CN114467032A - 用于测量生物流体中未结合胆红素浓度的一步方法、试剂盒和系统 - Google Patents

Abstract

描述了荧光标记的蛋白质的鉴定和使用，这些蛋白质在结合胆红素时会发生荧光指数的变化。公开了在半胱氨酸或赖氨酸残基处标记的探针以及在半胱氨酸和赖氨酸二者处用两种不同的荧光团标记的探针。这些探针可用于确定流体样品中未结合的胆红素水平。

Description

用于测量生物流体中未结合胆红素浓度的一步方法、试剂盒 和系统

相关申请的交叉引用

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关于联邦资助研发的声明

这项工作得到了美国国立卫生研究院的SBIR批准号R44HD080412的部分支持。因此，美国政府可能对本发明拥有某些权利。

对序列表的引用

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技术领域

本公开涉及未结合胆红素的测量。

背景技术

胆红素是血红蛋白周转的产物，其难溶于水，因此主要与血浆中的白蛋白缔合。然而，总血浆胆红素的一小部分可溶于水相。这种未结合或游离的部分能够透过血脑屏障，并且在水平升高时具有神经毒性[Ahlfors CE，Wennberg RP，Ostrow JD和TiribelliC.Unbound(free)bilirubin：improving the paradigm for evaluating neonataljaundice.Clin Chem 55：1288-1299，2009]。在正常条件下，总血清胆红素通过胆红素的产生和排泄之间的调节平衡而维持在低水平。然而，在新生儿中，调节机制可能还不够成熟，因此生产-排泄平衡往往有利于积累，导致约80％的新生儿出现黄色黄疸[Maisels MJ和McDonagh AF.Phototherapy for neonatal jaundice.N Engl J Med 358：920-928，2008；Bhutani VK，Stark AR，Lazzeroni LC，Poland R，Gourley GR，Kazmierczak S，等人Predischarge screening for severe neonatal hyperbilirubinemia identifiesinfants who need phototherapy.J Pediatr 2013；162：477-82]。在大多数情况下，这种不平衡是良性的，或者实际上可能是有益的，并且对于大多数新生儿来说会自然消退[Wennberg RP，Ahlfors CE，Bhutani VK，Johnson LH和Shapiro SM.Towardunderstanding kernicterus：a challenge to improve the management of jaundicednewborns.Pediatrics 117：474-485，2006；Gopinathan V，Miller NJ，Milner AD和Rice-Evans CA.Bilirubin and ascorbate antioxidant activity in neonatal plasma.FEBSLett 349：197-200，1994]。未结合胆红素的浓度可能上升到具有神经毒性的水平，导致从可逆的听力缺陷到更严重的核黄疸神经系统后遗症的不足，在极少数情况下包括死亡[Ahlfors CE，Wennberg RP，Ostrow JD和Tiribelli C.Unbound(free)bilirubin：improving the paradigm for evaluating neonatal jaundice.Clin Chem 55：1288-1299，2009]。

使用光疗或换血的早期干预可以治疗新生儿胆红素介导的神经毒性[Maisels MJ和McDonagh AF.Phototherapy for neonatal jaundice.N Engl J Med 358：920-928，2008；Morris BH等人Aggressive vs.conservative phototherapy for infants withextremely low birth weight.N Engl J Med 359：1885-1896，2008；Kuzniewicz MW，Escobar GJ和Newman TB Impact of universal bilirubin screening on severehyperbilirubinemia and phototherapy use.Pediatrics 124：1031-1039，2009]。干预指南主要取决于总胆红素水平，并考虑孕龄和风险因素[Bhutani VK，Johnson L和SivieriEM.Predictive ability of a predischarge hour-specific serum bilirubin forsubsequentsignificant hyperbilirubinemia in healthy term and near-termnewborns.Pediatrics 103：6-14，1999]。然而，基础生化和越来越多的临床证据预测，未结合胆红素而不是总胆红素应该更准确地与胆红素介导的神经毒性相关[Ahlfors CE等人Unbound(free)bilirubin：improving the paradigm for evaluating neonataljaundice.Clin Chem 55：1288-1299，2009；Wennberg RP等人Intervention guidelinesfor neonatal hyperbilirubinemia：an evidence-based quagmire.Curr Pharm Des 15：2939-2945，2009；Ahlfors CE等人Unbound bilirubin predicts abnormal automatedauditory brainstem response in a diverse newborn population.J Perinatol 29：305-309，2009；Oh W等人Influence of clinical status on the association betweenplasma total and unbound bilirubin and death or adverse neurodevelopmentaloutcomes in extremely low birth weight infants.Acta Paediatr 99：673-678，2010]。因此，在识别有胆红素神经毒性风险的新生儿方面，未结合胆红素应优于总胆红素[Ahlfors CE.Predicting bilirubin neurotoxicity in jaundiced newborns.CurrOpin Pediatr 22：129-133，2010；Watchko JF和Tiribelli C Bilirubin-InducedNeurologic Damage Mechanisms and Management Approaches.N Engl J Med 2013；369：2021-30]。

早产儿的积极光疗旨在将总胆红素维持在5mg/dL以下[Morris BH等人Aggressive vs.conservative phototherapy for infants with extremely low birthweight.N Engl J Med 359：1885-1896，2008]。Morris等人发现经治疗以将总胆红素维持在低于5mg/dL的患者与维持在低于8mg/dL的患者的结果(死亡和神经发育障碍)没有差异。一项随访研究发现，结果与未结合的胆红素而不是总胆红素良好相关[Oh W等人]。临床状态对极低出生重量婴儿中血浆总胆红素和未结合胆红素与死亡或不良神经发育结果之间关联的影响。Acta Paediatr 99：673-678，2010]。这表明使用总胆红素来确定何时进行光疗可能具有误导性，因为总胆红素水平与未结合胆红素(胆红素的毒性部分)不相关。总胆红素和未结合胆红素的去联系可能是由于存在显著干扰胆红素与白蛋白结合的分子。例如，即使总胆红素低至1mg/dL，干扰分子仅置换0.2％的总胆红素就会导致34nM的未结合胆红素。这是超过了认为对足月新生儿有毒的未结合胆红素水平，并且通常认为低得多的未结合胆红素水平对早产儿有毒，例如在Morris等人试验中的那些[Morris BH等人Aggressive vs.conservative phototherapy for infants with extremely low birthweight.N Engl J Med 359：1885-1896，2008]。

几种治疗和生理过程可以产生胆红素的分子变体。胆红素的天然形式是Z，Z异构体(Z，Z-胆红素Ixα)。在暴露于400和600nm之间的光时，会产生3个变体；光异构体Z，E-胆红素IXα和E，Z-胆红素IXα和衍生物Z-光红素Ixα[Jana Jasproval等人PLoS ONE DOI：10.1371，2016；J.

等人Neuro-inflammatory effects of photo-degradativeproducts of bilirubin.Scientific Reports(2018)8：7444]。目前，唯一经FDA批准的用于测量血清样品中未结合胆红素水平的方法是Arrows UB分析仪，该分析仪基于测量HRP过氧化物酶对胆红素氧化的速率。[H.Nakamura&Y，Lee，Micro-determination of unboundbilirubin in icteric newborn sera：an enzymatic method employing peroxidaseand glucose oxidase.Clinica Chimica Acta，79：411-417，1977]。胆红素光生产物可能会破坏未结合胆红素的过氧化物酶测定，因为该测定假设胆红素吸光度的降低仅归因于Z，Z异构体。Z，E和E，Z异构体的吸收光谱与Z，Z吸光度重叠[Antony F.McDonagh等人Photoisomers：Obfuscating Factors in Clinical Peroxidase Measurements ofUnbound Bilirubin？Pediatrics 2009；123；67-76]。因为这些和其他光异构体比Z，Z异构体更易溶解但毒性更小，所以过氧化物酶测定会报告错误地升高的Bf水平。除了胆红素光生产物外，肝脏还会将胆红素与葡糖醛酸缀合，用于通过溶解在最终通过粪便排泄的胆汁中而排泄。根据肝脏的健康状况，一些缀合的胆红素可能会从肝脏泄漏到血液循环中。由于葡糖苷酸修饰增加了相对于未缀合的胆红素的溶解度，因此缀合的胆红素大部分保持未结合，并且通常以2至50μM的浓度存在，参考范围为0-2μM[Sanjiv Harpavat等人An Infantwith Persistent Jaundice and a Normal Newborn Direct BilirubinMeasurement.Clinical Chemistry 61：2 330-334(2015)]。这些μM浓度可能会干扰nM(0-100nM)未结合Z，Z胆红素浓度的测量，尤其是过氧化物酶测定，它不容易区分缀合和未缀合胆红素。

许多药物和代谢物可以与白蛋白结合，导致胆红素从其在白蛋白上的结合状态置换，从而无论总胆红素浓度是否增加，都会增加未结合的胆红素浓度[Spear ML等人Theeffect of 15-hour fat infusions of varying dosage on bilirubin binding toalbumin.JPEN J Parenter Enteral Nutr 9：144-147，1985；Amin SB.Effect of freefatty acids on bilirubin-albumin binding affinity and unbound bilirubin inpremature infants.JPEN J Parenter Enteral Nutr 34：414-420，2010]。特别重要的胆红素置换代谢物是游离脂肪酸(FFA)。FFA始终存在，但维持在低水平，对健康的足月新生儿没有显著影响。然而，在应激条件下，例如由于败血症，FFA水平会显著增加[Nogueira AC等人Changes in plasma free fatty acid levels in septic patients are associatedwith cardiac damage and reduction in heart rate variability.Shock29：342-348，2008]。除了疾病和应激之外，NICU中的早产儿由于使用油乳剂(例如

)进行肠外营养，会导致FFA水平极大地增加[Spear M等人The effect of 15-hour fat infusionsof varying dosage on bihrubin binding to albumin.JPEN J Parenter Enteral Nutr9：144-147，1985；Amin SB.Effect of free fatty acids on bilirubin-albuminbinding affinity and unbound bilirubin in premature infants.JPEN J ParenterEnteral Nutr 34：414-420，2010]。FFA以与胆红素相似的高亲和力结合白蛋白。与胆红素不同，FFA具有多个高亲和力结合位点，因此只有当相当一部分白蛋白结合位点被FFA占据时，胆红素置换才会变得显著[Spear ML等人The effect of 15-hour fat infusions ofvarying dosage on bilirubin b3inding to albumin.JPEN J Parenter Enteral Nutr9：144-147，1985；Amin SB.Effect of free fatty acids on bilirubin-albuminbinding affinity and unbound bilirubin in premature infants.JPENJParenterEnteral Nutr 34：414-420，2010]。接受

的哪些新生儿会产生足够大量的FFA以置换胆红素，无法容易地预测，因为孕龄、酶活性、肥胖等因素会起作用。[Spear ML等人The effect of 15-hour fat infusions of varying dosage on bilirubin binding toalbumin.JPEN J Parenter Enteral Nutr 9：144-147，1985；Amin SB.Effect of freefatty acids on bilirubin-albumin binding affinity and unbound bilirubin inpremature infants.JPENJParenterEnteral Nutr 34：414-420，2010]。监测脂质输注过程中未结合的FFA(FFAu)的浓度表明，升高的FFAu水平会大大增加未结合胆红素至危险水平[Hegyi T等人Unbound Free Fatty Acids from Preterm Infants Treated withIntralipid Decouples Unbound from Total Bilirubin Potentially MakingPhototherapy Ineffective Neonatology 2013；104：184-187；Hegyi等人Effects ofSoybean Lipid Infusion on Unbound Free Fatty Acids and Unbound Bilirubin inPreterm Infants J Pediatr 2017；184：45-50]。此外，由于这些代谢物的未结合水平取决于许多患者特异性因素，因此只有在

输注过程中直接监测未结合的胆红素，才能识别出有胆红素神经毒性风险的婴儿。对于胆红素尤其如此，因为增加

浓度引起的血浆FFA水平升高会产生升高的未结合胆红素浓度，而不会改变总胆红素浓度。

细胞内脂质结合蛋白(iLBP)是低分子量单链多肽家族。有四个公认的亚家族。亚家族I含有对维生素A衍生物例如视黄酸和视黄醇具有特异性的蛋白质。亚家族II含有对胆汁酸、类花生酸和血红素具有特异性的蛋白质。亚家族III含有肠型脂肪酸结合蛋白(FABP)。亚家族IV包含所有其他类型的脂肪酸结合蛋白[Haunerland NH和Spener F.Fattyacid-binding proteins，insights from genetic manipulations.Prog Lipid Res 43：328-349，2004]，包括以低亲和力结合胆红素的FABP[Di Pietro SM和SantomeJA.Isolation，characterization and binding properties of two rat liver fattyacid-binding protein isoforms.Biochim Biophys Acta 1478：186-200，2000]。整个家庭的特征在于共同的3维折叠。不同亚家族的配体结合特性有很大重叠。亚家族I的野生型蛋白质[Richieri GV等人Fatty acid binding proteins from different tissues showdistinct patterns of fatty acid interactions.Biochemistry 39：7197-7204，2000]和亚家族II都结合脂肪酸及其天然配体。此外，单个氨基酸取代能够互换亚家族I和II的蛋白质的配体结合特性[Jakoby MG等人Ligand-protein electrostatic interactionsgovern the specificity of retinol-and fatty acid-bindingproteins.Biochemistry 32：872-878，1993]。本文中阐述的每个参考文献的公开内容通过引用的方式明确整体纳入本文，并且用于本文所引用的公开内容。

简述

本文描述的是与近红外(NIR)Bf传感器相关的组合物、试剂盒、装置、系统和方法，其具有改进的荧光团，药物和代谢物的干扰水平低于其他方法，能够在使用少于5μL未稀释血液样品的单个步骤中进行Bf确定的一次性套筒，以及用于校准测定的方法。如本文所述，探针可以包含用荧光团标记的iLBP。公开了未结合胆红素(Bf或UB)的探针，其在结合胆红素时经历荧光指数的变化，并且该探针可用于测量流体中未结合胆红素的水平。荧光指数可以是例如波长、强度、偏振、寿命或任何可测量的荧光量。在确定未结合胆红素水平的流体中存在的其他分析物存在的情况下，本文公开的未结合胆红素探针不会显著结合或经历显著的荧光变化。本文所述的未结合胆红素探针可用于诊断和治疗高胆红素血症以及评估胆红素毒性的风险。还鉴定了不结合胆红素，并且在胆红素存在下不经历荧光指数变化，并且其荧光不受通常存在于确定未结合胆红素水平的流体中的其他分析物的影响的无响应探针。具有第一荧光团的未结合胆红素探针和具有不同荧光团的无响应探针一起可以产生Bf传感器，在Bf存在下，该传感器经历第一荧光团相对于第二荧光团的荧光指数比值的变化。连同包含Bf传感器和专用荧光读取器的套筒，该测定被称为UBCheck测定。

