CN111334079A - 一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料及其合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，该染料由4‑酰胺基取代萘酰亚胺类染料、双烷氧基取代的萘酰亚胺类荧光染料、双氨基取代萘酰亚胺类荧光染料、9,10‑双氨基取代苝酰亚胺、六元环并罗丹明类染料、五元环并罗丹明类染料、硅基罗丹明类染料中的一种或几种按任意比混合。相比于目前的商业染料，本发明的荧光染料光稳定性更高，半峰宽更窄(25nm)，对pH、极性、温度等多种外界环境均保持不敏感性。通过Click基团、蛋白标签、药物分子等活性基团的引入，得到的功能化荧光分子具有很高的生物相容性，能够对活细胞及活体进行快速、特异性染色。此外，由于光稳定性及荧光亮度的提升，该系列染料实现了Storm，STED、SIM等多种模式下的超分辨荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于荧光染料领域，具体涉及一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成及其应用。
背景技术
有机荧光染料从荧光构效关系上可分为共振(Resonant)染料与电荷转移(ChargeTransfer，CT)染料，而荧光性质决定于基态与激发态间的电子传递，这样通过构效关系的研究可以实现不同光性能需求的结构改造，或者对于已知结构进行发光性能的精准预测。荧光素、罗丹明、Bodipy与大部分菁染料等均归属于共振染料，其拥有窄的吸收与发射峰、溶剂不敏感、斯托克斯位移小、高摩尔消光系数及高量子产率等发光性能；而电荷转移染料(例如1,8-萘酰亚胺和香豆素等)存在明确的电子供体与电子受体，其具有较宽的吸收与发射峰、溶剂敏感、大斯托克斯位移、相对较低的摩尔吸光系数等发光性能。此外，电荷转移染料的光谱性质受强极性环境影响较大，在近红外区荧光量子产率极低。科研工作者应根据不同的生物应用需求选择合适的荧光染料，例如：荧光标记时通常选择光亮度高和环境不敏感的共振染料；而荧光探针往往选择环境敏感的电荷转移染料。
目前，被用于荧光标记的有机小分子荧光染料主要集中于高量子产率、半峰宽较窄的荧光素、罗丹明、Bodipy与菁染料。1953年，荧光素第一次用于免疫荧光的标记，而后罗丹明染料等多种有机小分子荧光染料也逐渐被开发并应于荧光标记。尽管，有机荧光染料种类繁多、性能不同，但是每种染料都有明显的缺点。荧光素的发光形式是一种带有负电荷的荧光团，此形态pH极其敏感，稳定性极差。并且这种负电荷形式的细胞渗透性很差，严重影响其对活细胞内靶标分子的标记。相反，罗丹明类染料是一种具有很好膜渗透性与稳定性的正离子荧光染料。由于线粒体内电势作用，这种正离子形式容在细胞内容易进入线粒体内进行非特异性标记。菁染料以其近红外的荧光发射波长常常被用于活体及组织的成像，在组织中穿透能力强同时屏蔽了自发荧光。但是，菁染料的光稳定及低的量子产率一直成为限制其应用的一道屏障。
而随着超分辨荧光技术发展，有机荧光染料以其高量子产率、分子结构小、易功能化等优势得到了广泛应用，但同时对荧光染料的性能提出了更高的要求。罗丹明与菁染料由于其meso-位的较高活性被成功应用于dSTORM，PALM荧光成像(文献)。此外，极高稳定性让罗丹明在STED中也得以应用。相比之下，荧光素与Bodipy因为其稳定性太差在此领域应用较少。2015年，Yamaguchi课题组开发了一种磷掺杂的新型荧光染料C-Naphox并成功将其应用于STED超分辨荧光成像(图)。PB430在STED超分辨荧光成像呈现出比Alexa Fluor 488更高的光稳定。但是，其低的摩尔消光系数导致亮度只有6900M-1cm-1(ε×Φ)。
虽然，大量商业染料已经被开发并广泛应用，但仍然需要克服现有染料的局限性来满足不同领域对其的需求。其中超分辨技术的发展更突显了这一需求的迫切性。小分子量、高吸光能力、高稳定性、高细胞渗透性及窄的发射峰的有机荧光染料仍需要进一步去开发、衍生以至实际应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，该体系荧光染料具有极高生物相容性，在20s到5min中内即可完成对活细胞染色。以此类染料进行的功能化荧光分子能够能够特异性标记目标分子或细胞器。
本发明的另一目的是提供一种高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，该方法具有操作简便、容易衍生、便于提纯等优点。
本发明提供一种高亮度、高稳定性荧光染料，以萘酰亚胺与苝酰亚胺为荧光基团，在供电基一端引入两个氨基取代基使其稳定性及荧光亮度得到大幅提升。此外，这类染料能够对黏度、pH、温度等外界微环境均呈现不敏感性。
本发明提供一类基于新型荧光染料的功能化荧光分子，该类荧光分子具有很高细胞渗透性，能够对多种活细胞进行快速染色，并成功应用于荧光标记、荧光成像等领域。
本发明一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，激发波长覆盖全波段，该染料在供电子一端通过刚性环胺结构的调节抑制了分子内扭转，实现了荧光量子效率的提高，光稳定性的提升，该染料由4-酰胺基取代萘酰亚胺类染料、双烷氧基取代的萘酰亚胺类荧光染料、双氨基取代萘酰亚胺类荧光染料、9,10-双氨基取代苝酰亚胺、六元环并罗丹明类染料、五元环并罗丹明类染料、硅基罗丹明类染料中的一种或几种按任意比混合。
所述4-酰胺基取代萘酰亚胺类染料，其吸收波长覆盖350-400nm可用于360nm，405nm激发进行荧光检测及成像，其结构式为：
其中，R1为H、C1-4烷基、芳基、(CH2)mCOOMe、生物靶向基团如N-乙基吗啉，苄基鸟嘌呤等。X为1,2,3,4及其他整数；m为0-4整数。
所述4-酰胺基取代萘酰亚胺类染料的合成路线为：
具体步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-烷基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于四氢呋喃中，并在0℃下向该反应液中滴加氯取代烷基酰氯；滴加完毕后将混合液转移至室温反应6-10h。减压除去溶剂后，去离子水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼并用甲醇洗涤，真空干燥得N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物；
(2)染料N-烷基基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-烷基基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物，溶于乙腈中，并向其中加入碳酸钾。将反应液缓慢升温至50-90℃，并持续反应1-3h。减压除去溶剂，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比为200～800:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-烷基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物。
步骤(1)中，N-烷基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与四氢呋喃的体积比为2-25:1mg/mL；
氯取代烷基酰氯与四氢呋喃体积比为1:10-80、
氯取代烷基酰氯与去离子水体积比为1:5-50、
氯取代烷基酰氯与甲醇的体积比为1:10-20。
步骤(2)中，N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物与碳酸钾质量比1:1-4；碳酸钾的质量与乙腈的体积比为10-20:1mg/mL。
所述双烷氧基取代的萘酰亚胺类荧光染料，其吸收波长位于390nm，荧光发射波长在用于405nm激发，其结构式如下：
R3,R4分别独立则为
若R3,R4不独立则为
以整体结构存在
p为0-2整数。
所述双烷氧基取代的萘酰亚胺类荧光染料的合成步骤如下：
具体步骤如下：
(1)染料N-丁基-4,5-二烷氧基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将多元醇溶于干燥的四氢呋喃中，鼓吹氮气下加入Na块，0.5-1h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺并加热至60-90℃,2-10h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:1～4的二氯甲烷和石油醚＝为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体N-丁基-4,5-二烷氧基-1,8-萘酰亚胺。
步骤(1)中，多元醇、钠块的质量比为2-1:1；多元醇、N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量比为2:1-12；多元醇的质量与四氢呋喃的体积比为1-10:1mg/mL；
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料，其吸收波长为440-490nm，能够通过450nm、488nm激光进行激发，通过靶向基团的改变可用作以下染料：线粒体荧光染料、SNAP-tag荧光染料、Halo-tag荧光染料、活性酯荧光染料、药物靶向荧光染料等，其结构式如下：
其中R2为H、C1-16烷基、芳基、取代芳基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOMe和(CH2)mSO3H、杂芳基或取代杂芳基，生物靶向基团如N-乙基吗啉，苄基鸟嘌呤，正己烷基-三苯基膦，叶酸，秋水仙素，紫杉醇，6-氯己烷基等。
R5,R6分别独立则为
中的一种，若R5,R6不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；
Y为砜基，亚砜基，二甲基硅烷基，硼烷基；
m、n为0-4整数。
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料合成步骤如下：
具体步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和苄胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以石油醚与二氯甲烷或体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
(2)染料N-烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪环胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
步骤(1)中：4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：脂肪伯胺的质量比为1:0.5-2；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
脂肪伯胺包括甲胺、乙胺、丁胺、正十二胺、正十六胺等直链烷基胺、苄胺类似物、氨基取代烷基磺酸、氨基醇等。
步骤(2)中：N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:1-3；N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL；
脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶、环己亚胺、乙二胺衍生物及环己二胺衍生物。
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料中用于线粒体标记的线粒体荧光染料，其结构如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。线粒体荧光染料的合成路线如下：
具体步骤为：
(1)中间体N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的合成：
将N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐于乙酸乙酯，向其中滴加三溴化磷，缓慢升温至60-80℃搅拌4-12h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐。
(2)中间体N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的合成：
将N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐和三苯基膦溶于乙腈中，升温至120-140℃，反应18-30h结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐。
(3)线粒体探针的合成：
将N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐溶于乙二醇甲醚，向其中滴加脂肪胺，升温至100-140℃搅拌，反应10-15h后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到
步骤(1)中特征在于：N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐与三溴化磷的质量比为1:1.7-5；N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的质量与乙酸乙酯的体积比为20-30:1mg/mL。
步骤(2)中特征在于：N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐与三苯基膦的质量比为：1:2.7-8；N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的质量与乙腈的体积比为15-30:1mg/mL。
步骤(3)中特征在于：N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐与脂肪胺的质量比为：1.6-2.4:1；N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的质量与乙二醇甲醚的体积比为5.3-24:1。
脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶、环己亚胺、乙二胺衍生物及环己二胺衍生物。
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料中SNAP-tag荧光染料，其特征在于结构如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n
为0-4整数。
SNAP-tag荧光染料的合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针。
步骤(1)中：N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-200g/mL。
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料中Halo-tag荧光染料，其特征在于结构如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。Halo-tag荧光染料的合成步骤如下：
具体步骤如下：
(1)Halo-tag探针的合成
将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺与NaH置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针。
步骤(1)中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺与NaH的质量比为5-10:1；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺的质量与1-碘-6-氯己烷体积比为0.5-1mg/μL；
N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺体积比为5-20:1mg/mL。
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料中活性酯荧光染料，其结构如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。活性酯荧光染料的合成步骤如下：
具体步骤如下：
(1)中间体N-1-(羧基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COOH-DF系列化合物
COEt-DF系列化合物溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得COOH-DF系列化合物；
(2)带有NHS活性基团的荧光染料合成
将COOH-DF系列化合物，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中；2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比20:1-4:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料染料。
步骤(1)中，COEt-DF系列化合物的质量与甲醇的体积比为10-20:1mg/mL；COEt-DF系列化合物的质量与2M氢氧化钠溶液的体积比为10-20:1mg/mL；COEt-DF系列化合物的质量与水的体积比为10-20:1mg/mL。
