JP6847141B2 - 非結合ビリルビンの蛍光プローブの開発および使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる、２０１１年８月２６日に出願された米
国仮出願第６１／５２７，８４９号に対する優先権を主張する。

連邦政府により援助されるＲ＆Ｄに関する言明
この研究は、米国国立衛生研究所からのＲｏａｄｍａｐ助成金第Ｒ３３ＤＫ０７０３１
４号およびＳＢＩＲ助成金第Ｒ４４ＤＫ０７３５３５号により部分的に支援された。結果
として、米国連邦政府は、本発明に対して一定の権利を有しうる。

配列表への言及
配列表は、本明細書の末尾に含まれる。

（発明の分野）
本発明の分野は、ビリルビンに結合すると蛍光の変化を起こす蛍光標識されたタンパク
質であり、非結合ビリルビンのレベルを測定するのに用いられる、非結合ビリルビンのプ
ローブの同定および使用に関する。これらのプローブは、非結合ビリルビンレベルが決定
される体液中に一般に存在する他の解析物の存在下で著しく結合せず、または著しい蛍光
の変化を起こさない。これらの非結合ビリルビンのプローブを、高ビリルビン血症および
高ビリルビン血症を結果としてもたらす疾患の診断および処置において用いることができ
る。

（発明の背景）
ビリルビンとは、ヘモグロビンの代謝回転の産物であって、水中の可溶性が低く、した
がって、血漿中では大部分がアルブミンと会合している。しかし、総血漿ビリルビンの小
さな画分は、水相中で可溶性である。この非結合画分または遊離画分は、血液脳関門を高
レベルで透過することが可能であり、神経毒性である［Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、Ｗｅｎｎ
ｂｅｒｇ ＲＰ、Ｏｓｔｒｏｗ ＪＤ、およびＴｉｒｉｂｅｌｌｉ Ｃ、「Ｕｎｂｏｕｎ
ｄ （ｆｒｅｅ） ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇ
ｍ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｎｅｏｎａｔａｌ ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｃｌｉｎ
Ｃｈｅｍ、５５：１２８８〜１２９９、２００９］。正常な条件下では、総血清ビリル
ビンが、ビリルビンの産生と排出との間で調節されるバランスにより、低レベルで維持さ
れる。しかし、新生児では、調節機構が十分に成熟していない可能性があるために、産生
−排出バランスが、蓄積に好適となることが多く、新生児のうちの約６０％において黄疸
の黄色をもたらす［Ｍａｉｓｅｌｓ ＭＪおよびＭｃＤｏｎａｇｈ ＡＦ、「Ｐｈｏｔｏ
ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｅｏｎａｔａｌ ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ
Ｍｅｄ、３５８：９２０〜９２８、２００８］。大半の場合、このバランスの失調は良性
であるか、または、実のところ有益な場合もあり、大半の新生児では、自発的に消散する
［Ｗｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、Ｂｈｕｔａｎｉ ＶＫ、Ｊｏｈｎｓ
ｏｎ ＬＨ、およびＳｈａｐｉｒｏ ＳＭ、「Ｔｏｗａｒｄ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎ
ｇ ｋｅｒｎｉｃｔｅｒｕｓ：ａ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ
ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｊａｕｎｄｉｃｅｄ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｐｅｄｉａ
ｔｒｉｃｓ、１１７： ４７４〜４８５、２００６；Ｇｏｐｉｎａｔｈａｎ Ｖ、Ｍｉｌ
ｌｅｒ ＮＪ、Ｍｉｌｎｅｒ ＡＤ、およびＲｉｃｅ−Ｅｖａｎｓ ＣＡ、「Ｂｉｌｉｒ
ｕｂｉｎ ａｎｄ ａｓｃｏｒｂａｔｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ
ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｌａｓｍａ」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、３４９：１９７〜２０
０、１９９４］。しかし、非結合ビリルビン濃度は、神経毒性となるレベルまで上昇する
可能性があり、可逆性の難聴から、核黄疸のより重度の神経学的後遺症であって、稀な場
合には死亡が含まれる後遺症にわたる欠損が結果としてもたらされる［Ａｈｌｆｏｒｓ
ＣＥ、Ｗｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、Ｏｓｔｒｏｗ ＪＤ、およびＴｉｒｉｂｅｌｌｉ Ｃ、
「Ｕｎｂｏｕｎｄ （ｆｒｅｅ） ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ
ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｎｅｏｎａｔａｌ ｊａｕｎｄｉｃ
ｅ」、Ｃｌｉｎ ｈｅｍ、５５： １２８８〜１２９９、２００９］。

光線療法または交換輸血を用いる早期の介入により、新生児におけるビリルビンを媒介
する神経毒性を処置することができる［Ｍａｉｓｅｌｓ ＭＪおよびＭｃＤｏｎａｇｈ
ＡＦ、「Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｅｏｎａｔａｌ ｊａｕｎｄｉｃｅ」、
Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５８：９２０〜９２８、２００８；Ｍｏｒｒｉｓ ＢＨ、
Ｏｈ Ｗ、Ｔｙｓｏｎ ＪＥ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＤＫ、Ｐｈｅｌｐｓ ＤＬ、Ｏ’Ｓ
ｈｅａ ＴＭ、ＭｃＤａｖｉｄ Ｅ、Ｐｅｒｒｉｔｔ ＲＬ、Ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ＫＰ
、Ｖｏｈｒ ＢＲ、Ｇｒｉｓｂｙ Ｃ、Ｙａｏ Ｑ、Ｐｅｄｒｏｚａ Ｃ、Ｄａｓ Ａ、
Ｐｏｏｌｅ ＷＫ、Ｃａｒｌｏ ＷＡ、Ｄｕａｒａ Ｓ、Ｌａｐｔｏｏｋ ＡＲ、Ｓａｌ
ｈａｂ ＷＡ、Ｓｈａｎｋａｒａｎ Ｓ、Ｐｏｉｎｄｅｘｔｅｒ ＢＢ、Ｆａｎａｒｏｆ
ｆ ＡＡ、Ｗａｌｓｈ ＭＣ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ＭＲ、Ｓｔｏｌｌ ＢＪ、Ｃｏｔｔ
ｅｎ ＣＭ、Ｄｏｎｏｖａｎ ＥＦ、Ｅｈｒｅｎｋｒａｎｚ ＲＡ、Ｇｕｉｌｌｅｔ Ｒ
、およびＨｉｇｇｉｎｓ ＲＤ、「Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｖｓ． ｃｏｎｓｅｒｖａｔ
ｉｖｅ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒｅｍ
ｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ」、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５９：１
８８５〜１８９６、２００８；Ｋｕｚｎｉｅｗｉｃｚ ＭＷ、Ｅｓｃｏｂａｒ ＧＪ、お
よびＮｅｗｍａｎ ＴＢ、「Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｉｌｉｒｕｂ
ｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｎ ｓｅｖｅｒｅ ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉ
ａ ａｎｄ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｅ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２４：１
０３１〜１０３９、２００９］。介入のためのガイドラインは、妊娠期間および危険性因
子を考慮に入れながらも、総ビリルビンレベルに主に依存している［Ｂｈｕｔａｎｉ Ｖ
Ｋ、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｌ、およびＳｉｖｉｅｒｉ ＥＭ、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｂ
ｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｒｅｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｈｏｕｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅ
ｒｕｍ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｆｏｒ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎ
ｔ ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｔｅｒｍ ａｎｄ
ｎｅａｒ−ｔｅｒｍ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１０３：６〜１４
、１９９９］。しかし、根底的な生化学的証拠および増大しつつある臨床的証拠からは、
総ビリルビンではなく、非結合ビリルビンが、ビリルビンを媒介する神経毒性とより正確
に相関することが予測される［Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、Ｗｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、Ｏｓｔ
ｒｏｗ ＪＤ、およびＴｉｒｉｂｅｌｌｉ Ｃ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ （ｆｒｅｅ） ｂｉ
ｌｉｒｕｂｉｎ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｖａｌ
ｕａｔｉｎｇ ｎｅｏｎａｔａｌ ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、５５：１
２８８〜１２９９、２００９；Ｗｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、および
Ａｒａｖｋｉｎ ＡＹ、「Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ
ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎｅｍｉａ：ａｎ ｅｖｉｄｅｎｃｅ
ｂａｓｅｄ ｑｕａｇｍｉｒｅ」、Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ、１５ ：２９３９〜
２９４５、２００９；Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、Ａｍｉｎ ＳＢ、およびＰａｒｋｅｒ
ＡＥ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ａｂｎｏｒｍａｌ
ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｕｄｉｔｏｒｙ ｂｒａｉｎｓｔｅｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ
ａ ｄｉｖｅｒｓｅ ｎｅｗｂｏｒｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ」、Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔ
ｏｌ、２９：３０５〜３０９、２００９；Ｏｈ Ｗ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＤＫ、Ｔｙｓ
ｏｎ ＪＥ、Ｍｏｒｒｉｓ ＢＨ、Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、Ｂｅｎｄｅｒ ＧＪ、Ｗｏｎ
ｇ ＲＪ、Ｐｅｒｒｉｔｔ Ｒ、Ｖｏｈｒ ＢＲ、Ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ＫＰ、Ｖｒｅｍ
ａｎ ＨＪ、Ｄａｓ Ａ、Ｐｈｅｌｐｓ Ｌ、Ｏ’Ｓｈｅａ ＴＭ、およびＨｉｇｇｉ
ｎｓ ＲＤ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｎ ｔ
ｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａｓｍａ ｔｏｔａｌ ａｎｄ
ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｎ
ｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ
ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎｆａｎｔｓ」、Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ、
９９：６７３〜６７８、２０１０］。したがって、ビリルビンの神経毒性に対する危険性
がある新生児を同定するためには、非結合ビリルビンが総ビリルビンより優れている［Ａ
ｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｎｅｕｒｏｔｏｘ
ｉｃｉｔｙ ｉｎ ｊａｕｎｄｉｃｅｄ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐ
ｅｄｉａｔｒ、２２：１２９〜１３３、２０１０］。

早産児における侵襲的光線療法は、総ビリルビンを５ｍｇ／ｄＬより低く維持するよう
にデザインされる［Ｍｏｒｒｉｓ ＢＨ、Ｏｈ Ｗ、Ｔｙｓｏｎ ＪＥ、Ｓｔｅｖｅｎｓ
ｏｎ ＤＫ、Ｐｈｅｌｐｓ ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ ＴＭ、ＭｃＤａｖｉｄ ＧＥ、Ｐｅｒ
ｒｉｔｔ ＲＬ、Ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ＫＰ、Ｖｏｈｒ ＢＲ、Ｇｒｉｓｂｙ Ｃ、Ｙａ
ｏ Ｑ、Ｐｅｄｒｏｚａ Ｃ、Ｄａｓ Ａ、Ｐｏｏｌｅ ＷＫ、Ｃａｒｌｏ ＷＡ、Ｄｕ
ａｒａ Ｓ、Ｌａｐｔｏｏｋ ＡＲ、Ｓａｌｈａｂ ＷＡ、Ｓｈａｎｋａｒａｎ Ｓ、Ｐ
ｏｉｎｄｅｘｔｅｒ ＢＢ、Ｆａｎａｒｏｆｆ ＡＡ、Ｗａｌｓｈ ＭＣ、Ｒａｓｍｕｓ
ｓｅｎ ＭＲ、Ｓｔｏｌｌ ＢＪ、Ｃｏｔｔｅｎ ＣＭ、Ｄｏｎｏｖａｎ ＥＦ、Ｅｈｒ
ｅｎｋｒａｎｚ ＲＡ、Ｇｕｉｌｌｅｔ Ｒ、およびＨｉｇｇｉｎｓ ＲＤ、「Ａｇｇｒ
ｅｓｓｉｖｅ ｖｓ． ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ
ｉｎｆａｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ
」、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５９：１８８５〜１８９６、２００８］。しかし、Ｍ
ｏｒｒｉｓらは、総ビリルビンを５ｍｇ／ｄＬ未満に維持するように処置された患者と、
８ｍｇ／ｄＬ未満に維持された患者とで、転帰（死亡および神経発達障害）の差違を見出
さなかった。しかし、これらの研究者による追跡研究からは、転帰が、非結合ビリルビン
とは十分に相関するが、総ビリルビンとは相関しないことが見出された［Ｏｈ Ｗ、Ｓｔ
ｅｖｅｎｓｏｎ ＤＫ、Ｔｙｓｏｎ ＪＥ、Ｍｏｒｒｉｓ ＢＨ、Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ
、Ｂｅｎｄｅｒ ＧＪ、Ｗｏｎｇ ＲＪ、Ｐｅｒｒｉｔｔ Ｒ、Ｖｏｈｒ ＢＲ、Ｖａｎ
Ｍｅｕｒｓ ＫＰ、Ｖｒｅｍａｎ ＨＪ、Ｄａｓ Ａ、Ｐｈｅｌｐｓ ＤＬ、Ｏ’Ｓｈ
ｅａ ＴＭ、およびＨｉｇｇｉｎｓ ＲＤ、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ ｓｔａｔｕｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｌａ
ｓｍａ ｔｏｔａｌ ａｎｄ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ａｎｄ ｄｅａｔ
ｈ ｏｒ ａｄｖｅｒｓｅ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ
ｉｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎｆａｎｔｓ」、
Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒ、９９：６７３〜６７８、２０１０］。これは、総ビリルビ
ンレベルが、ビリルビンの毒性画分である非結合ビリルビンと連動していなかったために
、光線療法をいつ送達するかを決定するために総ビリルビンを用いれば、誤解を招きかね
なかったことを示唆する。総ビリルビンと非結合ビリルビンとを切り離すことは、ビリル
ビンのアルブミンへの結合に著しく干渉する分子の存在から生じうる。例えば、総ビリル
ビンが１ｍｇ／ｄＬという低量であっても、干渉分子により総ビリルビンのうちのわずか
０．２％が置換されれば、非結合ビリルビン＝３４ｎＭが結果としてもたらされるであろ
う。これは、正期産児に毒性であると考えられる非結合ビリルビンレベルを超える非結合
ビリルビンレベルであり、一般に、はるかに低い非結合ビリルビンレベルでも、Ｍｏｒｒ
ｉｓら［Ｍｏｒｒｉｓ ＢＨ、Ｏｈ Ｗ、Ｔｙｓｏｎ ＪＥ、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＤＫ
、Ｐｈｅｌｐｓ ＤＬ、Ｏ’Ｓｈｅａ ＴＭ、ＭｃＤａｖｉｄ ＧＥ、Ｐｅｒｒｉｔｔ
ＲＬ、Ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ＫＰ、Ｖｏｈｒ ＢＲ、Ｇｒｉｓｂｙ Ｃ、Ｙａｏ Ｑ、Ｐ
ｅｄｒｏｚａ Ｃ、Ｄａｓ Ａ、Ｐｏｏｌｅ ＷＫ、Ｃａｒｌｏ ＷＡ、Ｄｕａｒａ Ｓ
、Ｌａｐｔｏｏｋ ＡＲ、Ｓａｌｈａｂ ＷＡ、Ｓｈａｎｋａｒａｎ Ｓ、Ｐｏｉｎｄｅ
ｘｔｅｒ ＢＢ、Ｆａｎａｒｏｆｆ ＡＡ、Ｗａｌｓｈ ＭＣ、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ Ｍ
Ｒ、Ｓｔｏｌｌ ＢＪ、Ｃｏｔｔｅｎ ＣＭ、Ｄｏｎｏｖａｎ ＥＦ、Ｅｈｒｅｎｋｒａ
ｎｚ ＲＡ、Ｇｕｉｌｌｅｔ Ｒ、およびＨｉｇｇｉｎｓ ＲＤ、「Ａｇｇｒｅｓｓｉｖ
ｅ ｖｓ． ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｉｎｆａ
ｎｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ」、Ｎ Ｅ
ｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５９：１８８５〜１８９６、２００８］による試験における早産
児などの早産児には毒性であろうと考えられる。