本文提供的一些实施方案涉及用于测量样品中的游离胆红素的传感器。在一些实施方案中，传感器包括用第一荧光团标记的胆红素响应性探针；和用第二荧光团标记的无响应探针。在一些实施方案中，第一和第二荧光团以相同的波长激发，并且其中第一和第二荧光团发射不同波长的荧光。在一些实施方案中，胆红素响应性探针包括第一细胞内脂质结合蛋白(iLBP)，其中第一iLBP具有包含SEQ ID NO：1的肽序列，并且包括取代十四个可接近赖氨酸的精氨酸(KR14，如SEQ ID NO：2所列出的)；C末端双His标签接头(C2XH11)，其具有如SEQ ID NO：3所列出的序列；MGI的N末端添加；和包括单个半胱氨酸的不超过62个氨基酸取代和添加。在一些实施方案中，胆红素响应性探针包含表1中列出的任何一种探针的序列。在一些实施方案中，无响应探针包括第二iLBP，其中第二iLBP具有包含SEQ ID NO：1的肽序列，并且包括在位置72、73、74、126和131处的取代；在位置27、31、33、54、73、74、76或98中任一项取代为Cys；不超过三个另外的氨基酸取代；和C末端双His标签接头(C2XH11)，其具有如EQ ID NO：3所列出的序列。在一些实施方案中，无响应探针包含表2中列出的任何一种探针的序列。在一些实施方案中，第一荧光团和第二荧光团是不同的荧光团。在一些实施方案中，胆红素响应性探针包含连接第一荧光团的单个半胱氨酸。在一些实施方案中，无响应探针包含与第二荧光团连接的单个半胱氨酸。在一些实施方案中，第一荧光团和第二荧光团在相同或大约相同的波长被激发。在一些实施方案中，第一荧光团是连接到半胱氨酸取代的LICOR 700DX马来酰亚胺或LICOR 800CW马来酰亚胺。在一些实施方案中，胆红素响应性探针被配置为结合胆红素的未缀合的IX-α(Z，Z)异构体。在一些实施方案中，胆红素响应性探针被配置为最低限度地结合缀合的胆红素(低于4mg/dl)。在一些实施方案中，胆红素响应性探针被配置为不与胆红素的Z，E或E，Z光异构体、光红素、脂肪酸、任何其他天然存在的血液成分和/或新生儿药物结合。在一些实施方案中，新生儿药物不是螺内酯。在一些实施方案中，无响应探针被配置为不结合胆红素的未缀合的IX-α(Z，Z)异构体或缀合的胆红素。在一些实施方案中，无响应探针被配置为不与胆红素的Z，E或E，Z光异构体、光红素、脂肪酸、任何其他天然存在的血液成分和/或新生儿药物结合。在一些实施方案中，第一荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺，第二荧光团是连接到半胱氨酸取代的LICOR 800CW马来酰亚胺，并且当第一荧光团是LICOR 800CW马来酰亚胺时，第二荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺。在一些实施方案中，第一荧光团或第二荧光团连接至半胱氨酸取代，并且其中半胱氨酸取代在SEQ ID NO：1的位置22、24、25、26、27、29、30、33、54、74、76、97或98处。在一些实施方案中，第一荧光团或第二荧光团的发射强度不受选自胆红素和血红蛋白的血液成分的吸光度的影响。在一些实施方案中，胆红素响应性探针或无响应探针还包含至少一个接头。

本文提供的一些实施方案涉及包括本文所述的任何传感器的组合物。在一些实施方案中，组合物包括游离胆红素(Bf)传感器。在一些实施方案中，传感器包括结合胆红素并用第一荧光团标记的第一细胞内脂质结合蛋白(iLBP)；和不结合胆红素并用第二荧光团标记的第二iLBP，其中第二荧光团不连接到第一iLBP，其中第一荧光团和第二荧光团在相同的波长激发，其中第一荧光团荧光团和第二荧光团的发射波长不同，和其中第二荧光团在胆红素存在下不改变其发射。在一些实施方案中，第一荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺并且第二荧光团是LICOR 800CW马来酰亚胺，或者其中第一荧光团是LICOR 800CW马来酰亚胺并且第二荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺。在一些实施方案中，在两个不同波长测量荧光指数比值的变化并用于确定未结合胆红素的浓度。在一些实施方案中，第一荧光团或第二荧光团的发射强度不受选自胆红素和血红蛋白的血液成分的吸光度的影响。

本文提供的一些实施方案涉及包括如本文所述的传感器或包括本文所述的组合物的固体基板。在一些实施方案中，胆红素响应性探针和/或无响应探针附接至固体基板。在一些实施方案中，固体基板是Ni-聚苯乙烯、Ni-胶乳或Ni-琼脂糖珠。在一些实施方案中，Ni-聚苯乙烯、Ni-胶乳或Ni-琼脂糖珠包含铁。在一些实施方案中，胆红素响应性探针或无响应探针包含如SEQ ID NO：3所列出的取代7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R100R 125R 129R和/或130R(KR14)。在一些实施方案中，胆红素响应性探针和/或无响应探针包含标签并且固体基板包含标签的受体。在一些实施方案中，标签包含His-标签、生物素、Flag-表位、c-myc表位、HA-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合结构域(CBD)、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白、钙调蛋白结合蛋白、聚苯乙烯(PS)疏水标签或金属亲和标签中的一种或多种。在一些实施方案中，标签是聚组氨酸标签并且固体基板包含固定的金属螯合物。在一些实施方案中，第一荧光团与胆红素响应性探针上的半胱氨酸残基连接。在一些实施方案中，第二荧光团与无应答探针上的半胱氨酸残基连接。

本文提供的一些实施方案涉及校准胆红素传感器以确定Kd和Rm的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将上述传感器中的任一种的传感器与已知浓度的胆红素Bt的水性样品混合，测量荧光，并通过用等式(1)拟合从测量的荧光确定校准参数：

其中R是测量的荧光比((I_λ1/I_λ2)，I_λ1是来自第一荧光团在波长λ1处的减去来自样品的背景的荧光强度，I_λ2是来自第二荧光团在波长λ2处的减去来自样品的背景的荧光强度，R_o是不存在胆红素时的比值，BT是总胆红素浓度，PT是响应探针浓度，r是不存在第二荧光团时胆红素探针荧光团的I_λ2/I_λ1比值，Kd是胆红素探针的平衡解离常数，和Rm是外推到无限BT的比值R。

本文提供的一些实施方案涉及测量样品中游离胆红素[B_f]浓度的方法。在一些实施方案中，所述方法包括测量样品的基线荧光；将样品施加到本文所述的任一种传感器；测量样品荧光；从样品荧光中减去基线荧光以获得测量的荧光；并从测量的荧光确定[Bf]的浓度。在一些实施方案中，任选地执行测量基线和/或减去基线的步骤。在一些实施方案中，等式(1)用于校准传感器和等式(2)

用于确定[Bf]，其中R是测量的荧光比((I_λ1/I_λ2)，I_λ1是来自第一荧光团在波长λ1处的荧光强度，I_λ2是来自第二荧光团在波长λ2处的荧光强度，R_o是不存在胆红素时的比值，r是不存在第二荧光团时探针的I_λ2/I_λ1比值，Kd是解离常数，Rm是∞Bf时的最小R值，和Rm是在探针的胆红素饱和的R。

在一些实施方案中，将样品与一种或多种用于胆红素的载体大分子混合。在一些实施方案中，一种或多种载体大分子包括白蛋白、脂质结合蛋白、脂质囊泡或环糊精。在一些实施方案中，传感器附接至固体支持物。在一些实施方案中，使用一次性微流体装置确定Bf浓度，所述一次性微流体装置任选地允许测量未稀释的血液样品。在一些实施方案中，样品来自人、动物或植物。在一些实施方案中，样品是全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴。在一些实施方案中，样品来自接受油乳剂静脉内输注的患者。在一些实施方案中，样品来自正在接受将胆红素从白蛋白中置换出来的药物的患者，和/或此类患者可能正在从输注的油乳剂、疾病或应激中产生从白蛋白中置换胆红素的分子。在一些实施方案中，样品来自正在经受光疗、输血或其他降低胆红素水平的疗法的患者。在一些实施方案中，通过光漂白样品从而获得零水平测量值来获得Ro。

本文提供的一些实方案例涉及套筒。在一些实施方案中，套筒被配置为测量样品中的胆红素。在一些实施方案中，套筒包括底座，被配置为联接至底座并包括用于接收样品的样品端口的透镜，以及具有固定在其上的胆红素响应性探针、无响应探针和抗血红蛋白肽的基板。在一些实施方案中，用波长范围为约145nm至约225nm的UV光处理底座，从而光处理聚苯乙烯聚合物链以连接至基板的聚合物链。在一些实施方案中，底座是聚苯乙烯底座。在一些实施方案中，底座包括具有深色的材料，所述材料被配置为降低激发光在660nm处的反射强度。在一些实施方案中，透镜是丙烯酸透镜。在一些实施方案中，透镜用O₂等离子体(plasma)处理。在一些实施方案中，将透镜联接到聚苯乙烯底座形成深度为约0.1mm或更小的通道，并密封套筒。在一些实施方案中，样品是全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴。在一些实施方案中，样品是未稀释的样品。在一些实施方案中，套筒被配置为测量平衡时的胆红素。在一些实施方案中，套筒通过胆红素标准品的可追溯性来校准。在一些实施方案中，胆红素标准品是用于校准探针的市售胆红素，其中探针用于校准校准复合物，并且其中校准复合物用于校准套筒。

本文提供的一些实施方案涉及试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括用于从患者收集样品的一个或多个收集装置、本文所述的任一种传感器或本文所述的任一种组合物(包括在合适载体中的一个或多个探针)，以及一个或多个参考标准，包括低于和/或高于医学决定水平已知浓度的未结合胆红素。在一些实施方案中，一个或多个参考标准是可选的。

附图说明

图1描绘了在荧光计中混合的用LICOR 700DX马来酰亚胺标记的胆红素敏感探针和用LICOR 800CW马来酰亚胺标记的无响应探针的发射光谱的实施方案，显示了零BT的强度，并描绘了随着Bf增加的混合的滴定，其显示了710nm发射的猝灭，而805nm没有变化，和710/805比值相应降低。

图2描绘了具有拟合和所得参数的游离探针校准数据的实施方案。图2描绘了游离探针的实施方案，浓度为1.2nM，用等式1的拟合的校准数据，其产生参数Kd、Rm和Qs＝Rm/Ro。

图3描绘了用产生固定Bf值的校准的胆红素-人血清白蛋白(HSA)复合物校准套筒批的实施方案。在每个Bf处测量的R值用等式3拟合以产生Kd(以nM为单位)、Rm和由加权χ2确定的拟合质量。

图4描绘了在强置换剂油酸存在下稀释对Bf水平的影响的实施方案。

图5描绘了作为血红蛋白(Hb)稀释度的函数的未结合胆红素(Bf)的浓度。

图6描绘了新生儿重症监护病房(NICU)药物的效果的实施方案，所述药物是白蛋白中胆红素的有效置换剂。

图7描述了Bf测定的实施方案，其显示对缀合的胆红素(cBR)的灵敏度低于Arrows过氧化物酶方法。

图8A和8B描绘了增加脂肪乳剂(intralipid)浓度的实施方案，其中所述脂肪乳剂在不存在脂解时降低Bf，分配成甘油三酯(图8A)，而在肝素存在时激活脂解，产生未结合的FFA，通过从白蛋白中置换胆红素增加Bf(图8B)。

图9A和9B描绘了数据的实施方案，该数据显示Bf测定仅检测胆红素的Z，Z异构体，但Arrows对Z，Z和所有光异构体敏感。

图10A-10D示意性地表示聚苯乙烯一次性样品套筒底座的实施方案的多个视图。

图11A-11D示意性地表示透镜的实施方案的多个视图，所述透镜被配置为联接到图10A-10D中所示的聚苯乙烯一次性样品套筒底座。

图12描绘了具有限定的Bf传感器斑点和样品端口的一次性套筒。

详细说明

在以下详细描述中，参考了构成其一部分的附图。在附图中，相似的符号通常标识相似的组件，除非上下文另有说明。在详细的说明书、附图和权利要求中描述的说明性实施方案并不意味着限制。在不背离本文提出的主题的精神或范围的情况下，可以使用其他实施方案，并且可以做出其他改变。将容易理解的是，如本文一般描述的和图中所示的本公开的各方面可以被布置、替换、组合、分离和设计成多种不同的配置，所有这些都被明确考虑在本文中。

美国专利号5,470,714、U.S.6,444,432、US 7,601,510、US 9,134,317、US 9,529,003和U.S.9,817,004描述了用于产生探针的方法，所述探针用于测定未结合的分析物，并且其全部内容和这些公开内容通过引用明确纳入本文。这些探针是使用来自细胞内脂质结合蛋白(iLBP)家族的天然或突变形式的蛋白质构建的。如上所述，该家族包括脂肪酸结合蛋白(FABP)[Banaszak等人Lipid-binding proteins A family of fatty acid andretinoid transport proteins.Adv Protein Chem 45：89-151，1994；Bernlohr DA等人Intracellular lipid-binding proteins and their genes.Annu Rev Nutr 17：277-303，1997]。iLBP是分子量约为15kDa的细胞内蛋白质，具有在野生型蛋白质中与1或2FFA以及其他代谢物结合的结合位点。

本文公开和描述的专利和出版物，每一个都明确地通过引用全部纳入本文，并且对于本文具体引用的任何公开内容，描述了未结合的胆红素(UB)，本文也称为游离胆红素(Bf)比值传感器，该传感器由对胆红素敏感的iLBP组成，其中一个荧光团和第二荧光团游离或附接至不结合或不响应胆红素的蛋白质上。本公开描述了对现有专利和出版物的改进，包括例如具有改进的荧光团的近红外(NIR)Bf传感器(与其他方法相比，药物和代谢物的干扰水平更低)，能够在单个步骤中使用少于5μL的未稀释血液样品确定Bf的一次性套筒，以及用于校准测定的方法。

本文描述的胆红素敏感性NIR荧光标记的iLBP突变体被开发为具有改进的胆红素特异性和灵敏度。先前的公开内容，例如，US 9,529,003描述了主要在赖氨酸、末端氨基或半胱氨酸处用荧光团标记的iLBP。如US 9,134,317中所公开的，在单个半胱氨酸处的标记通过消除在多个位点(野生型FABP(包括具有SEQ ID NO：1所列出的序列的蛋白质)或突变的FABP蛋白(例如具有表1和2中所列序列的突变蛋白不具有半胱氨酸残基))的荧光团标记提高了检测配体与iLBP结合的灵敏度和特异性。由于大多数位点的荧光团在配体结合时不会改变其荧光，因此在大多数位点进行标记会降低配体结合时的荧光信噪比。除了末端氨基外，iLBP具有多达14个表面可接近的赖氨酸，所有这些都可以用氨基反应性荧光团标记。本公开的一项改进涉及使用两种荧光团LICOR 700DX和LICOR 800CW的新可用的半胱氨酸特异性形式(马来酰亚胺)。LICOR 700DX马来酰亚胺在先前公开之前是不可用的或未知的，并且在US 9,529,003中没有研究LICOR 800CW马来酰亚胺。本文公开的胆红素敏感性iLBP具有用LICOR 700DX-马来酰亚胺标记的特定单个半胱氨酸突变。还开发了iLBP突变体，它们在胆红素存在下不表现出荧光变化，并用LICOR 800CW-马来酰亚胺在单个半胱氨酸突变处标记。