步骤(2)中，COOH-DF系列化合物、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；COOH-DF系列化合物的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1mg/mL。
所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料中药物靶向荧光染料，其结构如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
所述药物靶向荧光染料的合成步骤如下：
具体步骤如下：
(1)含药物性的荧光染料的合成
10-30mg带有NHS活性基团的系列染料与带有活性氨基的药物分子置于史莱克瓶中，并用氮气置换2-5次。2-20μL二异丙基乙基胺溶于0.5-2mL干燥的二甲基亚砜中并加入反应瓶中。室温下搅拌3-10h后，水洗并用二氯甲烷萃取得有机相，硅胶柱分离得药物分子为靶向基团的荧光染料。
药物分子包括紫杉醇、秋水仙素、磺胺、生物素、叶酸等。
步骤(1)中，NHS活性基团的系列染料与药物分子的质量比为1:0.5-1；NHS活性基团的系列染料的质量与二异丙基乙基胺的体积比为2-5:1mg/μL；二异丙基乙基胺与二甲基亚砜的体积比为1:100-300。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料中双取代的9，10双氨基取代苝酰亚胺类染料，其特征在于可用于680nm，710nm激光进行发，结构如下：
其中：R11为
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料中双取代的苝酰亚胺类染料的合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体N-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺溶于N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中；将反应液加热至100-140℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体，真空干燥，200-300目硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷：石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得深红色固体N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺；
(2)探针N-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪胺；而后将反应液缓慢升温至90-130℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，200-300目分离，以体积比为1:0-1的二氯甲烷：石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂，得蓝色固体探针N-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺。
步骤(1)中，所述9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺的质量比为1-10:1；所述9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与N-甲基吡咯烷酮的质量与体积比为1:20-120g/mL；所述N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为1-3:3-4；
步骤(2)中，所述N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺与脂肪胺的质量比为1:6-8；所述脂肪胺与乙二醇甲醚质量与体积比为5-120:1mg/mL；所述脂肪胺包括氨水、氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶或环己二胺衍生物等。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料中用于532nm激发的六元环并罗丹明类染料，其结构如下：
R12为5-位并六元环或者7-位并六元环；
R13为H或者C1-4烷烃。
六元环并罗丹明类染料的合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸的合成
将中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉和邻苯二甲酸酐溶于甲苯中，加热回流4-8h后停止反应，冷却至室温后，再用冰水浴静置30min–60min后，过滤，滤饼用少量石油醚洗涤，滤饼干燥得中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸粗产品；
(2)目标染料的合成
中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉(或者其类似物N-取代-7-羟基四氢喹啉)与中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸溶于甲磺酸和三氟乙酸的混合酸性溶剂中，氮气保护下，加热到140℃，反应两天后，减压除去大部分溶剂后用弱碱性水溶液调节pH值到9-10，二氯甲烷萃取，收集有机相后干燥，除去有机溶剂后，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得最终产品；
步骤(1)中，中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸和邻苯二甲酸酐的质量比为1:1-2，中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸的质量与甲苯的体积比为1:40-80g/mL；
步骤(2)中，中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉(或者其类似物N-取代-7-羟基四氢喹啉)与中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸的质量比为1:2-4；三氟乙酸和甲磺酸的体积比为1:1-5；中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉(或者其类似物N-取代-7-羟基四氢喹啉)的质量与三氟乙酸的体积比为1:30-80g/mL。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料中五元环并罗丹明类染料，其结构如下：
其中，R13为H或者C1-4烷烃。
五元环并罗丹明类染料的合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸的合成
中间体N-烷基-4羟基吲哚啉和邻苯二甲酸酐溶于甲苯中，加热回流4-8h后停止反应，冷却至室温后，于冰水浴静置30min-60min后，过滤，滤饼用少量石油醚洗涤，滤饼干燥得中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸；
(2)目标染料的合成
中间体N-烷基-4羟基吲哚啉和中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸溶于甲磺酸和三氟乙酸的混合酸性溶剂中，氮气保护下，加热到140℃,反应两天后，减压除去大部分溶剂后用弱碱性水溶液调节pH值到9-10，二氯甲烷萃取，收集有机相后干燥，除去有机溶剂后，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得最终产品；
步骤(1)中，中间体N-烷基-4羟基吲哚啉与邻苯二甲酸酐的质量比为1:1-2，中间体N-烷基-4羟基吲哚啉的质量与甲苯的体积比为1:20-40g/mL；
步骤(2)中，中间体N-烷基-4羟基吲哚啉和中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸的质量比为1:2-3，三氟乙酸和甲磺酸的体积比为1:1-5，中间体N-烷基-4羟基吲哚啉的质量与三氟乙酸的体积比为1：10-30g/mL。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料中硅基罗丹明类染料，其结构如下：
其中：q＝0或1；
R13为H、C1-4烷基.
硅基罗丹明类染料的合成路线如下：
具体步骤如下：
(1)目标荧光分子对称型硅基罗丹明的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体Si-keto的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到目标荧光染料分子；
具体步骤如下：
(2)目标荧光染料不对称型硅基罗丹明的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体Si-ketos的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品；粗产品经过柱层析分离，洗脱剂为体积比为50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，减压除去有机溶剂后得到目标荧光染料分子；
步骤(1)中，中间体Si-keto与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-8，中间体Si-keto的质量与丁基锂溶液的体积比为10-20：1mg/mL；
步骤(2)中，中间体Si-ketos与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-7，丁基锂溶液与四氢呋喃的体积比为1：30-50，中间体Si-ketos的质量与丁基锂的体积比为1:10-20mg/μL。
上述用于一类高亮度、高稳定性的荧光染料具有较高生物相容性，通过功能化后能够对活细胞不同细胞器、不同蛋白靶点等进行实时荧光成像，在STED、SIM等超分辨荧光显微技术中得以应用。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料在活细胞、组织及活体的荧光成像领域的应用。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料在SNAP-tag、Halo-tag的识别标记领域的应用。
一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料在活细胞、组织及活体的荧光成像领域的应用。
本发明具有以下特征：
本发明涉及的染料拥有合成方法简单、原料廉价且易于功能化等优点。
本发明涉及的部分染料在不同有机溶剂中荧光发射半峰宽<40nm，最窄可达25nm；荧光量子产率显著提高，水中可达0.80,；光稳定性明显高于荧光素、罗丹明、氟硼吡咯类染料。
基于该类染料荧光母体的功能化分子具有高生物相容性，能够在20s-5min内完成对细胞的荧光标记。其中，线粒体系列荧光探针能够在2分钟内完整对多种活细胞线粒体的标记。蛋白靶向的荧光探针与蛋白结合后实现了十几倍的荧光增强，能够实现活细胞内的免洗荧光成像。脂滴染料在HT29(结肠癌细胞)、MCF(乳腺癌细胞)、脂肪细胞等多种细胞系中均能对脂滴进行精准定位；同时能够对斑马鱼活体脂类代谢中心(肝脏)进行标记及荧光成像。
本发明涉及的染料光稳定性的提升使染料能够实现超分辨荧光成像，相比于传统荧光染料Alexa 488光稳定性更高。
附图说明
图1为实施例1制备的PAm的核磁谱图氢谱。
图2为实施例2制备的BAm的核磁谱图氢谱。
图3为实施例8制备的BuAN-DAze的核磁谱图氢谱。
图4为实施例8制备的BuAN-DAze的核磁谱图碳谱。
图5为实施例9制备的BuAN-DAzo的核磁谱图氢谱。
图6为实施例10制备的BuAN-DPip的核磁谱图氢谱。
图7为实施例11制备的BuAN-DHMI的核磁谱图氢谱。
图8为实施例12制备的BuAN-450的核磁谱图氢谱。
图9为实施例13制备的BuAN-AzeAzi的核磁谱图氢谱。
图10为实施例15制备的BuAN-AzeAzo的核磁谱图氢谱。
图11为实施例16制备的BuAN-AzePip的核磁谱图氢谱。
图12为实施例17制备的BuAN-EDA的核磁谱图氢谱。
图13为实施例18制备的BuAN-DAC的核磁谱图氢谱。
图14为实施例20制备的Halo-DAze的核磁谱图氢谱。
图15为实施例22制备的SNAP-DAze的核磁谱图氢谱。
图16为实施例24制备的SNAP-DAC的核磁谱图氢谱。
图17为实施例25制备的Mito-DAze的核磁谱图氢谱。
图18为实施例32制备的Lyso-DAze的核磁谱图氢谱。
图19为实施例33制备的Nu-DAC的核磁谱图氢谱。
图20为实施例34制备的SML-DAze的核磁谱图氢谱。
图21为实施例38制备的Tro-DAC的核磁谱图氢谱。
图22为实施例39制备的CM-DAze的核磁谱图氢谱。
图23为实施例42制备的MBAN-DAC的核磁谱图氢谱。
图24为实施例45制备的COOH-DAze的核磁谱图氢谱。
图25为实施例50制备的NHSB-DAC的核磁谱图氢谱。
图26为实施例57制备的UNAA-DAC的核磁谱图氢谱。
图27为实施例59制备的BuLD-DAze的核磁谱图氢谱。
图28为实施例61制备的OLD-710的核磁谱图氢谱。
图29为实施例64中制备的染料Rho-1的核磁谱图氢谱。
图30为实施例69中制备的染料SiR-1的核磁谱图氢谱。
图31为实施例42制备的MBSO3-DAC的高分辨质谱。
图32为实施例55制备的Col-DAC的高分辨质谱。
图33为实施例56制备的DTX-DAC的高分辨质谱。
图34为实施例8制备的染料料BuAN-DAze在乙醇中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图35为实施例9制备的染料料BuAN-DAzo在乙醇中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图36为实施例61制备的染料料OLD-710在乙醇中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图37为实施例64制备的染料料Rho-1在乙醇中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图38为实施例69制备的染料料SiR-1在乙醇中归一化的荧光激发谱图与荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图39为实施例8制备的染料料BuAN-DAze在500W钨灯照射下495nm处荧光强度随时间变化图，选取商业绿色线粒体染料、罗丹明123、荧光素、Bodipy作为参比染料。
图40为实施例25制备的染料Mito-DAze的RWPE细胞活细胞荧光共聚焦成像图。
图41为实施例25制备的染料Mito-DAze的RWPE细胞活细胞结构光照明显微成像图。
图42为实施例27制备的染料Mito-DAC的HeLa细胞活细胞荧光共聚焦成像图。
图43为实施例60制备的脂滴染料OLD-DAze的脂肪细胞活细胞荧光共聚焦成像图。
图44为实施例20制备的染料Halo-DAze在转染的HALO-H2B的HeLa细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图45为实施例24制备的染料SNAP-DAC在转染的pSNAPf-H2B的HeLa细胞荧光共聚焦成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图46为实施例24制备的染料SNAP-DAC在转染的pSNAPf-H2B的HeLa细胞受激辐射损耗显微成像图，荧光探针的浓度为1μM。
图47为实施例67制备的Rho-4与实施例33制备的Nu-DAC对RWPE细胞的结构光照明显微多色成像图
图48为实施例60制备的OLD-DAze与实施例33制备的Nu-DAC对HT29细胞的结构光照明显微多色成像图。
具体实施方式
实施例1
染料N-丁基-4-环丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(PAm)的合成
中间体N-丁基-4-(3-氯)丙酰胺基-1,8萘酰亚胺(ClPAm)的合成：
将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺(200mg,0.75mmol)溶于100mL四氢呋喃中，在0℃下向该反应液中滴加1.25mL 3-氯丙酰氯。滴加完毕后将混合液转移至室温反应6h。减压除去溶剂后，60mL水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼，用25mL甲醇洗涤滤饼，真空干燥得N-丁基-4-(3-氯)丙酰胺基-1,8-萘酰亚胺180mg，产率67％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CD3CN)δ8.91(s,1H),8.59(dd,J＝7.3,0.9Hz,1H),8.54(d,J＝8.1Hz,1H),8.52–8.48(m,1H),8.29(d,J＝8.1Hz,1H),7.85(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),4.15–4.10(m,2H),3.98(t,J＝6.3Hz,2H),3.08(t,J＝6.3Hz,2H),1.69(dt,J＝7.7,6.6Hz,2H),1.44(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),1.00(t,J＝7.4Hz,3H).