多くの薬物および代謝物は、アルブミンに結合することが可能であり、結果として、ビ
リルビンは、そのアルブミンへの結合状態から排除され、これにより、総ビリルビン濃度
が上昇するのであれ、しないのであれ、非結合ビリルビン濃度は上昇する［Ｓｐｅａｒ
ＭＬ、Ｓｔａｈｌ ＧＥ、Ｐａｕｌ ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ ＧＲ、
およびＰｏｌｉｎ ＲＡ、「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １５−ｈｏｕｒ ｆａｔ ｉ
ｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅ
ｒａｌ Ｎｕｔｒ、９：１４４〜１４７、１９８５；Ａｍｉｎ ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ
ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎ
ｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、３４：４１４〜４２０、２０１０］。とりわけ、重要なビリルビ
ン置換代謝物は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）である。ＦＦＡは常に存在するが、低レベルで維
持され、健常な正期産児に対しては著しい影響を及ぼさない。

しかし、例えば、敗血症に起因するストレス条件下では、ＦＦＡレベルが著しく上昇し
うる［Ｎｏｇｕｅｉｒａ ＡＣ、Ｋａｗａｂａｔａ Ｖ、Ｂｉｓｅｌｌｉ Ｐ、Ｌｉｎｓ
ＭＨ、Ｖａｌｅｒｉ Ｃ、Ｓｅｃｋｌｅｒ Ｍ、Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｗ、Ｊｕｎｉｏｒ
ＬＧ、Ｂｅｒｎｉｋ ＭＭ、ｄｅ Ａｎｄｒａｄｅ Ｍａｃｈａｄｏ ＪＢ、Ｍａｒｔｉ
ｎｅｚ ＭＢ、Ｌｏｔｕｆｏ ＰＡ、Ｃａｌｄｉｎｉ ＥＧ、Ｍａｒｔｉｎｓ Ｅ、Ｃｕ
ｒｉ Ｒ、およびＳｏｒｉａｎｏ ＦＧ、「Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｆｒ
ｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｅｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ
ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉａｃ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｒ
ｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ」、Ｓｈｏｃ
ｋ、２９：３４２〜３４８、２００８］。疾患およびストレスに加えて、ＮＩＣＵ内の早
産児は、非経口栄養法により、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）などの油エマルジョン
を施される結果として、ＦＦＡレベルの極度に大きな上昇をもたらしうる［Ｓｐｅａｒ
ＭＬ、Ｓｔａｈｌ ＧＥ、Ｐａｕｌ ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ ＧＲ、
およびＰｏｌｉｎ ＲＡ、「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １５−ｈｏｕｒ ｆａｔ ｉ
ｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅ
ｒａｌ Ｎｕｔｒ、９：１４４〜１４７、１９８５；Ａｍｉｎ ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ
ｏｆ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ
ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎ
ｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、３４：４１４〜４２０、２０１０］。ＦＦＡは、アルブミンに、
ビリルビンと同様の高アフィニティーで結合する。

ビリルビンと異なり、ＦＦＡは、複数の高アフィニティー結合部位を有するので、アル
ブミンへの結合部位のうちのかなりの部分がＦＦＡにより占有される場合に限り、ビリル
ビン置換が著しいものとなる［Ｓｐｅａｒ ＭＬ、Ｓｔａｈｌ ＧＥ、Ｐａｕｌ ＭＨ、
Ｅｇｌｅｒ ＪＭ、Ｐｅｒｅｉｒａ ＧＲ、およびＰｏｌｉｎ ＲＡ、「Ｔｈｅ ｅｆｆ
ｅｃｔ ｏｆ １５−ｈｏｕｒ ｆａｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ
ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｌｂｕｍｉｎ」、
ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、９：１４４〜１４７、１
９８５；Ａｍｉｎ ＳＢ、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ
ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ−ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎ
ｄ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ
」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、３４：４１４〜４２
０、２０１０］。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）を施されているいずれの新生児が十
分に大きな量のＦＦＡをもたらすのかは、それが、妊娠期間に依存し、おそらくは、酵素
活性、脂肪症、および他の因子などの要因に依存するために、容易に予測することはでき
ない［Ｓｐｅａｒ ＭＬ、Ｓｔａｈｌ ＧＥ、Ｐａｕｌ ＭＨ、Ｅｇｌｅｒ ＪＭ、Ｐｅ
ｒｅｉｒａ ＧＲ、およびＰｏｌｉｎ ＲＡ、「Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １５−ｈ
ｏｕｒ ｆａｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｙｉｎｇ ｄｏｓａｇｅ ｏｎ ｂ
ｉｌｉｒｕｂｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｌｂｕｍｉｎ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒｅ
ｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、９：１４４〜１４７、１９８５；Ａｍｉｎ ＳＢ
、「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉ
ｎ−ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂ
ｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａ
ｒｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、３４：４１４〜４２０、２０１０］。高ＦＦ
Ａｕレベルは、免疫抑制、心損傷、および心拍変動の低減、ならびに非結合ビリルビンレ
ベルの上昇を引き起こしうるために、脂質注入時におけるＦＦＡの非結合濃度（ＦＦＡｕ
）をモニタリングすることはきわめて重要である。加えて、これらの代謝物の非結合レベ
ルは、多くの患者特異的因子に依存するために、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の注
入時における非結合ビリルビンの直接的モニタリングだけで、ビリルビンの神経毒性に対
する危険性がある乳児を同定することができる。これは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商
標）濃度の上昇によりＦＦＡの血漿レベルが上昇すると、総ビリルビン濃度を変化させる
ことなく、非結合ビリルビン濃度が上昇するために、特にビリルビンについて当てはまる
。

細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）とは、低分子量単鎖ポリペプチドのファミリー
である。４つのサブファミリーが認知されている。サブファミリーＩは、レチノイン酸お
よびレチノールなど、ビタミンＡ誘導体に特異的なタンパク質を含有する。サブファミリ
ーＩＩは、胆汁酸、エイコサノイド（ｅｉｃｏｎｓａｎｏｉｄｓ）、およびヘムに対して
特異的なタンパク質を含有する。サブファミリーＩＩＩは、腸型脂肪酸結合タンパク質（
ＦＡＢＰ）を含有し、サブファミリーＩＶは、ビリルビンに低いアフィニティーで結合す
るＦＡＢＰ［Ｄｉ Ｐｉｅｔｒｏ ＳＭおよびＳａｎｔｏｍｅ ＪＡ、「Ｉｓｏｌａｔｉ
ｏｎ， ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１
４７８：１８６〜２００、２０００］を含めた、他の全ての種類の脂肪酸結合タンパク質
を含有する［Ｈａｕｎｅｒｌａｎｄ ＮＨおよびＳｐｅｎｅｒ Ｆ、「Ｆａｔｔｙ ａｃ
ｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｔｉ
ｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ」、Ｐｒｏｇ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、４３：３２８〜３
４９、２００４］。ファミリーの全体は、共通の三次元折り畳み構造を特徴とする。異な
るサブファミリーのリガンド結合特性は、大幅に重なり合う。

サブファミリーＩの野生型のタンパク質［Ｒｉｃｈｉｅｒｉ ＧＶ、Ｏｇａｔａ ＲＴ
、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ＡＷ、Ｖｅｅｒｋａｍｐ ＪＨ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ Ａ
Ｍ、「Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓｈｏｗ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ
ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９
：７１９７〜７２０４、２０００］およびサブファミリーＩＩの野生型のタンパク質のい
ずれも、脂肪酸のほか、それらの天然のリガンドにも結合する。さらに、単一のアミノ酸
置換により、サブファミリーＩおよびＩＩのタンパク質のリガンド結合特性を相互転換す
ることが可能である［Ｊａｋｏｂｙ ＭＧ、Ｍｉｌｌｅｒ ＫＲ、Ｔｏｎｅｒ ＪＪ、Ｂ
ａｕｍａｎ Ａ、Ｃｈｅｎｇ Ｌ、Ｌｉ Ｅ、およびＣｉｓｔｏｌａ ＤＰ、「Ｌｉｇａ
ｎｄ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｇｏ
ｖｅｒｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｒｅｔｉｎｏｌ− ａｎｄ ｆａｔ
ｔｙ ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３
２：８７２〜８７８、１９９３］。

参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，４７０，７１４号（特許文献１）、
Ｕ．Ｓ．６，４４４，４３２、ＵＳ７，６０１，５１０、および米国特許出願公開第２０
１０／０２９８１６２号（特許文献２）は、プローブを生成させるための方法および非結
合解析物を決定するためのプローブについて記載している。これらのプローブは、ｉＬＢ
Ｐファミリー由来の天然形態または突然変異体形態のタンパク質を用いて構築された。上
記で論じた通り、このファミリーは、ＦＡＢＰを含む［Ｂａｎａｓｚａｋ Ｌ、Ｗｉｎｔ
ｅｒ Ｎ、Ｘｕ Ｚ、Ｂｅｒｎｌｏｈｒ ＤＡ、Ｃｏｗａｎ Ｓ、およびＪｏｎｅｓ Ｔ
Ａ、「Ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｆａ
ｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎｄ ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
」、Ａｄｖ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ、４５：８９〜１５１、１９９４；Ｂｅｒｎｌｏ
ｈｒ ＤＡ、Ｓｉｍｐｓｏｎ ＭＡ、Ｈｅｒｔｚｅｌ ＡＶ、およびＢａｎａｓｚａｋ
ＬＪ、「Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｇｅｎｅｓ」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｕｔｒ、１７：２７７〜３
０３、１９９７］。ＦＡＢＰとは、分子量約１５ｋＤａの細胞内タンパク質であり、野生
型のタンパク質中に、１つまたは２つのＦＦＡのほか、他の代謝物に結合する結合部位を
有する。

米国特許第５４７０７１４号明細書 米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号

本発明の目的は、非結合ビリルビンの蛍光プローブおよびその使用方法を提供すること
にある。

本発明の実施形態は、非結合ビリルビンに高度に特異的なプローブの同定、および単純
な水溶液からヒト体液（血液、ＣＳＦ、尿、間質液）を含めた複雑な生物学的試料にわた
る試料中の非結合ビリルビン濃度を決定するのにこれらのプローブを用いるための方法で
あって、以下のステップ：
ＵＳ７，６０１，５１０および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号の方法
、ならびに第２の遊離フルオロフォアまたは、例えば、タンパク質、ポリデキストラン、
もしくはポリスチレンなど、固体基質もしくはポリマーへと付着させもしくはこれに包埋
させた第２のフルオロフォアを用いることにより、比についてのビリルビンプローブを生
成させる方法を用いてプローブを生成させ、式（１〜３）を用いてプローブを修正して、
解離定数を決定するステップ、
プローブを固体基質へと連結するための方法を同定し、デバイス内のこのようなプロー
ブの特性［決定される特性には、プローブの解離の影響、アルブミンの緩衝の影響、ビリ
ルビンのプローブではなくてビーズへの結合の影響、溶液と比較したビーズにおける平衡
速度、溶液における測定値の固体における測定値に対する関係が含まれる］について記載
し、このようなデバイスにおける非結合ビリルビンレベルの確度および精度の高い決定の
ための方法について記載するステップ、
一般的な代謝物、薬物、ビリルビン光異性体、および抱合型ビリルビンを含めた、潜在
的な干渉物質ならびにさらなる突然変異のパネルに照らして、規定された水溶液中の試験
を組み合わせることにより、ビリルビンプローブの特異性を洗練させて、１ｎＭ未満の非
結合ビリルビンまたは何らかの医学的に適切なレベルと同等な他の解析物寄与と符合する
特異性を達成するステップ、
ビリルビンでスパイクした、規定されたヒト血漿中の非結合ビリルビンを測定すること
により定量化を試みて、ヒト血液試料中の非結合ビリルビンに対する特異性を確認するス
テップ、
溶液中のプローブまたは固体表面へと結合させたプローブを用い、式（４および５）に
おいて記載される通りに非結合ビリルビン濃度を計算するステップ
のうちの１または複数を含む方法を対象とする。

好ましい実施形態は、１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する脂質結
合タンパク質などのｉＬＢＰとフルオロフォアとに基づくプローブを対象とする。フルオ
ロフォアは、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン置換へと付着
させることが好ましい。プローブは、ビリルビンには結合するが、脂肪酸に著しくは結合
しないことが好ましい。
好ましい実施形態では、プローブが、場合により、ローダミンＢと組み合わせて、置換
１４Ｒ、１８Ｌ、２５Ｃ、２７Ａ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｌ、１１５Ｒ、１１
７Ｄを含む（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１）。
別の好ましい実施形態では、プローブが、場合により、ローダミンＢと組み合わせて、
置換１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１５Ｒ、および１１７Ｄを
含む（Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７）。

好ましい実施形態では、プローブが、１４、１８、２３、２５、２７、３１、３６、３
８、５５、６０、７２、７３、７４、７８、１０２、１０４、１０６、１１５、および１
１７位から選択される位置において１または複数のアミノ酸置換を伴う、配列番号３の脂
質結合タンパク質に対応する。
一部の好ましい実施形態では、フルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２
９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位において、システイン置換へと
付着している。
一部の好ましい実施形態では、フルオロフォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２
９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位において、リシン置換へと付着
している。
一部の好ましい実施形態では、プローブが、７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５
Ｒ、および１３０Ｒ位において置換され（ＫＲ６）、より好ましくは、７Ｒ、１６Ｒ、２
０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ
、１２９Ｒ、および１３０Ｒ位において置換される（ＫＲ１４）。
好ましい実施形態では、プローブが、少なくとも１つのリンカーを含む。（１または複
数の）リンカーは、
ACSGGG、SAGCGG、GGGCCG、GSGGCG、DTAGCG、GDCGGG、GCSGAG、GGDGCG、SSNSCG、SDCAYG、
DTNCGG、GSGCSG、GCGCGG、ANACGG、GGACGG、GNCGGG、CGGSCG、GSTSCG、DGGCSG、ATSCGG、
ASCGYG、DGACGG、GGSGSGSGG、GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA、SRAWRHPQFGG、RAFIASRRIRRP
、RLLLRRLRR、RIIIRRIRR、AAS、NDN、PSNTNHNSNSN、SHRATPNTSPH、およびこれらの組合せ
から選択される１または複数でありうる。

ポリヌクレオチド鋳型は、切断可能であるかまたは切断不可能なアフィニティータグを
有する、ｉＬＢＰムテインをコードすることが好ましい。ポリヌクレオチド鋳型は、ポリ
ヒスチジンアフィニティータグを有するｉＬＢＰムテインをコードし、固体マトリックス
は、固定化金属キレートを含むことがより好ましい。

好ましい実施形態では、フルオロフォアが、システイン側鎖と優先的に反応するように
、ｉＬＢＰムテインが、８未満のｐＨで、単一のフルオロフォアにより標識される。フル
オロフォアは、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキ
シ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾー
ルエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メ
チルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）、Ｔ
ｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｃ２−マレイミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗヨードアセトア
ミド、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６８０マレイミド、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｓｉｇｈｔ ６７
０ ＬＳＳ色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃ５−ブロモアセトアミド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕ
ｏｒ ７５０ Ｃ５−マレイミド、またはＢＯＤＩＰＹ ５７７／６１８が好ましい。

第２の好ましい実施形態では、フルオロフォアが、タンパク質のアミノ末端またはリシ
ン側鎖など、アミンと優先的に反応するように、ｉＬＢＰムテインが、８を超えるｐＨで
、単一のフルオロフォアにより標識される。好ましくは、フルオロフォアは、アクリロダ
ンであるか、またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、フルオレセイン誘
導体、ローダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｂｉｏｔｉｕｍ ＣＦ７５０ ＳＥ、Ｋ
ｏｄａｋ Ｘ−Ｓｉｇｈｔ ６７０ ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ ＩＲＤｙｅ６８０ ＬＴ
、もしくはＬｉＣｏｒ ＩＲＤｙｅ７００ＤＸなど、長波長で吸収および発光するフルオ
ロフォアである。

代替的な好ましい実施形態では、ｉＬＢＰムテインが、第１のフルオロフォアおよび第
２のフルオロフォアで標識される。１つのフルオロフォアは、アクリロダン、ダンジルア
ジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−
ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、または４−
［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２
−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）であることが好ましい。他のフルオロフ
ォアは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミ
ン誘導体、またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄなど、長波長で吸収および発光するフルオロフォア
であることが好ましい。一部の好ましい実施形態では、標識化は、システインを８以下の
ｐＨで第１のフルオロフォアと反応させるステップと、リシンを、８を超えるｐＨで第２
のフルオロフォアと反応させるステップとを含む。他の好ましい実施形態では、標識化は
、システインを８以下のｐＨで第１のフルオロフォアと反応させるステップと、ｉＬＢＰ
ムテインのアミノ末端を、８を超えるｐＨで第２のフルオロフォアと反応させるステップ
とを含む。

