착제에, 항체와 불순물을 포함하는 혼합물을 통과시켜, 합성 흡착제에 흡착되지 않은, 항체를 포함하는 비흡착 획분을 회수하는 공정을 포함하는, 항체의 정제 방법.
<12> 상기 불순물이, 분자량 50,000 이하의 물질을 포함하는, <10> 또는 <11>에 기재된 항체의 정제 방법.
<13> 상기 불순물이, 숙주 세포 유래 단백질, 항체 유래의 중합체, 항체 유래의 분해물 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, <10>∼<12> 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법.
<14> 상기 혼합물과 합성 흡착제의 혼합을, pH 3∼8의 액체 중에서 행하는, <10>∼<13> 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법.
<15> <10>∼<14> 중 어느 하나에 기재된 항체의 정제 방법을 포함하는 항체의 제조 방법.
본 발명의 합성 흡착제는, 항체의 정제, 제조 비용을 저감하고, 또한 공업 스케일에서도 효율적인 항체의 생산을 가능하게 한다.
본 발명의 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법은, 항체의 정제, 제조 비용을 저감하고, 또한 공업 스케일에서도 효율적인 항체의 생산을 가능하게 한다.
도 1은, 실시예 및 비교예에 있어서의 합성 흡착제(A)∼(G)의 차분 세공 용적(mL/g)의 측정치를 나타내는 그래프이다.
이하에 본 발명에 대하여 상세히 기술한다. 본 발명은, 이하의 실시의 형태로 한정되는 것은 아니고, 그 요지의 범위 내에서 여러 가지로 변경해서 실시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「∼」라고 하는 표현을 이용하는 경우, 그 전후의 수치 또는 물성치를 포함하는 표현으로서 이용하는 것으로 한다.
본 명세서에 있어서, 「(메트)아크릴」이란, 「아크릴」, 「메타크릴」 또는 그 양자를 말한다. 「(메트)아크릴레이트」란, 「아크릴레이트」, 「메타크릴레이트」 또는 그 양자를 말한다. 「(메트)아크릴로」에 대해서도 마찬가지이다.
(합성 흡착제)
본 발명의 합성 흡착제는, 이하의 방법으로 측정되는 0.5psia 내지 30.0psia의 압력 조건하에서의 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 0.05mL/g을 초과하는 것을 특징으로 한다.
<차분 세공 용적(mL/g)의 측정 방법>
1. 건조한 해당 합성 흡착제를 넣은 시료 용기를 10Pa 이하까지 감압하고, 해당 시료 용기에, JIS K8572에 규정하는 수은을 10Pa 이하까지 감압해서 탈포 후, 0.5psia의 압력으로 충전한다.
2. 해당 수은이 충전된 시료 용기를 0.5psia부터 30.0psia까지 단계적으로 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량을 측정한다.
3. 상기 2에서 측정된 수은 압입량에 기초하여 산출한 1단계 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량의 증가량을, 측정 합성 흡착제량으로 나눈 차분 세공 용적(mL/g)을 구한다.
수은 압입법이란, 수은의 표면 장력이 크기 때문에, 대기압만의 힘으로는 공극 또는 세공에 들어가지 않는 것을 이용하여, 압력으로 수은을 압입하는 것에 의해 측정되는, 공극 또는 세공 용적의 측정 방법이다. 측정은, 단계적으로 압력을 상승시켜, 주입된 수은의 양을 정전 용량식 등의 검출기로 검출하고, 증가한 수은의 주입량을 이용하여 세공 용적을 산출한다.
단계적으로 압력을 상승시켜 수은 압입량을 측정하고, 측정된 수은 압입량에 기초하여 산출한 1단계 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량의 증가량을, 측정 합성 흡착제량으로 나눈 것을 차분 세공 용적(mL/g)이라고 한다.
차분 세공 용적(mL/g)의 측정에 있어서, 단계적으로 압력을 상승시킬 때의 측정마다의 압력의 상승폭은, 이용하는 세공 용적 측정 장치의 사양에도 따르지만, 본 발명에 관련된 차분 세공 용적(mL/g)을 정확하게 파악할 수 있기 때문에, 2psia∼10psia, 특히 2psia∼5psia의 범위인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 차분 세공 용적(mL/g)은, 구체적으로는 후게하는 실시예의 항에 기재된 대로, 세공 분포 측정 장치(기종명 「오토포어 IV 9520」, Micromeritics Instruments Corporation사제)를 이용하여, 수은 압입법에 의해, 단계적으로 측정 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량의 증가분으로부터 차분 세공 용적(mL/g)을 구했다. 일례로서의 수은 압입량의 측정 압력치는, 이하의 압력으로 하는 것이 바람직하다.
제1 측정 압력치: 9.0±0.5psia
제2 측정 압력치: 11.0±0.5psia
제3 측정 압력치: 15.0±0.5psia
제4 측정 압력치: 20.0±0.5psia
제5 측정 압력치: 25.0±0.5psia
본 발명의 합성 흡착제는, 0.5psia 내지 30.0psia의 범위의 측정 압력하에서의 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가, 0.05mL/g을 초과하는 것을 특징으로 한다. 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 0.05mL/g을 초과하는 합성 흡착제는, 합성 흡착제 입자 표면에 불순물의 제거성이 우수한 세공을 갖는 것이며, 불순물의 제거성, 항체의 정제 효율이 우수하다. 불순물의 제거성이 우수하기 때문에, 본 발명의 합성 흡착제의 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치는, 0.05mL/g을 초과하고, 바람직하게는 0.1mL/g 이상이며, 보다 바람직하게는 0.2mL/g 이상이며, 더 바람직하게는 0.3mL/g 이상이다. 한편, 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치의 상한에 대해서는 특별히 제한은 없지만, 측정의 정확성이나 합성 흡착제의 물리적 강도의 관점에서 통상 1.0mL/g 이하이다.
차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 0.05mL/g을 초과하는 합성 흡착제는, 예를 들면, 후술하는 대로, 시판 중의 합성 흡착제(합성 수지) 입자 또는 제조된 합성 흡착제(합성 수지) 입자를, 이와 같은 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치를 만족시키는 합성 흡착제가 얻어지도록 파쇄하는 것에 의해 얻을 수 있다.
합성 흡착제란, 모체의 구조, 세공의 구조, 표면적, 표면의 극성 등을 호적화한, 물리적 상호작용이나 화학적 상호작용에 의해, 용액 중으로부터 특정 유기 화합물을 흡착하는 합성 물질을 말한다.
본 발명에 있어서, 합성 흡착제는 유기계 합성 흡착제를 의미한다.
합성 흡착제의 재료로서는, 예를 들면, 스타이렌계 수지, 아크릴계 수지, 페놀계 수지, 아마이드계 수지 등을 들 수 있다. 이들 합성 흡착제의 재료는, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다. 이들 합성 흡착제의 재료 중에서도, 저비용이고, 소수성이 우수하기 때문에, 스타이렌계 수지, 아크릴계 수지가 바람직하고, 스타이렌계 수지가 보다 바람직하다.