本文公开的探针可能对超过50种最常开给新生儿的药物(例如，表4中列出的那些)、缀合的胆红素、胆红素的光异构体、用于向早产儿或其他有风险的婴儿提供肠外营养的静脉内脂质乳剂不敏感，并且对游离脂肪酸不敏感。

本公开还涉及用于确定样品中未结合胆红素浓度的装置。在一些实施方案中，所述装置包括一次性塑料套筒，其包含NIR荧光Bf传感器作为血液样品微通道中心的干燥斑点(例如，具有1-50μL的体积，在一些实施方案中为5μL)。可以在施加血液样品后，通过将套筒插入专门为此测量开发的荧光读取器中，测量来自套筒的荧光。一次性样品套筒和读取器的这种配置可以允许在单个步骤中测量未结合胆红素的血液水平，并且在一些实施方案中使用微升体积的样品。

干燥套筒上的Bf传感器导致胆红素介导的胆红素敏感探针荧光的不完全猝灭。这需要新的分析方法来表征传感器并根据来自胆红素敏感探针的荧光除以来自胆红素不敏感探针的荧光的比值计算未结合胆红素浓度。

因此，本文提供的一些实施方案涉及用于鉴定对未结合的胆红素高度特异的荧光标记的蛋白质(或iLBP突变蛋白)和对胆红素无响应的荧光标记的iLBP突变蛋白的方法。一些实施方案涉及在胆红素响应性iLBP突变蛋白和无响应iLBP突变蛋白上使用不同的近红外(NIR)荧光团。当在Bf传感器中组合时，Bf的存在将产生两种不同NIR荧光团的指数比值发生变化。本文提供的实施方案涉及使用两种荧光标记的蛋白质产生荧光比值传感器的方法，所述传感器用于确定从简单水溶液到包括人体液(血液、CSF、尿液、组织液)的复杂生物样品的样品中的未结合胆红素浓度。在一些实施方案中，所述方法包括使用US 7,601,510和9,529,003的方法产生探针和通过使用第二荧光标记的无响应蛋白产生比值Bf传感器。例如，一种或两种荧光蛋白可以在溶液中游离，或者一种或两种都可以连接到固体基板(基体)或树脂聚合物，例如聚葡聚糖或聚苯乙烯。在一些实施方案中，所述方法包括校准传感器以使用等式(1)确定传感器的校准常数。一些实施方案涉及将探针连接至固体基板。可以检查与固体基板连接的探针的特征，以评估此类装置中未结合胆红素水平的准确度和精确度测定。这样的特征可以包括例如探针解离、白蛋白缓冲或胆红素与聚合物结合的影响，但不包括探针和聚合物上的平衡速率。在一些实施方案中，Bf传感器特异性可以通过针对一组潜在干扰物进行测试来精调，所述干扰物包括常见代谢物、药物、胆红素光异构体、缀合的胆红素或相当于小于1nM未结合胆红素或一些医学上合适水平的其他分析物贡献。在一些实施方案中，所述方法还包括通过测量掺有胆红素的限定的人血浆、血清或全血中的未结合胆红素来测试定量，以确保对人血液样品中未结合胆红素的特异性。在一些实施方案中，所述方法还包括计算未结合胆红素浓度，如等式(2)中所述。

一些实施方案涉及基于iLBP(例如脂质结合蛋白，其对应于SEQ ID NO：1)的探针，其包括一个或多个氨基酸取代和荧光团(见表1和2中的示例)。在一些实施方案中，荧光团附接至仅具有单个反应性半胱氨酸的iLBP的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，胆红素敏感性iLBP结合胆红素的IXα-Z，Z异构体，但不显著结合光异构体Z，E、E，Z和光红素、缀合的胆红素，也不结合脂肪酸，以及无响应iLBP也只有单个反应性半胱氨酸，并且不结合或响应任何这些分析物。

在一些实施方案中，胆红素敏感探针对应于SEQ ID NO：1的脂质结合蛋白，其具有N端MGI取代、C端双HIS标签取代C2XH11(SEQ ID NO：3)和选自以下位置处的一个或多个氨基酸取代：所述氨基酸取代位置选自SEQ ID NO：1的14、18、23、28、24、25、26、27、29、30、33、38、54、60、73、74、76、97、98、106、115、117或132。

在一些实施方案中，胆红素响应性探针的荧光团附接至SEQ ID NO：1的位置22、24、25、26、27、29、30、33、54、73、74、76、97或98的半胱氨酸取代。

在一些实施方案中，探针在SEQ ID NO：1的位置7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R88R 92R 94R 100R 125R 129R和/或130R(KR14-SEQ ID NO：2)处被精氨酸取代，除非当位置29突变为半胱氨酸时。

在一些实施方案中，探针在SEQ ID NO：1的C端包括具有序列RGAASHHHHHHSHRATPNTSPHHHHHHH(SEQ ID NO：3)的接头(C2XH11)。

在一些实施方案中，多核苷酸模板编码具有可切割或不可切割亲和标签的iLBP突变蛋白。在一些实施方案中，模板多核苷酸模板编码具有多组氨酸亲和标签的iLBP突变蛋白，并且固体基板包括固定的金属螯合物。

在一些实施方案中，胆红素响应性和无响应iLBP突变蛋白在pH小于8下用单个荧光团标记。在小于8的pH值下，荧光团可能与半胱氨酸侧链反应。在一些实施方案中，荧光团是硫醇特异性荧光团，其在约660nm的波长激发并在约700nm和819nm的波长发射，例如LICOR 700DX-马来酰亚胺和LICOR 800CW马来酰亚胺。

在一些实施方案中，第二荧光团通过将荧光团添加到无响应探针，例如无响应iLBP突变蛋白来提供。无响应iLBP也用单个荧光团标记，所述荧光团在pH值小于8下优先与半胱氨酸侧链反应。在一些实施方案中，荧光团是LICOR 800CW-马来酰亚胺或BiotiumCF800马来酰亚胺。在一些实施方案中，与胆红素响应性(胆红素结合)iLBP突变蛋白探针的荧光相比，无响应iLBP在暴露于胆红素时其荧光指数为零或具有显著降低的响应。

在一些实施方案中，无响应探针基于iLBP，例如对应于SEQ ID NO：1的脂质结合蛋白，它包括一个或多个氨基酸取代和荧光团(参见表2中的示例)。在一些实施方案中，荧光团与仅具有单个反应性半胱氨酸的iLBP的半胱氨酸残基附接。

在一些实施方案中，无响应探针对应于在选自14、18、20、23、27、29、33、54、72、73、74、76、98、100、117、126或131的位置处具有一个或多个氨基酸取代的SEQ ID NO：1的脂质结合蛋白。

在一些实施方案中，用于无响应探针的荧光团附接至SEQ ID NO：1的位置27、31、33、54、73、74、76或98的半胱氨酸取代。

本文提供的一些实施方案涉及具有用第一荧光团和第二荧光团标记的iLBP突变蛋白的组合物，所述第二荧光团附接到不结合胆红素的单独的未附接的iLBP上。在一些实施方案中，第一荧光团和第二荧光团能够以相同的波长激发，并且第一荧光团和第二荧光团的发射波长不同。在一些实施方案中，第二荧光团不受对胆红素与胆红素无响应iLBP突变蛋白结合和/或无响应iLBP不结合胆红素的响应的影响(不改变其发射)。在一些实施方案中，第一荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺并且第二荧光团是LICOR 800CW马来酰亚胺。

在一些实施方案中，在两个不同波长测量荧光指数比值的变化并且该比值用于确定未结合的胆红素浓度。

在一些实施方案中，指数是附接到iLBP突变蛋白的荧光团的发射强度，如本文所述，其不受血液成分例如胆红素和血红蛋白的吸光度(600nm以上)的显著影响。在一些实施方案中，本文所述的系统和方法不依赖于溶血。由于样品中的血红蛋白和血红素，溶血会造成显著的干扰。然而，本文提供的方法、系统和组合物克服了与溶血相关的干扰。在一些实施方案中，将肽添加到附接Bf探针的固体基板中，并且所述肽消除或显著降低来自溶血的干扰。

在一些实施方案中，第一荧光团附接到半胱氨酸并且是LICOR 700DX-马来酰亚胺并且第二荧光团也附接到不同iLBP上的半胱氨酸并且是LICOR 800CW-马来酰亚胺。

在其他实施方案中，第一荧光团是LICOR 800CW-马来酰亚胺并且附接到胆红素敏感突变蛋白，并且第二荧光团是LICOR 700DX-马来酰亚胺并且附接到无响应突变蛋白。

在本文所述的其他实施方案中，第二不同的荧光团附接至不结合胆红素的蛋白质。结合第一荧光团的探针与胆红素响应性iLBP突变蛋白附接和结合第二荧光团的探针附接至胆红素无响应iLBP突变蛋白，因此响应和无响应探针的混合物产生Bf传感器，所述Bf传感器改变其响应胆红素在两种不同波长测量的荧光指数的比值。第二荧光团可以具有比第一(响应性iLBP突变蛋白)荧光团更长或更短的发射波长，但两个荧光团应具有共同的激发波长。例如，在一些实施方案中，第一(蛋白质连接的)荧光团是LICOR 700DX-马来酰亚胺并且第二荧光团的实例包括但不限于LICOR 800CW-马来酰亚胺，和/或与胆红素无响应蛋白连接的Biotium CF800马来酰亚胺。一种或两种荧光标记的蛋白质可以在溶液中游离或嵌入另一种聚合物或固体基板中。这种布置具有可调节的荧光团浓度的理想益处，使得即使当第二荧光团的最大激发波长不同于第一荧光团的最大激发波长时，两个荧光团的发射强度相似。这种类型的比值探针使用第二不同的荧光团，而不是与第一荧光团附接到相同的蛋白质上，从而消除了通常当两个荧光团位于相同的蛋白质上时两个荧光团中的一个被另一个荧光团能量转移猝灭的问题。

在一些实施方案中，第二荧光团附接至受体蛋白。在一些实施方案中，探针包括SEQ ID NO：1的取代7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R 100R 125R 129R和130R(KR14-SEQ ID NO：2)，除非这些位置之一具有半胱氨酸取代。

在一些实施方案中，探针包括由序列RGAASHHHHHHSHRATPNTSPHHHHHHH(SEQ IDNO：3)组成的C末端接头C2XH11。

本文提供的实施方案涉及其中荧光团附接至半胱氨酸残基的探针，例如LICOR700DX马来酰亚胺、LICOR 800CW马来酰亚胺、LICOR、IRDye 680LT马来酰亚胺、Alexafluor680马来酰亚胺或Biotium CF800马来酰亚胺。

在一些实施方案中，如上所述的任何探针可以包括在探针的C或N-末端的两个或更多个标签与用于附接至固体支持物的一个或多个接头组合。

在一些实施方案中，使用两个His-标签和两个接头将探针附接至固体支持物。

本文提供的实施方案涉及包含如上所述的探针的组合物。

本文提供的一些实施方案涉及在溶液中游离的胆红素敏感探针(例如，LICOR700DX-马来酰亚胺)和胆红素无响应探针(例如，LICOR 800CW-马来酰亚胺)。在一些实施方案中，胆红素敏感探针和胆红素无响应探针附接至溶液中的固体基板。

本文提供的实施方案涉及固体基板，其包括附接至固体基板的上述任何探针。在一些实施方案中，固体基板是聚苯乙烯或胶乳珠、Ni-聚苯乙烯珠，任选地包含铁。选择用于附接至固体基板的探针可以单独或组合包含上述任何修饰，包括但不限于N-末端修饰和C-末端修饰、接头和表面赖氨酸(KR14)的取代。具有不同发射波长的两种探针可以固定在相同或不同的固体基板上，所述固体基板是纳米颗粒或珠子。

在一些实施方案中，探针被标记以附接至固体基板上。在一些实施方案中，标签包括His-标签、生物素、Flag-表位、c-myc表位、HA-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合结构域(CBD)、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白、钙调蛋白结合蛋白、聚苯乙烯(PS)疏水标签或金属亲和标签中的一种或多种。

一些实施方案涉及固体基板，其中探针具有标签并且固体基板包括标签的受体。在一些实施方案中，标签是具有或不具有另外的接头的多组氨酸标签，并且固体基板包括固定的金属螯合物。

其他实施方案包括附接到固体基板的胆红素探针，所述固体基板是纳米颗粒，包括但不限于聚合物，例如葡聚糖、聚苯乙烯、胶乳、琼脂糖珠或Ni-NTA聚苯乙烯珠，任选地包含铁。这些纳米颗粒基板可以进一步固定在宏观表面上。使用这种表面的实例包括但不限于一次性微流体装置的通道，包括单次使用的样品套筒。设计为固定在表面上的胆红素探针的实例包括但不限于表1和表2各自的组合，其双组氨酸标签和接头允许它们与各种聚合物树脂上的各种金属配体螯合，包括但不限于聚苯乙烯、乳胶或琼脂糖珠上的镍、钴或铜。这种带有附接探针的珠子可以在溶液中游离使用，胆红素响应性和无响应探针可以添加到相同或不同的珠子中，对于这两种配置，两种不同的荧光团充分分离，以消除能量转移，从而获得对胆红素结合的比值响应。在一些实施方案中，基板是微流体装置或多孔板。在一些实施方案中，基板包括在本文所述的检测装置中，使得基板附接到套筒的表面。

本文提供的实施方案涉及具有用荧光染料标记的单个半胱氨酸的iLBP突变蛋白。在一些实施方案中，在半胱氨酸/赖氨酸特异性标记条件下具有荧光标记活性的任何表面赖氨酸或任何其他半胱氨酸被替换为另一种氨基酸，包括例如丙氨酸或精氨酸。在利用对应于SEQ ID NO：1的iLBP突变蛋白模板的一些实施方案中，27位的赖氨酸是高度反应性的并且可以突变，通常突变为丙氨酸，除非标记涉及该位置。

在一些实施方案中，胆红素与载体大分子例如白蛋白、脂质结合蛋白、脂质囊泡或环糊精复合。胆红素和载体大分子的复合物缓冲了未结合胆红素的浓度，这提供了一定水平的未结合胆红素的钳位。在一些实施方案中，载体大分子是白蛋白。在进一步的实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)，其对胆红素的亲和力大于例如牛血清白蛋白，因此在一些实施方案中可能是对胆红素更优选的白蛋白缓冲液。