染料N-丁基-4-环丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(PAm)的合成：
将N-丁基-4-(3-氯)丙酰胺基-1,8萘酰亚胺(100mg,0.28mmol)，溶于10mL乙腈中，并向其中加入碳酸钾100mg。反应液缓慢升温至50℃，并在此温度持续反应3h。减压除去溶剂，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1(体积比)为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-丁基-4-环丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(PAm)60mg，产率67％。实施例1制备的PAm的核磁谱图氢谱如图1所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.82(dd,J＝8.6,1.0Hz,1H),8.65(dd,J＝7.3,1.0Hz,1H),8.57(d,J＝8.1Hz,1H),7.77(dd,J＝8.6,7.3Hz,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),4.24–4.10(m,2H),4.06(t,J＝4.8Hz,2H),3.32(t,J＝4.8Hz,2H),1.78–1.64(m,2H),1.45(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.98(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.32,164.21,163.64,140.75,131.88,131.72,131.22,129.46,126.35,123.86,122.80,119.38,116.14,41.06,40.27,36.20,30.21,20.40,13.85.
经检测，其结构如上式PAm所示。由于环丁酰胺与萘酰亚胺平面达到更好的共轭导致吸收的大幅红移，这使得PAm在氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的紫外吸收波长在405nm仍然有很强的吸收，便于激发得到高亮度荧光。
实施例2
染料N-丁基-4-环戊酰胺基-1,8萘酰亚胺(BAm)的合成
中间体N-丁基-4-(4-氯)丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(ClBAm)的合成：
将N-丁基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺(400mg,1.49mmol)溶于16mL四氢呋喃中，在0℃下向该反应液中滴加1.6mL 4-氯丁酰氯。滴加完毕后将混合液转移至室温反应10h。减压除去溶剂后，8mL水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼，用16mL甲醇洗涤滤饼，真空干燥得N-丁基-4-(4-氯)丁酰胺基-1,8-萘酰亚胺340mg，产率61％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(d,J＝7.2Hz,1H),8.61(d,J＝8.2Hz,1H),8.42(d,J＝6.8Hz,1H),8.20(d,J＝8.5Hz,1H),7.88(s,1H),7.84–7.75(m,1H),4.28–4.11(m,2H),3.81–3.67(m,2H),2.80(t,J＝6.6Hz,2H),2.31(dt,J＝13.0,6.5Hz,2H),1.72(dt,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.45(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).
N-丁基-4-环戊酰胺基-1,8萘酰亚胺(BAm)的合成：
将N-丁基-4-(4-氯)丁酰胺基-1,8萘酰亚胺(60mg,0.17mmol)，溶于12mL乙腈中，并向其中加入碳酸钾240mg。反应液缓慢升温至90℃，并在此温度持续反应1h。减压除去溶剂，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：甲醇＝400:1为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-丁基-4-环戊酰胺基-1,8萘酰亚胺(BAm)45mg，产率80％。实施例2制备的BAm的核磁谱图氢谱如图2所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),8.60(d,J＝2.7Hz,1H),8.13(d,J＝8.4Hz,1H),7.76(t,J＝7.9Hz,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),4.26–4.10(m,2H),3.99(t,J＝6.9Hz,2H),2.75(t,J＝8.0Hz,2H),2.47–2.32(m,2H),1.71(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.44(dq,J＝14.7,7.3Hz,2H),0.98(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ175.23,163.98,163.57,141.85,131.67,131.22,129.93,129.25,127.82,127.13,124.15,123.23,121.99,51.67,40.26,31.58,30.18,20.36,19.45,13.85.
经检测，其结构如上式BAm所示，该染料可用于405nm激光激发。
实施例3
DOAN的合成
N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成：
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.0g,3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加正丁胺(250mg，3.43mmol)。40℃下12h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.5Hz,2H),1.68(m,2H),1.40(m,J＝7.8Hz,2H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
DOAN的合成：
将乙二醇(20mg，0.33mmol)溶于10mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(20mg，0.89mmol)，0.5h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(120mg，0.31mmol)并加热至80℃,10h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：石油醚＝1:2为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体DOAN 12mg，产率12％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.44(d,J＝8.3Hz,2H),7.23(d,J＝8.4Hz,2H),4.31(s,4H),4.06–3.96(m,2H),1.60(td,J＝13.2,6.2Hz,2H),1.34(td,J＝14.2,7.3Hz,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式BAm所示，该染料在405nm处有较强吸收可用于405nm激发的荧光染料。
实施例4
OEOAN的合成：
N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成：
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(500mg,1.56mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加正丁胺(250mg，3.43mmol)。90℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体193mg，产率33％。
OEOAN的合成：
将乙二醇(100mg，1.67mmol)溶于10mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(77mg，3.34mmol)，1h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)并加热至60℃持续反应3h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝100:1为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体OEOAN 40mg，产率81％。实施例4制备的OEOAN的核磁谱图氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.43(d,J＝8.4Hz,2H),7.22(d,J＝8.5Hz,2H),5.21(t,J＝5.7Hz,2H),4.23(s,4H),4.06–3.96(m,2H),3.91(d,J＝4.0Hz,4H),1.60(td,J＝13.5,6.3Hz,2H),1.34(td,J＝14.4,7.2Hz,2H),0.93(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.69,162.86,134.26,131.88,114.04,114.01,107.88,71.42,60.20,30.21,20.31,14.21.
经检测，其结构如上式OEOAN所示，OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的荧光发射波长在420-450nm，荧光波长基本不随溶剂极性变化，半峰宽<50nm，避免了荧光成像及检测中不同极性环境对荧光信号的干扰。OEOAN在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的紫外吸收波长在405nm有很强的吸收，便于激发得到高亮度荧光。此外，该染料受极性变化影响较小。
实施例5
DOEOAN的合成：
将二甘醇(50mg，0.47mmol)溶于5mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(50mg，2.18mmol)，0.5h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)并加热至60℃持续反应2h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：甲醇＝50:1为洗脱剂，减压除去溶剂得淡黄色半固体DOEOAN 14mg，产率23％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.21(d,J＝8.6Hz,2H),5.46(t,J＝5.8Hz,2H),4.25(s,4H),4.06–3.94(m,2H),3.92-3.65(m,12H),1.61(td,J＝13.0,6.2Hz,2H),1.36(td,J＝142,7.1Hz,2H),0.95(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式DOEOAN所示，该染料在405nm处有较强吸收可用于405nm激发的荧光染料。
实施例6
DMOAN的合成：
将1,2-二甲基乙二醇(30mg，0.33mmol)溶于30mL干燥的四氢呋喃中，氮气下加入Na块(15mg，0.87mmol)，0.5h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(126mg，0.33mmol)并加热至90℃,8h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以二氯甲烷：石油醚＝1:2为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体DMOAN 9mg，产率8％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.41(d,J＝8.2Hz,2H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),4.47(m,2H),4.01–3.92(m,2H),2.47(d,J＝8.7Hz,6H),1.61(td,J＝13.1,6.4Hz,2H),1.33(td,J＝14.2,7.8Hz,2H),0.96(t,J＝7.2Hz,3H).
经检测，其结构如上式DMOAN所示，该染料在405nm处有较强吸收可用于405nm激发的荧光染料。
实施例7
N-丁基-4,5-二(二甲胺)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DDM)的合成
中间体N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BuAN-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.0g,3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加正丁胺(227mg，3.11mmol)。70℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.5Hz,2H),1.68(m,2H),1.40(m,J＝7.8Hz,2H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
N-丁基-4,5-二(二甲胺)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DDM)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入二甲胺水溶液200mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体40mg，产率89％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.5Hz,2H),6.94(d,J＝8.5Hz,2H),4.25–4.05(m,2H),2.96(s,12H),1.69(ddd,J＝12.7,8.5,6.6Hz,2H),1.44(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.51,156.54,133.85,132.56,112.56,112.23,110.40,42.83,39.68,30.40,20.48,13.93.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C20H26N3O2[M+H]+340.2025,实测值340.2023.
经检测，其结构如上式BuAN-DDM所示，该染料在460nm处有较强吸收可用于450nm激发的荧光染料，荧光发射波长位于590nm。
实施例8
N-丁基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAze)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.26mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(300mg，5.26mmol)。将反应液缓慢加热至120℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝150:1，V/V)，得黄色固体80mg，产率51％。实施例8制备的BuAN-DAze的核磁谱图氢谱与碳谱分别如图3、4所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.21–4.12(m,2H),4.05(s,2H),2.42(s,8H),1.69(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.43(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.44,155.52,133.05,132.82,110.29,108.05,106.30,54.79,39.68,30.41,20.49,16.90,13.93.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值calcd for C22H26N3O2[M+H]+364.2025,实测值364.2035.
经检测，其结构如上式BuAN-DAze所示，其荧光性能如下：
将BuAN-DAze溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱与激发光谱。
每次取20μL染料母液，分别加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光激发与发射光谱测试。
BuAN-DAze荧光激发与发射光谱如图34所示：BuAN-DAze在乙醇中激发波长在480nm，荧光发射波长在488nm，荧光发射半峰宽只有32nm。这说明BuAN-Daze能够适用于多色荧光成像。
实施例9
N-丁基-4,5-二(氮杂环戊)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAzo)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入四氢吡咯200mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得黄色固体38mg，产率75％。实施例9制备的BuAN-DAzo的核磁谱图氢谱如图5所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝8.7Hz,2H),6.65(d,J＝8.7Hz,2H),4.18(t,J＝7.0Hz,2H),3.60(s,2H),3.37(d,J＝4.9Hz,1H),3.28(d,J＝4.2Hz,2H),2.67(d,J＝8.0Hz,2H),2.19(s,2H),1.97(s,4H),1.70(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.57(s,2H),1.45(dt,J＝15.1,7.4Hz,2H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.33,154.20,133.79,132.69,109.52,108.97,106.15,52.27,49.49,39.53,30.45,25.89,25.54,20.51,13.97.
其高分辨质谱数据如下：分辨质谱理论值C24H30N3O2[M+H]+392.2338,实测值392.2343.
经检测，其结构如上式BuAN-DAzo所示，其荧光性能如下：
将BuAN-DAzo溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱与激发光谱。
每次取20μL染料母液，分别加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光激发与发射光谱测试。
BuAN-DAzo荧光激发与发射光谱如图35所示：BuAN-DAzo在乙醇中激发波长在485nm，荧光发射波长在495nm，荧光发射半峰宽只有40nm，适合用于488nm激发。
实施例10
N-丁基-4,5-二氮杂环己基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DPip)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(50mg，0.13mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入哌啶200mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应16h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得黄色固体49mg，产率90％。
实施例10制备的BuAN-DPip的核磁谱图氢谱如图6所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝7.7Hz,2H),7.00(d,J＝7.8Hz,2H),4.06(s,2H),3.36(s,4H),2.97(s,4H),1.82–1.28(m,16H),0.88(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.52,155.29,132.58,131.30,113.35,113.13,111.73,52.62,38.67,29.35,24.62,23.46,19.44,12.89.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C26H34N3O2[M+H]+420.2651,实测值420.2657.
经检测，其结构如上式BuAN-DPip所示，其荧光性能如下：水溶液中吸收波长达到480nm，荧光发射波长为515nm。
实施例11
N-丁基-4,5-二氮杂环庚基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DHMI)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(80mg，0.21mmol)溶于15mL乙二醇甲醚中，并向其中加入六亚甲基亚胺400mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应20h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体80mg，产率85％。实施例11制备的BuAN-DHMI的核磁谱图氢谱如图7所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.32(d,J＝8.6Hz,2H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),4.23–3.97(m,2H),3.47(s,8H),1.82–1.31(m,20H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.42,156.62,134.48,132.31,110.55,109.52,109.48,52.71,39.60,30.46,28.33,27.80,20.52,13.95.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C28H38N3O2[MH+]448.2964,实测值448.2973.