소수성이란, 물 분자에 대해서 친화성이 작은 비극성기가 수용액 중에서 서로 모이려고 하는 성질이다. 이 인력을 이용한 상호작용을, 소수성 상호작용이라고 한다.
소수성의 작용기로서는, 예를 들면, 알킬기, 페닐기, 벤질기 등의 탄화수소의 작용기 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서, 스타이렌계 수지는, 스타이렌계 수지를 구성하는 전체 단량체 단위 100질량% 중, 방향족 바이닐 단량체 유래의 구성 단위가 50질량% 이상인 것이다. 불순물의 합성 흡착제로의 흡착량, 합성 흡착제의 물리적 강도, 세공의 형성성이 우수하기 때문에, 이 비율은 80질량% 이상이 바람직하다. 스타이렌계 수지는, 방향족 바이닐 단량체 유래 이외의 구성 단위를 포함해도 된다.
방향족 바이닐 단량체로서는, 예를 들면, 스타이렌, 메틸스타이렌, 에틸스타이렌, α-메틸스타이렌, 클로로스타이렌, 클로로메틸스타이렌, 브로모뷰틸스타이렌 등의 방향족 모노바이닐 단량체; 다이바이닐벤젠, 비스(바이닐페닐)에테인, 다이바이닐나프탈렌, 2,4,6-트라이바이닐에틸벤젠 등의 가교성 방향족 바이닐 단량체 등을 들 수 있다. 이들 방향족 바이닐 단량체는, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 방향족 바이닐 단량체 중에서도, 불순물의 합성 흡착제로의 흡착량, 합성 흡착제의 물리적 강도, 세공의 형성성이 우수하기 때문에, 가교성 방향족 바이닐 단량체를 포함하는 것이 바람직하고, 방향족 모노바이닐 단량체와 가교성 방향족 바이닐 단량체의 병용이 보다 바람직하고, 스타이렌과 다이바이닐벤젠의 병용이 더 바람직하다.
스타이렌계 수지 중의 방향족 모노바이닐 단량체 유래의 구성 단위의 함유율은, 스타이렌계 수지를 구성하는 전체 단량체 단위 100질량% 중, 0질량%∼99질량%가 바람직하고, 20질량%∼80질량%가 보다 바람직하다. 방향족 모노바이닐 단량체 유래의 구성 단위의 함유율이 상기 하한치 이상이면, 합성 흡착제의 유연성이 우수하다. 방향족 모노바이닐 단량체 유래의 구성 단위의 함유율이 상기 상한치 이하이면, 합성 흡착제의 용매에 대한 용해나 팽윤·수축을 억제할 수 있다.
스타이렌계 수지 중의 가교성 방향족 바이닐 단량체 유래의 구성 단위의 함유율은, 스타이렌계 수지를 구성하는 전체 단량체 단위 100질량% 중, 1질량%∼100질량%가 바람직하고, 20질량%∼80질량%가 보다 바람직하다. 가교성 방향족 바이닐 단량체 유래의 구성 단위의 함유율이 상기 하한치 이상이면, 합성 흡착제의 용매에 대한 용해나 팽윤·수축을 억제할 수 있다. 가교성 방향족 바이닐 단량체 유래의 구성 단위의 함유율이 상기 상한치 이하이면, 합성 흡착제의 유연성이 우수하다.
스타이렌계 수지 중의 방향족 모노바이닐 단량체 단위 및 가교성 방향족 바이닐 단량체 단위 이외의 다른 단량체 유래의 구성 단위의 함유율은, 합성 흡착제의 소수성이 우수하기 때문에, 스타이렌계 수지를 구성하는 전체 단량체 단위 100질량% 중, 10질량% 이하가 바람직하고, 1질량% 이하가 보다 바람직하고, 0질량%가 더 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 아크릴계 수지는, 아크릴계 수지를 구성하는 전체 단량체 단위 100질량% 중, (메트)아크릴레이트 유래의 구성 단위가 50질량% 이상인 것이다. 항체의 회수율이 우수하기 때문에, 이 비율은 80질량% 이상이 바람직하다. 아크릴계 수지는, (메트)아크릴레이트 유래 이외의 구성 단위를 포함해도 된다.
(메트)아크릴레이트로서는, 예를 들면, 메틸 (메트)아크릴레이트, 에틸 (메트)아크릴레이트, 뷰틸 (메트)아크릴레이트, 스테아릴 (메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실 (메트)아크릴레이트, 사이클로헥실 (메트)아크릴레이트 등의 알킬 (메트)아크릴레이트; 하이드록시에틸 (메트)아크릴레이트, 하이드록시프로필 (메트)아크릴레이트, 글리세린 모노(메트)아크릴레이트 등의 하이드록실기 함유 (메트)아크릴레이트; 글라이시딜 (메트)아크릴레이트, 4,5-에폭시뷰틸 (메트)아크릴레이트, 9,10-에폭시스테아릴 (메트)아크릴레이트 등의 에폭시기 함유 (메트)아크릴레이트; (메트)아크릴아마이드, 다이메틸(메트)아크릴아마이드, 하이드록시에틸(메트)아크릴아마이드 등의 (메트)아크릴아마이드류; (메트)아크릴로나이트릴 등의 사이아노기 함유 (메트)아크릴레이트; 에틸렌 글라이콜 다이(메트)아크릴레이트 등의 알킬렌 다이(메트)아크릴레이트; 폴리에틸렌 글라이콜 다이(메트)아크릴레이트 등의 폴리알킬렌 글라이콜 다이(메트)아크릴레이트; N,N'-알킬렌비스(메트)아크릴아마이드, 글리세롤 다이(메트)아크릴레이트, 트라이메틸올프로페인 트라이(메트)아크릴레이트 등의 가교성 (메트)아크릴레이트 등을 들 수 있다. 이들 (메트)아크릴레이트는, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 (메트)아크릴레이트 중에서도, 합성 흡착제의 작용기화가 용이하고, 합성 흡착제의 물리적 강도가 우수하기 때문에, 가교성 (메트)아크릴레이트를 포함하는 것이 바람직하고, 에틸렌 글라이콜 다이(메트)아크릴레이트를 포함하는 것이 보다 바람직하다.
아크릴계 수지 중의 가교성 (메트)아크릴레이트 단위의 함유율은, 아크릴계 수지를 구성하는 전체 단량체 단위 100질량% 중, 1질량%∼100질량%가 바람직하고, 20질량%∼80질량%가 보다 바람직하다. 가교성 (메트)아크릴레이트 단위의 함유율이 상기 하한 이상이면, 합성 흡착제의 용매에 대한 용해나 팽윤·수축을 억제할 수 있다. 가교성 (메트)아크릴레이트 단위의 함유율이 상기 상한 이하이면, 합성 흡착제의 유연성이 우수하다.
본 발명의 합성 흡착제는, 현탁 중합이나 유화 중합 등의 공지된 중합 방법으로 제조한 합성 수지 입자나 시판품을 파쇄함으로써 얻어진다.
파쇄란, 물리적인 힘에 의해 합성 흡착제를 미세하게 하는 것을 말한다.