本文提供的实施方案涉及校准胆红素探针的方法，通过在水性介质中将传感器与总胆红素浓度(BT)增加的胆红素样品混合，测量在每个浓度下传感器的荧光强度R的比值，并通过用等式(1)拟合从测量的荧光中确定校准参数(Kd、Rm和Ro)，其中R是测量的荧光比(I_λ1/I_λ2)，其中I_λ1是来自第一荧光团在波长λ1的荧光强度，I_λ2是来自第二荧光团在波长λ2的荧光强度，I_λ1和I_λ2都减去了背景，Ro是不存在胆红素时的比值。BT是总胆红素浓度，PT是传感器的浓度，r是在不存在第二荧光团的情况下胆红素敏感探针的荧光的I_λ2/I_λ1比值，Kd是传感器的平衡解离常数，Rm是外推到无限BT的比值R。当Rm＞0时，在一些实施方案中使用等式(1)而不是美国专利9,529,003的等式(5)。

本文提供的实施方案涉及通过以下步骤的组合测量游离胆红素[Bf]浓度的方法，所述步骤包括任选地测量样品的荧光，将传感器与样品混合，以及测量荧光，任选地，从存在传感器的样品荧光强度中减去不存在传感器时样品的荧光强度(背景或空白)，从减去背景的传感器强度计算R，并从等式(2)确定[Bf]的浓度。

在一些实施方案中，等式2用于校准传感器和/或测量Bf，其中R是测量的荧光比((I_λ1/I_λ2)，I_λ1是来自第一荧光团在波长λ1处的荧光强度并且I_λ2是来自第二荧光团在波长λ2处的荧光强度，两个强度都减去样品空白，Ro是不存在胆红素时的比值，r是不存在第二荧光团时传感器的I_λ2/I_λ1比值，Kd是解离常数，Rm是∞Bf时的最小R值，和Rm是探针胆红素饱和的R。

在一些实施方案中，传感器通过胆红素响应性iLBP与一个荧光团的组合由两个荧光团组成，并且第二荧光团附接到溶液中游离的聚合物或溶液中游离的蛋白质，其不结合胆红素。在一些实施方案中，传感器由具有一个荧光团的蛋白质组成，所述荧光团结合或响应胆红素并附接至固体基板，第二荧光团附接至不结合或响应胆红素的另一种蛋白质，该蛋白质也附接至固体基板，但与具有第一荧光团的蛋白质分离。

在一些实施方案中，样品包含用于胆红素的载体大分子，例如白蛋白、脂质结合蛋白、脂质囊泡或环糊精。

在一些实施方案中，胆红素响应性探针和无响应探针附接到一次性微流体通道的通道，允许测量未稀释的血液样品中的Bf。

在一些实施方案中，样品来自人、动物或植物。在一些实施方案中，样品来自全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴。在一些实施方案中，样品来自接受油乳剂静脉内输注的患者。在一些实施方案中，样品来自可能因疾病或应激而产生从白蛋白中置换胆红素的分子的患者。在一些实施方案中，样品来自正在用可以从白蛋白中置换胆红素的药物治疗的患者。在一些实施方案中，样品来自正在经受光疗、输血(transfusion)或其他降低胆红素水平的疗法的患者。

本文提供的实施方案涉及试剂盒，其可以包括用于从患者收集样品的一个或多个收集装置、一个或多个如上所述的传感器或在合适的载体中包含一个或多个传感器的组合物，并且任选地，包含已知浓度的未结合胆红素的参考标准。

本文提供的实施方案涉及如表1或2任一个中定义的探针。

对于本公开的目的，胆红素是未缀合的胆红素IXα的Z，Z异构体[McDonagh AF等人Photoisomers：obfuscating factors in clinical peroxidase measurements ofunbound bilirubin？Pediatrics 123：67-76，2009]。未结合胆红素是未缀合的Z，Z IXα胆红素的水性单体，与血浆中通常发现与白蛋白结合的胆红素不同。

为了本公开的目的，术语“脂质”具有其通常和惯用的含义，并定义了在有机溶剂中最易溶解但在水相中具有一定溶解度的化合物(未结合的部分)。因此，“脂质结合蛋白”包括能够结合脂质的任何蛋白质，如本文所定义的脂质。

当在适当的人或动物体液中测量时，未结合分子的水平，例如胆红素、脂质，包括脂肪酸、激素和代谢产物，可以提供健康和疾病的诊断信息。越来越明显的是，确定此类分子的未结合(本文也称为“水相”或“游离”)浓度提供了有关生理内稳态的关键信息。许多代谢物是疏水性分子，水溶性低，未结合浓度远低于其“总”浓度，其中大部分“总”浓度可能与蛋白质或细胞结合。在生物体液中，通常调节未结合分子的浓度以在正常生理条件下保持相对恒定的未结合浓度。这种调节通过分子与载体蛋白(例如白蛋白)的相互作用而发生。因此，大多数分子通常与白蛋白或其他载体结合。然而，一小部分分子可能从白蛋白解离(并重新结合)到水相中，并且这些是未结合的分子。

为了本公开的目的，在一些实施方案中，“胆红素传感器”是两个iLBP，其在半胱氨酸残基处用两种不同的荧光团标记，并且其中第一iLBP在结合胆红素时经历荧光指数的变化，和第二iLBP在存在胆红素的情况下不会显著改变其荧光(无响应探针)。在一些实施方案中，胆红素传感器还可以包含在半胱氨酸残基处被荧光标记的iLBP，所述iLBP具有由第二荧光团提供的另外的荧光，所述第二荧光团可以在溶液中游离，附接到不同的分子或聚合物，并且第二荧光团在存在胆红素的情况下不改变荧光。在这种情况下，如果只有一个荧光团的荧光在结合胆红素时发生变化，则在2个波长的荧光指数比值将不同。此类探针可用于具体确定未结合胆红素的水溶液浓度，这在其他方面是困难的，因为它在水溶液中的溶解度差，并且因为存在其他代谢物，尤其是游离脂肪酸。荧光响应比值的变化对于准确测定未结合胆红素的细胞内浓度特别重要，对于提高测定未结合胆红素的细胞外浓度的准确度和精密度也很重要。

美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003，[Huber AH等人Fatty acid-specific fluorescent probes and their use in resolving mixtures of differentunbound free fatty acids in equilibrium with albumin.Biochemistry 45：14263-14274，2006]和[Huber AH和Kleinfeld AM.Unbound free fatty acid profiles inhuman plasma and the unexpected absence of unbound palmitoleate.J.LipidRes.58：578-585，2017]描述了高通量生成高特异性探针的方法，这些探针允许测定未结合的分析物。美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003描述了胆红素特异性探针的开发。本文提供的实施方案涉及在美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003中描述的胆红素技术的改进。本公开的实施方案提高了确定未结合胆红素水平的准确度和精密度，并允许该技术用于不同的仪器形式。在美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003以及[Huber等人Fluorescence Sensor for the Quantification of Unbound BihrubinConcentrations.Clin Chem 58：869-876，2012]中描述的胆红素探针主要是在水悬浮液中使用探针(基于比色皿的荧光法)和主要使用稀释的血浆或血清样品的方法。本文公开的实施方案涉及通过使用两个探针(用在近红外发荧光的荧光团标记的iLBP突变蛋白)产生Bf传感器的方法。第一iLBP用LICOR 700DX-马来酰亚胺标记，它在700nm处发出荧光，其荧光在结合Z，Z胆红素时被淬灭。第二iLBP用LICOR 800CW-马来酰亚胺标记，它在819nm处发出荧光，对胆红素没有响应。LICOR 700DX-马来酰亚胺和LICOR 800CW-马来酰亚胺均可在660nm处激发。本文提供的一些实施方案涉及胆红素对长波长探针的猝灭。此外，一些实施方案涉及将胆红素探针附接到固体表面以及使用此类组合物测量微流体装置和一次性样品套筒中未结合的胆红素的方法。

胆红素传感器用于确定血液样品中未结合的胆红素水平，并且脂肪酸是血液中最丰富的代谢物，其具有与胆红素相似的特性。脂肪酸与胆红素竞争结合白蛋白并具有与未结合胆红素相似的未结合浓度。胆红素敏感探针是从通常对脂肪酸具有高亲和力的iLBP突变体开始开发的。因此，从iLBP突变蛋白探针中发现胆红素探针的第一步是筛选超过300,000个此类探针，使用多达11种最丰富的脂肪酸，以鉴定对脂肪酸没有显著响应的探针。突变蛋白的系统高通量筛选是不可能的，因为通常没有荧光标记的突变蛋白在分析物结合时不会引发可测量的信号。通过发现ΔR/ΔR_ADIFAB2＜0.1，鉴定了超过10,000个此类脂肪酸无响应者(“无响应者文库”)。该定量基准表明这些探针对脂肪酸的亲和力通常比ADIFAB2参考探针小至少10倍。用胆红素筛选这些无响应探针鉴定了潜在的胆红素探针和/或模板，所述探针和/或模板用于通过对新鉴定的模板蛋白的进一步诱变来产生新的突变蛋白探针文库。筛选生成的文库对脂肪酸和胆红素的响应，将鉴定为对胆红素最响应和对脂肪酸最不敏感的探针鉴定为胆红素探针或可用作进一步轮的诱变和筛选的模板。对本文所述的所有胆红素和无响应突变蛋白(例如，在表1和表2中)进行了此操作，并且所得胆红素传感器对脂肪酸没有显著响应。

进一步表征通过这些方法鉴定的具有有用特性的胆红素探针，包括对胆红素的显著响应和对脂肪酸的零至低响应。对FFA没有显著响应的探针意味着与FFA的结合比与胆红素的结合少10倍以上。在一些实施方案中，与FFA的结合比与胆红素的结合少100倍。这包括校准以确定探针胆红素结合亲和力和荧光特性，以及监测含有胆红素和人血清白蛋白的水溶液中未结合的胆红素水平，以鉴定与脂肪酸的潜在竞争。可以产生无响应探针，其中脂肪酸与探针结合但不产生荧光变化。在这种情况下，血液样品中的脂肪酸可能会与胆红素竞争结合探针，从而导致未结合胆红素水平的不准确测定。通过确定胆红素探针加胆红素的荧光响应是否因添加脂肪酸而改变来评估与脂肪酸的竞争。

选择通过本文描述的方法发现的、在具有胆红素和白蛋白的溶液中产生准确的胆红素浓度，并且不表现出可检测的脂肪酸竞争的胆红素探针用于在人血液样品中进行进一步测试。来自个体新生儿和成人供体的血浆样品以及来自商业来源的合并样品用于确定胆红素探针是否在样品中提供准确的血清或血浆未结合胆红素浓度，所述样品具有通常存在于人血液样品中的基本未知水平的非胆红素分析物。健康成人的胆红素水平低，胆红素：HSA摩尔比小于0.1，因此它们的Bf浓度接近零(＜1nM)。血液样品中掺入胆红素，并测量白蛋白浓度以获得明确的胆红素：白蛋白比值，使Bf水平高于测定的检测限(LOD)，所述检测限低于1nM。然后用Bf传感器测量各种样品中未结合胆红素的浓度，并将结果与用过氧化物酶测定法测定的未结合胆红素浓度进行比较[Jacobsen J和Wennberg RP.Determinationof unbound bilirubin in the serum of newborns.Clin Chem 20：783，1974]，所述过氧化物酶测定法使用FDA批准的唯一Bf测试Arrows UB-2分析仪实施[Nakamura H和LeeY.Micro determination of unbound bilirubin in icteric newborn sera：anenzymatic method employing peroxidase and glucose oxidase.Clinica ChimicaActa，79(1977)411-417]。Bf传感器测定的血浆未结合胆红素浓度与用过氧化物酶测定确定的浓度的等效性证实，未结合胆红素以外的血液成分对探针性能没有可检测的影响。

美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003要求省略先前必要且耗时的表征胆红素与蛋白质结合的步骤；仅对探头本身进行了表征。这是需要的，不仅是为了避免蛋白质表征，而且因为探针的特性通常无法从配体-蛋白质结合特性中预测。例如，不同的蛋白质可能具有非常相似的结合亲和力，但其衍生探针的荧光响应可能会有所不同。

之前描述的大多数胆红素探针仅用丙烯酰丹(acrylodan)标记，主要在SEQ IDNO：1的赖氨酸27处(包括在美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003和[Huber等人Fluorescence Sensor for the Quantification of Unbound BilirubinConcentrations.Clin Chem 58：869-876，2012]中)。另外的胆红素探针用两种不同的荧光团标记，即在SEQ ID NO：1的赖氨酸27处的丙烯酰丹，和在N末端的半胱氨酸处的Texas红色马来酰亚胺以两种版本加合，一种没有KR14，另一种有KR14(“KR14”是指SEQ ID NO：1中以下14个表面赖氨酸突变为精氨酸的缩写，包括7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R100R 125R 129R和130R，并且具有如SEQ ID NO：2所列出的序列)取代，所述KR14减少多重丙烯酰丹标记。这些探针对胆红素具有良好的亲和力和响应，并且不受人体血液样品中非胆红素代谢物的显著影响。然而，在高胆红素浓度的样品中，仅丙烯酰丹的探针可能会受到胆红素介导的激发内过滤效应(严重新生儿高胆红素血症中的一种病况)[Bhutani VK和Johnson L.The Jaundiced Newborn in the Emergency Department：Prevention ofKernicterus.Clin Ped Emerg Med 9：149-159，2008]和血液样品中血红蛋白的存在的不利影响。带有丙烯酰丹和较长波长荧光团(例如Texas红)的双标记探针，由于丙烯酰丹和次级荧光团之间的能量转移而具有严重降低的丙烯酰丹荧光强度，使得此类探针无法在临床重要浓度范围内获得准确的Bf值。

为了克服这些缺陷，本文提供的实施方案涉及用于确定未结合胆红素水平的传感器和方法。鉴定了突变蛋白文库，其中被胆红素淬灭的荧光团标记了单个半胱氨酸侧链，并且发现该侧链的位置对于优化胆红素结合时的荧光变化很重要。还描述了胆红素探针，其中被胆红素淬灭的荧光团标记不同的半胱氨酸侧链，并且发现侧链的位置对于优化胆红素结合时的荧光变化很重要。还描述了在长波长下吸收和发射的胆红素可猝灭荧光团，其中不应发生由

型能量转移引起的胆红素猝灭。本公开还涉及通过胆红素对极长波长荧光团(包括那些延伸到红外线中的荧光团)的荧光猝灭。由于它们的长波长吸光度和荧光，这些荧光团不受胆红素或血红蛋白吸光度或血液样品中可能存在的几乎任何其他发色团吸光度的影响。

本文描述的另外的实施方案涉及产生胆红素比值传感器的方法，所述传感器由胆红素结合蛋白上的单个荧光团产生并且其荧光在结合胆红素时降低，并且第二不同的荧光团附接到对胆红素不响应和/或不与胆红素结合的蛋白质(无响应探针)上。这种传感器响应胆红素与探针蛋白质部分的结合，并随着在两个不同波长处测量的荧光指数比值的变化而变化。这种类型的比值传感器使用独立的第二荧光团，消除了通常在两个荧光团位于同一大分子(例如蛋白质)上时观察到荧光团之间能量转移猝灭的问题。这种猝灭极大地降低了信号强度，从而降低了测量未结合胆红素浓度的准确度和精密度。这种能量转移的避免是通过不将两个荧光团附接到相同的探针分子来实现的。