经检测，其结构如上式BuAN-DHMI所示，其荧光性能如下：水溶液中其荧光发射波长为520nm，吸收波长达到485nm。
实施例12
BuAN-450的合成
中间体N-丁基-4,5-二丁胺基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DBu)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(300mg，0.80mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入正丁胺500mg。将反应液缓慢加热至80℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体209mg，产率66％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(d,J＝8.4Hz,2H),6.75(d,J＝8.5Hz,2H),5.79(t,J＝4.9Hz,2H),4.20–4.08(m,2H),3.25(dd,J＝12.2,6.9Hz,4H),1.82–1.65(m,6H),1.59–1.49(m,4H),1.43(dq,J＝14.8,7.4Hz,2H),1.03(t,J＝7.3Hz,6H),0.96(t,J＝7.4Hz,3H).
BuAN-450的合成
将BuAN-DBu(100mg，0.25mmol)溶于10mL甲苯中，而后将反应液缓慢加热至100℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体39.6mg，产率40％。实施例12制备的BuAN-450的核磁谱图氢谱如图8所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(d,J＝8.2Hz,1H),8.50(d,J＝8.4Hz,1H),7.23(d,J＝8.2Hz,1H),6.75(d,J＝8.5Hz,1H),4.26–4.12(m,2H),4.04–3.90(m,2H),2.84–2.72(m,2H),1.70(dt,J＝7.7,6.5Hz,2H),1.61–1.50(m,2H),1.45(td,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.13(t,J＝7.4Hz,3H),1.07(t,J＝7.4Hz,3H),0.97(t,J＝7.4Hz,3H).
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H30N3O2[M+H]+392.2338,实测值392.2352.
经检测，其结构如上式BuAN-450所示，其荧光性能如下：二氯甲烷中其荧光发射波长为475nm，吸收波长达到458nm，适用于450nm激光进行激发。
实施例13
N-丁基-4-氮杂环丁基-5-环乙胺基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeAzi)的合成
N-丁基-4溴-5-环乙胺基-1,8萘酰亚胺(BuAN-BrAzi)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.26mmol)溶于10毫升乙二醇甲醚中，并向其中加入氮丙啶(30μL)。反应液在50℃下搅拌2h后，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体78mg，产率80％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(d,J＝8.1Hz,1H),8.36(d,J＝7.9Hz,1H),8.06(d,J＝7.9Hz,1H),7.40–7.08(m,1H),4.28–4.02(m,2H),2.54(s,4H),1.84–1.58(m,2H),1.43(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.89,163.44,157.69,133.68,132.98,131.48,131.17,125.58,125.35,122.47,118.61,117.16,40.23,32.63,30.14,20.38,13.85.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C18H18BrN2O2[M+H]+373.0554,实测值373.0561.
N-丁基-4-氮杂环丁基-5-环乙胺基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeAzi)的合成
将BuAN-BrAzi(50mg，0.13mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中并向反应液中加入200mg氮杂环丁烷，而后将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体22mg，产率47％。实施例13制备的BuAN-AzeAzi的核磁谱图氢谱如图9所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.43(d,J＝5.9Hz,1H),8.41(d,J＝6.3Hz,1H),7.02(d,J＝8.1Hz,1H),6.53(d,J＝8.5Hz,1H),4.28–4.08(m,6H),2.38(dt,J＝15.0,7.5Hz,2H),2.26(s,4H),1.68(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.43(dq,J＝14.7,7.3Hz,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.41,164.31,159.01,155.45,132.87,132.52,132.33,115.99,115.20,115.15,111.06,107.80,55.77,39.80,30.32,30.26,20.45,16.97,13.90.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C21H24N3O2[M+H]+350.1869,实测值350.1872.
经检测，其结构如上式BuAN-AzeAzi所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为530nm，吸收波长达到468nm，适用于450nm激光进行激发。
实施例14
N-丁基-4-正丁胺基-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeBu)的合成
N-丁基-4-溴-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-BrAze)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.26mmol)溶于10毫升乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷15mg。反应液在50℃下搅拌1h后，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体91mg，产率89％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(d,J＝8.5Hz,1H),8.30(d,J＝7.9Hz,1H),7.82(d,J＝7.9Hz,1H),6.77(d,J＝8.5Hz,1H),4.24(t,J＝7.5Hz,4H),4.15(dd,J＝10.0,5.0Hz,2H),2.54–2.36(m,2H),1.69(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.51–1.35(m,2H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).
N-丁基-4-正丁胺基-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeBu)的合成
将BuAN-BrAze(80mg，0.21mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中并向反应液中加入400mg正丁胺，而后将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体64mg，产率82％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(d,J＝8.2Hz,1H),8.39(d,J＝8.6Hz,1H),8.04(s,1H),6.95(d,J＝8.2Hz,1H),6.57(d,J＝8.6Hz,1H),4.19–4.08(m,2H),3.95(t,J＝7.2Hz,4H),3.37(dd,J＝12.1,7.1Hz,2H),2.40–2.25(m,2H),1.81(dt,J＝14.9,7.4Hz,2H),1.69(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.63–1.51(m,2H),1.43(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),1.05(t,J＝7.4Hz,3H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C23H30N3O2[M+H]+380.2338,实测值380.2338.
经检测，其结构如上式BuAN-AzeBu所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为520nm，吸收波长达到460nm，适用于450nm激光进行激发。
实施例15
N-丁基-4-氮杂环戊基-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeAzo)的合成
N-丁基-4-溴-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-BrAze)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.26mmol)溶于8毫升乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷40mg。反应液在50℃下搅拌1h后，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体75mg，产率72％。
N-丁基-4-氮杂环戊基-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeAzo)的合成
将BuAN-BrAze(80mg，0.21mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中并向反应液中加入200mg四氢吡咯，而后将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体52mg，产率67％。实施例15制备的BuAN-AzeAzo的核磁谱图氢谱如图10所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(dd,J＝10.1,8.7Hz,2H),6.61(d,J＝8.7Hz,1H),6.27(d,J＝8.5Hz,1H),4.16–3.90(m,4H),3.68–3.49(m,4H),2.95(s,2H),2.45–2.23(m,2H),2.09–1.89(m,2H),1.87(s,2H),1.62(dt,J＝15.2,7.6Hz,2H),1.36(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ163.50,163.32,155.24,152.31,132.38,131.85,131.67,109.05,108.50,107.97,105.48,104.86,54.66,52.05,50.07,38.62,29.41,28.68,24.70,19.49,15.78,12.92.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C23H28N3O2[M+H]+378.2182,实测值378.2093.
经检测，其结构如上式BuAN-AzeAzo所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为493nm，吸收波长达到481nm，适用于488nm激光进行激发。
实施例16
N-丁基-4-氮杂环己基-5-氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(BuAN-AzeAzo)的合成
将BuAN-BrAze(60mg，0.15mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中并向反应液中加入200mg哌啶，而后将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝120:1，V/V)，得深黄色固体35mg，产率58％。实施例16制备的BuAN-AzePip的核磁谱图氢谱如图11所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(t,J＝8.4Hz,2H),6.99(d,J＝8.4Hz,1H),6.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.29–4.01(m,6H),3.46(dt,J＝8.8,4.1Hz,2H),2.92(t,J＝9.0Hz,2H),2.46–2.26(m,2H),1.94–1.63(m,8H),1.43(dq,J＝14.7,7.4Hz,2H),0.96(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.50,164.48,156.56,156.35,133.28,132.83,132.39,113.62,111.91,111.84,111.29,107.61,53.02,39.70,30.39,25.52,24.32,20.48,16.83,13.92.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H30N3O2[M+H]+392.2338,实测值392.2344.
经检测，其结构如上式BuAN-AzePip所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为505nm，吸收波长达到475nm，适用于488nm激光进行激发。
实施例17
N-丁基-4,5-乙二胺基-1,8萘酰亚胺(BuAN-EDA)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.27mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入乙二胺150mg。将反应液缓慢加热至70℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体71mg，产率87％。
实施例17制备的BuAN-EDA的核磁谱图氢谱如图12所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.29(s,2H),8.03(d,J＝8.6Hz,2H),6.67(d,J＝8.7Hz,2H),4.01–3.92(m,2H),3.51(s,4H),1.54(dt,J＝14.9,7.5Hz,2H),1.31(dt,J＝14.8,7.4Hz,2H),0.90(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.36,155.59,135.28,133.35,110.27,107.36,105.79,46.73,38.97,30.40,20.35.
经检测，其结构如上式BuAN-EDA所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为487nm，吸收波长达到481nm，适用于488nm激光进行激发。
实施例18
N-丁基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DAC)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.27mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺350mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体31mg，产率32％。实施例18制备的BuAN-DAC的核磁谱图氢谱如图13所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.50(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.04–3.83(m,2H),3.16(t,J＝7.0Hz,2H),2.19(d,J＝11.2Hz,2H),1.73(d,J＝8.1Hz,2H),1.54(dt,J＝14.9,7.6Hz,2H),1.30(dq,J＝14.3,7.2Hz,6H),0.90(t,J＝7.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.43,154.52,134.70,133.32,110.56,107.86,106.52,59.52,55.38,32.09,30.40,23.64,20.35,14.28.
高分辨质谱理论值C22H26N3O2[M+H]+364.2025,实测值364.2029.
经检测，其结构如上式BuAN-DAC所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为488nm，吸收波长达到481nm，适用于488nm激光进行激发。
实施例19
N-丁基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(BuAN-DMC)的合成
将N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(100mg，0.27mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N’-二甲基环己二胺350mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得黄色固体31mg，产率30％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.40(d,J＝8.2Hz,1H),6.81(d,J＝8.4Hz,1H),4.35–3.94(m,1H),3.10(s,2H),2.22(s,1H),1.81(d,J＝8.3Hz,1H),1.70(dt,J＝15.2,7.5Hz,1H),1.44(dq,J＝14.8,7.4Hz,1H),1.20(s,1H),0.96(t,J＝7.3Hz,2H).
经检测，其结构如上式BuAN-DMC所示，其荧光性能如下：水中其荧光发射波长为515nm，吸收波长达到460nm，适用于450nm激光进行激发。
实施例20
Halo-DAze的合成
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(2.00g,6.24mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(2.0g，19.0mmol)。40℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-0:1，V/V)分离得米白色固体996mg，产率39％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3/DMSO-d6)δ8.70(d,J＝7.8Hz,1H),8.50(d,J＝7.9Hz,1H),8.28(d,J＝7.9Hz,1H),8.13(d,J＝7.8Hz,1H),4.37(t,J＝5.9Hz,2H),4.21(s,1H),3.78(t,J＝5.9Hz,2H),3.58(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3/DMSO)δ167.48,166.76,155.77,140.86,137.11,136.25,135.21,130.44,128.84,128.34,127.29,125.60,77.28,72.13,65.73.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C16H14BrN2O6[M+H]+409.0035,实际值409.0031.
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-二氮杂环丁基-1,8萘酰亚胺(OAN-DAze)的合成
将OAN-Br(50mg，0.12mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷150mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体25mg，产率52％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.42(d,J＝5.3Hz,2H),4.09(s,8H),3.83(t,J＝5.4Hz,2H),3.68(s,4H),2.42(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.74,155.77,133.31,133.16,109.85,107.84,106.39,72.18,68.91,61.94,55.25,38.99,16.89.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实测值396.1919.
Halo-DAze的合成
将Halo-OH(30mg，0.08mmol)与NaH(6mg，0.25mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将15μL 1-碘-6-氯己烷溶于6mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌5h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得棕色固体20mg，产率50％。实施例20制得的Halo-DAze核磁谱图氢谱如图14所示，氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.41(t,J＝6.5Hz,2H),4.07(s,8H),3.78(t,J＝6.5Hz,2H),3.71–3.65(m,2H),3.60–3.54(m,2H),3.43(t,J＝6.6Hz,2H),2.43(s,4H),2.02(dd,J＝14.1,7.1Hz,2H),1.80–1.70(m,2H),1.54(dd,J＝13.8,6.9Hz,2H),1.41(dd,J＝15.2,7.8Hz,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.41,155.61,133.22,132.94,110.11,108.02,107.86,106.32,77.22,71.21,70.13,68.21,54.55,38.61,33.56,29.70,26.74,25.42,25.38.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C28H37ClN3O4[M+H]+514.2473,实测值514.2477.