파쇄에 이용하는 기구로서는, 물리적인 힘에 의해 합성 흡착제를 미세하게 할 수 있으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 유발, 믹서, 볼 밀, 해머 밀, 핀 밀 등을 들 수 있다. 이들 파쇄에 이용하는 기구 중에서도, 합성 흡착제를 미세하게 분쇄할 수 있고, 입자경 분포를 제어하기 쉽기 때문에, 볼 밀이 바람직하다.
본 발명의 합성 흡착제는, 비표면적을 효율 좋게 늘리고, 불순물의 제거성이 우수하기 때문에, 세공을 갖는 것이 바람직하다.
합성 흡착제의 세공의 형성은, 합성 수지를 얻을 때의 중합 시에 다공화제를 이용하면 된다.
합성 흡착제의 세공의 반경은, 3nm∼15nm가 바람직하고, 5nm∼10nm가 보다 바람직하다. 합성 흡착제의 세공의 반경이 상기 하한치 이상이면, 불순물의 합성 흡착제 내부로의 확산성이 우수하고, 불순물의 제거성이 우수하다. 합성 흡착제의 세공의 반경이 상기 상한치 이하이면, 불순물의 합성 흡착제로의 흡착량이 우수하고, 항체의 합성 흡착제 내부로의 확산에 의한 수율의 저하를 억제할 수 있다. 즉, 항체 정제 시의 항체의 회수율, 항체의 생산성이 우수하다.
합성 흡착제의 세공의 반경은, 질소 가스를 이용하고, 세공 분포 측정 장치를 이용하여 측정한 세공의 최빈도 반경으로 한다.
합성 흡착제의 세공의 반경은, 다공화제의 종류나 첨가량, 합성 수지를 얻을 때의 중합의 속도를 제어하는 것에 의해 조정할 수 있다.
합성 흡착제의 체적 평균 입자경은, 1μm∼500μm가 바람직하고, 10μm∼200μm가 보다 바람직하다. 합성 흡착제의 체적 평균 입자경이 상기 하한치 이상이면, 항체 정제 시의 여과성이 우수하고, 항체의 회수율, 항체의 생산성이 우수하다. 합성 흡착제의 체적 평균 입자경이 상기 상한치 이하이면, 합성 흡착제의 표면적을 늘릴 수 있고, 불순물의 제거 성능이 우수하다.
합성 흡착제의 체적 평균 입자경은, 레이저 회절·산란식 입도 분석계를 이용하여 측정한 값으로 한다.
측정 샘플로서, 합성 흡착제를 20체적% 에탄올 수용액에 침지시켜, 부착 수분을 여과로 제거한 것을 이용한다.
본 발명의 합성 흡착제의 보정 진원도의 값은, 0.10보다 큰 것이 바람직하고, 0.40 이상이 보다 바람직하다. 보정 진원도의 값이 0.10보다 크면, 합성 흡착제의 세공 내부로의 확산성이 높고, 불순물의 제거 성능이 우수하다. 보정 진원도의 상한에는 특별히 제한은 없지만, 통상 1.00 이하이다.
여기에서, 「진원도」란, JIS B0621에 정의되어 있고, 「원형 형체의 기하학적으로 올바른 원으로부터의 목표하는 크기」를 말한다. 진원도는, 「대상물(원형 형체)을 2개의 동심의 기하학적 원으로 협지했을 때, 동심 2원의 간격이 최소가 되는 경우의 2원의 반경의 차」이다.
본 발명에 관련된 「보정 진원도」는, 이 진원도를, 진원도를 구할 때에 촬영한 합성 흡착제의 근사 원의 반경으로 나눈 것이며, 입경에 따른 진원도의 값의 변화를 보정한 값에 해당한다. 보정 진원도가 0에 가까울수록 기하학적 원에 가깝고, 보정 진원도가 클수록 기하학적 원으로부터 벗어나 있는 것을 나타낸다.
본 발명에 관련된 보정 진원도는, 이하의 방법으로 구해진다. 한편, 이하에 있어서의 진원도와 근사 원의 반경의 값의 길이의 단위는 동일로 한다.
<보정 진원도의 값의 측정·산출 방법>
1. 광학 현미경을 이용하여, 합성 흡착제를 촬영한다.
2. 화상 해석 소프트웨어 WinROOF2018을 이용하여, 촬영한 합성 흡착제의 근사 원을 작성한다.
3. JIS B0621에 따라, 당해 근사 원과 동심인, 2개의 동심의 기하학적 원(동심 2원)으로 협지한다.
4. 상기 3의 동심 2원의 간격이 최소가 되는 경우의 당해 동심 2원 중 외주측의 원의 반경과 내주측의 원의 반경의 차를 진원도로서 구한다.
5. 구한 진원도를, 당해 근사 원의 반경으로 나눈다.
6. 100점 이상, 상기 1∼5의 측정·산출을 행하여, 그 평균치를 보정 진원도로 한다.
합성 흡착제의 압궤 강도(물리적 강도)는, 100gf/립∼2000gf/립이 바람직하고, 300gf/립∼1000gf/립이 보다 바람직하다. 일반적으로, 압궤 강도는, 높은 편이 사용 중에 파쇄되기 어려워지므로 바람직하다. 그러나, 압궤 강도가 지나치게 높은 합성 흡착제는, 통액하는 용매 조성의 변화에 의한 팽윤·수축에 견딜 수 없게 되어, 파쇄되어 버린다. 합성 흡착제 입자의 적층에 의한 하중이나 교반에 의한 충돌 등 물리적 충격에 강하고, 용매의 조성 변화에 의한 팽윤·수축에 견디는 균형으로부터, 상기 압궤 강도의 범위인 것이 바람직하다.
여기에서 압궤 강도란, 어떤 물체가 압궤(압축)의 힘을 받았을 때에, 원형을 유지할 수 없게 되는(파괴되는) 힘의 평균치이다. 압궤 강도는, 구체적으로는, 후게하는 실시예의 항에 기재된 방법으로 측정된다.
후게하는 실시예에 있어서, 압궤 강도는 파쇄 전의 합성 흡착제에 대하여 측정을 행하고 있다. 이는, 파쇄 후의 합성 흡착제에서는 입자가 작아, 측정 결과가 얻어지지 않기 때문이다. 압궤 강도는, 재료로서의 강도이기 때문에, 일반적으로 동일한 조성물이면, 작은 편이 높다. 그 때문에, 파쇄 후에 값이 작아지는 경우는 없다고 생각되고, 파쇄 전의 합성 흡착제의 압궤 강도의 측정치는, 파쇄 후의 합성 흡착제의 측정치 이상이 된다.
(항체)
본 발명의 합성 흡착제는, 바람직하게는 항체의 정제에 이용된다.
항체란, 항원 자극의 결과로서 면역 반응에 의해 생체내에 생산되는 단백질이며, 항원에 특이적으로 결합하는 활성을 가지는 것을 말한다.
항체로서는, 예를 들면, 마우스 항체, 라마 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 그들의 Fc 영역 등을 개변한 항체, 이들 항체를 다가화한 항체, 이들 항체의 일부를 개변한 항체 등을 들 수 있다. 항체의 분자형으로서는, 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 A(IgA), 면역글로불린 D(IgD), 면역글로불린 E(IgE), Fab, Fc, Fc-융합 단백, VH, VL, VHH, Fab'2, scFv, scFab, scDb, scDbFc 등을 들 수 있다. 이들 항체 중에서도, 단일성이 우수하기 때문에, 동일 세포 유래의 항체, 동일 클래스의 항체가 바람직하고, 모노클로날 항체가 보다 바람직하다.