还描述了胆红素探针，其可以附接到固体基板例如聚苯乙烯或胶乳珠子上，并且这些珠子可以固定在用于一次性微流体装置的表面上。第一和第二荧光团可以分别附接至胆红素响应性iLBP和胆红素无响应iLBP。在一些实施方案中，两个探针可以附接到相同或不同的固体珠子基板上，使得两个荧光团保持充分分离，使得能量转移不显著，并且这些珠子可以固定在一次性塑料微流体装置上。将传感器-珠复合物在水性缓冲液(浆液)中的混合物以小于2μl的体积分配到微流体装置的通道中并使其干燥，从而形成直径约为2mm的圆形点并粘附到通道的底部。将未稀释的血液样品施加到通道的入口处，并迅速流过并重新构成干燥的胆红素传感器点。然后将包含血液样品的装置置于荧光读取器中，该读取器测量来自胆红素响应性和无响应探针(传感器)的荧光比值，从中计算Bf浓度。

还描述了用于校准和使用本文描述的胆红素传感器的方法，使得可以在单个步骤中确定大约5μl的未稀释的血液样品中的Bf浓度。这些小体积的血液样品被应用到含有干胆红素比值传感器的一次性塑料微流体套筒中。包含胆红素传感器的套筒优选用于单次测量，校准参数(Kd、Rm、Ro)必须在“批次”相同制造的套筒中确定。校准是通过滴定足够数量的套筒来进行的，其中水性样品具有增加的明确的Bf水平。由于塑料与未结合的胆红素结合，并且由于微流体通道中的表面积与体积比很大，因此校准Bf样品必须通过与白蛋白的复合物进行高度缓冲。每种复合物的Bf浓度通过使用在水溶液中游离的校准传感器通过比色皿荧光法测量每种复合物来确定。游离传感器通过用胆红素水溶液滴定来校准，其中这些未结合的胆红素溶液的浓度由吸光度确定。游离探针的响应(R值与Bf浓度)用于确定游离传感器的校准(Kd、Rm、Ro)(等式1)。校准后的游离传感器与每种BR：HSA复合物的样品混合，用于使用等式2通过比色皿荧光测定法确定每种复合物的Bf浓度。这些校准的复合物用于确定一次性套筒的结合参数，包括在限定的适用于血液样品的温度、pH值和溶液组成的条件下的平衡解离常数(Kd)、最小荧光比(Rm)和初始比(Ro)。通过测量胆红素传感器响应于增加的胆红素浓度(“滴定数据”)的荧光变化，在水性缓冲液中进行结合等温线。每个胆红素浓度下的一组荧光响应都用适当的等式(“校准等式(3)”)拟合，所述等式正确地描述了作为Bf浓度、特定光谱特性和Kd函数的荧光响应。

在样品中确定游离胆红素浓度([Bf])，其中[Bf]通过白蛋白结合平衡缓冲，因此不受胆红素探针的存在的显著干扰。等式(2)用于确定Rm＞0的比值传感器的[Bf]。

本文提供的一些实施方案涉及可用于确定未结合分析物浓度的荧光蛋白分子的开发。更具体地，一些实施方案涉及1)通过美国专利7,601,510、9,134,317和9,529,003的方法产生的胆红素探针的鉴定，这些专利通过引用明确纳入本文并且还描述了这些方法的修改，2)此类探针在临床医学和基础科学中的用途，或3)用于确定不同液体中未结合胆红素浓度的这些探针的示例。

胆红素探针是已通过一个或多个荧光分子(荧光团)的共价添加被“标记”的iLBP蛋白，所述荧光分子(荧光团)在结合胆红素时表现出荧光指数的变化。在一些实施方案中，探针包含单个半胱氨酸，荧光团共价附接到该半胱氨酸上。

在一些实施方案中，使用两种不同的荧光团，其中两种荧光团中的一种标记对胆红素结合有响应的iLBP，并在胆红素与探针结合时显示荧光指数的变化。第二荧光团标记对胆红素没有响应或不结合胆红素的iLBP。第二探针提供了参考点，以便在结合胆红素时观察到两个不同波长的荧光比值的差异。第二探针可能不与胆红素结合反应或可能以与第一荧光团不同的方式反应。在一些实施方案中，第二荧光团具有相对于第一荧光团不同波长的发射点。可用作第二荧光团的化学染料的实例包括但不限于LI-COR 800CW马来酰亚胺、Cy7马来酰亚胺、Cy7.5马来酰亚胺、VivoTag-S 750-M和Alexa Fluor 750。在一些实施方案中，第二荧光团是LI-COR 800CW马来酰亚胺。

在一些实施方案中，使用两种不同的荧光团，其中一个荧光团附接至半胱氨酸并且该荧光团对胆红素结合有响应，即，在胆红素与荧光标记的iLBP突变蛋白结合时显示荧光指数的变化，第二荧光团与结合胆红素的iLBP突变蛋白没有化学连接，对胆红素与iLBP突变蛋白的结合不敏感。第二荧光团提供参考点，以便在结合胆红素时观察到两种不同波长的荧光比值差异。在一个实施方案中，第二荧光团在相对于第一荧光团更长的波长处具有发射点。可用作第一荧光团的化学染料的实例包括但不限于LI-COR 700DX马来酰亚胺、Biotum CF680-M、CF680R-M、Lumiprobe Cy5、Cy7、Perkin Elmer VivoTag 645-M、VivoTag680XL-M、Atto Tek Atto 680、Atto 700、Dyomics DY677或DY 689。可用作第二荧光团的化学染料的实例包括但不限于LI-COR 800CW马来酰亚胺。在一些实施方案中，第一荧光团是LI-COR 700DX马来酰亚胺并且第二荧光团是LI-COR 800CW马来酰亚胺。

iLBP突变蛋白可以被“标记”，使得它们以高亲和力结合固体支持物。这包括但不限于用生物素，Flag-表位或c-myc表位或HA-标签，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，几丁质结合结构域(CBD)，硫氧还蛋白，β-半乳糖苷酶，VSV-糖蛋白，钙调蛋白结合蛋白，聚苯乙烯(PS)疏水标签或金属亲和标签，例如6X His标签进行标记。亲和标签与固体支持材料的特异性结合有助于在平面结构(包括但不限于多孔板和微流体装置)中测量未结合的胆红素。由于它们与固体支持物的附接，探针可以集中在有限的、有效的二维区域中。这可以测量允许流过探针的薄层样品溶液中的未结合胆红素，这些探针被限制在有效的二维区域内。这有效地允许前表面荧光测量，从而降低胆红素和血红蛋白引起的吸光度并促进全血中的测量。亲和标签可以融合在NH2-或COOH-末端或同时融合在两个末端，例如如表1和2中所示。在一些实施方案中，6X组氨酸标签与iLBP突变蛋白的NH2-或COOH-末端融合或同时融合在两个末端，而不会显著改变蛋白质的胆红素结合特性。在一些实施方案中，融合肽由位于探针的COOH末端的两个分开的组氨酸区域组成。在一些实施方案中，探针固定在固体支持物上，包括但不限于Ni-聚苯乙烯珠。

在一些实施方案中，固定在固体支持物上的胆红素传感器是用不同荧光团标记的两种探针的组合，所述荧光团在相同波长激发但在两种不同波长发射。两种探针中的一种对胆红素结合有响应，也就是说，它显示了胆红素与蛋白质结合后荧光指数的变化。用不同荧光团标记的第二探针对胆红素的结合没有响应，或者对胆红素的响应产生与第一探针不同的变化。第二探针的荧光团提供了参考点，以便在胆红素结合时观察到两个不同波长的荧光比值的差异。在一些实施方案中，第一胆红素敏感蛋白用LI-COR 700DX马来酰亚胺标记，第二胆红素不敏感蛋白用LI-COR 800CW马来酰亚胺标记。

本文提供的一些实施方案涉及包含Bf传感器的一次性样品套筒，如图10A-10D、11A-11D和12所示。添加样品后，将套筒放入荧光读取器中以确定样品的Bf浓度。在一些实施方案中，套筒由聚苯乙烯底座和丙烯酸透镜组成，如图10A-10D和11A-11D。在一些实施方案中，传感器由来自表1的胆红素敏感iLBP，LICOR 700DX-马来酰亚胺，和来自表2的无响应iLBP，LICOR 800CW-马来酰亚胺组成，其中两个探针与Ni-NTA聚苯乙烯珠(例如dynal 1μmNTA珠子)在单独的珠子上或在相同的珠子上结合。一些实施方案将来自表4的肽添加到具有结合探针的Ni-NTA聚苯乙烯珠子中，以帮助减少来自血红蛋白和/或溶血产物的干扰。探针和肽标记的珠子悬浮在水性缓冲液中以形成浆液，以250至2000nL体积的液滴分配到聚苯乙烯底座上。Bf传感器珠的这个斑点被允许干燥，然后被丙烯酸透镜包围，形成包含干燥的传感器斑点的通道。在一些实施方案中，在施加传感器浆液之前用UV辐射处理聚苯乙烯底座。在一些实施方案中，约185nm波长的UV照射优于254nm照射，用于锚定聚苯乙烯珠传感器并在聚苯乙烯底座上形成明确定义的圆形传感器斑点。在一些实施方案中，在传感器斑点干燥后，将等离子体处理的丙烯酸透镜卡扣到聚苯乙烯底座上，形成2.7mm宽、0.1mm高和13.7mm长的密封通道(总体积＝3.7μl)。然后将样品施加到透镜的样品端口，迅速填充通道并重构干燥的传感器。

在一些实施方案中，套筒是微流体装置，并且包括聚苯乙烯底座；丙烯酸透镜；和具有固定于其上的胆红素响应性探针、无响应探针和抗血红蛋白肽的基板。在一些实施方案中，聚苯乙烯底座包括具有深色的材料，所述材料被配置为降低660nm处激发光的反射强度，例如深灰色底座。在一些实施方案中，基板是珠子，探针和/或抗血红蛋白肽附接于其上。在一些实施方案中，将珠以小于2μL体积的浆液形式施加到底座上的限定区域，然后使其固化，例如通过光处理。在一些实施方案中，用波长范围为约145nm至约225nm的UV光处理底座，从而用基板的聚合物链对聚苯乙烯聚合物链进行光处理。在一些实施方案中，在固化(光处理)之后，干燥的传感器在套筒上形成斑点，例如具有约2mm直径的斑点。在一些实施方案中，透镜放置在底座上的适当位置，并形成从样品端口到传感器之外几毫米的通道(图10A-10D、11A-11D和12)。在一些实施方案中，将微流体装置(套筒)放入带有干燥剂的Steriflex W1F袋中。

图10A-10D描绘了套筒的底座的实施方案的多个视图。图10A描绘了套筒底座1000的俯视图。套筒底座1000包括开口区域1010，所述开口区域1010包括基板。套筒底座1000还可以包括外壳，所述外壳可以包括用于操作(包括用于抓握和/或用于将套筒插入或移除到读取器装置中)的肋部1020。套筒底座1000可以由任何合适的材料制备，包括例如聚苯乙烯。在一些实施方案中，底座1000包括具有深色的材料，所述材料被配置为降低660nm激发光的反射强度，例如深灰色底座。在一些实施方案中，底座的开放区域1010用波长范围从约145nm至约225nm的UV光处理。在一些实施方案中，光处理使聚苯乙烯聚合物链对与基板反应具有光不稳定性。在一些实施方案中，在光处理之后，基板与底座的光处理区域接触，这将基板在开口区域1010内的指定区域处结合到底座。基板可包括本文公开的任何基板。

图10B描绘了套筒底座1000的侧视图，具有可放置基板的开口区域1010，并且包括肋部1020。图10C描绘了套筒底座1000的仰视图。图10D描绘了开口区域1010的放大横截面图，描绘了在将底座套筒1000联接到透镜时变得挤压(crush)的肋部1030。

图11A-11D描绘了被配置为联接到套筒底座1000的透镜1100的实施方案的多个视图。图11A描绘了透镜1100的俯视图，其包括样品端口1105、流体流动路径1110和胆红素传感器1115。图11B描绘了透镜1100的侧视图。如图11B所示，透镜1100包括样品端口1105和插入部分1120，其被配置为联接到套筒底座1000，形成流体流动路径1110，并且密封套筒以防止流体泄漏。图11C描绘了透镜1100和流体流动路径1110的仰视图。图11D描绘了透镜1100的横截面图，其显示了样品端口1105和流体流动路径1110。

透镜1100的尺寸和形状被配置为联接到套筒底座1000的开口区域1010。在联接时，透镜挤压套筒底座的肋部1030，从而密封套筒，从而防止流体从套筒泄漏。此外，将透镜1100联接到盒底座1000形成流体流动路径1110，流体在进入样品端口1105时通过所述流体流动路径流向基板。

在一些实施方案中，流体流动路径具有指定的大小和尺寸，用于准确测量样品中的胆红素。在一些实施方案中，流体流动路径的表面积与体积比大，足以测量未稀释样品中的胆红素。在一些实施方案中，样品是未稀释样品，例如全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴的未稀释样品。在一些实施方案中，套筒被配置为接收范围从小于0.5μL到大于10μL的量的样品，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20μL。

在一些实施方案中，套筒被配置为测量平衡状态的样品。之前的测量装置和/或系统，例如那些可商购的，能够测量非平衡状态的胆红素。然而，本发明的套筒被配置为测量样品中在平衡时的胆红素。

在一些实施方案中，套筒被配置为通过可追溯性提高胆红素测量的准确度。例如，可通过使用从Sigma获得的标准胆红素样品来实现可追溯性，所述标准胆红素样品用于校准本文所述的探针。然后使用校准的探针校准胆红素-人血清白蛋白复合物组。然后使用校准的复合物校准套筒批次(如本文实施例中更详细描述的)。

本文提供的一些实施方案涉及定制的Qiagen Lr3荧光读取器，其中插入了含有样品的套筒。读取器使用660nm激发光源扫描传感器并测量700和819nm的荧光强度包括来自样品本身的任何荧光，通过还测量传感器前后的荧光(背景强度)。读取器使用测得的荧光强度以形成R值，并使用等式(2)计算Bf浓度。每个套筒可以存储在包含干燥剂的密封袋中，并且包含校准参数的条形码打印在袋上并由读取器扫描。将样品施加到套筒并将其插入读取器后，Bf可能会在大约90秒内显示。

使用传感器

在一些实施方案中，用于确定未结合胆红素的样品是源自人、动物或植物的流体样品。在一些实施方案中，流体是全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴。在其他实施方案中，未结合胆红素的测定通过将传感器显微注射或以其他方式转染到细胞中在细胞的细胞质内进行，或者在细胞或组织切片的细胞外介质中进行。