经检测，其结构如上式Halo-DAze所示，在水中的紫外吸收波长为484nm，荧光发射波长为493nm，能够用于Halo-tag的荧光标记。
实施例21
Halo-DAC的合成
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(OAN-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.12mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中滴加二甘醇胺(0.5g，9.5mmol)。90℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-0:1，V/V)分离得米白色固体677mg，产率53％。
N-十二烷基-4,5-(1,2-环己二胺)基-1,8萘酰亚胺(DDAN-DAC)的合成
将OAN-NBr(100mg，0.24mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺100mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体34mg，产率35％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,21H),7.54(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.59(t,J＝4.7Hz,1H),4.15(t,J＝6.8Hz,2H),3.56(t,J＝6.8Hz,2H),3.46(s,4H),3.15(d,J＝9.4Hz,2H),2.20(d,J＝12.0Hz,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.43–1.22(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO d6)δ163.43,154.65,134.84,133.40,110.63,107.62,106.40,72.53,67.69,60.66,59.48,46.17,32.07,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实测值396.1919.
Halo-DAC的合成
将OAN-DAC(50mg，0.13mmol)与NaH(10mg，0.42mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将50μL 1-碘-6-氯己烷溶于5mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌1h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体36mg，产率56％。实施例2制备的Halo-DAC的核磁批图氢谱如图2所示，氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.25(d,J＝8.3Hz,2H),6.52(d,J＝8.3Hz,2H),5.00(s,2H),4.39(t,J＝6.2Hz,2H),3.81(t,J＝6.2Hz,2H),3.70(s,2H),3.58(d,J＝4.4Hz,2H),3.41(dd,J＝11.1,6.3Hz,2H),3.21(d,J＝7.7Hz,2H),2.13(d,J＝11.4Hz,2H),1.86(d,J＝7.5Hz,2H),1.79–1.64(m,2H),1.56–1.27(m,10H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.33,152.36,133.81,114.40,110.73,110.57,107.77,71.20,70.18,70.12,68.15,59.46,45.18,38.69,33.58,32.67,32.56,29.51,26.75,25.41,23.61.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C28H37ClN3O4[M+H]+514.2473,实测值514.2477.
经检测，其结构如上式Halo-DAC所示，其荧光性能如下：Halo-DAC在水光发射波长在490nm左右，激发波长在480nm，荧光半峰宽只有40nm。
实施例22
SNAP-DAze的合成：
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(500mg，3.60mmol)。80℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-二氯甲烷:甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体480mg，产率35％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.69(d,J＝8.1Hz,2H),8.50–8.39(m,2H),7.35(d,J＝8.1Hz,2H),7.25(d,J＝7.9Hz,2H),5.23(s,2H),5.13(t,J＝5.8Hz,1H),4.45(d,J＝5.5Hz,2H).
BA-DAze的合成
将BA-NBr(300mg，0.68mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷300mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝60:1，V/V)，得黄色固体52mg，产率18％。其核磁谱图氢谱如图1所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(d,J＝7.8Hz,2H),7.25(d,J＝5.9Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),5.36(s,2H),4.61(s,2H),4.11(s,8H),2.44(s,4H).
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C26H26N3O3[M+H]+428.1974,实际值428.1997.
SNAP-DAze的合成
将BA-DAze(40mg，0.09mmol)、BG+(40mg，0.16mmol)、叔丁醇钾(40mg，0.36mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次并加入5mL干燥DMF。室温下搅拌6h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝20:1，V/V)，得棕色固体24mg，产率45％。实施例22制备的核磁谱图氢谱如图15所示，核磁谱图氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.40(s,1H),8.17(d,J＝8.4Hz,2H),7.79(s,1H),7.41(d,J＝7.4Hz,2H),7.28(d,J＝7.6Hz,2H),6.48(d,J＝8.5Hz,2H),6.26(s,2H),5.42(s,2H),5.22(s,2H),4.14(s,8H),2.38(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.47,160.31,160.09,156.01,155.65,138.90,138.22,135.60,133.37,132.87,128.87,127.74,113.97,108.21,106.94,106.73,56.50,54.63,42.37,19.02.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C31H29N8O3[M+H]+561.2363,实际值561.2380.
经检测，其结构如上式SNAP-DAze所示，其荧光性能如下：SNAP-DAze在乙腈、氯仿、二甲基亚砜、乙醇、水光发射波长在490nm左右，且随着极性的变化荧光发射波长及荧光峰型均没有明显变化。
实施例23
SNAP-DAzo的合成
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(2.00g，14.4mmol)。90℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-二氯甲烷:甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体880mg，产率66％。
中间体BA-DAzo的合成
将BA-NBr(100mg，0.23mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入四氢吡咯300mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体46mg，产率45％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝8.7Hz,2H),7.51(d,J＝7.9Hz,2H),7.25(d,J＝8.4Hz,2H),6.66(d,J＝8.7Hz,2H),5.37(s,2H),4.61(d,J＝5.8Hz,2H),3.61(s,2H),3.40(s,2H),3.29(s,2H),2.71(s,2H),2.21(s,2H),1.98(dt,J＝15.9,7.8Hz,4H),1.62(s,2H),1.50(t,J＝6.0Hz,1H).
SNAP-DAzo的合成
将BA-DAzo(30mg，0.07mmol)、BG+(150mg，0.63mmol)、叔丁醇钾(150mg，0.91mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入6mL干燥DMF。室温下搅拌6h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体23mg，产率60％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.60(s,1H),8.27(d,J＝8.4Hz,2H),7.78(s,1H),7.41(d,J＝7.4Hz,2H),7.28(d,J＝7.6Hz,2H),6.48(d,J＝8.5Hz,2H),6.26(s,2H),5.42(s,2H),5.22(s,2H),4.62(d,J＝5.8Hz,2H),3.71(s,2H),3.45(s,2H),3.39(s,2H),2.71(s,2H),2.21(s,2H),1.98(dt,J＝15.9,7.8Hz,4H),1.62(s,2H).
经检测，其结构如上式SNAP-DAzo所示，其在水中的荧光发射波长为495nm，吸收波长为485nm左右，能有用于488nm激光激发。
实施例24
SNAP-DMEDA的合成
中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入4-氨甲基苄醇(1.00g，7.2mmol)。40℃下10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝3:1-二氯甲烷:甲醇＝200:1，V/V)分离得米白色固体573mg，产率43％。
BA-DMEDA的合成
将BA-NBr(150mg，0.34mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N’-二甲基乙二胺200mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝90:1，V/V)，得黄色固体88mg，产率65％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.25(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(d,J＝8.3Hz,2H),7.22(d,J＝8.3Hz,2H),6.86(d,J＝8.7Hz,2H),5.18(s,2H),5.11(t,J＝5.7Hz,2H),4.43(d,J＝5.7Hz,2H),3.62(s,4H),3.12(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.65,155.89,141.53,137.07,132.95,127.72,126.86,116.10,110.62,110.37,63.14,57.85,42.52,41.66.
SNAP-DMEDA的合成
将BA-DMDEA(50mg，0.12mmol)、BG+(95mg，0.37mmol)、叔丁醇钾(100mg，0.89mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入4mL干燥DMF。室温下搅拌3h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体27mg，产率40％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.40(s,1H),8.25(d,J＝8.6Hz,2H),7.79(s,1H),7.42(d,J＝7.8Hz,2H),7.32(d,J＝8.1Hz,2H),6.86(d,J＝8.7Hz,2H),6.27(s,2H),5.42(s,2H),5.22(s,2H),3.63(s,4H),3.12(s,6H).
经检测，其结构如上式SNAP-DMEDA所示，其在水中的荧光发射波长为510nm左右，吸收波长为458nm左右，能快速特异性识别SNAP-tag。
实施例25
SNAP-DAC的合成
BA-DAC的合成
将BA-NBr(200mg，0.45mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺400mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体93mg，产率48％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝8.6Hz,21H),7.56(s,2H),7.24(d,J＝8.2Hz,2H),7.20(d,J＝8.3Hz,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),5.14(s,2H),5.10(t,J＝5.7Hz,2H),4.42(d,J＝5.7Hz,2H),3.16(d,J＝9.2Hz,2H),2.19(d,J＝12.0Hz,2H),1.72(d,J＝7.3Hz,2H),1.49–1.18(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.39,154.73,141.39,137.45,134.91,133.49,127.79,126.77,110.69,107.60,106.41,63.16,59.47,42.36,32.06,23.62
SNAP-DAC的合成
将BA-DAC(40mg，0.09mmol)、BG+(95mg，0.37mmol)、叔丁醇钾(84mg，0.75mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换四次并加入3mL干燥DMF。室温下搅拌10h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝25:1，V/V)，得棕色固体28mg，产率53％。其核磁谱图氢谱如图16所示，氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.39(s,1H),8.05(d,J＝8.6Hz,2H),7.79(s,1H),7.56(s,2H),7.40(d,J＝8.0Hz,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),6.27(s,2H),5.41(s,2H),5.17(s,2H),3.16(d,J＝8.5Hz,2H),2.19(d,J＝11.3Hz,2H),1.73(d,J＝6.6Hz,2H),1.40–1.25(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.39,160.30,160.09,155.65,154.76,138.94,138.22,135.61,134.96,133.53,128.86,127.99,113.94,110.71,107.56,106.40,99.99,66.98,59.47,42.38,32.06,23.62.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C31H29N8O3[M+H]+561.2363,实际值561.2380.
经检测，其结构如上式SNAP-DAC所示，其在水中的荧光发射波长为485nm，吸收波长为479nm左右，能够对SNAP-tag进行免洗标记。
实施例26
SNAP-AzeAzo的合成
BA-AzeAzo的合成
将BA-NBr(300mg，0.68mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷39mg。将反应液缓慢加热至50℃，并反应1h。向反应液滴加四氢吡咯200mg，逐渐加热至130℃，并在此温度持续反应12h减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体30mg，产率10％。
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C27H28N3O3[M+H]+442.2131,实测值442.2142.
SNAP-AzeAzo的合成
将BA-AzeAzo(20mg，0.05mmol)、BG+(36mg，0.14mmol)、叔丁醇钾(51mg，0.45mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次并加入4mL干燥DMF。室温下搅拌8h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝20:1，V/V)，得棕色固体14mg，产率52％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.45(s,1H),8.13(dd,J＝15.7,8.0Hz,2H),7.80(s,1H),7.41(d,J＝5.9Hz,2H),7.29(d,J＝7.2Hz,2H),6.76(dd,J＝18.6,9.6Hz,1H),6.42(t,J＝8.4Hz,1H),6.25(s,2H),5.43(s,2H),5.23(s,2H),3.63(s,2H),3.19(s,2H),2.90(s,2H),2.07(m,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.51,163.36,160.09,156.69,155.65,154.68,153.83,138.19,133.73,132.76,132.66,132.59,128.82,127.77,113.99,107.87,107.39,107.15,106.84,106.24,67.01,52.46,49.75,42.31,25.93,25.63,25.30,16.69.
经检测，其结构如上式SNAP-AzeAzo所示，其在水中的荧光发射波长为494nm，吸收波长为485nm左右，能够对SNAP-tag进行免洗标记。
实施例27
荧光探针Mito-DAC的合成。
中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.30g，3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加6-氨基-1-己醇(363mg，3.11mmol)。70℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.25–4.07(m,2H),3.65(t,J＝6.5Hz,2H),1.75(dt,J＝14.4,7.0Hz,2H),1.59(dd,J＝13.2,6.5Hz,2H),1.48–1.43(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.83,162.06,151.31,135.98,132.36,131.24,130.55,125.74,124.15,123.55,122.45,121.23,62.77,40.76,32.55,27.86,26.68,25.29.