모노클로날 항체란, 단일 클론의 항체 생산 세포가 생산하는 항체이며, 일차 구조, 즉, 아미노산 서열이 균일하다. 따라서, 클래스, 서브클래스, 알로타입, L쇄의 형 등도 균일하다.
모노클로날 항체로서는, 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 A(IgA), 면역글로불린 D(IgD), 면역글로불린 E(IgE) 등을 들 수 있다. 이들 모노클로날 항체 중에서도, 합성 흡착제에 흡착되기 어렵기 때문에, IgG, IgD, IgE가 바람직하고, IgG가 보다 바람직하다.
모노클로날 항체의 분자량은, 100,000∼9,000,000이 바람직하고, 300,000∼2,000,000이 보다 바람직하다. 모노클로날 항체의 분자량이 상기 하한치 이상이면, 항체의 합성 흡착제 내부로의 확산에 의한 수율의 저하를 억제할 수 있다. 또한, 모노클로날 항체의 분자량이 상기 상한치 이하이면, 모노클로날 항체가 수중에서 침전되기 어렵고, 용해되기 쉽다.
모노클로날 항체의 분자량은, 분자체 효과를 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 측정한 값으로 한다.
(항체의 정제 방법)
본 발명의 합성 흡착제를 이용하여 항체를 정제하는 방법에는 특별히 제한은 없지만 예를 들면 이하의 (1)∼(3)의 방법을 들 수 있다.
(1) 항체와 불순물을 포함하는 혼합물과, 본 발명의 합성 흡착제를 혼합한 후에, 여과를 행하는 항체의 정제 방법. 즉, 불순물이 흡착된 합성 흡착제와, 액체에 용해시킨 항체를, 여과에 의해 분리한다.
(2) 본 발명의 합성 흡착제에, 항체와 불순물을 포함하는 혼합물을 통과시켜, 흡착제에 흡착되지 않은, 항체를 포함하는 비흡착 획분을 회수하는 공정을 포함하는, 이른바, 플로 스루(flow through) 양식의 정제 방법.
(3) 하기 공정(i) 및 (ii)의 전단에 하기 공정(A)를 갖는 항체의 정제 방법.
공정(i): 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과, 본 발명의 합성 흡착제를 접촉시키는 접촉 공정
공정(ii): 상기 공정(i) 후에, 혼합 용액과 합성 흡착제를 분리하는 분리 공정
공정(A): 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과, 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 접촉시키는 이온 교환 수지 접촉 공정
상기 공정(A)에 의한 탈염 처리로, 본 발명의 합성 흡착제에 의한 불순물 제거 효율, 항체 정제 효율, 항체 회수 효율을 높일 수 있다. 한편, 상기 공정(i)에서 이용하는 합성 흡착제에 상기 공정(A)에서 이용하는 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지의 혼합물을 혼합해도 된다. 상기 공정(i)은, 배치 방식이어도 되고, 플로 스루 방식이어도 되지만, 플로 스루 방식의 경우는, 상기 공정(ii)를 생략할 수도 있다.
불순물이란, 항체를 의약품으로서 이용하기 위해서 제거할 필요가 있는 것이고, 예를 들면, 재조합 세포를 배양하기 위해서 필요한 배지 성분, 세포 유래의 항체를 제거한 단백질 및 대사물, 핵산 등을 들 수 있다.
구체적으로는, 불순물은, 숙주 세포 유래 단백질, 항체 유래의 중합체, 항체 유래의 분해물 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함한다.
숙주 세포 유래 단백질이란, 항체를 생산하는 세포를 배양했을 때의 생육하는 과정에서 산출된 단백질, 사(死)세포의 세포편 등이며, 예를 들면, 당쇄 성분의 제거, 산화, 탈아마이드 등을 받은 단백질 유래의 수식체, 숙주 세포로부터 용출된 효소류 등을 들 수 있다.
숙주 세포로부터 용출된 효소류로서는, 예를 들면, 당제거 효소, 단백질 가수분해 효소, 산화 환원 효소, 아미노산 이성화 효소 등을 들 수 있다.
당제거 효소로서는, 예를 들면, 뉴라미니다아제(시알리다아제), 갈락토시다아제, 글리카나아제 등을 들 수 있다.
단백질 분해 효소로서는, 예를 들면, 세린 프로테아제, 에스테라아제, 시스테인 프로테아제, 트립신양(樣) 프로테아제, 아미노펩티다아제, 아스파르트산 프로테아제, 카텝신 등을 들 수 있다.
산화 환원 효소로서는, 예를 들면, 싸이오레독신 리덕타아제 등의 싸이오레독신 관련 효소 등을 들 수 있다.
항체 유래의 중합체란, 항체가 열, 촉매, pH 조건 등에 의해 중합된 것이고, 예를 들면, 인간 γ 글로불린의 열변성 중합체, 산화에 의해 생긴 중합체 등을 들 수 있다.
항체 유래의 분해물이란, 항체가 단백질 분해 효소, 열, pH 조건 등에 의해, 항체의 펩타이드 결합 또는 다이설파이드 결합이 절단되어, 분해된 단편물이다.
핵산이란, 퓨린, 피리미딘 염기, 펜토스 및 인산으로 이루어지는 뉴클레오타이드를 기본 단위로 하고, 인산이 각 뉴클레오타이드 간에서 당의 3'위와 5'위의 탄소 사이에 다이에스터 결합에 의해 중합된 장쇄의 폴리뉴클레오타이드이며, 예를 들면, DNA, RNA, 그들의 분해물 등을 들 수 있다.
불순물의 분자량은, 1,000∼50,000이 바람직하고, 5,000∼25,000이 보다 바람직하다. 불순물의 분자량이 상기 하한치 이상이면, 불순물이 소수부를 갖고, 합성 흡착제에 흡착되기 쉽다. 또한, 불순물의 분자량이 상기 상한치 이하이면, 불순물의 합성 흡착제 내부로의 확산성이 우수하다.
불순물의 분자량은, 분자체 효과를 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 측정한 값으로 한다.
상기 (1)의 방법에 있어서의 여과는, 여과재를 이용하여, 고체와 액체를 분리함으로써 행한다.
여과재로서는, 예를 들면, 친수성 설폰계 고분자막, 친수성 방향족 에터계 고분자막, 친수성 불소계 고분자막, 친수성 올레핀계 고분자막, 셀룰로스계 막, (메트)아크릴계 고분자막, (메트)아크릴로나이트릴계 고분자막, 바이닐 알코올계 고분자막 등을 들 수 있다. 이들 여과재 중에서도, 친수성이 우수하기 때문에, 친수성 불소계 고분자막, 친수성 설폰계 고분자막, 셀룰로스계 막이 바람직하고, 친수성 불소계 고분자막이 보다 바람직하다.