未结合胆红素的范围可以从健康人群中确定，并且与该正常范围的偏差可以指示疾病。

具有零Rm的未结合胆红素传感器可以被校准并用于[B_f]的测量，如US 9,529,003和[Huber等人Fluorescence Sensor for the Quantification of Unbound BilirubinConcentrations.Clin Chem 58：869-876，2012]中描述的。用于校准和使用具有Rm＞0的探针的方法在本文中首次在等式(1-3)(校准)和计算Bf的等式(2)中描述。

未结合的胆红素传感器用于测量有胆红素介导的毒性风险的患者的Bf，例如80％的所有新生儿，因为他们的肝功能不足以消除过量的胆红素[Bhutani等人Pre-dischargescreening for severe neonatal hyperbilirubinemia identifies infants who needphototherapy.J Pediatr 2013；162：477-82]。

未结合的胆红素传感器可用于测量溶血性疾病患者、接受油乳剂静脉内输注的患者、接受可从白蛋白中置换胆红素的药物的患者以及患有通过降低胆红素对白蛋白的结合亲和力可增加Bf的疾病例如败血症的患者中的Bf，败血症在早产新生儿中很常见并增加FFA水平[Nogueira等人Changes in plasma free fatty acid levels in septicpatients are associated with cardiac damage and reduction in heart ratevariability.Shock 29：342-348，2008和[Hegyi等人Effects of Soybean LipidInfusion on Unbound Free Fatty Acids and Unbound Bilirubin in Preterm InfantsJPediatr 2017；184：45-50]。

未结合的胆红素传感器可用于测量接受光疗、输血或其他旨在降低胆红素毒性的疗法的患者的B_f。

因为未结合胆红素而不是总胆红素是有毒的，所以可以在光疗期间监测未结合胆红素而不是总胆红素以确保未结合胆红素显著降低。尽管已显示总胆红素响应光疗会降低，但在存在胆红素置换分子(例如FFA)和某些为新生儿开具的药物时，总胆红素和未结合胆红素可能几乎完全脱钩。在这些条件下，可能需要几乎完全破坏总胆红素，以将未结合的胆红素水平降低到认为无毒的水平。因此，即使是积极治疗，总胆红素水平也需要远低于目前达到的水平[Hegyi等人Unbound free fatty acids from preterm infants treatedwith intralipid decouples unbound from total bilirubin potentially makingphototherapy ineffective.Neonatology 2013；104：184-187和Hegyi等人Effects ofSoybean Lipid Infusion on Unbound Free Fatty Acids and Unbound Bilirubin inPreterm Infants JPediatr 2017；184：45-50]。此外，过氧化物酶测定不能用于监测光疗期间未结合的胆红素，因为该测试不能区分胆红素或缀合的胆红素的光异构体和“天然”未缀合的IX-α(Z，Z)异构体。相比之下，使用本申请中描述的UBCheck传感器测量的未结合胆红素对天然未缀合的IX-α(Z，Z)异构体具有特异性。

目前用于测定未结合胆红素的唯一方法是基于胆红素的辣根过氧化物酶氧化[Jacobsen J和Wennberg RP.Determination of unbound bilirubin in the serum ofnewborns.Clin Chem 20：783，1974]。过氧化物酶测定的实施可使用FDA批准的测定(Arrows Ltd，Osaka，Japan)。由于Arrows方法的问题使准确的未结合胆红素测定复杂化，采用这种方法对黄疸新生儿进行一般筛查受到限制[Ahlfors CE.Measurement of plasmaunbound unconjugated bilirubin.Anal Biochem 279：130-135，2000；Ahlfors等人Effects of sample dilution，peroxidase concentration，and chloride ion on themeasurement of unbound bilirubin in premature newborns.Clin Biochem 40：261-267，2007]。重要的是，使用Arrows UB分析仪UA-2测量Bf需要多个相对较大的血浆或血清样品体积(20到25μL)。此外，将样品稀释52倍的Arrows测定不能确定平衡的未结合胆红素浓度，并且需要使用Arrows方法对干扰物进行校正[Ahlfors等人Effects of sampledilution，peroxidase concentration，and chloride ion on the measurement ofunbound bilirubin in premature newborns.Clinical Biochemistry 40(2007)261-267；Ahlfors等人Unbound(Free)Bilirubin：Improving the Paradigm for EvaluatingNeonatal Jaundice.Clinical Chemistry 55：71288-1299(2009)]。

本文提供的实施方案涉及用于在单个步骤中测量未结合胆红素的方法。在一些实施方案中，所述方法克服了过氧化物酶-Arrows方法的缺点。在一些实施方案中，该方法使用荧光标记的突变脂肪酸结合蛋白(未结合胆红素传感器)，其允许直接监测未稀释血液样品中的平衡未结合胆红素浓度。探针可以对未缀合胆红素的Z，Z异构体具有特异性，并以高亲和力结合Z，Z异构体胆红素。此外，未结合的胆红素传感器可能对未结合的胆红素具有高度特异性，并且对游离脂肪酸(FFA)、胆红素的光异构体、缀合的胆红素、其他代谢物和血液中存在的大多数药物没有显著响应或结合。未结合胆红素传感器可用于确定黄疸患者包括新生儿的未结合胆红素水平，以评估胆红素神经毒性的潜在风险，从而准确指导治疗以防止此类毒性的后果。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括向基于胆红素神经毒性风险的结果选择或鉴定为患有或遭受胆红素神经毒性的受试者施用治疗或疗法。在一些实施方案中，治疗或疗法是光疗、换血、静脉内免疫球蛋白治疗(IVIg)或使用胆红素抑制剂的药物治疗。在一些实施方案中，光疗治疗或疗法包括暴露于发射蓝-绿色光谱中的光的灯，其中暴露于光增加胆红素排泄。在一些实施方案中，换血包括重复抽取血液并用未受影响的血液例如来自供体的血液替换它。在一些实施方案中，IVIg治疗或疗法包括静脉内输注血液蛋白，其可以降低患有胆红素神经毒性的受试者血液中的抗体水平。其他治疗或疗法可包括例如治疗或抑制胆红素神经毒性的根本原因，包括例如治疗或抑制或改善胆管阻塞、治疗或抑制或改善感染性病因或遗传疾病例如Crigler-Najjar和吉尔伯特综合症。

实施例

在以下实施例中进一步限定实施方案。应当理解，这些实施例仅通过说明的方式给出。通过以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本文描述的实施方案的特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对实施方案进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了在本文示出和描述的那些之外，实施方案的各种修改对于本领域技术人员来说从前面的描述中将是显而易见的。这种修改也旨在落入所附权利要求的范围内。本文中阐述的每个参考文献的公开内容通过引用全部纳入本文，并用于本文引用的公开内容。

实施例1

通过野生型肠脂肪酸结合蛋白(SEQ ID NO：1)的突变产生的胆红素敏感(响应)探 针和无响应探针的序列。

来自大鼠的野生型肠脂肪酸结合蛋白(WT rIFABP)具有如SEQ ID NO：1中列出的序列。表1显示了在SEQ ID NO：1的24至98位的单个取代的半胱氨酸处标记有LICOR 700DX-马来酰亚胺的Bf敏感探针。此外，表1中列出的每个探针都有N端MGI。Bf响应性探针在SEQID NO：1的14个可接近的赖氨酸上具有14个精氨酸的取代，其是7R、16R、20R、29R、37R、46R、50R、88R、92R、94R、100R、125R、129R和130R(KR14)。KR14的序列如SEQ ID NO：2所列出的。响应性和无响应性突变体具有C末端双HIS标签接头，Arg Gly Ala Ala Ser His His HisHis His His Ser His Arg Ala Thr Pro Asn Thr Ser Pro His His His His His HisHis(C2XH11；SEQ ID NO：3)。因此，表1中列出的每个探针除了表中所示的另外的取代和添加外，还包括N末端MGI-KR14-C2XH11。

表1：Bf敏感探针

表2：无响应探针是在左侧栏中所示的半胱氨酸位置处用LICOR 800CW-马来酰亚胺标记的野生型大鼠FABP(SEQ ID NO：1)的突变。

实施例2

荧光团位置对Bf结合特性的影响和突变对无响应蛋白发射光谱的影响

表1和2中的所有用LICOR 700DX-马来酰亚胺标记的响应探针和用LICOR 800CW-马来酰亚胺探针标记的无响应探针分别对Bf具有定性相似的依赖性。探针的主要区别在于蛋白质表达、结合参数(Kd、Ro和Rm)和稳定性。不同突变蛋白和荧光团标记位置对Kd和Rm的影响表明，优选的响应探针可能是那些具有低Kd和/或低Qs(Qs＝Rm/Ro)的探针，这表明探针被胆红素结合淬灭的程度(表3)。尽管无响应者的特征不在于胆红素结合参数，但800CW-马来酰亚胺的发射光谱对可以改变LICOR 700DX-马来酰亚胺强度的特异性取代敏感。例如，在没有700DX-马来酰亚胺的情况下，许多初始无响应突变体显示700nm相对于819nm的发射随时间增加。在其中一些突变体中，700与819nm的比值在4℃下储存时从约1％增加到20％。通过适当的突变，消除了这种不稳定性。例如，表2的突变体：SEQ ID NO：1B--73C在第1天和第6天显示相同的700/819比率(1％)。

表3：荧光团位置对探针响应的影响(700DXM＝700DX-马来酰亚胺)。

探针	K<sub>d</sub>(nM)	Qs(R<sub>m</sub>/R<sub>o</sub>)
			24C-C2XH11-700DXM	44	0.14
25C-C2XH11-700DXM	12	0.27
			26C-C2XH11-700DXM	21	0.36
27C-C2XH11-700DXM	30	0.21
			29C-C2XH11-700DXM	29	0.52
30C-C2XH11-700DXM	41	0.11
			33C-C2XH11-700DXM	25	0.17
54C-C2XH11-700DXM	22	0.48
			74C-C2XH11-700DXM	16	0.15
76C-C2XH11-700DXM	14	0.04
			97C-C2XH11-700DXM	25	0.29
98C-C2XH11-700DXM	13	0.03

实施例3

胆红素响应(700nm)和无响应(800nm)探针的荧光及其比值(700/800)的变化

图1描绘了Bf传感器的强度和强度比，所述Bf传感器由胆红素响应性LICOR 700DX马来酰亚胺突变体：SEQ ID NO：2--76C探针(表1)和胆红素无响应的LICOR 800CW马来酰亚胺突变体：SEQ ID NO：1B-73C探针(表2)组成，两者均在水性缓冲液中游离，具有增加的BT(总胆红素)，在所用浓度下主要是未结合的胆红素(Bf)。在Horiba Fluorolog 2中分别以1.5nM和10nM的探针浓度测量675nm激发下的710和805nm强度。结果显示附接到胆红素敏感iLBP的LICOR 700DX马来酰亚胺强度(在710nm处测量)单调下降，而附接到无响应iLBP的LICOR 800CW马来酰亚胺缺乏强度变化(cv＝2.5％)(在805nm处测量)。插图显示了710/805比值的行为。

实施例4

通过比色皿荧光法校准游离NIR比值传感器

将由分别来自表1和2的游离于水性缓冲液中的LICOR 700DX马来酰亚胺标记的胆红素敏感iLBP(突变体：SEQ ID NO：2--76C)和LICOR 800CW马来酰亚胺无响应iLBP(突变体：SEQ ID NO：1B--73C)组成的Bf传感器，用溶解在pH 12的水性缓冲液中的Sigma胆红素(货号：B4126)原液以逐渐增加的浓度进行滴定(图2)。BT浓度由441nm处的吸光度确定。在每个胆红素浓度下，在660nm激发的荧光和在700nm和805nm发射的测量值用于确定减去背景的700与805发射的比值(R)。在滴定的每个步骤中，比色皿中的总胆红素BT是可溶的，并且是除与传感器结合的部分外的总游离胆红素。使用等式(1)对所得滴定曲线(R vs BT)(图2)进行最小二乘拟合，其中考虑了探针结合的胆红素。该程序通过确定其校准参数(Kd、Rm和Ro)来校准游离探针。在这种情况下，拟合结果产生12.4±0.4nM的Kd、0.42的Rm、3.02的Ro和0.139±0.007的Rm/Ro的Qs。

实施例5

胆红素-白蛋白(HSA)复合物的校准

为了校准Bf测试套筒，制备了一系列具有增加的高缓冲Bf浓度的水性样品。高缓冲Bf样品是这样的样品，其Bf浓度不受胆红素与套筒通道壁结合的影响，也不受与通道中干燥的胆红素探针结合的影响。与HSA结合的胆红素复合物(BR：HSA)，HSA浓度在400和1000μM之间，足以缓冲或钳制测试套筒中的Bf浓度，当胆红素壁结合可忽略不计时，Bf与校准水平保持不变。BR：HSA复合物通常以0.05至0.1的步骤以胆红素与HSA在0.1至1.0的摩尔比制备。通过向每个未稀释的复合物添加约1-20nM的实施例4中校准的游离Bf传感器，测量比色皿中每个复合物产生的Bf浓度来校准复合物。通常，Bf值随着BR：HSA从0到0.9的增加呈指数增加，其中从0.1开始，Bf从2增加到300nM(图3)。

实施例6

使用BR：HSA复合物校准测试套筒

在给定时间段内生产的大量测试套筒(例如500至2000个或更多，称为“批次”)通过随机选择足够数量的套筒来校准，以便可以将每种胆红素-白蛋白复合物应用于复制套筒。批次的单次校准需要对每个复合物至少进行三次测量，根据BR：HSA步长(step size)，测量范围为33到60个套筒。每个套筒仅用于单次测量并丢弃。每个套筒和每个复合物的测量的R值通过最小二乘法使用等式2进行拟合，以获得套筒批次的Ro、Kd和Rm。使用BR：HSA复合物进行套筒校准的实施例表明，表观Kd和Qs可能与游离探针参数相似或更大(图3)。Kd的增加可能是在干燥套筒上的探针珠时的探针与相邻表面的固定和相互作用的结果。

实施例7

一步式一次性套筒

一步式一次性套筒是本发明的基本组件。该套筒包括在添加患者血液样品和将套筒插入读取器时测量Bf所需的所有组件。新生儿早产儿体重可低至400g，因此必须使用非常小的血液体积来确定Bf。一次性套筒的最小样品体积为3.8μl。此外，由于要测量全血以及血浆、血清和其他流体，因此激发和发射光路的光路长度应尽可能小。这些考虑导致了图10A-10D和11A-11D中所示的套筒的开发。在该装置中，将样品添加到端口并填充由丙烯酸透镜形成的通道，所述透镜卡在通道中心包含胆红素传感器斑点的套筒底座上。所得通道的高度为0.1mm，宽度为2.7mm，长度为14mm，可容纳3.8μL的样品体积。