本発明の一部の実施形態では、アクセプタータンパク質またはペプチドドメインを、ｉ
ＬＢＰムテインの各々へと付加することにより、第２のフルオロフォアを提供する。アク
セプタータンパク質またはペプチドドメインが、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、およびＡ
ＣＰタグなどから選択されることが好ましい。一部の実施形態では、ライブラリー内のポ
リヌクレオチドの突然変異体が、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチドセグメントを
含有する。アクセプタータンパク質ドメインまたは蛍光タンパク質は、ビリルビンへと曝
露したときに発光する蛍光の強度および／または波長による応答が、プローブのｉＬＢＰ
ムテイン部分の蛍光と比較してゼロであるか著しく低減されることが好ましい。
一部の実施形態では、第１のフルオロフォアがリシン置換へと付着し、第２のフルオロ
フォアが、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７
、または９８位から選択されるシステイン置換へと付着している。

本発明の実施形態は、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアで標識された
ｉＬＢＰムテインを有する組成物を対象とする。第２のフルオロフォアは、溶液中に遊離
しているか、またはビリルビンに結合しないタンパク質へと付着していることが好ましい
。第１のフルオロフォアと第２のフルオロフォアとは、同じ波長で励起することが可能で
あり、第１のフルオロフォアの発光波長と、第２のフルオロフォアの発光波長とは異なる
ことが好ましい。第２のフルオロフォアは、ビリルビンのｉＬＢＰムテインへの結合に応
答して影響されない（その発光を変化させない）ことが好ましい。第１のフルオロフォア
は、アクリロダンであり、第２のフルオロフォアは、ローダミンＢ、ＮＢＤ、Ｌｕｃｉｆ
ｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ色素、およびＡｌｅｘａ Ｆｌ
ｕｏｒ色素から選択されることが好ましい。第１のフルオロフォアは、ＬｉＣｏｒ ７０
０ＤＸであり、第２のフルオロフォアは、例えば、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、またはＡｌｅｘ
ａ Ｆｌｕｏｒ色素、またはＢｏｄｉｐｙ色素であることがより好ましい。

好ましい実施形態では、蛍光指数比の変化を、２つの異なる波長において測定し、非結
合ビリルビン濃度を決定するのに用いる。
好ましい実施形態では、本明細書で記載されるプローブへと付着させた（１または複数
の）フルオロフォアの発光強度が、ビリルビンおよびヘモグロビンなどの血液成分の吸光
（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）により影響されない。
一部の実施形態では、第１のフルオロフォアが、システインへと付着し、アクリロダン
、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルア
ミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）
、および４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニト
ロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）から選択され、第２のフル
オロフォアが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ロ
ーダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄから選択される。
一部の実施形態では、第１のフルオロフォアが、リシンへと付着し、アクリロダン、Ｂ
ｉｏｔｉｕｍ ＣＦ７５０ＳＥ、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｓｉｇｈｔ ６７０ ＬＳＳ色素、Ｌ
ｉＣｏｒ ＩＲＤｙｅ６８０ ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ ＩＲＤｙｅ７００ＤＸから選択
され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレ
セイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄから選択される。

本明細書で記載される本発明の他の好ましい実施形態では、第２の異なるフルオロフォ
アが、溶液中に遊離している可溶性分子として提供される。このようなプローブは、２つ
の異なる波長において測定される蛍光指数の比の変化により、ビリルビンの、プローブの
タンパク質部分への結合に応答する。これは、ビリルビンに対する著しい応答を明示しな
い、第２のフルオロフォアであるが付着していないフルオロフォアを用いることにより、
ビリルビンの結合に応答して蛍光指数の比の変化を明示するのではないプローブを、比に
ついてのプローブへと容易に変換することを可能とする。第２の遊離フルオロフォアの発
光波長は、第１の（タンパク質に結合した）フルオロフォアより長い場合もあり、短い場
合もあるが、いずれのフルオロフォアも、共通の励起波長を有さなければならない。例え
ば、一部の実施形態では、第１の（タンパク質に連結された）フルオロフォアが、アクリ
ロダンであり、第２のフルオロフォアの例には、溶液中に遊離しているか、または別のポ
リマーもしくは固体基質へと付着させもしくはこれに包埋されたローダミンＢ、ＮＢＤ、
Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄが含まれるがこれらに限定さ
れない。この配置は、第２のフルオロフォアの最大の励起波長が、第１のフルオロフォア
の場合とは異なる場合であっても、両方のフルオロフォアの発光強度が同様となるように
、遊離フルオロフォアの濃度を調整しうる利点を有する。プローブへと付着させていない
第２の異なるフルオロフォアを用いる、この種の比についてのプローブにより、典型的に
は両方のフルオロフォアがタンパク質などの同じ高分子上に配置される場合における、２
つのフルオロフォアのうちの一方の他方による、エネルギー移動消光の問題が消滅する。

一部の実施形態では、第２のフルオロフォアが、プローブのアクセプタータンパク質ま
たはペプチドドメインへと付着している。アクセプタータンパク質またはペプチドドメイ
ンは、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、およびＡＣＰタグから選択されることが好ましい。
プローブが、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、および１３０Ｒ（ＫＲ６
）を含むことが好ましい。プローブが、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４
６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、および１３０
Ｒ（ＫＲ１４）を含むことがより好ましい。
一部の実施形態では、上記のプローブのうちのいずれかについて、Ｎ末端のＭＡＦＤを
、例えば、ＭＧＩＦＤ、ＭＧＣＦＤまたはＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換することができる
。
一部の実施形態では、プローブは、
ACSGGG、SAGCGG、GGGCCG、GSGGCG、DTAGCG、GDCGGG、GCSGAG、GGDGCG、SSNSCG、SDCAYG、
DTNCGG、GSGCSG、GCGCGG、ANACGG、GGACGG、GNCGGG、CGGSCG、GSTSCG、DGGCSG、ATSCGG、
ASCGYG、DGACGG、GGSGSGSGG、GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA、SRAWRHPQFGG、RAFIASRRIRRP
、RLLLRRLRR、RIIIRRIRR、AAS、NDN、PSNTNHNSNSN、SHRATPNTSPH、またはこれらの組合せ
など、少なくとも１つのリンカーを含む。

本発明の実施形態は、フルオロフォアが、システイン残基へと付着させたプローブを対
象とする。フルオロフォアは、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−
ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１
，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エ
チル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡ
ＮＢＤＡ）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｃ２−マレイミド、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗヨ
ードアセトアミド、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６８０マレイミド、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｓｉｇ
ｈｔ ６７０ ＬＳＳ色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｃ２−マレイミド、Ｔｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ Ｃ５−ブロモアセトアミド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０ Ｃ５−マレイミド、
およびＢＯＤＩＰＹ ５７７／６１８から選択されることが好ましい。

本発明の実施形態は、フルオロフォアが、リシン残基へと付着させたプローブを対象と
する。フルオロフォアは、アクリロダン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、
フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｂｉｏｔｉｕｍ ＣＦ
７５０ ＳＥ、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｓｉｇｈｔ ６７０ ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ ＩＲＤ
ｙｅ６８０ ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ ＩＲＤｙｅ７００ＤＸから選択されることが好ま
しい。

一部の実施形態では、上記のプローブのうちのいずれかは、プローブのＣ末端またはＮ
末端において、固体支持体への付着のための１または複数のリンカーと組み合わせた２つ
以上のタグを含むことができる。
好ましい実施形態では、プローブは２５位にＬＩ−ＣＯＲ ７００ＤＸで標識されたリ
シンを含む。
一部の好ましい実施形態では、プローブが、２つのＨｉｓタグおよび２つのリンカーを
用いて、固体支持体へと付着している。
一部の好ましい実施形態では、プローブが、好ましくは、ＨｉｓタグおよびＰＳタグか
ら選択される、１または複数のタグを含む。

本発明の実施形態は、上記の１または複数のプローブを含有する組成物を対象とする。

他の好ましい実施形態は、表面へと固定化しうるポリスチレンビーズまたはラテックス
ビーズが含まれるがこれらに限定されない固体基質へと付着させたビリルビンプローブを
含む。このような固定化された粒子の使用の例には、ハイスループットの測定のためのマ
ルチウェルプレートの底面またはディスポーザブルのマイクロ流体デバイスのチャネルに
接着させた粒子が含まれるがこれらに限定されない。表面上に固定化されるようにデザイ
ンされたビリルビンプローブの例には、システインまたはリシンとの化学反応を介して固
体支持体表面上の適切な基へと連結されるプローブ（表８の最初の２つの群）のほか、非
共有結合的相互作用を介して連結されるプローブ（表８の第３群ならびに例６および７）
も含まれる。加えて、第２のフルオロフォアは、固体支持体表面へと付着させることもで
き、この中に包埋することもでき、これにより、２つのフルオロフォアを分離して、エネ
ルギー移動を消失させ、これにより、ビリルビンの結合に対する比の応答を得ることがで
きる。加えて、第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合しないかまたはこれに対して
不応答性である、ｉＬＢＰなどの別のタンパク質、またはデキストランなどの別の型のポ
リマーへと付着させることもできる。

本発明の実施形態は、固体基質へと付着させた上記のプローブのうちのいずれかを含む
固体基質を対象とする。固体基質は、場合により、鉄のコアおよび／またはマイクロ流体
デバイスもしくはマルチウェルプレートを伴う、ポリスチレンビーズまたはラテックスビ
ーズ、Ｎｉ−アガロースビーズであることが好ましい。固体基質へと付着させるために選
択されるプローブは、Ｎ末端の修飾、リンカー、および表面リシンの置換（ＫＲ６および
ＫＲ１４）が含まれるがこれらに限定されない上記の修飾のうちのいずれかを単独または
組合せで含有しうる。
好ましい実施形態では、プローブが、固体基質への付着のためにタグづけされる。好ま
しい実施形態では、タグには、Ｈｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープ、ｃ−ｍｙ
ｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトー
ス結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−ガ
ラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン
（ＰＳ）疎水性タグ、および金属アフィニティータグのうちの１または複数が含まれる。
一部の実施形態では、固体基質は、第２のフルオロフォアを含む。第２のフルオロフォ
アは、ビリルビンに結合しないタンパク質へと付着させることができる。
好ましい実施形態は、プローブがタグを有し、固体基質がタグのためのレセプターを含
む固体基質を対象とする。タグが、ポリヒスチジンタグであり、固体基質が、固定化金属
キレートを含むことが好ましい。

本発明の実施形態は、蛍光色素で標識された単一のシステインまたはリシンを有するｉ
ＬＢＰムテインを対象とする。システイン／リシン特異的な標識化条件下において蛍光標
識化活性を伴う任意の表面リシンまたは他の任意のシステインを、別のアミノ酸、好まし
くは、アラニンまたはアルギニンで置きかえることが好ましい。配列番号３に対応するｉ
ＬＢＰムテイン鋳型を使用する好ましい実施形態では、２７位におけるリシンが高度に反
応性であり、典型的にはアラニンへと突然変異させる。
好ましい実施形態では、ビリルビンを、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、
またはシクロデキストリンなどの担体高分子と複合体化させる。ビリルビンと担体高分子
との複合体は、非結合ビリルビンの濃度を緩衝し、非結合ビリルビンのレベルのクランピ
ングをもたらす。好ましい実施形態では、担体高分子がアルブミンである。さらなる好ま
しい実施形態では、アルブミンが、ビリルビンに対するアフィニティーが例えばウシ血清
アルブミンより大きく、したがって、一部の実施形態ではビリルビンに対するより好まし
いアルブミン緩衝液である、ヒト血清アルブミンである。

一部の実施形態では、ビリルビンによる吸光が、ビリルビンプローブのフルオロフォア
の励起波長と重複し、内部フィルターによる吸光が著しいものとなる程度に経路長ｄが十
分に長いキュベット内で検定を実施する。この場合、励起波長におけるビリルビンによる
吸光に起因して、そして、おそらくは発光波長におけるビリルビンによる吸光に起因して
、校正式を、ビリルビンプローブの滴定データへと適合する前に、または遊離（非結合）
ビリルビン濃度［Ｂ_ｆ］を、式４もしくは５により決定するときに、フルオロフォアの発
光強度を、内部フィルターによる吸光について補正しなければならない。発光強度

を補正するための式は、

［式中、Ｉ_λｅｍは、波長λ_ｅｍにおいて測定された蛍光発光強度であり、Ｂ_Ｔは、総ビ
リルビン濃度であり、ε（λ_ｅｘ）は、励起波長または発光波長（λ_ｅｘ）におけるビリ
ルビンの減衰係数であり、ｄは、キュベット経路長である］
である。式（１）により示される通り、内部フィルター補正は、［Ｂ_ｆ］を決定するため
にもまた測定しなければならない、総ビリルビン濃度（Ｂ_Ｔ）について知ることを要求す
る。内部フィルター励起の補正は、単一のフルオロフォアによる、比についてではないビ
リルビンプローブに重要であり、これについては、式（２）を校正に用いる。

本発明の実施形態は、プローブを、ビリルビンの水性試料と混合し、蛍光を測定し、キ
ャリブレーションパラメータを、以下の式１および２または３：

［式中、Ｉ_λｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、
Ｉ_０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、Ｐ_Ｔは、総ビリルビンプ
ローブ濃度であり、Ｂ_Ｔは、総ビリルビン濃度であり、Ｒは、測定された蛍光比（Ι_λ１
／Ι_λ２）［式中、Ｉ_λ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍光強度で
あり、Ｉ_λ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である］であり
、Ｒ_０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存
在下におけるプローブのΙ_λ２／Ι_λ１比であり、Ｋ_ｄは、解離定数である］
で適合して、測定された蛍光から決定することにより、ビリルビンプローブをキャリブレ
ートする方法を対象とする。

本発明の実施形態は、以下のステップの組合せに従うことにより、遊離ビリルビン濃度
［Ｂ_ｆ］を測定する方法であって、場合により、試料の蛍光を測定するステップと、プロ
ーブを、試料と混合するステップと、蛍光を測定するステップと、場合により、試料を伴
うプローブの蛍光から試料の蛍光を減じるステップと、濃度［Ｂ_ｆ］を、測定された蛍光
から決定するステップとを含む方法を対象とする。

好ましい実施形態では、以下の式４〜６：

［式中、Ｉ_λｅｍは、ブランクの蛍光強度を減じた試料中のプローブの蛍光強度であり、
Ｉ_０は、ビリルビンの非存在下におけるプローブの強度であり、Ｒは、測定された蛍光比
（Ι_λ１／Ι_λ２）［式中、Ｉ_λ１は、波長λ１における第１のフルオロフォアからの蛍
光強度であり、Ｉ_λ２は、波長λ２における第２のフルオロフォアからの蛍光強度である
］であり、Ｒ_０は、ビリルビンの非存在下における比であり、ｒは、第２のフルオロフォ
アの非存在下におけるプローブのΙ_λ２／Ι_λ１比であり、Ｋ_ｄは、解離定数であり、Ｉ
ｓは、プローブのビリルビン飽和時における発光強度である］
のうちの少なくとも１つを用いて、プローブをキャリブレートし、かつ／または［Ｂ_ｆ］
を測定する。

一部の実施形態では、プローブが、溶液中に遊離しているか、またはビリルビンに結合
しないタンパク質などのポリマーへと付着している、２つのフルオロフォアまたは１つの
フルオロフォアおよび第２のフルオロフォアを伴うプローブの組合せを有する。一部の実
施形態では、ビリルビンに結合するかまたはこれに応答する１つのフルオロフォアを伴う
プローブが、固体基質へと付着し、第２のフルオロフォアが、別のタンパク質へと付着し
、これもまた固体基質へと付着しているが、ビリルビンには結合または応答しない。
一部の実施形態では、プローブが単一のフルオロフォアを有し、方法が、内部フィルタ
ーの励起について補正するための１または複数のステップを含む。
好ましい実施形態では、試料が、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、または
シクロデキストリンなど、ビリルビンの担体高分子を含む。
一部の実施形態では、プローブが固体支持体へと付着している。一部の好ましい実施形
態では、マイクロ流体装置(Microfluidics)は、希釈されていない血液試料の測定を可能
とする。