여과재의 공경은, 0.1μm∼30μm가 바람직하고, 0.2μm∼10μm가 보다 바람직하다. 여과재의 공경이 상기 하한치 이상이면, 여과의 통액성이 우수하다. 또한, 여과재의 공경이 상기 상한치 이하이면, 고체와 액체의 분리성이 우수하다.
여과재의 공경은, 주사형 전자 현미경(SEM)을 이용하여, 얻어진 화상에 의해 계측한다.
상기 (3)의 방법에 있어서, 상기 공정(i)에서, 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과 본 발명의 합성 흡착제를 접촉시키는 방법으로서는, 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과 본 발명의 합성 흡착제를 혼합하는 방법을 들 수 있다. 또한, 상기 (2)의 방법과 같이, 본 발명의 합성 흡착제를 충전한 칼럼에 혼합 용액을 통액하는 플로 스루 양식으로 해도 된다.
상기 (3)의 방법에 있어서, 상기 공정(A)에 있어서, 이용하는 음이온 교환 수지로서는, 모노바이닐 방향족 모노머와 가교성 방향족 모노머로 이루어지는 가교 폴리머에 4급 암모늄(트라이메틸암모늄 혹은 다이메틸에탄올아민)기 등의 교환기를 갖고, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 등의 강알칼리와 마찬가지로 해리되어 염기성을 나타내는 염기성 음이온 교환 수지를 들 수 있다. 특히, 전체 pH 범위(0∼14)에 있어서 이온 교환성을 나타내는 것이 바람직하고, 강염기성 음이온 교환 수지가 바람직하다. 시판 중의 염기성 음이온 교환 수지로서는, 예를 들면, 미쓰비시 케미컬 주식회사제 다이아이온(등록상표)의 SA 시리즈, PA 시리즈, UBA 시리즈를 들 수 있다. 염기성 음이온 교환 수지의 구체적인 것으로서는, 교환기로서, 4급 암모늄(트라이메틸암모늄 혹은 다이메틸에탄올아민)기를 갖고, 염형이, OH형, Cl형인 것 등을 들 수 있으며, 이들 중에서도 OH형이 탈염 효율이 우수하여 바람직하다.
한편, 양이온 교환 수지로서는, 모노바이닐 방향족 모노머와 가교성 방향족 모노머로 이루어지는 가교 폴리머에 설폰산기(-SO3H) 등의 교환기를 가지는 이온 교환 수지이며, 염산, 황산 등의 광산과 마찬가지로 해리되어 산성을 나타내는 산성 양이온 교환 수지를 들 수 있다. 특히, 모든 pH 영역(0∼14)에서 이온 교환성을 갖는 것이 바람직하고, 강산성 양이온 교환 수지가 바람직하다. 시판 중의 산성 양이온 교환 수지로서는, 예를 들면, 미쓰비시 케미컬 주식회사제 다이아이온(등록상표)의 SK 시리즈, PK 시리즈, UBK 시리즈를 들 수 있다. 산성 양이온 교환 수지의 구체적인 것으로서는 설폰산기를 교환기로서 갖고, 또한 그의 염형은, 통상, H형 또는 Li형이며, 탈염 효율의 점에서 H형인 것이 바람직하다.
또한, 이온 교환 수지는, 그의 구조적 성질로 크게 나누면, 「겔형」, 「포러스(다공성)형」으로 나눌 수 있지만, 본 발명에서 이용하는 산성 양이온 교환 수지 및 염기성 음이온 교환 수지는 모두 겔형인 것이 바람직하다.
즉, 겔형의 이온 교환 수지는, 포러스형의 이온 교환 수지에 비해, 체적당 이온 교환 용량이 크고, 물리 강도(압궤 강도)가 높기 때문에, 장기간 사용할 수 있다.
상기 공정(A)의 탈염 처리에는, 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지 중 한쪽만을 이용해도 되지만, 양이온성 불순물과 음이온성 불순물의 양쪽을 제거할 수 있기 때문에, 음이온 교환 수지와 양이온 교환 수지를 혼합하여, 혹은 조합하여 이용하는 것이 바람직하다.
상기 공정(A)의 탈염 처리는, 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 혼합하는 것에 의해, 혹은, 음이온 교환 수지상(床) 및/또는 양이온 교환 수지상, 바람직하게는 음이온 교환 수지와 양이온 교환 수지의 혼상에 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액을 통액하는 것에 의해 행할 수 있다.
어느 경우에 있어서도, 상기 공정(A)의 탈염 처리로 얻어지는 처리액은, 이온성 불순물의 제거로, 도전율이 10mS/cm 이하, 특히 5mS/cm 이하의 저도전율을 나타내는 것인 것이, 탈염 처리에 의한 불순물 제거 효율, 항체 정제 효율, 항체 회수 효율의 향상의 관점에서 바람직하다.
상기 (1)∼(3)의 방법에 있어서, 혼합물과 합성 흡착제의 혼합, 합성 흡착제로의 혼합물의 통과, 또는 혼합 용액과 합성 흡착제의 접촉은, pH 3∼8의 액체 중에서 행하는 것이 바람직하고, pH 4∼6의 액체 중에서 행하는 것이 보다 바람직하다. pH가 상기 하한치 이상이면, 항체의 안정성을 유지할 수 있다. 또한, pH가 상기 상한치 이하이면, 항체의 합성 흡착제로의 흡착을 억제할 수 있다.
따라서, 항체와 불순물을 포함하는 혼합물 또는 혼합 용액에는, 필요에 따라서, pH 조정을 위해서 산, 알칼리 등을 첨가해도 된다.
(항체의 제조 방법)
본 발명의 항체의 제조 방법은, 전술한 항체의 정제 방법을 포함한다.
본 발명의 항체의 제조 방법은, 전술한 항체의 정제 공정 이외에도, 세포의 배양 공정, 이온 교환 수지에 의한 정제 공정, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의한 정제 공정, 막 분리에 의한 정제 공정을 포함해도 된다.
(용도)
본 발명의 합성 흡착제는, 항체의 제조 비용을 저감하고, 또한 공업 스케일에서도 효율적인 항체의 생산을 가능하게 한다. 또한, 본 발명의 항체의 정제 방법 및 항체의 제조 방법은, 항체의 제조 비용을 저감하고, 또한 공업 스케일에서도 효율적인 항체의 생산을 가능하게 한다.
실시예
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은, 그 요지를 일탈하지 않는 한, 이하의 실시예의 기재로 한정되는 것은 아니다.
(체적 평균 입자경·입도 분포의 측정)
합성 흡착제(A)∼(G)에 대하여, 레이저 회절·산란식 입도 분석계(기종명 「MLS-2000e」, 주식회사 세이신 기업제)를 이용하여, 체적 평균 입자경·입도 분포를 측정했다.
(차분 세공 용적의 측정)
합성 흡착제(A)∼(G)에 대하여, 수은 압입법에 의해, 세공 분포 측정 장치(기종명 「오토포어 IV 9520」, Micromeritics Instruments Corporation사제)를 이용하여, 0.5psia부터 30.0psia까지 단계적으로 압력을 상승시켰을 때의 차분 세공 용적을 측정하여, 그 최대치를 구했다.