高分辨质谱数据如下：C18H18BrN2O5[M+H]+计算值：421.0399,实验值：421.0396.
经验证，上述结构为N-(6-羟基己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
将N-(6-羟基己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(500mg,1.19mmol)溶于二氯甲烷中，并向其中滴加三溴化磷(1.61g,5.95mmol)。70℃下搅拌6h后，用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相。所得有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：石油醚＝1:1，V/V)，得白色固体230mg，产率40％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.22–4.11(m,2H),3.41(t,J＝6.8Hz,2H),1.94–1.83(m,2H),1.75(dt,J＝15.0,7.6Hz,2H),1.58–1.49(m,2H),1.44(dd,J＝14.8,5.8Hz,2H).
高分辨质谱数据如下：C18H16Br2N2O4[M+H]+计算值：481.9477,实验值：481.9482.
经验证，上述结构为N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
将N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(200mg，0.41mmol)与三苯基膦(1.08g，4.13mmol)溶于10mL无水乙腈中，并置于密封管中。140℃下反应24h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝400:1，V/V)，得白色固体485mg，产率60％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝7.3Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(d,J＝7.3Hz,1H),8.01–7.40(m,16H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(s,2H),1.80–1.33(m,8H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.73,161.96,151.21,135.98,135.13,133.77,133.67,132.32,132.13,132.03,131.96,131.25,130.64,130.52,128.56,128.44,125.68,124.05,123.59,122.40,121.16,118.57,117.71,53.46,40.58,30.11,29.95,27.43,26.55.
高分辨质谱数据如下：C36H31N2O4P+[M]+计算值：665.1205,实验值：665.1208.
经验证，上述结构为N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
荧光探针Mito-DAC的合成
将N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(100mg，0.13mmol)溶于10毫升乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-二氨基环己二胺(60mg，0.52mmol)。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体40mg，产率89％.其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.5Hz,2H),7.83(t,J＝6.8Hz,3H),7.68(dd,J＝13.9,6.4Hz,12H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),5.86(s,2H),4.02(t,J＝6.5Hz,2H),3.42–3.31(m,2H),3.18(d,J＝9.7Hz,2H),2.33(d,J＝12.5Hz,2H),1.80(d,J＝8.2Hz,2H),1.63(s,4H),1.48(d,J＝9.7Hz,2H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.31,153.34,135.46,134.31,133.53,133.43,130.75,130.63,118.30,117.44,111.04,109.26,107.18,59.65,38.94,32.67,29.71,27.28,25.53,23.65.
高分辨质谱数据如下：C42H43N10O21P+[M]+计算值：652.3087，实验值：652.3128.
经检测，该化合物结构如Mito-DAC所示，适用于多种生理状态下的活细胞线粒体成像且光性能不受微环境影响，亮度高稳定性强可以满足超分辨成像对线粒体的长时间动态追踪，荧光发射波长在481nm左右。
实施例28
荧光探针Mito-DAze的合成。
中间体N-(6-羟基己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.30g，3.11mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加6-氨基-1-己醇(363mg，3.11mmol)。70℃下1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚：二氯甲烷＝2:1，V/V)分离得米白色固体620mg，产率53％。核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.25–4.07(m,2H),3.65(t,J＝6.5Hz,2H),1.75(dt,J＝14.4,7.0Hz,2H),1.59(dd,J＝13.2,6.5Hz,2H),1.48–1.43(m,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.83,162.06,151.31,135.98,132.36,131.24,130.55,125.74,124.15,123.55,122.45,121.23,62.77,40.76,32.55,27.86,26.68,25.29.
高分辨质谱数据如下：C18H18BrN2O5[M+H]+计算值：421.0399,实验值：421.0396.
经验证，上述结构为N-(6-羟基己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
中间体N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
将化合物N-(6-羟基己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(500mg,1.19mmol)溶于二氯甲烷中，并向其中滴加三溴化磷(1.61g,5.95mmol)，于70℃下搅拌6h后，用饱和碳酸钠溶液洗涤有机相。所得有机相用无水硫酸钠干燥后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：石油醚＝1:1，V/V)，得白色固体230mg，产率40％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.22–4.11(m,2H),3.41(t,J＝6.8Hz,2H),1.94–1.83(m,2H),1.75(dt,J＝15.0,7.6Hz,2H),1.58–1.49(m,2H),1.44(dd,J＝14.8,5.8Hz,2H).
高分辨质谱数据如下：C18H16Br2N2O4[M+H]+计算值：481.9477,实验值：481.9482.
经验证，上述结构为N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐。
中间体N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的合成
将化合物N-(6-溴己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(200mg，0.41mmol)与三苯基膦(1.08g，4.13mmol)溶于10mL无水乙腈中，并置于密封管中。140℃下反应24h后，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝400:1，V/V)，得白色固体485mg，产率60％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.66(d,J＝7.3Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(d,J＝7.3Hz,1H),8.01–7.40(m,16H),4.11(t,J＝6.8Hz,2H),3.72(s,2H),1.80–1.33(m,8H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.73,161.96,151.21,135.98,135.13,133.77,133.67,132.32,132.13,132.03,131.96,131.25,130.64,130.52,128.56,128.44,125.68,124.05,123.59,122.40,121.16,118.57,117.71,53.46,40.58,30.11,29.95,27.43,26.55.
高分辨质谱数据如下：C36H31N2O4P+[M]+计算值：665.1205,实验值：665.1208.
经验证，上述结构为N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐所示。
荧光探针Mito-DAze的合成
将化合物N-(6-三苯基膦己基)-4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(100mg，0.13mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(30mg，0.52mmol)。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝200:1，V/V)，得黄色固体40mg，产率89％。实施例28制备的Mito-DAze核磁谱图氢谱如图17所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.31(d,J＝8.4Hz,2H),7.76(dd,J＝21.9,9.4Hz,15H),6.38(d,J＝8.4Hz,2H),4.22–3.83(m,10H),3.50(s,2H),2.43(s,4H),1.66(s,4H),1.38(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ155.69,135.22,133.65,133.55,132.86,130.68,130.56,118.51,109.73,107.73,106.34,55.05,39.31,29.67,27.53,26.15,22.51,16.92.
高分辨质谱数据如下：C42H43N3O2P+[M]+计算值：652.3088,实验值：652.3109.
经检测，上述产物结构为Mito-DAze，该化合物在活细胞成像实验中能快速准确定位于线粒体，亮度高、稳定性强。
实施例29
HAN-DAze的合成
将BA-DAze(50mg，0.12mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，并向其中加入三乙胺200mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应10h。向反应液中加入100mL二氯甲烷并用水洗得有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体24mg，产率67％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.2(s,1H),8.36(d,J＝8.7Hz,2H),7.52(d,J＝7.7Hz,2H),4.21(s,8H),2.46(s,4H).
经检测，其结构如上式HAN-DAze所示，其荧光性能如下：其在水中荧光发射波长为491nm，吸收为482nm。
实施例30
HAN-DAC的合成
将BA-DAC(50mg，0.12mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，并向其中加入三乙胺300mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应12h。向反应液中加入150mL二氯甲烷并用水洗(50mL*4)得有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝40:1，V/V)，得黄色固体25mg，产率70％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.73(s,1H),7.98(d,J＝8.5Hz,2H),7.45(s,2H),6.81(d,J＝8.6Hz,2H),3.15(d,J＝8.6Hz,2H),2.18(d,J＝11.8Hz,2H),1.72(d,J＝6.8Hz,2H),1.52–1.20(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.21,154.59,136.21,132.56,110.39,108.45,107.11,59.58,32.11,23.65.
经检测，其结构如上式HAN-DAC所示，其荧光性能如下：其在水中荧光发射波长为487nm，吸收为478nm。
实施例31
HAN-DMEDA的合成
将BA-DMEDA(50mg，0.12mmol)溶于15mL二甲基亚砜中，并向其中加入三乙胺350mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应12h。向反应液中加入150mL二氯甲烷并用水洗(50mL*4)得有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体14mg，产率40％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.05(s,1H),8.18(d,J＝8.5Hz,2H),6.84(d,J＝8.6Hz,2H),3.60(s,4H),3.11(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.43,155.77,134.18,131.97,116.90,111.50,110.18,57.80,41.65.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C19H20N3O2[M+H]+336.1712,实测值336.1733.
经检测，其结构如上式HAN-DMEDA所示，其荧光性能如下：其在水中荧光发射波长为520nm，吸收为475nm。
实施例32
Lyso-DAze的合成
中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉(609mg，4.68mmol)。70℃下反应3h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝200:1-50:1，V/V)分离得土黄色固体1.12g，产率55％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(t,J＝6.6Hz,2H),3.71–3.57(m,4H),2.70(t,J＝6.5Hz,2H),2.57(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.85,162.08,151.34,136.00,132.36,131.25,130.63,125.73,124.22,123.57,122.44,121.29,67.02,55.94,53.81,37.66.
Lyso-DAze的合成
将Lyso-NBr(50mg，0.12mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷100mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应15h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体6mg，产率12％。实施例32制备的Lyso-DAze的核磁谱图氢谱如图18所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.39(d,J＝8.5Hz,2H),4.37–4.30(m,2H),4.07(s,8H),3.75–3.66(m,4H),2.72–2.66(m,2H),2.62(s,H),2.43(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.37,155.62,133.17,132.88,110.06,107.98,106.34,67.13,56.42,54.62,53.80,36.67,16.90.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H29N4O3[M+H]+421.2240,实测值421.2251.
经检测，其结构如上式Lyso-DAze所示，其荧光性能如下：其在水中荧光发射波长为493nm，吸收为483nm，其能够用于细胞内溶酶体标记。
实施例33
Nu-DAC的合成
中间体N-(2-吗啉)乙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(Lyso-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40mL乙醇中，并向其中滴加N-(2-胺乙基)吗啉(500mg，3.84mmol)。90℃下反应3h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝200:1-50:1，V/V)分离得土黄色固体1.36g，产率67％。
Nu-DAC的合成
将Lyso-NBr(100mg，0.23mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺300mg。将反应液缓慢加热至90℃，并反应18h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体48mg，产率50％。实施例33制备的Nu-DAC的核磁谱图氢谱如图19所示，氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.10(t,J＝7.0Hz,2H),3.62–3.51(m,4H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.45(s,4H),2.19(d,J＝11.9Hz,2H),1.73(d,J＝7.1Hz,2H),1.44–1.20(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.39,154.58,134.78,133.35,110.59,107.75,106.45,66.66,59.50,56.42,53.89,36.50,32.08,23.64.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H29N4O3[M+H]+421.2240,实测值421.2248.
经检测，其结构如上式Nu-DAC所示，其荧光性能如下：其在水中荧光发射波长为487nm，吸收为480nm，其能够用于细胞内细胞核标记。
实施例34
碳酸酐酶探针SML-DAze的合成。
中间体SML-NBr合成路线和产物结构如下：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐(0.5g,1.56mmol)与4-(氨甲基)苯磺酰胺盐酸盐(1.0g,4.67mmol,1g)与三乙胺(0.7g,7mmol)加入10mL乙醇中，并将反应液加热至80℃反应8h后，将反应液冷却至室温，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝150/1，V/V)分离得橙色固体0.63g，产率82％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝7.9Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.45–8.40(m,2H),7.76(d,J＝8.2Hz,2H),7.58(d,J＝8.3Hz,2H),7.31(s,2H),5.31(s,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.22,162.50,150.84,143.41,141.14,136.70,132.58,131.72,130.84,128.27,126.36,126.20,124.92,123.15,120.46,43.57.