試料は、ヒト、動物または植物由来であることが好ましい。好ましい実施形態では、試
料が、全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパ由来である。一
部の実施形態では、試料が、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者由来である
。一部の実施形態では、試料が、疾患またはストレスにより、ビリルビンをアルブミンか
ら排除する分子を産生している可能性がある患者由来である。一部の実施形態では、試料
が、光線療法、輸血またはビリルビンレベルを低減する他の療法を受けている患者由来で
ある。

本発明の実施形態は、以下のステップ：
場合により、試料の蛍光を測定するステップ、
試料とＦＦＡｕプローブとを混合するステップ、
プローブの蛍光を測定するステップ、
ＦＦＡｕ濃度を計算するステップ、
のうちの１または複数により、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者由来の血
液試料中の非結合ＦＦＡの濃度を測定するための方法を対象とする。
一部の実施形態では、患者に対する損傷の危険性をＦＦＡｕ濃度に基づき決定し、処置
を施して、損傷の危険性を防止、処置または軽減する。

本発明の実施形態は、試料を患者から回収するための１または複数の回収デバイスと、
上記の１または複数のプローブまたは適切な担体中に１もしくは複数のプローブを含有す
る組成物と、場合により、既知濃度の非結合ビリルビンを含む参照標準物質とを含みうる
キットを対象とする。

本発明の実施形態は、表２、３、４、５、６、７、８および１０のうちのいずれかにお
いて規定されたプローブを対象とする。

本発明の実施形態は、脂肪エマルジョン（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標））を施さ
れている患者における非結合ビリルビンおよび／または非結合ＦＦＡの毒性の危険性を決
定する方法であって、以下のステップ：
試料を患者から得るステップ、
試料を、ＡＤＩＦＡＢ２、Ｌ１９ＣＰ１０Ｃ７、Ｌ１３８Ｐ１Ｈ８Ｎ２４Ｃ、Ｌ２２Ｐ
５Ｅ１１、Ｌ６１Ｐ８Ｂ１２、Ｌ４ＢＰ４Ｂ９、およびＬ１１９Ｐ３Ｅ５など、１または
複数のプローブと接触させて、１または複数のＦＦＡｕのレベルを決定するステップ、
非結合ビリルビンのレベルを決定するステップ、
ＦＦＡｕレベルおよび非結合ビリルビンレベルを、正常な集団から得られるレベルと比
較して、毒性の危険性を決定するステップ、
のうちの１または複数を含む方法を対象とする。

本発明の実施形態は、１または複数のアミノ酸置換を有する配列番号３に対応する脂質
結合タンパク質（ｉＬＢＰ）などのプローブとフルオロフォアとを含む固体基質を対象と
する。フルオロフォアは、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基またはシステイン
置換へと付着していることが好ましい。プローブは、脂肪酸に結合し、固体基質へと付着
していることが好ましい。固体基質が、場合により、鉄のコア、マイクロ流体デバイス、
またはマルチウェルプレートを伴う、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、Ｎｉ
−アガロースビーズであることが好ましい。
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブが、プローブのＭＡＦＤがＭ
ＧＩＦＤ、ＭＧＣＦＤ、またはＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤで置換された修飾Ｎ末端を有する。
固体基質へと付着させたプローブは、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ
、および１３０Ｒ（ＫＲ６）、より好ましくは、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３
７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、およ
び１３０Ｒ（ＫＲ１４）など、表面リシンの修飾を有することが好ましい。
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブが、
ACSGGG、SAGCGG、GGGCCG、GSGGCG、DTAGCG、GDCGGG、GCSGAG、GGDGCG、SSNSCG、SDCAYG、
DTNCGG、GSGCSG、GCGCGG、ANACGG、GGACGG、GNCGGG、CGGSCG、GSTSCG、DGGCSG、ATSCGG、
ASCGYG、DGACGG、GGSGSGSGG、GGGSGGGSGGGTGGGSGGGRRADAA、SRAWRHPQFGG、RAFIASRRIRRP
、RLLLRRLRR、RIIIRRIRR、AAS、NDN、PSNTNHNSNSN、SHRATPNTSPH、およびこれらの組合せ
など、少なくとも１つのリンカーを含む。
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブが、固体基質への付着のため
にタグづけされる。好ましくは、タグは、Ｈｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープ
、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）
、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシ
ン、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポ
リスチレン（ＰＳ）疎水性タグおよび金属アフィニティータグの１または複数を含む。
一部の好ましい実施形態では、固体基質が、場合により、ＦＦＡｕに結合しないタンパ
ク質へと付着させた第２のフルオロフォアを含む。
好ましい実施形態では、固体基質へと付着させたプローブがタグを含み、固体基質がタ
グのためのレセプターを有する。タグがポリヒスチジンタグであり、固体基質が固定化金
属キレートを含むことが好ましい。

本発明のさらなる態様、特色および利点は、後出する好ましい実施形態の詳細な説明か
ら明らかとなろう。
ここで、本発明のこれらの特色および他の特色を、本発明を例示することを意図するも
のであり、限定することを意図するものではない、好ましい実施形態についての図面との
関連で記載する。

図１Ａは、プローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７について、Ｉ_５２５／Ｉ_０を、ビリルビン濃度と対比して示す。図１Ｂは、ビリルビン（３μΜ）の存在下および非存在下におけるプローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７について、測定された遊離ビリルビン濃度［Ｂ_ｆ］を、オレイン酸濃度と対比して示す。図１Ｃは、プローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７について、遊離ビリルビン濃度［Ｂ_ｆ］を、添加されるビリルビンの上昇する濃度と対比して示す。 プローブＬ２４Ｐ１９Ｃ７−Ｘｃ（Ｘｃは、アクリロダンで標識された異なる単一のシステイン位置を表示する）について、Ｉ_５２５／Ｉ_０を、ビリルビン濃度と対比して示す。 スパイクされた成人血清中の結果を示す。プローブＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１について、Ｉ_５２５／Ｉ_０が、添加されるビリルビンの上昇する濃度と対比して示される。 総ビリルビンを上昇に伴うＩ_５２５／Ｉ_５７５比を測定することにより実行されるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈプローブのキャリブレーションを示す。滴定曲線を式（３）に適合してＫ_ｄを決定する。 抱合型ビリルビンのモデルであるジタウロビリルビンの、ビリルビンプローブであるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈへの結合（Ｋ_ｄ＝３００ｎＭ）が、非抱合型ビリルビンの結合の約１９分の１（Ｋ_ｄ＝１６ｎＭ）であることを示す。 ビリルビンの、４６０ｎｍの照射への曝露を増大に伴い、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈにより、非結合ビリルビンの減少がモニタリングされることを示す。これは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈが、４６０ｎｍでの放射時に生成するビリルビンの光酸化生成物および光異性体の存在に対して低感度であり、したがって、ビリルビン毒性を処置するための光線療法の有効性を正確にモニタリングするための方法を提供することを含意する。 ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈを用いて、１０×１０ｍｍのキュベットを用いるＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３（ＪＹ Ｈｏｒｉｂａ）（黒塗りのダイア形）内、または発光フィルターを５２５および５８０ｎｍを中心とするフィルターで置きかえることにより非結合ビリルビンを測定するために改変されたＦＦＡｕ Ｍｅｔｅｒ（ＦＦＡ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（○、丸形）内で行われた［Ｂ_ｆ］の測定を示す。［Ｂ_ｆ］の測定はまた、同じ試料に対して、ペルオキシダーゼ法を用いても実施された［Ｊａｃｏｂｓｅｎ ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、２０：７８３、１９７４］（黒塗りの三角形）。結果は、３回の測定全てについて事実上同一の結果を示し、ビリルビンの単一のヒトアルブミン部位への結合についてＫｄ＝２０ｎＭで、測定される結果と予測される結果との良好な一致を示す。 蛍光分析測定のためにデザインされたマイクロチャネル型のディスポーザブルカートリッジセットの「ウェル」内に固定化されたＮｉ−アガロースビーズ上に固定化されたプローブＰＳ１９−１について、ビリルビンによる消光結果を示す。ビリルビンをスパイクした成人ヒト血漿試料であって、２０μＬの希釈されていない試料を、カートリッジへと添加し、非結合ビリルビンによるＤＸ７００蛍光の消光を、式（５）を用いてデータへと適合して、Ｋ_ｄを決定した。 総ビリルビンを上昇に伴うＩ_５２５／Ｉ_６１５比を測定することにより実行される、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄプローブのキャリブレーションを示す。滴定曲線を式（３）に適合してＫ_ｄを決定する。

記載される実施形態は、本発明の好ましい実施形態を表すが、当業者は、本発明の精神
から逸脱することなしに、工程を改変しうることを理解されたい。
本開示の目的で、「解析物」とは、それらの分子量が約２０００Ｄａ以下の分子であり
、非結合解析物とは、水溶液中のこれらの分子である。これらには、ヒトまたは動物の生
理または病態生理の過程で自然発生する代謝物および生理学的に重要な分子、ならびに薬
物分子およびそれらの代謝産物、ならびに栄養物分子およびそれらの代謝産物が含まれる
。それらの溶解度に応じて、各解析物の一画分は、水溶液中で単量体として存在する（帯
電しているかまたは中性である）。この画分を、「遊離解析物または非結合解析物」画分
と称し、非結合代謝物（ＭＥＴｕ）を含む。
本開示の目的では、ビリルビンが、非抱合型ビリルビンＩＸα［ＭｃＤｏｎａｇｈ Ａ
Ｆ、Ｖｒｅｍａｎ ＨＪ、Ｗｏｎｇ ＲＪ、およびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ ＤＫ、「Ｐｈｏ
ｔｏｉｓｏｍｅｒｓ：ｏｂｆｕｓｃａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌ
ｉｒｕｂｉｎ？」、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１２３：６７〜７６、２００９］である。非
結合ビリルビンとは、血漿中で一般にアルブミンに結合して見出されるビリルビンとは異
なる非抱合型ビリルビンＩＸαの水性単量体である。
本開示の目的では、「脂質」という用語を、その通常で慣用的な意味を有すると理解し
、有機溶媒中の可溶性が最も高いが、水性相（非結合の画分）中でもあるレベルの溶解度
を示す化合物と定義する。したがって、「脂質結合タンパク質」は、本明細書で定義され
る脂質に結合することが可能な任意のタンパク質を含む。
例えば、ビリルビン、脂肪酸を含めた脂質、ホルモン、および代謝産物など、非結合分
子のレベルは、適切なヒトまたは動物の体液中で測定されると、健康および疾患について
の診断情報を提示しうる。このような分子の非結合濃度（また、「水性相」濃度または「
遊離」濃度としても知られている）の決定は、生理学的ホメオスタシスについてのきわめ
て重要な情報をもたらすことがますます明らかである。多くの代謝物は、水性溶解度およ
び非結合濃度が低い（バルクの「全体」がタンパク質または細胞に結合しうるそれらの「
総」濃度よりはるかに低い）疎水性分子である。生体液中では、非結合分子の濃度が、正
常な生理学的条件下で比較的一定の非結合濃度を維持するように調節されることが多い。
この調節は、分子の、例えば、アルブミンなどの担体タンパク質との相互作用を介して生
じる。したがって、大半の分子は一般に、アルブミンまたは他の担体に結合する。しかし
、小画分の分子は、アルブミンから水性相へと解離（および再結合）し、これらが非結合
分子となる。

本開示の目的で、「ビリルビンプローブ」とは、１または複数のシステイン残基または
リシン残基において蛍光標識され、ビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を起こすｉＬ
ＢＰである。ビリルビンプローブはまた、ビリルビンに結合したとき、フルオロフォアの
うちの一方だけの蛍光が変化すれば、２つの波長における蛍光指数の比が異なるように、
システイン残基において１つのフルオロフォアにより蛍光標識され、異なる残基、好まし
くはリシン残基において異なるフルオロフォアにより蛍光標識されたｉＬＢＰでもありう
る。ビリルビンプローブはまた、システイン残基またはリシン残基において、プローブタ
ンパク質へと付着させていない第２のフルオロフォアによりもたらされるさらなる蛍光で
蛍光標識されたｉＬＢＰも含む。この場合も、ビリルビンに結合したとき、フルオロフォ
アのうちの一方だけの蛍光が変化すれば、２つの波長における蛍光指数の比が異なる。第
２のフルオロフォアは、水溶液中に遊離した蛍光分子の場合もあり、ｉＬＢＰなど、ビリ
ルビンに対して応答性でなく、かつ／またはビリルビンに結合しない大型の分子へと付着
している場合もあり、第２のフルオロフォアは、表面へと付着している場合もあり、第２
のフルオロフォアへと付着させた非応答性分子が表面へと付着している場合もある。この
ようなプローブを用いると、非結合ビリルビンの水性濃度を特異的に決定することができ
るが、これは、とりわけ、水溶液中のその溶解度特性が低いために、かつ、他の代謝物、
とりわけ、遊離脂肪酸が存在するために、他の方途では困難である。蛍光応答の比の変化
は、とりわけ、非結合ビリルビンの細胞内濃度を正確に決定するために重要であり、非結
合ビリルビンの細胞外濃度の決定の確度および精度を改善するためにも重要である。

残念ながら、タンパク質構造および対象のリガンドとの共複合体構造が利用可能である
にもかかわらず、分子理論についての当技術分野の現況は、任意の所望の代謝物特異性お
よび新規の感度を伴うプローブをデザインするのに十分でない。したがって、所望の特異
性で結合するだけでなく、また、要求されるシグナルの変化であって、リガンド結合を示
すシグナルの変化ももたらす突然変異体のタンパク質プローブを見出すには、膨大な実験
が要求されることが典型的である。単一のタンパク質を、そのビリルビンへの結合親和性
およびある範囲のさらなる解析物に対する特異性についてスクリーニングする場合であっ
てもなお、タンパク質精製、様々な解析物の結合を測定する方法の開発、および各解析物
の結合等温線の測定には莫大な時間が要求される［一般に、蛍光標識を伴わない突然変異
体タンパク質は、解析物と結合しても測定可能なシグナルを誘起しないために、突然変異
体タンパク質の体系的なハイスループットスクリーニングは不可能である］。タンパク質
−解析物間相互作用を特徴づけても、フルオロフォア化学反応およびプローブ蛍光応答の
特徴づけのためにさらなる実験が要求される。さらには一般に、解析物−タンパク質間の
結合特性は、解析物−プローブ間相互作用の結合特性と異なる。したがって、膨大な実験
後にビリルビンに対する所望の結合特異性を有することが見出されるタンパク質を用いて
開発されたプローブが、ビリルビンには結合しても、著しい蛍光の変化を発生させない場
合もある。必要とされるのは、そうではなくて、結果として得られる何千もの突然変異体
プローブを迅速に生成させてスクリーニングする方法である。

参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許
出願公開第２０１０／０２９８１６２号、ならびに［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ、Ｋａｍｐｆ Ｊ
Ｐ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｚｈｕ Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ ａｃ
ｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ
ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６３〜１４２７
４、２００６］は、プローブをハイスループット生成させるための方法であって、非結合
解析物を決定するために高度の特異性を伴うプローブの開発を可能とする方法について記
載している。米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２
９８１６２号のいずれもが、ビリルビン特異的プローブの開発について記載している。本
発明は、米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８
１６２号において記載されるビリルビン法であって、非結合ビリルビンレベルを決定する
ための確度および精度を改善し、これを異なる測定装置フォーマットにおいて用いること
を可能とする技法のきわめて重要な改善に関する。重要なことは、米国特許第７，６０１
，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号において記載されるこ
れらの先願のビリルビンプローブが、比についてのプローブではなかったことである。本
発明は、第１のフルオロフォアが付着している、ビリルビンに高感度なプローブへと付着
させていない第２のフルオロフォアを用いることにより、比についてのプローブを生成さ
せる新規の方法に関する。本発明はまた、ビリルビンによる、長波長プローブの驚くべき
消光にも関する。加えて、本発明は、ビリルビンおよびＦＦＡｕプローブを固体表面へと
付着させ、このような組成物を、マイクロ流体デバイス内およびディスポーザブルの試料
カートリッジ内で非結合ビリルビンおよびＦＦＡｕを測定するために用いる方法にも関す
る。