일례로서, 합성 흡착제(A)∼(G)의 실제의 측정 압력과 차분 세공 용적의 측정치를 하기 표 1에 나타낸다.
(세공의 반경의 측정)
합성 흡착제(D)∼(G)에 대하여, 질소 가스를 이용하고, 세공 분포 측정 장치(기종명 「ASAP2024」, Micromeritics Instruments Corporation사제)를 이용하여, 세공의 최빈도 반경을 측정했다. 한편, 분쇄 전후에서 세공의 반경이 크게 변화하지 않았다.
(보정 진원도의 측정·산출)
합성 흡착제(A)∼(G)에 대하여, NiconSMZ18(주식회사 니콘 솔루션즈사제)을 사용하여 현미 사진을 촬영했다. 동심 2원의 각 반경과 근사 원의 반경의 측정은, 화상 해석 소프트웨어 WinROOF2018(미타니 상사 주식회사제)을 사용해서 행하고, 전술한 방법으로 진원도와, 근사 원의 반경으로 진원도를 나눈 보정 진원도를 산출했다.
(압궤 강도의 측정)
합성 흡착제(A)∼(F)의 제조에 이용한 파쇄 전의 합성 흡착제(합성 흡착제(A)∼(C), (E)는 동일한 것을 이용하고 있다)의 입자를 탈염수에 담그고, 측정 직전까지 탈염수 중에 보관했다. 이어서, 파쇄 전의 합성 흡착제 입자를 랜덤으로 최저 30립 선택하고, Charillon force measurement CS225(AMETEK TEST & CALIBRATION INSTRUMENTS)로 강도 측정을 행하여, 모든 입자에 대한 강도의 평균치를 산출했다. 한편, 합성 흡착제(G)는, 체적 입자경(μm)이 작아, 압궤 강도의 측정이 곤란했다.
(불순물의 농도와 항체의 회수율의 측정)
모노클로날 항체(면역글로불린 G, 분자량: 150,000)의 배양액으로서, 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포(CHO 세포)에 항체를 생산시킨 후, CHO 세포를 제거하여 청징화한 배양액을 이용했다. 5mol/L의 아세트산 수용액을 이용하여, pH 7.4의 배양액을 pH 4.5로 조정했다.
이어서, 합성 흡착제(A)∼(G)를 각각 0.2g씩 15mL의 용기에 재어 취하고, 조제한 배양액을 각각 4mL씩 첨가했다. 첨가 후, 8시간 진탕하여, 혼합했다. 그 후, 멤브레인 필터(Merck사제, 공경 0.22μm, PVDF막)를 이용하여 여과를 행해서 합성 흡착제를 제거하여, 합성 흡착제 처리액을 얻었다.
숙주 세포 유래 단백질 농도(HCP 농도)[ng/mL]에 대해서는, 키트(키트명 「ELISA Kit F550(CHO Host Cell Protein, 3Rd Generation)」)를 이용하여, ELISA법에 의해 측정했다.
HCP 농도의 대수 감소치(LRV)에 대해서는, 처리 전후의 HCP 농도로부터 산출했다.
항체의 회수율[%]에 대해서는, 어피니티 크로마토그래피 칼럼(상품명 「POROS A20μm Column」, Thermo Fisher Scientific사제)을 이용하여 고속 액체 크로마토그래피 HPLC에 의해 측정했다. 용매는 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4), 용리액은 20mmol/L의 인산 완충액(pH 2.8, 식염 농도 150mmol/L)을 사용했다.
(도전율의 측정)
배양액 상청 또는 배양액 상청의 탈염 처리액의 도전율은, HORIBA사의 탁상형 pH 미터 F-74 도전율(전기 전도율) 전극: 3552-10D에 의해 측정했다.
[실시예 1]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 825L」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체)를 유발로 분쇄하고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 합성 흡착제(A)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(A)의 평가 결과를, 표 2에 나타낸다.
[실시예 2]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 825L」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체)를 유발로 분쇄하고, 20μm의 체로 정립하고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 합성 흡착제(B)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(B)의 평가 결과를, 표 2에 나타낸다.
[실시예 3]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 825L」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체)를 유발로 분쇄하고, 63μm의 체로 정립하고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 합성 흡착제(C)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(C)의 평가 결과를, 표 2에 나타낸다.
[비교예 1]
다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체를 분쇄하지 않고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 분쇄되어 있지 않는 합성 흡착제(G)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(G)의 평가 결과를, 표 2 및 표 3에 나타낸다.
표 2로부터도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1에서 제조한 차분 세공 용적이 0.05mL/g 이하인 합성 흡착제(G)와 비교해서, 실시예 1∼3에서 제조한 차분 세공 용적이 0.05mL/g을 초과하는 합성 흡착제(A)∼(C)는, HCP 농도, LRV, 항체 회수율이 우수했다. 특히, 체적 평균 입자경이 작은 실시예 1의 합성 흡착제(A)는, HCP 농도가 낮아, 불순물의 제거 성능이 우수했다. 또한, 체적 평균 입자경이 큰 실시예 3의 합성 흡착제(C)는, 항체의 회수율이 높아, 효율적인 항체의 생산을 가능하게 한다.
한편, 합성 흡착제(A), 합성 흡착제(B), 합성 흡착제(C) 및 합성 흡착제(G)의 차분 세공 용적의 측정치의 측정 압력과 차분 세공 용적(증가한 세공 용적)의 관계를 도 1에 나타낸다. 도 1로부터, 합성 흡착제(A), 합성 흡착제(B) 및 합성 흡착제(C)는, 합성 흡착제(G)보다도 차분 세공 용적의 최대치가 현격히 큰 것을 알 수 있다.
[실시예 4]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 850」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체, 세공의 반경 5nm)를 유발로 분쇄하고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 합성 흡착제(D)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(D)의 평가 결과를, 표 3에 나타낸다.
[실시예 5]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 825L」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체, 세공의 반경 7nm)를 유발로 분쇄하고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 합성 흡착제(E)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(E)의 평가 결과를, 표 3에 나타낸다.
[실시예 6]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 HP21」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체, 세공의 반경 11nm)를 유발로 분쇄하고, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 20체적% 에탄올 수용액으로 세정하고, 여과로 부착 수분을 제거하여, 합성 흡착제(F)를 얻었다.
얻어진 합성 흡착제(F)의 평가 결과를, 표 3에 나타낸다.
표 3으로부터도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 1에서 제조한 분쇄되어 있지 않는 합성 흡착제(G)와 비교해서, 실시예 4∼6에서 제조한 합성 흡착제(D)∼(F)는, HCP 농도, LRV, 항체 회수율이 우수했다. 특히, 세공의 반경이 큰 실시예 6의 합성 흡착제(F)는, HCP 농도가 낮아, 불순물의 제거 성능이 우수했다. 또한, 세공의 반경이 작은 실시예 4의 합성 흡착제(D)는, 항체의 회수율이 높아, 효율적인 항체의 생산을 가능하게 한다.