经检测，其结构如上式SML-NBr所示。
碳酸酐酶探针SML-DAze合成路线和产物结构如下：
取SML-NBr(0.1g,0.2mmol)、氮杂环丁烷(0.13g,2mmol)于5mL乙二醇单甲醚中，升温至140℃反应12h后，冷却反应液至室温后减压除蒸溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得0.06g SML-Daze，为橙色固体，产率为60％。实施例34制备的SML-DAze核磁谱图氢谱谱图如图20所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.5Hz,2H),7.80(d,J＝8.2Hz,2H),7.61(d,J＝8.2Hz,2H),6.40(d,J＝8.5Hz,2H),5.41(s,2H),4.78(s,2H),4.14(s,8H),2.43(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ159.52,151.17,139.17,135.63,128.66,128.54,124.32,121.70,104.75,102.98,101.71,53.72,37.96,12.12.
经检测，其结构如上式SML-DAze所示，其在乙醇中的发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞内碳酸酐酶。
实施例35
碳酸酐酶探针SML-AzeAzo合成路线和产物结构如下：
取SML-NBr(0.1g,0.2mmol)、氮杂环丁烷(0.01g,0.2mmol)于5mL乙二醇甲醚中，升温至60℃反应5h后冷却反应液至室温，减压除蒸溶剂后无需后处理过程，加入5mL乙二醇甲醚及四氢吡咯(0.15g,2mmol)，升温至140℃反应12h后，冷却反应液至室温后减压除蒸溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝40/1，V/V)得0.04g SML-AzeAzo，为橙色固体，产率为40％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.13(dd,J＝15.6,8.0Hz,2H),7.74(d,J＝7.8Hz,2H),7.41(d,J＝7.9Hz,2H),7.26(s,1H),6.88–6.70(m,1H),6.46(d,J＝8.6Hz,1H),5.27(s,2H),4.16(s,2H),3.66(s,4H),3.19(s,2H),2.34(s,2H),2.02(s,2H),1.86(s,2H).
经检测，其结构如上式SML-DAzeAzo所示，其在乙醇中的发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞内碳酸酐酶。
实施例36
碳酸酐酶探针SML-DAzo合成路线和产物结构如下：
取SML-NBr(0.1g,0.2mmol)、四氢吡咯(0.15g,2mmol)于5mL乙二醇甲醚中，升温至140℃反应12h后，冷却反应液至室温后减压除蒸溶剂，残余物经硅胶柱色谱分离(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)得0.06g SML-DAzo，为橙色固体，产率为60％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(d,J＝8.8Hz,2H),7.73(d,J＝8.3Hz,2H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),7.26(s,2H),6.78(d,J＝8.9Hz,2H),5.26(s,2H),3.82–3.61(m,2H),3.38(dd,J＝13.5,7.3Hz,2H),3.27–3.16(m,2H),2.23–1.86(m,8H),1.66–1.47(m,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.31,154.79,143.36,142.89,134.19,132.66,127.92,126.11,108.56,106.94,52.51,49.80,42.32,25.96,25.42.
经检测，其结构如上式SML-DAzo所示，其在乙醇中的发射波长为495nm，有很高的亮度和光稳定性，能够快速标记细胞内碳酸酐酶。
实施例37
SO3-DAze的合成
中间体N-磺酸甲基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(SO3-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.70g,2.18mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中滴加氨基甲磺酸(485mg，4.68mmol)与600mg二异丙基乙基胺。80℃下反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝200:1-50:1，V/V)分离得土黄色固体317mg，产率35％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),8.57(d,J＝7.8Hz,1H),8.38(s,2H),8.36(d,J＝7.9Hz,1H),3.38(s,2H).
SO3-DAze的合成
将SO3-NBr(50mg，0.12mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷100mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体7mg，产率14％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.34(d,J＝8.5Hz,2H),8.28(s,1H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.18(s,8H),2.45(s,4H).
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C19H20N3O5S[M+H]+402.1124,实测值402.1140.
经检测，其结构如上式SO3-DAze所示，其在乙醇中的发射波长为490nm，荧光量子产率达到0.85。
实施例38
Tro-DAC的合成
中间体N-(3,4,5-三甲氧基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(TrO-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中滴加3,4,5-三甲氧基苄胺(613mg，3.11mmol)。80℃下反应6h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝2:1，V/V)分离得黄色固体1.36g，产率87％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝7.8Hz,1H),8.47(d,J＝8.0Hz,1H),8.45–8.35(m,2H),6.69(s,2H),5.17(s,2H),3.72(s,6H),3.61(s,3H).
Tro-DAC的合成
将Tro-NBr(150mg，0.30mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺400mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)，得黄色固体102mg，产率70％。实施例38制备的Tro-DAC的核磁谱图氢谱如图21所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.11(d,J＝7.1Hz,2H),7.57(s,2H),6.87(d,J＝7.3Hz,2H),6.67(s,2H),5.13(s,2H),3.72(s,6H),3.64(s,3H),3.18(s,2H),2.21(s,2H),1.75(s,2H),1.33(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.52,154.78,153.11,136.99,134.96,134.88,133.58,110.76,107.61,106.44,105.83,60.45,59.51,56.31,42.85,32.09,23.64.
经检测，其结构如上式SO3-DAze所示，其在乙醇中的发射波长为487nm，吸收波长为480nm。
实施例39
CM-DAze的合成
中间体N-(8-邻苯二甲酰亚胺基-3,6-氧杂)辛基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(PhAN-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入N-邻苯二甲酰亚胺-1,8-二氨基乙二醇二乙醚三氟乙酸盐(1.22g，3.11mmol)与1.5g三乙胺。80℃下反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝2:1，V/V)分离得土黄色固体254mg，产率28％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝7.8Hz,1H),8.47(d,J＝7.9Hz,1H),8.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.79(dd,J＝5.3,3.1Hz,2H),7.68(dd,J＝5.3,3.1Hz,2H),4.48–4.35(m,2H),4.03–3.59(m,10H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.18,162.77,162.02,151.16,135.94,133.89,132.34,132.05,131.29,130.49,125.62,124.04,123.55,123.18,122.36,70.11,67.89,67.69,39.60,37.19.
中间体PhAN-DAze的合成
将PhAN-NBr(150mg，0.26mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷400mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体51mg，产率35％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.35(d,J＝8.5Hz,2H),7.87–7.80(m,2H),7.69(s,2H),6.37(d,J＝8.6Hz,2H),4.42–4.30(m,2H),4.08(s,8H),3.87–3.80(m,2H),3.71(dd,J＝14.1,6.4Hz,4H),3.66(d,J＝18.8Hz,2H),2.44(s,4H).
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C32H32N4O6Na[M+Na]+591.2220,实测值591.2284.
CM-DAze的合成
将PhAN-DAze(20mg，0.03mmol)溶于20mL乙醇中，并向其中加入水合肼水溶液(85％)200μL。反应液回流3h后，减压除去乙醇，并将残余物溶于20mL二氯甲烷。用3×50mL饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥有机相过夜。将减压除去溶剂得到的棕黄色固体溶于10mL乙腈中，并加入Chol-ANBr(71mg，0.14mmol)、K2CO3(15mg，0.14mmol)。将反应液加热至回流3h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝50:1，V/V)分离得深黄色固体26mg，两步总产率58％。实施例39制备的CM-DAze的核磁谱图氢谱如图22所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.6Hz,2H),6.51–6.20(m,2H),5.35(s,2H),4.69(d,J＝8.1Hz,2H),4.47(d,J＝4.7Hz,2H),4.23–3.46(m,20H),2.90(s,2H),2.39(dd,J＝28.2,12.6Hz,8H),2.06–1.32(m,40H),1.21–0.82(m,42H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.89,155.94,139.47,133.42,122.82,121.66,109.31,107.51,106.48,69.78,56.79,56.21,50.10,42.32,39.76,39.51,38.04,36.98,36.58,36.19,35.78,31.93,31.81,29.70,28.22,28.01,27.76,24.28,23.84,22.82,22.57,21.04,19.29,18.73,16.92,14.13,11.86.
经检测，其结构如上式CM-DAze所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为482nm，荧光发射波长为497nm。
实施例40
细胞膜探针DDAN-DAC的合成。
中间体DDAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于30mL乙醇中，并向其中滴加十二胺(0.87g，4.68mmol)，加热至90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/二氯甲烷＝2/1，V/V)分离得黄白色固体DDAN-NBr0.54g，产率为71％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.4Hz,2H),1.1-1.8(m,20H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
经检测，其结构如上式DDAN-NBr所示。
DDAN-DAC的合成：
将DDAN-NBr(0.25g，0.51mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(0.35g,3.1mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝150/1，V/V)，得黄色固体0.06g，产率25％。其核磁谱图氢谱谱图与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.46(s,2H),6.82(d,J＝8.6Hz,2H),3.94(t,J＝7.2Hz,2H),3.15(s,2H),2.19(d,J＝11.6Hz,2H),1.73(d,J＝6.3Hz,2H),1.54(s,2H),1.43–1.12(m,22H),0.84(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.42,154.48,134.69,133.28,110.54,107.93,106.56,59.54,32.09,31.76,29.48,29.46,29.43,29.39,29.27,29.17,28.16,27.06,23.65,22.55,14.41.
经检测，其结构如上式DDAN-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例41
细胞膜探针HexAN-DAC的合成。
中间体HexAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中加入十六胺(0.11g，4.68mmol)，加热至90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/二氯甲烷＝2/1，V/V)分离得黄白色固体HexAN-NBr 0.52g，产率62％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.7Hz,1H),8.51(d,J＝7.9Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.9Hz,1H),3.63(t,J＝6.5Hz,2H),1.1-1.8(m,28H),0.92(t,J＝7.8Hz,3H).
经检测，其结构如上式HexAN-NBr所示。
HexAN-DAC的合成：
将N-十六烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.3g，0.55mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(0.45g,3.99mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝150/1，V/V)，得黄色固体HexAN-DAC 0.1g，产率35％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.7Hz,2H),7.51(s,2H),6.85(d,J＝8.5Hz,2H),3.96(t,J＝7.2Hz,2H),3.25(s,2H),2.19(d,J＝11.3Hz,2H),1.73(d,J＝6.3Hz,2H),1.54(s,2H),1.47–1.02(m,30H),0.85(t,J＝6.5Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.55,154.62,134.77,133.20,110.54,108.05,106.70,59.55,32.12,31.76,29.48,29.46,29.33,29.32,29.19,28.20,27.07,23.68,22.57,14.43.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C34H50N3O2[M+H]+532.3903,实际值532.3930.
经检测，其结构如上式HexAN-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例42
细胞膜探针MBSO3-DAC的合成。
中间体MBAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于60mL乙醇中，并向其中加入1-(N-(3-氨基)丙基-N-甲基)氨基-3,7-二甲基辛烷(1.07g，4.68mmol)，加热至70℃下反应12h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷/甲醇＝80:1，V/V)分离得黄色固体MBAN-NBr 0.43g，产率52％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝7.6Hz,1H),8.48(d,J＝7.7Hz,1H),8.20(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,1H),4.24(t,J＝6.5Hz,2H),2.80(s,2H),2.65(s,2H),2.46(s,3H),2.10(s,2H),1.41(s,2H),1.30–1.03(m,8H),0.86(t,J＝6.3Hz,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ162.87,162.12,151.31,135.98,132.38,131.32,130.52,125.56,124.30,123.55,122.28,121.18,77.24,55.19,54.51,39.18,38.82,37.13,31.22,29.71,27.93,24.63,22.71,22.60,19.56.