ビリルビンプローブを用いて、血液試料中の非結合ビリルビンレベルを決定する場合、
脂肪酸は、ビリルビンと類似の特性を有する血液中で最も豊富な代謝物である。脂肪酸は
、アルブミンへの結合についてビリルビンと競合し、ビリルビンと類似の非結合濃度を示
す。ビリルビンプローブは、脂肪酸に対して一般に高アフィニティーを示すｉＬＢＰの突
然変異体から出発して開発されている。したがって、ｉＬＢＰムテインプローブからビリ
ルビンプローブを発見する第１のステップは、最大１１の最も豊富な脂肪酸により３００
，０００を超えるこのようなプローブをスクリーニングして、脂肪酸に著しくは応答しな
いプローブを同定することである。１０，０００を超えるこのような脂肪酸不応答体（「
不応答体ライブラリー」）が、ΔＲ／ΔＲ_{ＡＤＩＦＡＢ２}＜０．１（米国特許第７，６０
１，５１０号）により同定されている。この定量基準により、これらのプローブの脂肪酸
に対するアフィニティーは、一般に、ＡＤ１ＦＡＢ２基準プローブの場合の少なくとも１
０分の１であることが示される。これらの不応答プローブを、ビリルビンによりスクリー
ニングすることにより、潜在的なビリルビンプローブおよび／または鋳型が同定され、こ
れらを新たに同定された鋳型タンパク質をさらに突然変異誘発することにより、新たなム
テインプローブライブラリーを生成させるのに用いる。この新たなライブラリーを、脂肪
酸およびビリルビンに対する応答についてスクリーニングし、ビリルビンに対する応答性
が最も大きく脂肪酸に対する応答性が最も小さいプローブとして同定されるプローブを、
ビリルビンプローブとして同定するか、またはさらなるラウンドの突然変異誘発およびス
クリーニングに用いることができる。

ビリルビンに対する著しい応答および脂肪酸に対する応答なしから低い応答を含めた有
用な特性を有することが、これらの方法により同定されたビリルビンプローブをさらに特
徴づける。ＦＦＡに対して著しくは応答しないプローブとは、ＦＦＡへの結合がビリルビ
ンへの結合の１０分の１であることを意味する。ＦＦＡへの結合は、ビリルビンへの結合
の１００分の１であることが好ましい。これは、プローブのビリルビンに対する結合アフ
ィニティーおよび蛍光特徴を決定するためのキャリブレーションのほか、脂肪酸との潜在
的な競合を同定するために、ビリルビンおよびヒト血清アルブミンを含有する水溶液中の
非結合ビリルビンレベルをモニタリングすることも含む。脂肪酸がプローブに結合しても
蛍光の変化を発生させない、非応答性プローブが生成する場合もあろう。この場合、血液
試料中の脂肪酸は、プローブへの結合についてビリルビンと競合し、これにより、非結合
ビリルビンレベルの不正確な決定を結果としてもたらしうるであろう。脂肪酸との競合は
、ビリルビンを伴うビリルビンプローブの蛍光応答が、脂肪酸を添加することにより変化
するかどうかを決定することにより評価する。

上記の方法により見出されるビリルビンプローブであって、ビリルビンおよびアルブミ
ンを伴う溶液中で正確なビリルビン濃度をもたらし、脂肪酸との検出可能な競合を呈示し
ないビリルビンプローブを、ヒト血液試料中のさらなる試験について選択する。個別のド
ナー由来の血漿試料のほか、市販の販売元によりプールされた試料を用いて、ビリルビン
プローブが、ヒト血液試料中に一般に存在する本質的に未知のレベルの解析物を有する試
料中の正確な血漿中非結合ビリルビン濃度をもたらすかどうかを決定する。これは、各試
料中のアルブミン濃度を決定し、ビリルビンを伴う血液試料を滴定して、十分に明確なビ
リルビン：アルブミン比を得ることにより達成される。次いで、非結合ビリルビン濃度を
プローブにより測定し、結果を、ａ）ビリルビン：アルブミン比が同じビリルビン−アル
ブミン水溶液中で測定される非結合ビリルビン濃度、ｂ）ペルオキシダーゼアッセイ［Ｊ
ａｃｏｂｓｅｎ ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏ
ｆ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｎｅｗｂ
ｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、２０：７８３、１９７４］を用いて決定される非結合
ビリルビン濃度と比較する。プローブにより決定された血漿中非結合ビリルビン濃度が、
ビリルビン−アルブミン溶液中でペルオキシダーゼアッセイにより決定された非結合ビリ
ルビン濃度と同等であれば、非結合ビリルビン以外の血液成分は、プローブの性能に対し
て検出可能な影響を及ぼさないことが確認される。
米国特許第７，６０１，５１０号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２
号の重要な態様は、かつては必要であり、極めて時間のかかった、ビリルビンのタンパク
質への結合の特徴づけを省くことが可能となり、プローブ自体だけを特徴づけることであ
る。これは、タンパク質を特徴づけるステップを回避するために重要なだけでなく、また
、プローブの特性が、リガンド−タンパク質間結合特徴から予測可能でないことが多いた
めに重要でもある。例えば、異なるタンパク質は、極めて類似の結合アフィニティーを有
しうるが、それらの誘導体プローブの蛍光応答は、全く異なりうる。

既に記載されているビリルビンプローブは、主に配列番号３のリシン２７において、ア
クリロダンだけで標識された（米国特許第７，６０１，５１０号）。さらなるビリルビン
プローブは、２つの異なるフルオロフォアである、配列番号３のリシン２７におけるアク
リロダンと、一方はアクリロダンによる多重標識化を低減する（米国特許出願公開第２０
１０／０２９８１６２号）ＫＲ１４（「ＫＲ１４」とは、配列番号３における以下の１４
の表面リシン：７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２
Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒの、アルギニンへの突然変異を指す略記である）置換を
伴わず、他方はＫＲ１４置換を伴う、２つの変化形のＮ末端のＭＧＣＦＤ付加物のシステ
インにおけるＴｅｘａｓ Ｒｅｄマレイミドとで標識された。これらのプローブは、ビリ
ルビンに対する良好なアフィニティーおよび応答を示し、ヒト血液試料中の非ビリルビン
代謝物により著しくは影響されなかった。しかし、アクリロダンだけのプローブは、重度
の新生児高ビリルビン血症における状態である、ビリルビン濃度の高い試料中のビリルビ
ンを媒介する励起内部フィルター効果［Ｂｈｕｔａｎｉ ＶＫおよびＪｏｈｎｓｏｎ Ｌ
、「Ｔｈｅ Ｊａｕｎｄｉｃｅｄ Ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ：Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｅｒｎｉｃｔｅｒｕｓ」、Ｃ
ｌｉｎ Ｐｅｄ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ、９：１４９〜１５９、２００８］、および血液試
料中のヘモグロビンの存在から有害な影響を受ける可能性がある。アクリロダンに加えて
Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄなど、長波長のフルオロフォアで二重標識されたプローブでは、アク
リロダンと第２のフルオロフォアとの間のエネルギー移動のために、アクリロダンの蛍光
強度が大きく低減されうる。

これらの欠陥を克服し、ビリルビンプローブを用いうる測定器の範囲を拡張するために
、本発明は、非結合ビリルビンレベルを決定するための新たなプローブおよび新たなアッ
セイの形態について記載する。ビリルビンにより消光されるフルオロフォアが、単一のシ
ステイン側鎖またはリシン側鎖を標識し、この側鎖の位置が、ビリルビンに結合したとき
の蛍光の変化を最適化するのに重要であることが見出される、新たなムテインライブラリ
ーを同定した。また、ビリルビンにより消光されるフルオロフォアが、１または複数のシ
ステイン側鎖またはリシン側鎖を標識するが、側鎖のうちの一方の位置が、ビリルビンに
結合したときの蛍光の変化を最適化するのに重要であることが見出されるビリルビンプロ
ーブも同定される。また、ビリルビンにより消光可能なフルオロフォアであって、フェル
スター型のエネルギー移動によるビリルビン消光が生じないとされる長波長で吸収および
発光するフルオロフォアも発見される。ビリルビンの結合は、アクリロダン、およびその
発光が約３８０ｎｍ〜５５０ｎｍの範囲で生じる他のフルオロフォアの事実上完全な消光
をもたらすが、これは、アクリロダンおよび他のフルオロフォアの発光が、ビリルビンに
よる吸光と大きく重複することに起因する、高度なフェルスター型のエネルギー移動のた
めに予測されることである。ビリルビンにより、赤外へと広がるフルオロフォアを含めた
、極めて長波長のフルオロフォアの蛍光が消光されるという発見（表５および７）は、全
く予測外であった。それらの長波長の吸光および蛍光がなされるために、このようなフル
オロフォアが、ビリルビンもしくはヘモグロビンの吸光または血液試料中に潜在的に存在
する事実上任意の他の発色団の吸光に影響されることはない。

本明細書で記載される本発明のさらなる実施形態は、タンパク質上の単一のフルオロフ
ォアと、（ａ）溶液中に遊離しているか、（ｂ）ビリルビンに対して応答性でなく、かつ
／もしくはビリルビンに結合しない、ポリマーなどの大型の分子へと付着しているか、（
ｃ）樹脂もしくはポリマーに包埋されているか、または（ｄ）表面へと直接的または間接
的に付着させた第２の異なるフルオロフォアとにより生成する、ビリルビン比プローブを
生成させる方法である。このようなプローブは、ビリルビンの、プローブのタンパク質部
分への結合に対して、２つの異なる波長において測定される蛍光指数の比の変化で応答す
る。これはまた、ビリルビンへの結合に応答して蛍光指数比の変化を明示しないプローブ
を、ビリルビンに対する著しい応答を明示しない、第２のフルオロフォアではあるが、非
付着のフルオロフォアを用いることにより、比についてのプローブへと容易に変換するこ
とも可能とする。独立の第２のフルオロフォアを用いるプローブである、この種の比につ
いてのプローブは、フルオロフォアの間のエネルギー移動による消光の問題であって、両
方のフルオロフォアが、タンパク質などの同じ高分子上に配置される場合に典型的に観察
される問題を消滅させる。この消光は、シグナル強度を大きく低減し、これにより、非結
合ビリルビン濃度の測定の確度および精度を減殺する。このエネルギー移動の回避は、両
方のフルオロフォアを同じプローブ分子へと付着させないことにより達成される。第２の
フルオロフォアを同じ小型のタンパク質へと付着させる場合、他の方途では、フルオロフ
ォアを空間的に制限することによりエネルギー移動の回避を達成することが必要となろう
。

また、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズなど、固体基質へと付着させること
ができ、これらのビーズをディスポーザブルのマイクロ流体デバイスにおいて用いられる
表面上に固定化しうる、ビリルビンプローブも記載される。加えて、第２のフルオロフォ
アを、ビーズに付着させるかまたはこの中に包埋し、これにより、２つのフルオロフォア
を分離して、エネルギー移動を消失させ、これにより、ビリルビンの結合に対する比の応
答を得ることもできる。代替的に、第２のフルオロフォアを、ビリルビンに対して応答性
でなく、かつ／またはビリルビンに結合しない、ｉＬＢＰまたは他の任意のポリマーへと
付着させ、このｉＬＢＰまたは他のポリマーを固体基質へと付着させて、２つのフルオロ
フォアが十分な分離を維持し、エネルギー移動を著しいものでなくすることもできる。

また、ビリルビンプローブをキャリブレートし、用いるための解析的／数学的方法も記
載される。その中の非結合ビリルビン濃度を知ることが所望される試料に対応する温度、
ｐＨ、および溶液の組成などの条件下において、ビリルビンプローブをキャリブレートし
て、ビリルビンに対するそれらの結合アフィニティー（解離定数Ｋ_ｄ）を決定する。結合
等温線は、ビリルビン濃度の上昇に応答するビリルビンプローブの蛍光の変化を測定する
こと（「滴定データ」）により、水性緩衝液中で実施する。各ビリルビン濃度における蛍
光応答のセットを、ビリルビン濃度、プローブ濃度、特異的分光光度特徴、およびＫ_ｄの
関数としての蛍光応答について適正に記載する適切な式（「校正式」）で適合する。

一部の実施形態では、ビリルビンによる吸光が、ビリルビンプローブのフルオロフォア
の励起波長と重複し、内部フィルターによる吸光が著しいものとなる程度に経路長ｄが十
分に長いキュベット内でキャリブレーションを実施する。この場合、励起波長におけるビ
リルビンによる吸光に起因して、そして、おそらくは発光波長におけるビリルビンによる
吸光に起因して、キャリブレーション式を、ビリルビンプローブの滴定データへと適合す
る前に、フルオロフォアの発光強度を、内部フィルターによる吸光について補正しなけれ
ばならない。発光強度

を補正するための式は、

［式中、Ｉ_λｅｍは、波長λ_ｅｍにおいて測定された蛍光発光強度であり、Ｂ_Ｔは、総ビ
リルビン濃度であり、ε（λ_ｅｘ）は、励起波長または発光波長（λ_ｅｘ）におけるビリ
ルビンの減衰係数であり、ｄは、キュベット経路長である］
である。式（１）により示される通り、内部フィルター補正は、［Ｂ_ｆ］を決定するため
にもまた測定しなければならない総ビリルビン濃度（Ｂ_Ｔ）について知ることを要求する
。
内部フィルター励起の補正は、単一のフルオロフォアによる、比についてではないビリ
ルビンプローブに重要であり、これについてのキャリブレーション式は、

［式中、Ｉ_λｅｍは、ブランク（ビリルビンプローブを伴わない試料）の蛍光強度を減じ
た試料中のプローブの蛍光強度であり、内部フィルターによる吸光が著しい場合は、式（
１）による

で、式（２）のＩ_λｅｍを置き換えなければならず、Ｉ_０はビリルビンの非存在下におけ
るプローブの強度であり、Ｐ_Ｔは総ビリルビンプローブ濃度であり、Ｂ_Ｔは総ビリルビン
濃度である］
である。

内部フィルター励起の補正は、単一フルオロフォアプローブには重要であるが、２つの
波長λ１およびλ２における蛍光発光の比（Ιλ１／Ιλ２）の変化によりビリルビンに
応答する、比についてのビリルビンプローブの応答には影響しない。この比またはＲ値は
、Ιλ１／Ιλ２と等しい。Ｋｄを決定するための、比についてのプローブによるビリル
ビン滴定は、以下のキャリブレーション式（３）：

［式中、Ｒは、測定された蛍光比（Ι_λ１／Ι_λ２）であり、Ｒ_０は、ビリルビンの非存
在下における（Ι_λ１／Ι_λ２）比であり、ｒは、第２のフルオロフォアの非存在下にお
けるプローブの（Ι_λ２／Ι_λ１）比であり、Ｂ_Ｔ、Ｐ_Ｔ、およびＫ_ｄは、式（２）にお
けるＢ_Ｔ、Ｐ_Ｔ、およびＫ_ｄと同じである］
により十分に記載される。
遊離ビリルビン濃度（［Ｂ_ｆ］）は、［Ｂ_ｆ］がＨＳＡの結合平衡により緩衝され、し
たがって、ビリルビンプローブの存在により摂動しない試料中で決定する。以下の式：