[실시예 7]
시판 중의 합성 흡착제(상품명 「세파비즈 825L」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제, 다공화 처리를 한 스타이렌-다이바이닐벤젠 공중합체)를 유발로 분쇄하고, 20체적% 에탄올 수용액에 침지한 후, 여과막(Merck사제, 공경 5μm)을 이용하여 흡인 여과하여, 합성 흡착제(H)를 얻었다. 합성 흡착제(H)에 대하여 측정한 차분 세공 용적의 최대치는 0.131mL/g이었다.
모노클로날 항체(면역글로불린 G, 분자량: 150,000)의 배양액으로서, 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포(CHO 세포)에 항체를 생산시킨 후, CHO 세포를 제거하여 청징화한 배양액 상청을 이용했다. 5mol/L의 아세트산 수용액을 이용하여, pH 7.4의 배양액을 pH 4.5로 조정했다.
이어서, 합성 흡착제(H) 1.5g과 조제한 배양액 30mL를 용기에 재어 취하고, 25℃에서 8시간 진탕하여, 혼합했다. 그 후, 원심분리 및 여과막(Merck사제, 공경 0.22μm)으로 합성 흡착제를 제거하여, 합성 흡착제의 배치의 처리액을 얻었다.
얻어진 합성 흡착제의 배치의 처리액을 1mol/L의 염산으로 pH 3.5로 조정하고, 25℃에서 2시간 정치했다. 그 후, 1mol/L의 Tris 용액으로 pH 5.0으로 조정하고, 여과를 하여, 바이러스 불활화액을 얻었다.
얻어진 바이러스 불활화액을 MilliQ수로 4배로 희석하고, 20mmol/L의 트리스-염산 완충액(pH 8.5)의 평형화 완충액으로 평형화한 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼(상품명 「ChromSpeed Q103」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제)에, 희석한 바이러스 불활화액을 첨가했다. 첨가 종료 후, 5칼럼 체적의 평형화 완충액을 칼럼에 통액했다. 칼럼 비흡착 획분을 ChromSpeed Q103 용출액으로 했다.
얻어진 ChromSpeed Q103 용출액을 5mol/L의 아세트산으로 pH 4.5로 조정하고, 20mmol/L의 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 평형화한 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼(상품명 「ChromSpeed S103」, 미쓰비시 케미컬사제)에, 조제한 용출액을 첨가했다. 첨가 종료 후, 흡착 획분을 용리액(500mmol/L의 식염을 용해시킨 20mmol/L의 아세트산 완충액, pH 4.5)에 용출하여, 용출액을 3단계 정제 샘플로 했다.
배양액 상청과 얻어진 합성 흡착제 처리액, 3단계 정제 처리액은 하기의 방법으로 HCP와 항체 농도를 측정했다.
숙주 세포 유래 단백질 농도(HCP 농도)[ng/mL]에 대해서는, 키트(키트명 「ELISA Kit F550(CHO Host Cel Protein, 3Rd Generation)」)를 이용하여, ELISA법에 의해 측정했다.
항체 순도[HCP/Mab ppm]에 대해서는, 어피니티 크로마토그래피 칼럼(상품명 「POROS A20μm Column」, Thermo Fisher Scientific사제)을 이용하여 고속 액체 크로마토그래피 HPLC에 의해 측정했다.
항체의 회수율[%]에 대해서는, 어피니티 크로마토그래피 칼럼(상품명 「POROS A20μm Column」, Thermo Fisher Scientific사제)을 이용하여 고속 액체 크로마토그래피 HPLC에 의해 측정했다. 용매는 인산 완충 생리 식염수(pH 7.4), 용리액은 20mmol/L의 인산 완충액(pH 2.8, 식염 농도 150mmol/L)을 사용했다.
[비교예 2]
모노클로날 항체(면역글로불린 G, 분자량: 150,000)의 배양액으로서, 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포(CHO 세포)에 항체를 생산시킨 후, CHO 세포를 제거하여 청징화한 배양액 상청을 이용했다. 5mol/L의 아세트산 수용액을 이용하여, pH 7.4의 배양액을 pH 4.5로 조정했다.
조제한 배양액 30mL를 어피니티 크로마토그래피(상품명 「MabSelect SuRetm LX」, GE Healthcare Life Sciences사제, 어피니티 흡착제인 흡착제(I)를 포함하는 칼럼)에 첨가하고, 흡착시킨 상태에서 20mmol/L의 인산 완충 식염수로 세정했다. 150mmol/L의 식염을 용해시킨 100mmol/L의 아세트산으로 탈착시켜, 흡착제의 배치의 처리액을 얻었다.
얻어진 흡착제의 배치의 처리액을 MilliQ수로 10배로 희석한 후, 1mol/L의 염산으로 pH 3.5로 조정하고, 25℃에서 2시간 정치했다. 그 후, 1mol/L의 Tris 용액으로 pH 5.0으로 조정하고, 여과를 하여, 바이러스 불활화액을 얻었다.
얻어진 바이러스 불활화액을 20mmol/L의 트리스-염산 완충액(pH 8.5)의 평형화 완충액으로 평형화한 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼(상품명 「ChromSpeed Q103」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제)에 첨가했다. 첨가 종료 후, 5칼럼 체적의 평형화 완충액을 칼럼에 통액했다. 칼럼 비흡착 획분을 ChromSpeed Q103 용출액으로 했다.
얻어진 ChromSpeed Q103 용출액으로부터, 실시예 7에 있어서와 마찬가지의 조작으로 양이온 교환 크로마토그래피 칼럼에서 얻어진 용출액을 3단계 정제 샘플로 하고, 실시예 7과 마찬가지로, 배양액 상청, 합성 흡착제 처리액, 및 3단계 정제 처리액에 대하여 각각 분석을 행했다.
상기 실시예 7 및 비교예 2의 결과를 표 4에 나타낸다.
표 4로부터도 알 수 있는 바와 같이, 비교예 2에서 이용한 어피니티 흡착제인 흡착제(I)와 비교해서, 실시예 7에서 제조한 합성 흡착제(H)는, 1단계째의 흡착제 처리에서는, 흡착제(I)와 같이 항체의 흡탈착·세정 공정이 없기는 하지만, 항체 순도가 세 자릿수 ppm 레벨까지 조(粗)정제할 수 있고, 회수율도 80% 이상이었다. 3단계 정제의 최종 샘플에 있어서는, 어피니티 흡착제인 흡착제(I)를 사용한 공정과 동등한 HCP 제거율, 항체 회수율을 나타냈다.
[실시예 8]
(배양액 상청의 조제)
모노클로날 항체(면역글로불린 G, 분자량: 150,000)의 배양액으로서, 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포(CHO 세포)에 항체를 생산시킨 후, CHO 세포를 제거하여 청징화한 배양액 상청 1(항체 농도 2.4mg/mL, 도전율 20mS/cm)을 이용했다.
(탈염 처리)
상기 배양액 상청 1의 4mL에, 음이온 교환 수지(다이아이온(등록상표) 「UBA120OH」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제) 0.4g, 및 양이온 교환 수지(다이아이온(등록상표) 「UBK10H」, 미쓰비시 케미컬 주식회사제) 0.4g을 각각 첨가했다. 그 후, 0.1mol/L의 수산화 나트륨 수용액을 이용하여, pH 7.4의 상기 배양액 상청 1을 pH 4.5로 조정했다.