在模制中需要高耐性来保持这些尺寸。该装置的重要且新颖的组件是能够通过简单地将透明丙烯酸透镜卡扣到聚苯乙烯底座上，在干燥的Bf胆红素传感器-聚苯乙烯珠上形成密封通道(图10A-10D、11A-11D和图12)。这是通过透镜在卡入到位时在底座上建立一椭圆形凹槽来实现的，通过压在底座表面下方的挤压肋上形成密封通道。为了实现样品在胆红素传感器斑点上的快速毛细流动，丙烯酸透镜用O₂等离子体处理，其水平提高了透镜的亲水性，而不会影响其在NIR中的光学透明度。此外，聚苯乙烯底座经过紫外线辐射处理，以增加其亲水性，增强快速毛细管流动并调整传感器斑点大小。紫外线照射对于使胆红素传感器的聚苯乙烯珠紧密粘附在聚苯乙烯底座上也很重要。已显示254nm的紫外线辐射会破坏聚合物键，从而允许相反表面的聚合物链插入，这增加了表面之间的结合亲和力。[Maeda等人Adhesion and friction mechanisms of polymer-on-polymersurfaces.Science(2002)297，379-382]。来自254nm光源的照射增加了聚苯乙烯表面之间的结合亲和力。然而，粘附程度对254nm灯泡的寿命高度敏感，照射时间可超过60分钟。该应用的一项发明是发现典型的254nm灯泡也产生低水平的185nm辐射，这表明185nm辐射主要负责增加聚合物的粘附性。切换到185nm光源可将曝光时间缩短至几秒或几分钟，具体取决于照射距离。此外，在185±40nm辐照的套筒上起斑(spotting)传感器会产生更均匀的斑点几何形状。因此，在一些实施方案中，波长范围从约145nm到约225nm，例如145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220或225nm，或由上述值中的任何两个定义的范围内的波长。

与US 9,529,003中描述的完全猝灭的传感器相反，附接到套筒表面的Bf传感器不被胆红素完全猝灭。例如，US 9,529,003描述了一种胆红素探针，其具有附接到Ni-琼脂糖珠上的HIS标签和聚苯乙烯标签(PS)，固定在“一次性套筒”的孔中，尽管没有详细说明这种套筒。如US 9,529,003的图8所示，该探头的Qs(Rm/Ro)为0.02±0.03(Rm＝0)，表明Bf传感器完全淬火。本公开的有限受限猝灭(Rm＞0)使用不同的分析来确定准确的Bf水平。本文所述的分析在等式1和2中进行了数学详述，当Rm＝0时，其简化为US 9,529,003的等式2和3。

US 9,529,003描述了在微流体装置中测量全血中的Bf，其中在含有铁的聚苯乙烯珠上的Bf传感器使用磁体浓缩在多孔板的底部。这种配置对于将样品套筒密封在含有干燥剂的袋子中的一步测定法是不实用的，因此传感器必须紧密地结合到套筒表面。相反，在本公开中，制备浆液，其含有附接至聚苯乙烯珠的胆红素敏感和无响应iLBP突变体，每个都具有在半胱氨酸残基处标记的不同NIR荧光团，全部在水性缓冲液中。将小滴(＜2μl)的这种浆液分配到经过紫外线处理的套筒上，使其干燥并放入含有干燥剂的袋子中。

实施例8平衡Bf浓度的测定。

血液样品中的Bf由于胆红素与白蛋白的结合和解离而处于平衡状态。典型的白蛋白浓度在400和600μM之间，对于高亲和力位点，成人白蛋白的胆红素平衡解离常数(Kd)约为20nM。平衡时0.5的胆红素-白蛋白摩尔比产生约20nM的Bf。每个套筒中Bf传感器的估算量为2x10^-13摩尔。因此，在5μl样品中，传感器浓度为40nM。这意味着，传感器最多可以结合少于40nM的胆红素，或者约1.6x10^-4的结合500μM白蛋白的250μM总胆红素。因为Bf约为Kd*BT/蛋白，所以BT的微小变化对Bf的影响可以忽略不计。这意味着传感器对实际白蛋白缓冲Bf平衡浓度的影响可以忽略不计，因此UBCheck接近平衡Bf浓度。重要的是，对于胆红素-白蛋白复合物而言，样品未稀释以产生高度缓冲的Bf水平，该水平不受传感器结合量的干扰。用于测量血液样品中Bf的其他方法不是在平衡时的测量值。最重要的是，已经使用了45年并通过FDA批准的Arrows UB分析仪实施的过氧化物酶方法不会产生在平衡时的Bf[Jacobsen等人，Determination of unbound bilirubin in the serum ofnewborns.Clin Chem(1974)20，183]。这部分是由于FDA批准的Arrows方法中的大样品稀释因子(42到52倍)以及氧化大部分Bf的过氧化物酶方法。通过重复测量具有不同过氧化物酶浓度的样品并将过氧化物酶浓度外推至零，可以获得更接近平衡的更好的Bf估算值[Ahlfors等人，Unbound(Free)Bilirubin：Improving the Paradigm for EvaluatingNeonatal Jaundice.Clin Chem(2009)55：71288-1299]。然而，这种方法未经FDA批准，最终只能产生更好的平衡近似值。已经提出了较新的测量Bf的方法，然而该方法也不测量平衡，并获得比本发明或用过氧化物酶方法获得的结果高几个数量级的Bf浓度。[Bell等人Paper-based potentiometric sensing of free bilirubin in bloodserum.Biosensors and Bioelectronics 126(2019)115-121]。该方法通过使用过滤器和电动势将胆红素与白蛋白分离，从而破坏Bf与白蛋白的平衡。

实施例9

稀释对平衡的影响——当胆红素-白蛋白置换剂增加HSA Kd时

UBCheck最密切地测量平衡Bf并由此最接近于循环中的稳态Bf水平。胆红素：白蛋白复合物的缓冲能力的直接说明是套筒中传感器在有和没有白蛋白的情况下的响应。将浓度为100nM的游离胆红素添加到套筒中产生≤1nM，如Bf传感器检测到的，添加1000nM游离胆红素后检测到50nM Bf。游离胆红素的这种损失是由于它与定义套筒中样品通道的聚苯乙烯和丙烯酸表面结合，特别是因为样品通道的表面与体积比(20)大。

即使不与表面结合，由于胆红素-HSA反应动力学，平衡Bf浓度也取决于样品稀释度。此外，在存在白蛋白中胆红素置换剂的情况下，稀释的效果会被放大，该置换剂有效地降低了HSA对胆红素的结合亲和力。这在Bf作为摩尔比为0.1至0.5的胆红素-HSA复合物的函数的测量结果中得到说明，其中油酸以6油酸与1HSA的摩尔比添加到HSA(图4)。从550μM的HSA浓度开始，Bf浓度在稀释42倍(原始Arrows UB分析仪使用的稀释度)后降低一个数量级以上。油酸是一种有效的FFA置换剂，是脂肪乳剂的主要成分，通常为NICU的早产儿开具。

实施例10

血红蛋白/溶血对UBCheck Bf测量缺乏影响。

在将Bf响应者和无响应者探针应用于Ni-聚苯乙烯珠之后，将表4的肽添加到珠中并通过双HIS标签附接到珠的Ni-NTA。然后将组合的探针和肽珠点斑到套筒上。通过滴定掺入胆红素的新生儿血清来测试随着血红蛋白浓度的增加全血溶血产物的作用。测定血红蛋白滴定前后的Bf浓度，表明相对于零血红蛋白的Bf浓度不受血红蛋白浓度至少高达4g/l的影响(图5)。

实施例11

为新生儿处方的药物的影响

本文所述的实施方案涉及测量新生婴儿中的Bf浓度。具有高胆红素神经毒性风险的早产婴儿尤其值得关注，因为NICU婴儿经常接受药物治疗。[Hsieh等人Medication usein the neonatal intensive care unit.Am J Perinatol.(2014)31，811-822.]。表5显示特定药物，其中NICU中最常开具的药物，是白蛋白中胆红素的强大置换剂和干扰，如使用实施例7的一步式套筒测量Bf所确定的。药物的等级表明它们在NICU中的使用频率，从氨苄青霉素开始，等级1是处方最多的药物。如果药物没有作用，“置换或干扰”栏的元素为空白。置换剂是阳性的，并且显示出3倍药物浓度相对于没有药物的百分比增加。螺内酯的负值表示Bf传感器的干扰。如表5所示，几种药物是强效置换剂，其中一种是螺内酯，是唯一被发现会干扰Bf测定的NICU药物。图6显示了对Bf的影响，作为表5中那些是白蛋白中胆红素的有效置换剂的药物的处方(低、中、高和3倍高)药物浓度的函数。

表5：白蛋白中胆红素的药物置换

由这些药物引起的Bf增加可能大大超过NICU婴儿的正常上限，并且可能对他们的健康产生严重后果。此外，如实施例7所述的FFA(油酸)的效果，稀释效果极大地影响药物引起的置换程度。表6通过比较掺入胆红素和随后添加1.12和3.76mM头孢唑林的成人血清的Bf水平来说明这种效果。使用Arrows UB2分析仪(52倍稀释)和UBCheck(未稀释)测量Bf。如表6所示，UBCheck中存在1.12和3.76mM头孢唑啉的Bf比Arrows大约3倍和5倍。

表6：血清样品稀释对头孢唑啉置换胆红素的影响。

实施例12

减少缀合的胆红素的干扰

缀合的胆红素对胆红素探针的潜在干扰通过测量二牛磺酸胆红素对UBCheck准确测量Bf的能力的影响来确定。我们还将UBCheck结果与使用Arrows UB分析仪UA-2方法的测量结果进行了比较。测量是通过在新生儿血清中掺入未缀合的胆红素来产生大约10nM的Bf，然后用高达20mg/dl的二牛磺酸胆红素滴定掺入的样品进行的(图7)。在每个步骤中，Bf通过UBCheck和Arrows测量，直接(缀合的)胆红素浓度使用Sigma直接胆红素试剂盒确定。在二牛磺酸胆红素为零时，UBCheck和Arrows两者产生的Bf为10nM，但直接胆红素测量产生约0.5mg/dl的非零值(图7)。随着二牛磺酸胆红素浓度的增加，UBCheck没有变化，但Arrows从大约0.5mg/dl二牛磺酸胆红素开始增加，然后迅速增加直到4mg/dl二牛磺酸胆红素，此时Arrow的测定在Bf≥50nM时饱和。相比之下，UBCheck仅在4mg/dl二牛磺酸胆红素时开始增加，其Bf增加到约12nM，从最初的10nM水平增加20％，并且仅在20mg/dl二牛磺酸胆红素时Bf才增加到33nM。因此，UBCheck对Bf的特异性优于Arrows，即使Arrows样品被稀释52倍而UBCheck样品未稀释。

实施例13

缺乏胆红素光异构体的干扰

新生儿中的高胆红素血症最常使用蓝绿光光疗法治疗，该疗法使与白蛋白结合的胆红素光异构化。[Newman等人Neonatal Hyperbilirubinemia and Long-Term Outcome：Another Look at the Collaborative Perinatal Project.Pediatrics(1993)92，651-657.，Ennever JF.Blue light，green light，white light，more light：treatment ofneonatal jaundice.Clinics in perinatology.(1990)17，467-481.]。与天然胆红素IXa(4Z，15Z)分子相比，胆红素光异构体(4Z，15E)、(4E，15Z)和光红素更易溶解，因此更容易排出体外。光疗很容易减少Z，Z异构体，从而有效地治疗新生儿高胆红素血症。暴露于环境光下也可能产生光异构体[McDonagh等人Photoisomers：Obfuscating Factors in ClinicalPeroxidase Measurements of Unbound Bilirubin？.Pediatrics(2009)123，67-76]。如图9A和9B所示，Bf测定仅检测胆红素的Z，Z异构体，但Arrows对Z，Z和所有光异构体敏感。然而，只有Z，Z而不是光异构体是有毒的[Jasparova等人The Biological Effects ofBilirubin Photoisomers.(2016)PLoS ONE 11(2)：e0148126.doi：10.1371/journal.pone.0148126]。来自未接受光疗但HPLC分析显示大量光异构体(可能是由于血清的环境光暴露)的健康新生儿的血清样品也显示出Arrows比UBCheck Bf测定高2倍以上的Bf水平，如图9A所示。掺入胆红素的成人血清样品，然后暴露在光疗灯(Natus Neoblue)下5小时，如图9B所示。上图显示了在5小时曝光期间多次通过HPLC扫描确定的Z，Z和3种光异构体的相对强度结果。这表明Z，Z单调下降到低水平，而光异构体在大约1.5到2小时达到峰值，然后下降到零。下图显示了两个样品掺入胆红素的结果，其Bf水平在进行光疗之前通过Arrows和Bf测定分别为8和12nM。与Arrows相比，Bf测定遵循Z，Z单调下降至零，而快速上升1小时的Arrow Bf已达到其50nM的饱和水平。因此，Arrows对光异构体高度敏感。

图9B中的用光疗灯漂白血清表明，5小时后，UBCheck的Bf浓度实际上为零。此类实验允许对检测限、定量限进行定量，此外它们还证明，在缺乏胆红素的血清或血浆中，UBCheck不受任何其他含血分子的影响，包括其他疏水性代谢物，如脂肪酸、其他脂质、肽、核酸等。重要的是，光疗灯发出的光不太可能对其他血液成分造成破坏，因为婴儿的光疗治疗通常使用更长的时间(通常为24至72小时)。UBCheck不仅对光异构体不敏感，而且由于UBCheck的响应趋向于零，这表明该测定对所有天然血液代谢物不敏感，包括FFA、肽、核酸或任何其他天然血液成分。

实施例14

缺乏来自脂肪乳剂和甘油三酯的干扰

图8A-8B显示，作为甘油三酯，脂肪乳剂可以降低Bf(图8)，并且在脂解时产生未结合的FFA，该FFA可以通过从白蛋白中置换胆红素来增加Bf(图8B)。在图8A中，掺入胆红素以产生24nM的Bf的新生儿血清样品用高达10mM的甘油三酯(脂肪乳剂)滴定，这导致Bf单调下降至18nM。这些结果可能对应于不含肝素的脂肪乳剂输注。UBCheck方法可以正确监测Bf的降低，因此甘油三酯会产生胆红素槽(sink)，因此不是干扰物。图8B显示了大约100名接受脂肪乳剂输注的早产儿的结果，在存在肝素的情况下，从1g/kg/天(IL1)然后2g/kg/天(IL2)到3g/kg/天(IL3)。在每个脂肪乳剂步骤，Bf水平增加，因为未结合的FFA(FFAu)(其从白蛋白中置换胆红素)的肝素激活脂肪酶产生。这些结果与甘油三酯或FFA对Bf测量没有干扰一致。换句话说，浊度(光散射)对测定没有影响，至少由于以下原因：1)荧光的激发(660nm)和发射(700和819nm)在NIR(光散射随着波长的增加而减少)，2)套筒的光路长度为0.1mm和3)如果700/819比值受到散射的影响，它会降低比值，因为700强度会比819强度降低更多，从而降低R值，从而增加Bf而不是降低Bf，如图8A所示。相比之下，由Arrows实施的过氧化物酶方法(在460nm处进行测量)受散射影响很大，因为Arrows报告总胆红素随着脂肪乳剂水平的增加而增加。