および

は、単一（４）フルオロフォアプローブおよび比（５）プローブのそれぞれについての式
である。

本発明の好ましい実施形態は、非結合解析物の濃度を決定するのに用いられうる、蛍光
タンパク質分子の開発に関する。より詳細に述べると、本発明は、１）参照により本明細
書に組み込まれ、これらの方法の改変もまた記載される、米国特許第７，６０１，５１０
号および米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号の方法により生成させたビリル
ビンプローブの同定、２）臨床医学および基礎科学のためのこのようなプローブの使用、
３）異なる体液中の非結合ビリルビン濃度を決定するためのこれらのプローブの例に関す
る。
ビリルビンプローブとは、ビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を呈示する１または
複数の蛍光分子（（１または複数の）フルオロフォア）の共有結合的付加を介して「標識
された」ｉＬＢＰタンパク質である。好ましい実施形態では、プローブが、フルオロフォ
アが共有結合で付着させた単一のシステインまたは単一の到達可能なリシンを含有する。
他の好ましい実施形態では、プローブが、システインへと付着させた１つのフルオロフォ
アと、ビリルビンに結合するタンパク質上の異なる部位、好ましくは、リシン部位へと付
着させた第２のフルオロフォアとを含む。他の好ましい実施形態では、プローブが、シス
テインへと付着させた１つのフルオロフォアと、ビリルビンに結合するタンパク質上の異
なる部位、好ましくは、末端のアミノ基へと付着させた第２のフルオロフォアとを含む。

一部の実施形態では、好ましくは、システインおよびリシン、またはシステインおよび
Ｎ末端のアミノ基へと付着させた２つの異なるフルオロフォアが用いられる。２つのフル
オロフォアのうちの一方が、ビリルビンの結合に対して応答性である、すなわち、ビリル
ビンがプローブへと結合すると、蛍光指数の変化を顕示する。第２のフルオロフォアは、
ビリルビンの結合に対して高感度でありうるが、第２のフルオロフォアがビリルビンの結
合に対して応答性であることは必要でない。第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合
すると、２つの異なる波長における蛍光比の差が観察されるような基準点をもたらす。第
２のフルオロフォアは、ビリルビンの結合に対して反応しない場合もあり、第１のフルオ
ロフォアとは異なる形で反応する場合もある。第２のフルオロフォアは、第１のフルオロ
フォアと比べて、異なる波長において発光点を有することが好ましい。本発明に従い第２
のフルオロフォアとして用いられうる化学的色素の例には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素
、Ｂｏｄｉｐｙ色素、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ Ｒ
ｅｄが含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、第２のフルオロフォア
はＴｅｘａｓ Ｒｅｄである。

一部の実施形態では、１つのフルオロフォアは、システインまたはリシンまたはＮ末端
のアミノ基へと付着し、このフルオロフォアが、ビリルビンの結合に対して応答性である
、すなわち、ビリルビンが蛍光標識されたｉＬＢＰムテインへと結合すると、蛍光指数の
変化を顕示し、第２のフルオロフォアは、ｉＬＢＰムテインへと化学的ではない形で連結
され、ビリルビンのｉＬＢＰムテインへの結合に対して高感度ではない、２つの異なるフ
ルオロフォアが用いられる。第２のフルオロフォアは、ビリルビンに結合すると２つの異
なる波長における蛍光比の差が観察されるような基準点をもたらす。一実施形態では、第
２のフルオロフォアが、可溶性であり、蛍光標識されたｉＬＢＰムテインの、第２の可溶
性フルオロフォアに対する明確な化学量論比で併せて混合される。この混合物は、溶液中
で維持することもでき、必要な場合は、乾燥または凍結乾燥させ、次いで、再構成するこ
ともできる。この混合物は、２つの異なる波長における蛍光比の差により応答するビリル
ビンプローブを構成する。この可溶性の第２のフルオロフォアを伴うビリルビンプローブ
の構成は、第２の長波長フルオロフォアの吸光スペクトルが、第１の短波長フルオロフォ
アの発光と重複しうるために有利である。両方のフルオロフォアが同じｉＬＢＰタンパク
質へと化学的に付着している場合、この構成は、第１のフルオロフォアの蛍光を著しく消
光させ、これにより、プローブ応答シグナルの質を減殺しうる。さらなる利点は、第１の
フルオロフォアの、第２のフルオロフォアに対する化学量論比が、第１のフルオロフォア
および第２のフルオロフォアの、ｉＬＢＰムテインとの２つの別個の化学反応に依存する
化学量論比の場合より、調節が容易であり、調製が簡便なことである。第２のフルオロフ
ォアは、第１のフルオロフォアと比べて長波長に発光点を有することが好ましい。第１の
フルオロフォアとして用いられうる化学的色素の例には、アクリロダン、ダンジルアジリ
ジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニト
ロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、または４−［Ｎ
−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オ
キサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）が含まれるが、これらに限定されない。本発
明に従い第２のフルオロフォアとして用いられうる化学的色素の例には、Ａｌｅｘａ Ｆ
ｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴ
ｅｘａｓ Ｒｅｄが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、第１の
フルオロフォアが、システインまたはリシンにおいて標識されたアクリロダンであり、第
２のフルオロフォアが、ローダミンＢである。

代替的に、タンパク質を、高アフィニティーで固体支持体に結合するように「タグづけ
」することもできる。これには、ビオチン、Ｆｌａｇ−エピトープもしくはｃ−ｍｙｃエ
ピトープもしくはＨＡタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルト
ース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β−
ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレ
ン（ＰＳ）疎水性タグ、または６×Ｈｉｓタグなどの金属アフィニティータグによるタグ
づけが含まれるが、これらに限定されない。アフィニティータグを固体支持体材料と特異
的に会合させることにより、マルチウェルプレートおよびマイクロ流体デバイスが含まれ
るが、これらに限定されない平坦な表面構成における非結合ビリルビンの測定が容易とな
る。それらを固体支持体へと付着させることにより、プローブを、制限された有効な二次
元領域内に濃縮することができる。これにより、有効な二次元領域へと閉じ込められたプ
ローブ間の流動が可能となった試料溶液の薄層内での非結合ビリルビンの測定が可能とな
る。これは、ビリルビンおよびヘモグロビンに起因する吸光を低減し、全血中の測定を容
易とする、前面における蛍光測定を有効に可能とする。この構成はまた、二次元領域へと
閉じ込められたプローブ間で試料を連続的に流動させることにより、反復的であるか、試
料を洗浄用ボーラスと交互に流過させるか、または連続的な非結合ビリルビンの測定の可
能性ももたらす。例えば、表８で示される通り、（１または複数の）アフィニティータグ
を、ＮＨ_２末端またはＣＯＯＨ末端に融合させることもでき、両方の末端に同時に融合さ
せることもできる。好ましい実施形態では、６×ヒスチジンタグを、タンパク質のビリル
ビン結合特性を著しく変化させることなく、ＦＡＢＰのＮＨ_２末端もしくはＣＯＯＨ末端
に融合させるか、または両方の末端に同時に融合させた。好ましい実施形態では、融合ペ
プチドが、プローブのＣＯＯＨ末端における２つの隔てられたヒスチジン領域からなる。
好ましい実施形態ではまた、プローブが、鉄のコアを伴うかまたは伴わないＮｉ−ポリス
チレンビーズが含まれるがこれらに限定されない固体支持体上に固定化される。鉄のコア
は、マルチウェルプレート、マイクロ流体グローブ、または有効な二次元領域からの蛍光
測定と適合する他のデバイスの有効な二次元領域内でプローブビーズを磁気的に濃縮する
ことを容易とする。

一部の実施形態では、ビリルビンプローブ固体支持体上の固定化タンパク質が、同じ波
長において励起されるが、２つの異なる波長において発光する、異なるフルオロフォアで
標識された２つのタンパク質の組合せである。２つのタンパク質のうちの一方が、ビリル
ビンの結合に対して応答性である、すなわち、２つのタンパク質のうちの一方が、ビリル
ビンがタンパク質へと結合すると蛍光指数の変化を顕示する。異なるフルオロフォアで標
識された第２のタンパク質は、ビリルビンの結合に対して高感度でありうるが、第２のタ
ンパク質がビリルビンの結合に対して応答性であることは必要でない。第２のタンパク質
のフルオロフォアは、ビリルビンに結合すると２つの異なる波長における蛍光比の差が観
察されるような基準点をもたらす。好ましい実施形態では、第１のビリルビンに高感度な
タンパク質を、７００ＤＸで標識し、第２のビリルビンに低感度なタンパク質を、Ｔｅｘ
ａｓ Ｒｅｄ、Ｂｏｄｉｐｙ色素またはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素で標識する。

（プローブの使用）
本発明の好ましい実施形態では、非結合ビリルビンを決定するために用いられる試料が
、ヒト、動物または植物に由来する体液試料である。体液は、全血、血漿、血清、尿、Ｃ
ＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパであることが好ましい。他の実施形態では、プロ
ーブを、細胞へと、微量注入もしくは他の形でトランスフェクトすることにより、非結合
ビリルビンの決定を、細胞の細胞質内で実施するか、または細胞の細胞外媒体内で実施す
る。
非結合ビリルビンの正常範囲は健常者の集団から決定し、この正常範囲からの逸脱は疾
患を示しうる。
式１〜５を用いて、［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ、Ｚｈｕ Ｂ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｋａｍｐｆ Ｊ
Ｐ、Ｈｅｇｙｉ Ｔ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
Ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｂｏｕｎｄ
Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、５８：
８６９〜８７６、２０１２］において記載される通りに［Ｂ_ｆ］を測定するために、非結
合ビリルビンプローブを、キャリブレートして用いる。
非結合ビリルビンプローブは、過剰なビリルビンを消失させる肝機能が不十分な新生児
のうちの６０％など、ビリルビンを媒介する毒性に対する危険性がある患者における［Ｂ
_ｆ］を測定するために用いる［Ｍａｉｓｅｌｓ ＭＪおよびＭｃＤｏｎａｇｈ ＡＦ、「
Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｅｏｎａｔａｌ ｊａｕｎｄｉｃｅ」、Ｎ Ｅｎ
ｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５８：９２０〜９２８、２００８］。

非結合ビリルビンプローブは、油エマルジョンの静脈内注入を施されている患者のほか
、未熟新生児において一般であり、ＦＦＡレベルを上昇させる敗血症など、ビリルビンの
アルブミンに対する結合アフィニティーを低下させることにより［Ｂ_ｆ］を増大させうる
疾患を伴う患者における［Ｂ_ｆ］を測定するために用いる［Ｎｏｇｕｅｉｒａ ＡＣ、Ｋ
ａｗａｂａｔａ Ｖ、Ｂｉｓｅｌｌｉ Ｐ、Ｌｉｎｓ ＭＨ、Ｖａｌｅｒｉ Ｃ、Ｓｅｃ
ｋｌｅｒ Ｍ、Ｈｏｓｈｉｎｏ Ｗ、Ｊｕｎｉｏｒ ＬＧ、Ｂｅｒｎｉｋ ＭＭ、ｄｅ
Ａｎｄｒａｄｅ Ｍａｃｈａｄｏ ＪＢ、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ＭＢ、Ｌｏｔｕｆｏ Ｐ
Ａ、Ｃａｌｄｉｎｉ ＥＧ、Ｍａｒｔｉｎｓ Ｅ、Ｃｕｒｉ Ｒ、およびＳｏｒｉａｎｏ
ＦＧ、「Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｌａｓｍａ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌ
ｅｖｅｌｓ ｉｎ ｓｅｐｔｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｃａｒｄｉａｃ ｄａｍａｇｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｈｅａ
ｒｔ ｒａｔｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ」、Ｓｈｏｃｋ、２９：３４２〜３４８、２０
０８］。
非結合ビリルビンプローブは、ビリルビン毒性を軽減するようにデザインされた光線療
法、輸血または他の療法を施されている患者における［Ｂ_ｆ］を測定するために用いる。
総ビリルビンではなくて非結合ビリルビンが毒性であるために、光線療法時における総
ビリルビンではなくて非結合ビリルビンをモニタリングして、非結合ビリルビンが著しく
減少することを確認すべきである。総ビリルビンは、ＦＦＡなど、ビリルビン置換分子の
存在下において、光線療法に応答して減少することが示されているが、総ビリルビンと非
結合ビリルビンとは、ほとんど完全に切り離すことができる。これらの条件下において、
総ビリルビンが事実上完全に破壊されれば、非結合ビリルビンレベルを、非毒性と考えら
れるレベルまで低下させることが要求されるであろう。したがって、積極的療法について
もなお、現在達成されているレベルよりはるかに低い総ビリルビンレベルが要求されるで
あろう。さらに、ペルオキシダーゼアッセイは、この試験では、光分解生成物（および抱
合型ビリルビン）と「天然の」非抱合型ＩＸ−ａ異性体とが識別されないために、光線療
法時における非結合ビリルビンをモニタリングするのに用いることができない。これに対
し、本出願において記載されるプローブにより測定される非結合ビリルビンは、天然の非
抱合型ＩＸ−ａに特異的である。

非結合ビリルビンを決定するために現在用いられる唯一の方法は、西洋ワサビペルオキ
シダーゼによるビリルビンの酸化に基づく［Ｊａｃｏｂｓｅｎ ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒ
ｇ ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ
ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、２０：
７８３、１９７４］。ペルオキシダーゼアッセイの実装は、ＦＤＡで承認された測定器（
株式会社アローズ、大阪府、日本）を用いて実現可能である。黄疸に罹った新生児の一般
的なスクリーニングのためのこの方法の採用は、正確な非結合ビリルビンの決定を複雑化
させる、アローズ法に伴う問題のために限定されている［Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、「Ｍ
ｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｕｎｂｏｕｎｄ ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅ
ｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ」、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２７９：１３０〜１３５、２０
００；Ａｈｌｆｏｒｓ ＣＥ、Ｖｒｅｍａｎ ＨＪ、Ｗｏｎｇ ＲＪ、Ｂｅｎｄｅｒ
ＧＪ、Ｏｈ Ｗ、Ｍｏｒｒｉｓ ＢＨおよびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ ＤＫ、「Ｅｆｆｅｃ
ｔｓ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ， ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅ
ｍｅｎｔ ｏｆ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｎ
ｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ、４０：２６１〜２６７、２００７］。最
も重要なことは、アローズ法を用いて平衡非結合ビリルビン濃度を決定するには、複数の
比較的大きな試料容量の測定が要求され、干渉物質および試料希釈率についての補正が必
要とされることである。

本発明の実施形態は、非結合ビリルビンを測定するための新たな方法であって、ペルオ
キシダーゼ−アローズ法の欠点を克服する方法を提供する。この新たな方法では、平衡非
結合ビリルビン濃度の直接的なモニタリングを可能とする、蛍光標識された脂肪酸結合タ
ンパク質（非結合ビリルビンプローブ）を用いる。プローブは、非抱合型ビリルビンに特
異的であり、ビリルビンに高アフィニティーで結合する。さらに、非結合ビリルビンプロ
ーブは、非結合ビリルビンに高度に特異的であり、血液中に存在する遊離脂肪酸（ＦＦＡ
）、他の代謝物、および薬物に有意には応答または結合しない。非結合ビリルビンプロー
ブを用いて、新生児を含め、黄疸に罹った患者における非結合ビリルビンレベルを決定し
、潜在的なビリルビンの神経毒性を診断し、これにより、処置を正確に方向付けて、この
ような毒性の帰結を防止する。

以下の定義は、配列番号３と関連する。
「ＫＲ６」とは、以下の６つの表面リシン：７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５
Ｒ、１３０Ｒのアルギニンへの突然変異を指す。
「ＫＲ１４」とは、以下の１４の表面リシン：７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ
、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ、１３０Ｒ
のアルギニンへの突然変異を指す。
「ＭＧＩ」とは、野生型のＮＨ_２末端配列であるＭＡＦＤからＭＧＩＦＤへの突然変異
を指す。いずれの場合も、細胞によりＮ末端のメチオニンが除去されて、成熟タンパク質
が生成する。
「ＭＧＣＦＤ」とは、野生型のＮＨ_２末端配列であるＭＡＦＤからＭＧＣＦＤへの突然
変異を指す。いずれの場合も、細胞によりＮ末端のメチオニンが除去されて、成熟タンパ
ク質が生成する。
「ＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤ」とは、野生型のＮＨ_２末端配列であるＭＡＦＤからＭＧＧＳ
ＡＴＧＩＦＤへの突然変異を指す。いずれの場合も、細胞によりＮ末端のメチオニンが除
去されて、成熟タンパク質が生成する。