그 후, 여과막(Merck사제, 공경 0.22μm)으로 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지를 제거하여, 탈염 처리액(도전율 3mS/cm)을 얻었다.
(합성 흡착제에 의한 정제)
이어서, 합성 흡착제(B) 0.3g과 조제한 탈염 처리액 4mL를 용기에 재어 취하고, 25℃에서 8시간 진탕했다. 그 후, 원심분리 및 여과막(Merck사제, 공경 0.22μm)으로 합성 흡착제(B)를 제거하여, 합성 흡착제(B)에 의한 처리액을 얻었다. 처리액의 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
[실시예 9]
배양액 상청 1 대신에, 모노클로날 항체의 항체 농도를 15mg/mL로 조정한 배양액 상청 2를 이용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 공정으로 처리한 처리액의 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
[실시예 10]
탈염 처리를 행하지 않은 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 공정으로 처리한 처리액의 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
[실시예 11]
탈염 처리를 행하지 않은 것 이외에는, 실시예 9와 동일한 공정으로 처리한 처리액의 평가 결과를 표 5에 나타낸다.
표 5로부터도 알 수 있는 바와 같이, 실시예 10 및 11에서 실시한 탈염 처리 없는 프로세스에 대해, 탈염 처리를 행한 실시예 8 및 9는, HCP 농도, LRV, 항체 회수율이 우수했다. 특히, 배양액 중의 항체 농도가 높을 때, HCP 농도, LRV, 항체 회수율이 현저히 우수했다.
[실시예 12]
배양액 상청에 대해서 실시예 8에 기재된 탈염 처리를 행한 것, 합성 흡착제(H) 대신에 합성 흡착제(B)를 이용한 것, 바이러스 불활화액을 희석하지 않은 것 이외에는, 실시예 7과 동일한 처리를 행했다.
평가 결과를, 실시예 7 및 비교예 2의 결과와 함께, 표 6에 나타낸다.
표 6으로부터도 알 수 있는 바와 같이, 실시예 7과 비교해서, 실시예 12에서는 탈염 공정(공정(A))을 프로세스에 편입하는 것에 의해, 음이온 교환 크로마토그래피 전의 MilliQ수에 의한 4배 희석을 생략할 수 있고, 3단계 정제 후의 항체 회수율도 81%로 비교적 높은 값이었다. 또한, 3단계 정제의 최종 샘플에 있어서는, 어피니티 흡착제인 흡착제(I)를 사용한 공정과 동등한 HCP 제거율을 나타냈다.
본 개시를 특정 태양을 이용하여 상세히 설명했지만, 본 개시의 의도와 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 가능한 것은 당업자에게 분명하다.
본 출원은, 2021년 6월 10일자로 출원된 일본 특허출원 2021-097149에 기초하고 있고, 그 전체가 인용에 의해 원용된다.

Claims (20)

  1. 이하의 방법으로 측정되는 0.5psia 내지 30.0psia의 압력 조건하에서의 차분 세공 용적(mL/g)의 최대치가 0.05mL/g을 초과하는 합성 흡착제.
    <차분 세공 용적(mL/g)의 측정 방법>
    1. 건조한 해당 합성 흡착제를 넣은 시료 용기를 10Pa 이하까지 감압하고, 해당 시료 용기에, JIS K8572에 규정하는 수은을 10Pa 이하까지 감압해서 탈포 후, 0.5psia의 압력으로 충전한다.
    2. 해당 수은이 충전된 시료 용기를 0.5psia부터 30.0psia까지 단계적으로 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량을 측정한다.
    3. 상기 2에서 측정된 수은 압입량에 기초하여 산출한 1단계 압력을 상승시켰을 때의 수은 압입량의 증가량을, 측정 합성 흡착제량으로 나눈 차분 세공 용적(mL/g)을 구한다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항체 정제용의 합성 흡착제인, 합성 흡착제.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    세공을 갖는, 합성 흡착제.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 세공의 반경이, 3nm∼15nm인, 합성 흡착제.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    소수성인, 합성 흡착제.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    스타이렌계 수지 및 아크릴계 수지로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, 합성 흡착제.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    체적 평균 입자경이, 1μm∼500μm인, 합성 흡착제.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    이하의 방법으로 구해지는 보정 진원도의 값이, 0.10을 초과하는, 합성 흡착제.
    <보정 진원도의 값의 측정·산출 방법>
    1. 광학 현미경을 이용하여, 합성 흡착제를 촬영한다.
    2. 화상 해석 소프트웨어 WinROOF2018을 이용하여, 촬영한 합성 흡착제의 근사 원을 작성한다.
    3. JIS B0621에 따라, 당해 근사 원과 동심(同心)인, 2개의 동심의 기하학적 원(동심 2원)으로 협지한다.
    4. 상기 3의 동심 2원의 간격이 최소가 되는 경우의 당해 동심 2원 중 외주측의 원의 반경과 내주측의 원의 반경의 차를 진원도로서 구한다.
    5. 구한 진원도를, 당해 근사 원의 반경으로 나눈다.
    6. 100점 이상, 상기 1∼5의 측정·산출을 행하여, 그 평균치를 보정 진원도로 한다.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    압궤 강도가, 100gf/립(粒)∼2000gf/립인, 합성 흡착제.
  10. 제 2 항에 있어서,
    상기 항체가, 모노클로날 항체인, 합성 흡착제.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체의 분자량이, 100,000 이상인, 합성 흡착제.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 모노클로날 항체가, 면역글로불린 G인, 합성 흡착제.
  13. 항체 및 불순물을 포함하는 혼합물과, 제 1 항에 기재된 합성 흡착제를 혼합한 후에, 여과를 행하는 항체의 정제 방법.
  14. 제 1 항에 기재된 합성 흡착제에, 항체와 불순물을 포함하는 혼합물을 통과시켜, 흡착제에 흡착되지 않은, 항체를 포함하는 비흡착 획분을 회수하는 공정을 포함하는 항체의 정제 방법.
  15. 하기 공정(i) 및 (ii)를 갖는 항체의 정제 방법.
    공정(i): 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과, 제 1 항에 기재된 합성 흡착제를 접촉시키는 접촉 공정
    공정(ii): 상기 공정(i) 후에, 상기 혼합 용액과 상기 합성 흡착제를 분리하는 분리 공정
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 공정(i)의 전단에 하기 공정(A)를 갖는, 항체의 정제 방법.
    공정(A): 항체 및 불순물을 포함하는 혼합 용액과, 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지를 접촉시키는 이온 교환 수지 접촉 공정
  17. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 불순물이, 분자량 50,000 이하의 물질을 포함하는, 항체의 정제 방법.
  18. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 불순물이, 숙주 세포 유래 단백질, 항체 유래의 중합체, 항체 유래의 분해물 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 포함하는, 항체의 정제 방법.
  19. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼합물과 합성 흡착제의 혼합, 상기 합성 흡착제로의 상기 혼합물의 통과, 또는 상기 혼합 용액과 합성 흡착제의 접촉을, pH 3∼8의 액체 중에서 행하는, 항체의 정제 방법.
  20. 제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체의 정제 방법을 포함하는 항체의 제조 방법.
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