实施例15

没有来自FFAu的干扰

脂质输注，例如在存在肝素的情况下的脂肪乳剂(Intralipid)，可产生异常高浓度的未结合FFA(FFAu)，其中大部分从白蛋白中置换胆红素(图4)。在接受浓度增加的脂肪乳剂的新生儿中，FFAu水平可增加到超过100nM[Hegyi，T.，等人，Effects of SoybeanLipid Infusion on Unbound Free Fatty Acids and Unbound Bilirubin in PretermInfants.(2017)J Pediatr 184，45-50e41]。然而，图4中的结果表明，FFA不会干扰Bf传感器，因为在油酸与白蛋白的摩尔比为6∶1时，未结合的油酸浓度大于500nM[Richieri等人Interactions of long chain fatty acids and albumin：Determination of freefatty acid levels using the fluorescent probe ADIFAB Biochemistry.327574-7580(1993)]，但只有增加胆红素与白蛋白才能通过增加Bf来影响传感器。

实施例16

掺入和未掺入胆红素的人血清/血浆中Bf的分析规格和测量。

根据CLSI指南，UBCheck测定的分析规格是用多个套筒批次和2个或更多读取器确定的。结果包括通过血清样品的完全漂白确定的空白限(LOB＝0.7nM)、检测限(LOD＝0.9nM)和定量限(LOQ＝)。使用3个读取器、3个不同的套筒批次和掺入胆红素的新生儿和成人血清样品进行了3位点精密度研究。3个读取器和套筒批次的平均值得出以下结果(UB水平以nM为单位，CV以％为单位)：4.4、9％；8.0，7％；11.4，8％；19.1，7％；38.2，8％)。

将白蛋白浓度为620μM的合并人血浆(Golden West Biologicals)掺入胆红素以产生胆红素/白蛋白摩尔比约为0至0.9的血浆样品。[Bf]的测量还使用Arrows Bf分析仪中实施的过氧化物酶方法对相同的样品进行。这些结果表明，胆红素探针的响应完全是由于与胆红素的相互作用，胆红素探针对人体血液样品中存在的其他代谢物没有响应。此外，与过氧化物酶法和胆红素-白蛋白平衡预测的一致性也表明探针产生准确的未结合胆红素浓度。

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在本申请中，单数的使用包括复数，除非另有明确说明。此外，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包含(contain)”、“包含(contains)”、“包含(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用不旨在限制。

如在本说明书和权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数引用，除非内容另有明确规定。

尽管已经在某些实施方案和实施例的上下文中描述了本公开，但是本领域技术人员将理解，本公开超出具体公开的实施方案，延伸到其他备选实施方案和/或其用途及其明显的修改和等价物。此外，虽然已经详细示出和描述了若干变型，但是基于本公开，在本公开范围内的其他修改对于本领域技术人员将是显而易见的。还设想可以进行实施方案的具体特征和方面的各种组合或亚组合并且仍然落入本公开的范围内。应当理解，所公开的实施方案的各种特征和方面可以相互组合或相互替代，以形成不同的模式或实施方案。因此，本文所述的本公开的范围意在不受上述具体公开的实施方案的限制。

然而，应该理解的是，虽然指示各种实施方案，但该详细描述仅通过说明的方式给出，因为在其精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

在本文呈现的描述中使用的术语不旨在以任何受限性或限制性方式进行解释。相反，该术语只是结合系统、方法和相关组件的实施方案的详细描述来使用。此外，实施方案可以包括几个新颖的特征，其中没有一个单独负责其期望的属性或者被认为对于实践本文描述的实施方案是必不可少的。

Claims (58)

1.用于测量样品中游离胆红素的传感器，所述传感器包含：

胆红素响应性探针，其用第一荧光团标记；和

无响应探针，其用第二荧光团标记，

其中所述第一和第二荧光团在相同波长激发，并且其中所述第一和第二荧光团在不同波长发射荧光。

2.根据权利要求1所述的传感器，其中所述胆红素响应性探针包含第一细胞内脂质结合蛋白(iLBP)，其中所述第一iLBP具有包含SEQ ID NO：1的肽序列，包含：

取代十四个可接近的赖氨酸的Arg(KR14，如SEQ ID NO：2所列出的)；

具有如SEQ ID NO：3所列出的序列的C末端双His标签接头(C2XH11)；

MGI的N末端添加；和

包括单个半胱氨酸的不超过62个氨基酸取代和添加。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的传感器，其中所述胆红素响应性探针包含表1中列出的任意一种探针的序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的传感器，其中所述无响应探针包含第二iLBP，其中所述第二iLBP具有包含SEQ ID NO：1的肽序列，包含：

位置72、73、74、126和131的取代；

在位置27、31、33、54、73、74、76或98中任一处取代为Cys；

不超过三个另外的氨基酸取代；和

具有如SEQ ID NO：3所列出的序列的C末端双His标签接头(C2XH11)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的传感器，其中所述无响应探针包含如表2中所列出的任意一种探针的序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的传感器，其中，所述第一荧光团和所述第二荧光团是不同的荧光团。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的传感器，其中，所述胆红素响应性探针包含附接所述第一荧光团的单个半胱氨酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的传感器，其中，所述无响应探针包括附接所述第二荧光团的单个半胱氨酸。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的传感器，其中，所述第一荧光团是附接到半胱氨酸取代的LICOR 700DX马来酰亚胺或LICOR 800CW马来酰亚胺。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的传感器，其中所述胆红素响应性探针被配置为结合胆红素的未缀合的IX-α(Z，Z)异构体。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的传感器，其中，所述胆红素响应性探针被配置为与缀合的胆红素最低限度地结合(低于4mg/d1)。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的传感器，其中所述胆红素响应性探针被配置为不结合胆红素的Z，E或E，Z光异构体、光红素、脂肪酸、任何其他天然存在的血液成分和/或新生儿药物。

13.根据权利要求12所述的传感器，其中，所述新生儿药物不是螺内酯。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的传感器，其中，所述无响应探针不与胆红素的未缀合的IX-α(Z，Z)异构体或缀合的胆红素结合。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的传感器，其中所述无响应探针被配置为不与胆红素的Z，E或E，Z光异构体、光红素、脂肪酸、任何其他天然存在的血液成分和/或新生儿药物结合。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的传感器，其中，当所述第一荧光团为LICOR700DX马来酰亚胺时，所述第二荧光团为附接至半胱氨酸取代的LICOR 800CW马来酰亚胺，和当所述第一荧光团为LICOR 800CW马来酰亚胺时，所述第二荧光团为LICOR 700DX马来酰亚胺。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的传感器，其中所述第一荧光团或所述第二荧光团附接至半胱氨酸取代并且其中所述半胱氨酸取代在SEQ ID NO：1的位置22、24、25、26、27、29、30、33、54、74、76、97或98处。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的传感器，其中，所述第一荧光团或所述第二荧光团的发射强度不受选自胆红素和血红蛋白的血液成分的吸光度的影响。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的传感器，其中所述胆红素响应性探针或所述无响应探针还包含至少一个接头。

20.组合物，其包含权利要求1-19中任一项所述的传感器。

21.包含游离胆红素(Bf)传感器的组合物，其中所述Bf传感器包含：

第一细胞内脂质结合蛋白(iLBP)，其结合胆红素并用第一荧光团标记；和

第二iLBP，其不结合胆红素并用第二荧光团标记，其中所述第二荧光团不附接至所述第一iLBP，其中所述第一荧光团和所述第二荧光团在相同的波长激发，其中所述第一荧光团和所述第二荧光团的发射波长不同，并且其中所述第二荧光团在胆红素存在下不改变其发射。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述第一荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺和所述第二荧光团是LICOR 800CW马来酰亚胺，或者其中所述第一荧光团是LICOR 800CW马来酰亚胺和所述第二荧光团是LICOR 700DX马来酰亚胺。

23.根据权利要求21-22中任一项所述的组合物，其中在两个不同波长测量荧光指数比值的变化并用于确定未结合胆红素的浓度。

24.根据权利要求21-23中任一项所述的组合物，其中所述第一荧光团或所述第二荧光团的发射强度不受选自胆红素和血红蛋白的血液成分的吸光度的影响。

25.固体基板，其包含根据权利要求1-19中任一项所述的传感器或根据权利要求20-24中任一项所述的组合物，其中所述胆红素响应性探针和/或所述无响应探针附接至所述固体基板。

26.根据权利要求25所述的固体基板，其中所述固体基板是Ni-聚苯乙烯、Ni-胶乳或Ni-琼脂糖珠。

27.根据权利要求26所述的固体基板，其中所述Ni-聚苯乙烯、Ni-胶乳或Ni-琼脂糖珠包含铁。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的固体基板，其中所述胆红素响应性探针或所述无响应探针包含如SEQ ID NO：3所列出的取代7R 16R 20R 29R 37R 46R 50R 88R 92R 94R100R 125R 129R和130R(KR14)。

29.根据权利要求25-28中任一项所述的固体基板，其中所述胆红素响应性探针和/或所述无响应探针包含标签并且所述固体基板包含所述标签的受体。

30.根据权利要求29所述的固体基板，其中所述标签包括His-标签、生物素、Flag-表位、c-myc表位、HA-标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合结构域(CBD)、硫氧还蛋白、β-半乳糖苷酶、VSV-糖蛋白、钙调蛋白结合蛋白、聚苯乙烯(PS)疏水标签或金属亲和标签中的一种或多种。

31.根据权利要求29-30中任一项所述的固体基板，其中所述标签是聚组氨酸标签和所述固体基板包含固定化金属螯合物。

32.根据权利要求25-31中任一项所述的固体基板，其中所述第一荧光团附接至所述胆红素响应性探针上的半胱氨酸残基。

33.根据权利要求25-32中任一项所述的固体基板，其中所述第二荧光团附接至所述无响应探针上的半胱氨酸残基。

34.校准胆红素传感器以确定Kd和Rm的方法，其包括：

将根据权利要求1-19中任一项所述的传感器与已知浓度的胆红素(BT)的水性样品混合；

测量荧光；和

通过用等式(1)拟合从测量的荧光中确定校准参数：

其中R是测量的荧光比((I_λ1/I_λ2)，I_λ1是来自第一荧光团在波长λ1处的减去来自样品的背景的荧光强度，I_λ2是来自第二荧光团在波长λ2处的减去来自样品的背景的荧光强度，R_o是不存在胆红素时的比值，BT是总胆红素浓度，PT是探针浓度，r是不存在第二荧光团时胆红素探针荧光团的I_λ2/I_λ1比值，Kd是胆红素探针的平衡解离常数，和Rm是外推到无限BT的比值R。

35.测量样品中游离胆红素[Bf]浓度的方法，其包括：

任选地，测量所述样品的基线荧光；

将所述样品施加到根据权利要求1-19中任一项所述的传感器；

测量样品荧光；

任选地，从所述样品荧光中减去所述基线荧光以获得测量的荧光；和

从所述测量的荧光中确定[Bf]的浓度。

36.根据权利要求35所述的方法，其中等式(1)用于校准所述传感器，并且等式(2)

用于确定[Bf]，

其中R是测量的荧光比((I_λ1/I_λ2)，I_λ1是来自第一荧光团在波长λ1处的荧光强度，I_λ2是来自第二荧光团在波长λ2处的荧光强度，R_o是不存在胆红素时的比值，r是不存在第二荧光团时探针的I_λ2/I_λ1比值，K_d是解离常数，Rm是∞Bf时的最小R值，和Rm是在探针的胆红素饱和的R。

37.根据权利要求35-36中任一项所述的方法，其中，将所述样品与用于所述胆红素的一种或多种载体大分子混合。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述一种或多种载体大分子包括白蛋白、脂质结合蛋白、脂质囊泡或环糊精。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的方法，其中所述传感器附接到固体支持物。

40.根据权利要求35-39中任一项所述的方法，其中所述Bf浓度使用一次性微流体装置来确定，所述装置任选地允许测量未稀释的血液样品。

41.根据权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述样品来自人、动物或植物。

42.根据权利要求35-41中任一项所述的方法，其中所述样品是全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴。

43.根据权利要求35-42中任一项所述的方法，其中所述样品来自接受静脉内输注油乳剂的患者。

44.根据权利要求35-43中任一项所述的方法，其中所述样品来自正在接受从白蛋白中置换胆红素的药物的患者和/或可能正由输注的油乳剂、疾病或应激中产生从白蛋白置换胆红素的分子的这样的患者。

45.根据权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述样品来自正在接受光疗、输血或其他降低胆红素水平的疗法的患者。

46.根据权利要求35-45中任一项所述的方法，其中Ro通过对所述样品进行光漂白从而获得零水平测量值而获得。

47.套筒，其包括：

底座；

透镜，其被配置为联接到底座，并且包括用于接收样品的样品端口；和

基板，所述基板具有固定于其上的胆红素响应性探针、无响应探针和抗血红蛋白肽，

其中，所述底座用波长范围为约145nm至约225nm的UV光处理，从而光处理聚苯乙烯聚合物链以连接到所述基板的聚合物链上。

48.根据权利要求47所述的套筒，其中，所述底座是聚苯乙烯底座。

49.根据权利要求47-48中任一项所述的套筒，其中，所述底座包括具有深色的材料，所述材料被配置为降低660nm处激发光的反射强度。

50.根据权利要求47-49中任一项所述的套筒，其中，所述透镜是丙烯酸透镜。

51.根据权利要求47-50中任一项所述的套筒，其中，所述透镜用O₂等离子体处理。

52.根据权利要求47-51中任一项所述的套筒，其中将所述透镜联接到所述聚苯乙烯底座形成深度为约0.1mm或更小的通道，并且密封所述套筒。

53.根据权利要求47-52中任一项所述的套筒，其中，所述样品是全血、血浆、血清、尿液、CSF、唾液、胃液、组织液或淋巴。

54.根据权利要求47-53中任一项所述的套筒，其中，所述样品是未稀释的样品。

55.根据权利要求47-54中任一项所述的套筒，其中，所述套筒被配置为测量平衡时的胆红素。

56.根据权利要求47-55中任一项所述的套筒，其中，所述套筒通过胆红素标准品的可追溯性来校准。

57.根据权利要求56所述的套筒，其中所述胆红素标准品是用于校准探针的市售胆红素，其中所述探针用于校准校准复合物，并且其中所述校准复合物用于校准所述套筒。

58.试剂盒，其包括：

用于从患者采集样品的一种或多种采集装置，

根据权利要求1-19中任一项所述的传感器或根据权利要求20-24中任一项所述的组合物，所述组合物包含在合适载体中的一个或多个探针，和

任选地，一种或多种参考标准，其包含低于和/或高于医学决定水平的已知浓度的未结合胆红素。

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