（例１：Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７）
ビリルビンプローブは、非結合ＦＦＡ（ＦＦＡｕ）プローブについて、ＵＳ７，６０１
，５１０、米国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号、および［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ
、Ｚｈｕ Ｂ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｋａｍｐｆ ＪＰ、Ｈｅｇｙｉ Ｔ、およびＫｌｅｉｎｆ
ｅｌｄ ＡＭ、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎ
ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｎｂｏｕｎｄ Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｉｏｎｓ」、Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、５８：８６９〜８７６、２０１２；Ｈｕｂｅｒ
ＡＨ、Ｋａｍｐｆ ＪＰ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｚｈｕ Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ
、「Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｅｑ
ｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：
１４２６３〜１４２７４、２００６］において既に記載される通り、ラット腸型脂肪酸結
合タンパク質（ｒＩ−ＦＡＢＰ）に由来する。まず、コンビナトリアル突然変異誘発を用
いて、突然変異体プローブを生成させ、ＦＦＡｕに対する応答についてスクリーニングす
る。これらのプローブのうち、約１０％は、ＦＦＡｕに対して著しく応答せず、それらの
非抱合型ビリルビンに対する応答についてさらにスクリーニングされる。このスクリーニ
ングからのヒットを、非結合ビリルビンに対するアフィニティーおよび選択性を増大させ
るさらなる突然変異誘発について選択する。これらの方法の結果による例は、アクリロダ
ンで標識され、配列番号３と関連する（ｗｈｉｃｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ）、Ｌ２４Ｐ
１９Ｃ７であり、突然変異：１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１
５Ｒ、および１１７Ｄを有する（表５）。ｐＨ９．３におけるアクリロダン反応は、主に
Ｋ２７側鎖において、Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７を標識する。Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７を、２２℃で、水
性ビリルビンによりキャリブレートし、式（５）に適合することにより、飽和に近いビリ
ルビン濃度で、２２ｎＭのＫ_ｄおよび事実上完全な消光（残存画分強度（Ｑ_ｓ）＝０．０
０４２）をもたらした（図１Ａ）。Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に対して
応答性ではない。ビリルビンの存在下または非存在下においてＬ２４Ｐ１９Ｃ７を非結合
オレイン酸で滴定しても、その蛍光またはこれと等価の非結合ビリルビン濃度の変化はも
たらされない（図１Ｂ）。図１Ｂにおける非結合オレイン酸（ヒト血漿中で最も豊富なＦ
ＦＡ）のＦＦＡ濃度は、ヒト血漿中濃度の１０倍超である。そのＦＦＡに対する応答の欠
如に加えて、Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７はまた、ヒト血漿中に存在する他の代謝物に対しても応答
性でない。ビリルビンでスパイクした６例の異なる成人血漿試料における非結合ビリルビ
ンの測定は、ビリルビンの非存在下における非結合濃度が１ｎＭ未満であり、非結合ビリ
ルビンの増大がビリルビンと血清アルブミンとの平衡について予測される挙動に従うこと
を裏付ける。

（例２：Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７−ＸＣ）
単一のシステインが２２位と３０位との間の側鎖位置において置換されたＬ２４Ｐ１９
Ｃ７の突然変異体を合成して、安定で本質的に固有なアクリロダン標識部位を伴うプロー
ブを生成させ、ビリルビンのプローブとの相互作用を最適化した（図２）。結果は、ビリ
ルビン結合についてのＫ_ｄが、１９〜８９ｎＭの範囲にわたり、アクリロダン蛍光の消光
度（Ｑ_ｓ）が、約１．７〜６％の範囲にわたることを裏付ける。２５位または２６位にお
けるシステインにより、最適のプローブ性能が得られた。これは、プローブ性能の調整に
は、その基礎構造が同定された後で、最小限の実験が要求されることを裏付ける。
（例３：ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１）

ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１とは、単一のフルオロフォア（この場合は、１４の表面リシン（Ｋ
Ｒ１４）、２７位におけるリシン、および、Ｌ２４Ｐ１９Ｃと比べて、１０６位における
システインを除去することにより、２５位におけるアクリロダン）だけで標識されたビリ
ルビンプローブである。したがって、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、配列番号３と比べて、構造
：ＭＧＩ−ＫＲ１４−１４Ｒ １８Ｌ ２５Ｃ ２７Ａ ３８Ｖ ６０Ｒ ７３Ｆ １０
６Ｌ １１５Ｒ １１７Ｄを有する。固有で単一の蛍光標識を保有することに加えて、Ｂ
Ｌ２２Ｐ１Ｂ１１は、プローブのビリルビン飽和時において、ビリルビンに対して例外的
に大きなアフィニティー（Ｋ_ｄ＝１６ｎＭ）を有し、アクリロダン蛍光の事実上完全な消
光を明示する（Ｑ_ｓ＝０．００６）（図３）。ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、脂肪酸に対する応
答を事実上示さず、最も豊富なＦＦＡに対するＫ_ｄは、３〜７５μＭの範囲である（表１
）。Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７と同様にまた、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１も、ヒト血漿中でビリルビンだ
けを検出し、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１により決定される［Ｂ_ｆ］は、ビリルビンをスパイクし
た血漿におけるビリルビン−アルブミン平衡から予測されるばらつきと符合する（例えば
、図５を参照されたい）。

（例４：ビリルビンの比についてのプローブであるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈおよびＢ
Ｌ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン−Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）
ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１は、総ビリルビンが低い試料について、ヒト血液試料を含めた水溶
液中の正確な［Ｂ_ｆ］値を提供する。しかし、総ビリルビン濃度が上昇するにつれ、励起
時および発光時におけるビリルビンに起因する内部フィルターによる吸光は著しく増大す
る可能性があり（式（１））、したがって、総ビリルビン濃度および吸光の幾何学的配置
（式（１）における「ｄ」）について正確に知らなければ、見かけの［Ｂ_ｆ］に大きな誤
差が生じうる。この不確実性の源泉を克服し、総ビリルビン濃度を決定する必要を消失さ
せるため、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１などの単一波長によるプローブの比の形態を用いる。これ
は、単一波長によるプローブと同じ波長で励起され、その発光が単一波長によるプローブ
とは異なる波長においてなされる第２のフルオロフォアを添加することにより達成される
。アクリロダンで標識されたＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１では、適切な水溶性フルオロフォアが、
アクリロダンと同様の波長、例えば、３７５ｎｍで励起され、その発光が、アクリロダン
より著しく長いローダミンＢであり、ローダミンは５７５ｎｍで蛍光発光し、５２５ｎｍ
におけるアクリロダン蛍光への寄与が無視できる程度である。したがって、Ｉ５２５／Ｉ
５７５の強度比の測定を用いて、［Ｂ_ｆ］を決定する（式（５））。励起時における、ビ
リルビンに起因する内部フィルターによる吸光は、アクリロダンおよびローダミンＢにつ
いて同じであり、Ｉ５２５およびＩ５７５の強度は、常に比として現れるために、ビリル
ビンによる吸光が、経路長「ｄ」を十分に低減することによりほとんど常に達成されうる
十分な透過を可能とする限りにおいて、励起時における内部フィルターによる吸光は、［
Ｂ_ｆ］の測定に影響しない。励起時における、ビリルビンに起因する内部フィルターによ
る吸光を消失させることに加えて、５２５および５７５ｎｍにおける強度比の測定により
、発光時における、ヘモグロビンおよびビリルビンに起因する内部フィルターによる吸光
も有効に消滅する。この種の比についてのプローブは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１を、ローダミ
ンＢと、明確な分子比で併せて混合し、次いで、混合物を、−２０℃以下で保管するため
に凍結乾燥させることにより調製するか、または調製し、４℃において溶液として保管す
る。いずれの場合にも、ビリルビンの非存在下における蛍光比であるＲ_０を決定すること
により、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１／ローダミンＢ分子比が正確に決定される。ＢＬ２２Ｐ１Ｂ
１１−Ｒｈプローブのキャリブレーションは、総ビリルビンを上昇させるときのＩ５２５
／Ｉ５７５比を測定することにより実行する。滴定曲線の式（３）による適合を用いてＫ
ｄを決定し、図４に示される結果により、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈプローブのＫ_ｄ（１
６ｎＭ）が、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１のＫ_ｄと同一であることが裏付けられる通り、ローダミ
ンの存在が、ビリルビン−プローブ間相互作用に対して影響を及ぼさないことが示される
。

比についてのプローブはまた、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１を、明確な量のＴｅｘａｓ Ｒｅｄ
（登録商標）で標識されたデキストラン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄ−３
３２９）と併せて混合することによっても生成させた。新たな比についてのプローブをキ
ャリブレートし、凍結乾燥させ（図９）、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で再懸濁させた後でもキャ
リブレートした。キャリブレーションは、総ビリルビンを上昇させるときのＩ５２５／Ｉ
６１５比を測定することにより実行した。図９で観察される通り、比についてのＢＬ２２
Ｐ１Ｂ１１−デキストラン Ｔｅｘａｓ ＲｅｄプローブのＫ_ｄは１６ｎＭであり、これ
は、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１およびＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈのＫ_ｄと同じである。したがっ
て、第２のフルオロフォアは、溶液中に遊離させる（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈ）ことも
でき、プローブ−ビリルビン間相互作用を著しく変化させることなく、大型の不活性ポリ
マーへと付着させる（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−デキストラン Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）ことも
できる。

ビリルビンプローブと抱合型ビリルビンの潜在的な干渉は、ジタウロビリルビンのＢＬ
２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈに対する結合アフィニティーを測定することにより推定した。測定
は、ジタウロビリルビンの濃度を上昇させるときに滴定されるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈ
の蛍光応答の変化を測定することにより実施した。Ｒ値は、全ての濃度について計算し、
結合等温線を式（３）で適合して、ジタウロビリルビンのＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈへの
結合について３０１±９ナノモル／ＬのＫ_ｄを得た（図５）。
光退色（光酸化および／または光異性化）の、ビリルビンプローブを用いるＢ_ｆの決定
に対する影響を、回数を増大させる４６０ｎｍの光へと曝露されたビリルビン溶液由来の
試料中のＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−ＲｈでＢ_ｆを測定することにより評価した。Ｂ_ｆ値は、式
（６）を用いて決定した。総ビリルビン濃度（Ｂ_Ｔ）は、式（６）により測定されたＲ値
を用いて計算した。

結果は、Ｂ_ｆが７８％低下し（図６）、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈが、光酸化生成物ま
たはより豊富な光異性化生成物に対してほとんどまたは全く感度を有さないことを示す。
（例５：ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈによる、ビリルビンをスパイクしたヒト血漿中の［
Ｂ_ｆ］の測定）
プールされたヒト血漿（Ｇｏｌｄｅｎ Ｗｅｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）であって
、［アルブミン］が６２０μＭであるヒト血漿を、ビリルビンでスパイクして、ビリルビ
ン／アルブミン比を約０〜０．９とする血漿試料を作製した。［Ｂ_ｆ］の測定は、ＢＬ２
２Ｐ１Ｂ１−Ｒｈを、１０×１０ｍｍのキュベットを用いるＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３（ＪＹ
Ｈｏｒｉｂａ）内、または発光フィルターを、３２５および３８０ｎｍを中心とするフ
ィルターで置きかえることにより、非結合ビリルビンを測定するために改変されたＦＦＡ
ｕ Ｍｅｔｅｒ（ＦＦＡ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）内で用いて実行した。［Ｂ_ｆ］の測定はま
た、同じ試料に対して、ＪａｃｏｂｓｅｎおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ［Ｊａｃｏｂｓｅｎ
ＪおよびＷｅｎｎｂｅｒｇ ＲＰ、「Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｂｏｕｎ
ｄ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｎｅｗｂｏｒｎｓ」、Ｃｌ
ｉｎ Ｃｈｅｍ、２０：７８３、１９７４］のペルオキシダーゼ法を用いても実施した
。結果は、３回の測定全てについて事実上同一の結果を示し、ビリルビンの単一のヒトア
ルブミン部位への結合について、Ｋｄ＝２０ｎＭで、測定される結果と予測される結果と
の良好な一致を示す（図７）。これらの結果は、ビリルビンプローブの応答が、ビリルビ
ンとの相互作用に完全に起因し、ビリルビンプローブが、ヒト血液試料中に存在する他の
代謝物に対して応答性ではないことを裏付ける。さらにまた、ペルオキシダーゼ法および
ビリルビン−アルブミン平衡の予測との一致も、プローブが、正確な非結合ビリルビン濃
度をもたらすことを裏付ける。

（例６：ビーズの標識化の例、ならびに解離およびＢ_ｆ測定に対する影響）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０およびＬＩ−ＣＯＲ ７００ＤＸによる標識化を最適
化し、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するために、ビリルビンプ
ローブの突然変異体を生成させた。突然変異体は、血漿ビリルビンアッセイまたは全血ビ
リルビンアッセイによる使用に適する蛍光色素による標識化のために、ビリルビンプロー
ブであるＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１から誘導した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０色素を、多
様な標識化位置において単一のシステインを含有する突然変異体について調べたところ、
２５Ｃ位における標識化が、ビリルビンに結合すると、最大の蛍光の消光（約４０％）を
呈示した。プローブをポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するために
、２５Ｃ位におけるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０色素と反対側に単一反応性または多
重反応性のリシン残基を伴う突然変異体を開発した（表６）。好ましい実施形態では、Ｌ
Ｉ−ＣＯＲ ７００ＤＸ（Ｌｌ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、多様な標
識化位置において単一のリシンを含有する突然変異体を標識したところ、２５Ｋ位におけ
る標識化が、ビリルビンに結合すると、最大の蛍光の消光（≧６０％）を呈示した（表６
）。プローブをポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するために、２５
Ｋ位におけるＬＩ−ＣＯＲ ７００ＤＸ色素と反対側に単一反応性または多重反応性のシ
ステイン残基を伴う突然変異体を開発した。ＬＩ−ＣＯＲ ７００ＤＸで標識されたビリ
ルビンプローブを、ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズへと固定化するための２
つのアフィニティーベースの方法である、二重ＨｉｓタグおよびＰＳタグ（ポリスチレン
結合ペプチド）を用いて、固定化のためのさらなる改善を達成した（表８）。Ｃ末端の二
重Ｈｉｓタグを１１アミノ酸残基（ＳＲＡＷＲHＰＱＦＧＧ）からなるリンカーで隔てた
突然変異体（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘ）は、Ｎｉ共役Ｄｙｎａポリスチレン
ビーズまたはＮｉ共役Ｄｙｎａラテックスビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
）に対する結合アフィニティーが高く、ビリルビンによる消光が許容可能である（約５０
％）ことが見出された。また、そのＣ末端のＨｉｓタグの直後にＰＳタグ（ＰＳ１９−１
、ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰ）を伴う別の突然変異体（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｐ
Ｓ１９）も、単一のＨｉｓタグを伴う鋳型（ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ）より高いアフ
ィニティーを示した。ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズに高アフィニティーで
結合するプローブをもたらした他のＰＳタグには、ＰＳ１９−６Ｌ（ＲＬＬＬＲＲＬＲＲ
）およびＰＳ１９−６Ｉ（ＲＩＩＩＲＲＩＲＲ）が含まれた（表８）。さらに、ＢＬ２２
Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿ＰＳ１９プローブは、おそらく、さらなるＰＳタグが存在するため
に、遊離溶液中およびビーズ上の両方において最も高度な（＞６０％）ビリルビン消光を
呈示した。いずれのプローブからも、標準的な蛍光光度計による消光曲線と同様のビリル
ビン消光曲線が作成された。

より好ましい実施形態では、ビリルビン突然変異体プローブを、ＬＩ−ＣＯＲ ７００
ＤＸで標識されたＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘ鋳型に基づくリンカーライブラリ
ーを構築およびスクリーニングすることにより生成させた（表８）。新たな突然変異体プ
ローブは、タンパク質の発現が高度であり、多重標識化を伴わず、Ｎ末端におけるアミン
の標識化をほとんどまたは全く伴わず、プローブ収率が高く、ポリスチレンビーズまたは
ラテックスビーズに対するアフィニティーが高い。例えば（表４）、ＰＳ１９プローブの
うちの約１２％は、［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ、Ｋａｍｐｆ ＪＰ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｚｈｕ Ｂ
、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｓｏｌｖ
ｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆ
ａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ」、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６３〜１４２７４、２００６］において記載さ
れる場合など、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で６０分間にわたるインキュベーション後において、
ビーズから解離する。この解離したプローブは、総蛍光強度のうちの約６０％を占める（
表４）。Ｃ２ＸＦＦＡ３Ｐ１Ｈ１１プローブは、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋと第１のＨ
ｉｓタグとの間に挿入された固有の３アミノ酸のリンカー（ＡＡＳ）を有し、第１のＨｉ
ｓタグと第２のＨｉｓタグとの間の新規の１１アミノ酸（ＳＨＲＡＴＰＮＴＳＰＨ）のリ
ンカーでＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘ内の元のリンカーを置きかえた。両方のク
ローンを調べたところ、ＰＳ１９およびＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋ＿Ｃ２Ｘを上回る著
しい改善が示された（表２〜４）。いずれの突然変異体も、それらを大スケールのプロー
ブ作製および商品化に理想的な選択肢とする以下の特性を有する：タンパク質発現収率の
高さ；７００ＤＸによるＮ末端のアミンに対する反応性または結合可能性の低さ；標識化
後にＥＤＴＡによりＮｉビーズから溶出するプローブの収率の約１００％という高さ；Ｐ
Ｓ１９と同等であるかまたはこれより良好なビリルビンによる消光の高度さ；プローブの
ビリルビンによる７００ＤＸの蛍光の消光が、ポリスチレンビーズまたはラテックスビー
ズへと固定化されたプローブについて、遊離溶液中のプローブの場合と同じであること；
ビーズに対するアフィニティーがＰＳ−１９ならびに固有のリンカーおよびスペーサーの
１０倍（遊離プローブによる強度の約５％に対して約６０％）であること。

Ｎｉ共役ＤｙｎａポリスチレンビーズまたはＮｉ共役Ｄｙｎａラテックスビーズ上に固
定化されたＣ２ＸＦＦＡ３Ｈ１１、Ｃ２ＸＦＦＡ３Ｂ３、およびＰＳ１９についてのタイ
ムコースを２つの異なる日に実行し、これらを表２〜４に示すが、ここで、ビリルビンに
よるＬｉＣｏｒ ７００ＤＸの蛍光の消光は、総ビリルビン／アルブミンを約０．９とす
るビリルビン−アルブミン複合体に媒介された。

（例７：ディスポーザブルカートリッジ内の、固定化されたビリルビンプローブをスパ
イクした血漿の測定）
ＬｉＣｏｒ ＤＸ７００で標識されたＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１＿２５Ｋであり、６×Ｈｉｓ
タグに加えて、Ｃ末端においてＰＳタグであるＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰを有するプロー
ブであるＰＳ１９−１（表８）を、Ｎｉ−アガロースビーズ上に固定化した。これらの標
識されたビーズを、蛍光分析測定のためにデザインされた、マイクロチャネル型のディス
ポーザブルカートリッジセットの「ウェル」内に固定化した。ビリルビンをスパイクした
成人ヒト血漿試料であって、２０μＬの希釈されていない試料を、カートリッジへと添加
し、非結合ビリルビンによるＤＸ７００蛍光の消光を、［Ｂ_ｆ］値が上昇した試料につい
て決定した。これらの測定を用いて、固定化されたＰＳ１９−１のＫ_ｄを決定し、このよ
うなカートリッジにおけるビリルビンプローブの再現性を評価した。これらの測定から決
定されたＫ_ｄが、遊離ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈプローブから得られる値と符合する（図
８）ことから、固定化が、プローブとビリルビン−アルブミン間相互作用との平衡には影
響しないことが示される。さらに、調製後２カ月間超にわたり保管されたカートリッジを
用いても、事実上同じ結果が得られた。
（例８：単一のシステインプローブ）

（例９：蛍光標識された単一のリシンプローブ）

（例１０：２つのフルオロフォアビリルビンプローブ）

（例１１：固定化ビリルビンプローブ）

（例１２）
非結合ビリルビンおよび非結合ＦＦＡの測定は、生誕時体重が極度に軽い（＜２０００
ｇ）新生児であって、３〜３．５ｇ／ｋｇ／日の脂肪エマルジョン（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉ
ｄ（登録商標））で処置された新生児５例から得られた、そうでなければ廃棄される血液
試料中で実施した。非結合ビリルビンの測定は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中で２５倍に希釈され
た血漿試料中で、ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１−Ｒｈを用いて実施した。ＦＦＡｕ濃度は、ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液中で５０倍に希釈された血漿中で決定した。測定は、［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ、Ｋ
ａｍｐｆ ＪＰ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｚｈｕ Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、「Ｆａ
ｔｔｙ ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔ ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｅｑｕｉｌｉ
ｂｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６
３〜１４２７４、２００６］において記載される通りに実施した。蛍光強度は、ＦＦＡｕ
については、［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ、Ｋａｍｐｆ ＪＰ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｚｈｕ Ｂ、およ
びＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒ
ｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ
ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔ
ｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６３〜１４２７４、２００６］において記載される通
りに、ＦＦＡｕ Ｍｅｔｅｒを用いて測定し、Ｂｆ用には、５２５および５７５ｎｍにお
ける発光用に改変された同じＦＦＡｕ Ｍｅｔｅｒを用いて測定した。非結合ビリルビン
濃度は、式（６）を用いて、５２５／５７５ｎｍにおける蛍光比から決定した。非結合Ｆ
ＦＡは、ＡＤＩＦＡＢ２を、Ｃａｎｔｏｒら［Ｃａｎｔｏｒ ＷＪ、Ｈｏｅ Ｋｉｍ Ｈ
、Ｊｏｌｌｙ Ｓ、Ｍｏｅ Ｇ、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ＪＭ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ Ａ、
Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、およびＦｉｔｃｈｅｔｔ Ｄ、「Ｂ−Ｔｙｐｅ Ｎａｔｒｉ
ｕｒｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｓｅｒｕｍ Ｕｎｂｏｕｎｄ Ｆｒｅｅ Ｆａ
ｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｌｅｖｅｌｓ ａｆｔｅｒ Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｅｒｃｕ
ｔａｎｅｏｕｓ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、２０：１８６〜１８８、２００８］にお
いて記載される通りに用いて実施した。［Ｒｉｃｈｉｅｒｉ， ＧおよびＫｌｅｉｎｆｅ
ｌｄ， ＡＭ、「Ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌｓ ｉ
ｎ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、３６：２２９〜２４０、１９９５］の手法を用いて、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標
）の注入について、ＦＦＡｕ種の分布を推定した。

Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）は、総ＦＦＡを増大させ、これにより、非結合ビリ
ルビンを増大させうることが知られているが、例１２の結果は、非結合ＦＦＡ（ＦＦＡｕ
）が、総ＦＦＡよりはるかに大きな倍数で増大しうることを裏付ける。総ＦＦＡのアルブ
ミンに対する比は、直線的に増大する（Ａｍｉｎの研究では約１０倍［Ａｍｉｎ ＳＢ、
「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｏｎ ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ
−ａｌｂｕｍｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｕｎｂｏｕｎｄ ｂｉ
ｌｉｒｕｂｉｎ ｉｎ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｆａｎｔｓ」、ＪＰＥＮ Ｊ Ｐａｒ
ｅｎｔｅｒ Ｅｎｔｅｒａｌ Ｎｕｔｒ、３４：４１４〜４２０、２０１０］）が、ＦＦ
Ａのアルブミンに対する比が１０００倍を超えて大きいときには、ＦＦＡｕが本質的に指
数関数的に増大する（表９）ために、この結果が得られる。例１２では、患者のうちの２
例のＦＦＡｕのレベルが６００および１２００ｎＭであるのに対し、正常レベルは、１〜
２ｎＭである［Ａｐｐｌｅ ＦＳ、Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、およびＡｄａｍｓ ＪＥ
、「Ｕｎｂｏｕｎｄ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
Ａｒｅ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｉｓｃｈｅｍｉａ」、Ｃｌｉｎ
ｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、１：４１〜４４、２００４］。６００ｎＭよりはるか
に低いレベルであってもなお、多くの研究により、心毒性、免疫反応の遮断のほか、多く
の細胞機能に対する有害作用を含め、ＦＦＡ（またはＦＦＡｕ）の毒性作用が裏付けられ
ている［Ｋｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭおよびＯｋａｄａ Ｃ、「Ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａ
ｃｉｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓ
ｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｍｅｄｉ
ａｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ」、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ、４６：１９８３〜１９９０、２
００５；Ｏｌｉｖｅｒ ＭＦ、「Ｓｕｄｄｅｎ ｃａｒｄｉａｃ ｄｅａｔｈ：ｔｈｅ
ｌｏｓｔ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ」、ＱＪＭ、９９、７０１〜７
０９、２００６］。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）注入時においてＦＦＡｕレベルを
モニタリングすることによるだけで、ＦＦＡｕ毒性の危険性がある乳児を同定しうる。

Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）から生成する主要な（＞７５％）ＦＦＡ種は、リノ
ール酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびリノレン酸のＦＦＡである。ＡＤＩＦＡＢ２
は、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）が１．５〜５．５％の間でだけ含有するステアリ
ン酸に最も特異的であるために、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、およびリノレ
ン酸のＦＦＡに対して特異的なＦＦＡｕプローブによれば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録
商標）の加水分解に起因する血漿中のＦＦＡｕの上昇が、より正確かつ高感度に検出され
るであろう。このようなＦＦＡｕプローブが、米国特許第７，６０１，５１０号および米
国特許出願公開第２０１０／０２９８１６２号、ならびに［Ｈｕｂｅｒ ＡＨ、Ｋａｍｐ
ｆ ＪＰ、Ｋｗａｎ Ｔ、Ｚｈｕ Ｂ、およびＫｌｅｉｎｆｅｌｄ ＡＭ、「Ｆａｔｔｙ
ａｃｉｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ ｔｈ
ｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔ ｕｎｂｏｕｎｄ ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｅｑｕｉｌｉｂｒｉ
ｕｍ ｗｉｔｈ ａｌｂｕｍｉｎ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５：１４２６３〜１
４２７４、２００６］において記載されている方法を用いて作製されている（表１０）。
高感度なＦＦＡｕプローブは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の滴定早期における患
者のＦＦＡｕレベルの上昇を検出する（これは、非結合ビリルビンおよびＦＦＡｕが毒性
レベルに達することを防止するためにきわめて重要である）のに必要である。

当業者により、本発明の精神から逸脱しない限りにおいて、多数で多様な改変を施しう
ることが理解されるであろう。したがって、本発明の形態は、例示的なものであるに過ぎ
ず、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを明確に理解されたい。

Claims (14)

1. ポリスチレンビーズまたはラテックスビーズ、あるいはＮｉ−アガロースビーズを含む固体基質と、該固体基質に付着しているプローブを有するプローブが付着した固体基質であって、
   前記プローブが、１または複数のアミノ酸置換を含む配列番号３に対応する細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）と、ｉＬＢＰのＮ末端アミノ基であるリシン残基または配列番号３のシステイン置換へと付着させた第一のフルオロフォアとを含み、
   配列番号３のＣ末端Ｈｉｓタグは、１つまたは２つの６−Ｈｉｓタグと組み合わせた１つのまたは複数のリンカーによって置換されており、該リンカーは、ＧＧＳＧＳＧＳＧ、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＴＧＧＧＳＧＧＧＲＲＡＤＡＡ、ＳＲＡＷＲＨＰＱＦＧＧ，ＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰ、ＲＬＬＬＲＲＬＲＲ、ＲＩＩＩＲＲＩＲＲ，ＡＡＳ、ＮＤＮ、ＰＳＮＴＮＨＮＳＮＳＮ、ＳＨＲＡＴＰＮＴＳＰＨ及びこれらの組合せから選択され、
   前記プローブはビリルビンには結合するが脂肪酸に有意には結合しない
   ことを特徴とするプローブが付着した固体基質。
2. 前記プローブが、置換１４Ｒ、１８Ｌ、２５Ｃ、２７Ａ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｌ、１１５Ｒ及び１１７Ｄ （ＢＬ２２Ｐ１Ｂ１１）を含む、請求項１に記載のプローブが付着した固体基質。
3. 前記プローブが、置換１４Ｒ、１８Ｌ、３８Ｖ、６０Ｒ、７３Ｆ、１０６Ｃ、１１５Ｒ、および１１７Ｄ （Ｌ２４Ｐ１９Ｃ７）を含む、請求項１に記載のプローブが付着した固体基質。
4. 以下の（１）及び（２）：
   （１）前記１または複数のアミノ酸置換が、配列番号３の１４、１８、２３、２５、２７、３１、３６、３８、５５、６０、７２、７３、７４、７８、１０２、１０４、１０６、１１５ および１１７位から選択される、
   （２）前記第一のフルオロフォアが、前記プローブのシステイン置換へと付着し、該システイン置換が、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７ および９８位からなる群から選択される、
   の少なくとも１つを満たす、請求項１に記載のプローブが付着した固体基質。
5. 前記第一のフルオロフォアが、前記プローブのリシン置換へと付着し、該リシン置換が、２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７ および９８位からなる群から選択される、請求項１に記載のプローブが付着した固体基質。
6. 前記ポリスチレンビーズまたは前記ラテックスビーズ、あるいは前記Ｎｉ−アガロースビーズが、鉄のコアおよび／またはマイクロ流体デバイスもしくはマルチウェルプレートを伴う、請求項１乃至５のいずれか１項に記載のプローブが付着した固体基質。
7. 前記プローブが、置換７Ｒ、２０Ｒ、４６Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ および１３０Ｒ（ＫＲ６）をさらに含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプローブが付着した固体基質。
8. 前記プローブが、置換７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒ および１３０Ｒ（ＫＲ１４）をさらに含む、請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプローブが付着した固体基質。
9. 配列番号３のＮ末端ＡＦＤが、ＭＧＩＦＤ、ＭＧＣＦＤ、ＭＧＧＳＡＴＧＩＦＤ、ＭＧＡＣＳＧＧ、ＭＧＳＡＧＣＧ、ＭＧＧＧＧＣＣ、ＭＧＧＳＧＧＣ、ＭＧＤＴＡＧＣ、ＭＧＧＤＣＧＧ、ＭＧＧＣＳＧＡ、ＭＧＧＧＤＧＣ、ＭＧＳＳＮＳＣ、ＭＧＳＤＣＡＹ、ＭＧ
   ＤＴＮＣＧ、ＭＧＧＳＧＣＳ、ＭＧＧＣＧＣＧ、ＭＧＡＮＡＣＧ、ＭＧＧＧＡＣＧ、ＭＧＧＮＣＧＧ、ＭＧＣＧＧＳＣ、ＭＧＧＳＴＳＣ、ＭＧＤＧＧＣＳ、ＭＧＡＴＳＣＧ、ＭＧＡＳＣＧＹ、またはＭＧＤＧＡＣＧにより置換されている、請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプローブが付着した固体基質。
10. 前記プローブが、ビルリビンに結合しないタンパク質に付着した第２のフルオロフォアを更に含み、該ビルリビンに結合しないタンパク質は前記固体基質に付着している、請求項１乃至９のいずれか１項に記載のプローブが付着した固体基質。
11. 第１のフルオロフォアがシステインへと付着し、アクリロダン、ダンジルアジリジン、４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ］−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾールエステル（ＩＡＮＢＤＥ）、および４−［Ｎ−［（２−ヨードアセトキシ）エチル］−Ｎ−メチルアミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＩＡＮＢＤＡ）からなる群から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群から選択される、請求項１０に記載のプローブが付着した固体基質。
12. 第１のフルオロフォアが、リシンへと付着し、アクリロダン、Ｂｉｏｔｉｕｍ ＣＦ７５０ＳＥ、Ｋｏｄａｋ Ｘ−Ｓｉｇｈｔ ６７０ ＬＳＳ色素、ＬｉＣｏｒ ＩＲ Ｄｙｅ ６８０ ＬＴ、およびＬｉＣｏｒ ＩＲ Ｄｙｅ７００ＤＸからなる群から選択され、第２のフルオロフォアが、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ、フルオレセイン誘導体、ローダミン誘導体、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群から選択される、請求項１０に記載のプローブが付着した固体基質。
13. 前記第一及び第二のフルオロフォアの発光強度が、ビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光により影響されない、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載のプローブが付着した固体基質。
14. 前記ビルリビンに結合しないタンパク質が、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグおよびＡＣＰタグから選択される、請求項１０または１３に記載のプローブが付着した固体基質。

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