经检测，其结构如上式MBAN-NBr所示。
中间体MBAN-DAC的合成：
将MBAN-NBr(50mg，0.09mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(200mg,1.77mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，并反应18h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝50/1，V/V)，得黄色固体MBAN-DAC 25mg，产率52％。其核磁谱图氢谱如图23所示，氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.2Hz,2H),6.63(d,J＝8.4Hz,2H),5.70(s,2H),4.17(s,2H),3.16(s,4H),3.07–2.92(m,2H),2.78(s,3H),2.26(d,J＝11.0Hz,4H),1.83(d,J＝6.6Hz,3H),1.53–1.44(m,6H),1.10(d,J＝5.4Hz,4H),1.01–0.76(m,12H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ164.06,153.29,134.31,133.59,111.06,108.74,106.81,59.35,54.89,54.09,40.04,39.06,36.85,32.57,31.12,29.71,27.89,24.57,23.62,22.71,22.58,19.30,14.14.
经检测，其结构如上式MBAN-DAC所示。
细胞膜探针MBSO3-DAC的合成：
将MBAN-DAC(20mg，0.04mmol)，1,3-丙烷磺内酯(5mg,0.04mmol)溶于5mL乙腈中，并将反应液缓慢加热至60℃反应18h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝20/1，V/V)，得深黄色固体MBSO3-DAC 12mg，产率48％。
实施例42制备的MBSO3-DAC的高分辨质谱如图31所示，质谱数据为：高分辨质谱理论值C35H53N4O5S[M+H]+641.3737,实测值641.3762.
经检测，其结构如上式MBSO3-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例43
CMN-DAC的合成。
中间体CFAN-DAC的合成：
将CFAN-NBr(150mg，0.33mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺(400mg,3.54mmol)，将反应液缓慢加热至130℃，反应18h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体CFAN-DAC 73mg，产率50％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.46(s,1H),8.05(d,J＝8.4Hz,2H),7.52(s,2H),6.83(d,J＝8.6Hz,2H),4.16(s,2H),3.46(d,J＝4.8Hz,2H),3.16(s,2H),2.20(d,J＝10.7Hz,2H),1.73(s,2H),1.30(dd,J＝28.5,18.2Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.68,156.68,154.59,134.95,133.35,110.56,107.83,106.50,59.52,38.24,38.19,32.08,23.64.
经检测，其结构如上式CFAN-DAC所示。
中间体EDA-DAC的合成：
将CFAN-DAC(50mg，0.11mmol)溶于20mL甲醇中，并向其中加入碳酸钾(200mg,1.4mmol),将反应液缓慢加热至70℃，并反应6h。减压除去甲醇，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝40/1，V/V)，得深黄色固体EDA-DAC 33mg，产率85％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.05(d,J＝8.6Hz,2H),7.57(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.12(t,J＝6.4Hz,2H),3.15(d,J＝8.8Hz,2H),2.91(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(d,J＝11.5Hz,2H),1.73(d,J＝6.7Hz,2H),1.49–1.16(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.74,154.68,134.97,133.40,110.64,107.69,106.35,59.48,55.39,32.06,23.62.
经检测，其结构如上式EDA-DAC所示。
CMN-DAC的合成：
将EDA-DAC(20mg，0.06mmol)，碘化钾(10mg，0.06)，碳酸钾(30mg，0.22mmol)，Chol-ANBr(29mg,0.06mmol)溶于10mL乙腈中，并将反应液缓慢加热至85℃，并反应6h，减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝80/1，V/V)，得深黄色固体CMN-DAC 29mg，产率65％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.38(d,J＝8.6Hz,2H),7.62(s,2H)，6.51-6.20(m,2H),5.35(s,2H),4.71(d,J＝8.1Hz,2H),4.57(d,J＝4.7Hz,2H),4.23-3.46(m,10H),2.39(dd,J＝28.2,12.6Hz,8H),2.16-1.28(m,16H),1.21-0.75(m,22H).
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C49H69N4O4[M+H]+777.5319,实际值777.5365.
经检测，其结构如上式CMN-DAC所示，其在乙醇中的紫外吸收波长为475nm，荧光发射波长为485nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例44
DDAN-DAze的合成。
中间体DDAN-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于30mL乙醇中，并向其中滴加十二胺(0.87g，4.68mmol)，加热至90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(石油醚/二氯甲烷＝2/1，V/V)分离得黄白色固体DDAN-NBr0.54g，产率为71％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.9Hz,1H),8.51(d,J＝7.8Hz,1H),8.23(d,J＝7.8Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),3.66(t,J＝6.4Hz,2H),1.1-1.8(m,20H),0.94(t,J＝7.9Hz,3H).
经检测，其结构如上式DDAN-NBr所示。
DDAN-DAze的合成。
将DDAN-NBr(150mg，0.26mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷(400mg,7mmol)，将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h，减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷/甲醇＝100/1，V/V)，得深黄色固体51mg，产率35％。
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O3[M+H]+364.2025,实际值364.2082.
经检测，其结构如上式DDAN-DAze所示，其在乙醇中的荧光发射波长为490nm，有很高的亮度和光稳定性，对环境不敏感且能够准确定位活细胞细胞膜。
实施例45
COOH-DAze的合成
中间体2-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基乙酸乙酯(COMe-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入甘氨酸乙酯盐酸盐(1000mg，7.17mmol)与1.00g三乙胺。90℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体962mg，产率76％。
其核磁谱图数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(d,J＝7.8Hz,1H),8.53(d,J＝7.9Hz,1H),8.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),4.92(s,2H),4.26(q,J＝7.1Hz,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.36,162.48,161.75,151.56,136.06,132.66,131.64,130.74,125.26,124.71,123.60,122.00,121.35,61.94,41.64,14.16.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C16H12BrN2O6[M+H]+406.9879,实测值406.9888.
COOH-DAze的合成
(1)COMe-DAze的合成
将COMe-NBr(200mg，0.49mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷400mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得深黄色固体60mg，产率31％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.74(d,J＝7.9Hz,1H),8.54(d,J＝7.7Hz,1H),8.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.94(d,J＝7.8Hz,1H),4.93(s,2H),4.23(q,J＝7.2Hz,2H),4.19–3.90(m,8H),2.43(s,4H),1.32(t,J＝7.2Hz,3H).
(2)COOH-DAze的合成
COMe-DAze(40mg,0.10mmol)溶于4mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液4mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应1h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用4mL水洗涤滤饼干燥后得COOH-DAze 32mg，产率86％。实施例45制备的COOH-DAze核磁谱图氢谱如图24所示，具体数据如下:
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.15(d,J＝8.3Hz,2H),6.48(d,J＝8.3Hz,2H),4.49(s,2H),4.06(s,8H),2.39(s,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.49,155.72,133.21,132.50,109.02,107.32,106.59,54.80,43.24,16.81.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C20H20N3O4[M+H]+366.1454,实测值366.1440.
经检测，其结构如上式COOH-DAze所示，其荧光性能如下：
COOH-DAze在不同溶剂中的发射波长为480-495nm，荧光发射半峰宽小于35nm，且荧光波长不随极性变化而变化。
COOH-DAze在不同溶剂中的紫外吸收波长为470-485nm，吸收波长不随极性变化而变化，能够尽可能保持荧光信号稳定性。
实施例46
COOH-DAC的合成
(1)COMe-DAC的合成
将COMe-NBr(200mg，0.49mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺400mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体124mg，产率64％。
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H24N3O4[M+H]+394.1767,实测值394.1788.
(2)COOH-DAC的合成
COMe-DAC(60mg,0.10mmol)溶于3mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液3mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应3h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用3mL水洗涤滤饼干燥后得COOH-DAC46mg，产率83％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.72(s,1H),8.03(d,J＝8.6Hz,2H),7.59(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.62(s,2H),3.16(d,J＝5.9Hz,2H),2.20(d,J＝11.7Hz,2H),1.73(d,J＝6.9Hz,2H),1.31(dt,J＝31.3,16.1Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.62,163.06,154.85,135.08,133.45,110.71,107.28,106.37,59.46,41.02,32.06,23.62.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C20H20N3O4[M+H]+366.1454,实测值652.3109.
经检测，其结构如上式COOH-DAC所示，其在水中紫外吸收波长为481nm，荧光发射波长为489nm，荧光量子产率高达0.80。
实施例47
BCOOH-DAC的合成
中间体6-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基丁酸乙酯(BCOMe-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(1.00g，6.21mmol)与3.00g三乙胺。80℃下反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体608mg，产率45％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.25(t,J＝7.1Hz,2H),4.10(q,J＝7.1Hz,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),2.09(p,J＝7.3Hz,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.72,162.85,162.09,151.33,136.00,132.40,131.30,130.57,125.65,124.24,123.56,122.36,121.24,60.53,40.11,31.82,23.20,14.23.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C18H16BrN2O6[M+H]+435.0192,实测值435.0193.
BCOOH-DAC的合成
(1)BCOMe-DAC的合成
将BCOMe-NBr(200mg，0.46mmol)溶于10mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺600mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体103mg，产率53％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.51(s,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),4.00(dt,J＝14.1,5.3Hz,4H),3.14(d,J＝8.8Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),2.19(d,J＝11.7Hz,2H),1.89–1.80(m,2H),1.73(d,J＝6.8Hz,2H),1.31(dt,J＝30.1,15.8Hz,4H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.88,163.49,154.56,134.79,133.35,110.58,107.74,106.44,60.18,59.48,38.55,32.07,31.80,23.75,23.63,14.53.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H28N3O4[M+H]+422.2080,实测值422.2108.
(2)BCOOH-DAC的合成
BCOMe-DAC(80mg,0.19mmol)溶于5mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液8mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应1h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用5mL水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC 65mg，产率87％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.51(s,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),3.99(dd,J＝9.2,4.6Hz,2H),3.15(d,J＝9.1Hz,2H),2.21(dd,J＝16.7,9.3Hz,4H),1.88–1.76(m,2H),1.72(d,J＝8.0Hz,2H),1.42–1.19(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ174.48,163.50,154.57,134.79,133.36,110.58,107.76,106.47,59.50,47.97,33.82,32.08,31.90,25.79,24.93,23.86,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H24N3O4[M+H]+394.1767,实测值394.1824.
经检测，其结构如上式BOOH-DAC所示，其在水中紫外吸收波长为481nm，荧光发射波长为489nm，荧光量子产率高达0.80。
实施例48
NHSM-DAze的合成
COOH-DAze(30mg,0.08mmol)与二环己基碳亚(DCC)(30mg,0.15mmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌20min。N-羟基琥珀酰亚胺(100mg,0.87mmol)溶于3mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。2h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体32mg，产率85％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.18(d,J＝8.2Hz,2H),6.38(d,J＝8.4Hz,2H),4.51(s,2H),4.06(b,8H),2.87(s,4H),2.39(s,4H).
经检测，其结构如上式NHSM-DAze所示，其在水中荧光发射波长为493nm，能够与活性氨基进行室温缩合。
实施例49
NHSM-DAC的合成
COOH-DAC(20mg,0.05mmol)与二环己基碳亚(DCC)(100mg,0.50mmol)溶于1mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌30min。N-羟基琥珀酰亚胺(200mg,1.74mmol)溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝6:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体22mg，产率87％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.10–7.83(m,2H),7.56(s,2H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H),4.25(s,2H),3.18(d,J＝9.1Hz,2H),2.82(s,4H),2.19(d,J＝11.4Hz,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.33(dt,J＝27.8,15.1Hz,4H).
经检测，其结构如上式NHSM-DAC所示，其在水中荧光发射波长为487nm，能够与活性氨基进行室温缩合。
实施例50
NHSB-DAC的合成
BCOOH-DAC(50mg,0.12mmol)与二环己基碳亚(DCC)(112mg,0.54mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌20min。N-羟基琥珀酰亚胺(200mg,1.74mmol)溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。3h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体55mg，产率89％。实施例50制备的NHSB-DAC核磁谱图氢谱如图25所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.19–7.93(m,2H),7.53(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.05(t,J＝6.5Hz,2H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.80(s,4H),2.72(t,J＝7.7Hz,2H),2.19(d,J＝11.4Hz,2H),1.97–1.88(m,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.31(dt,J＝28.8,15.2Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.66,169.11,163.47,154.65,134.87,133.42,110.63,107.66,106.43,59.48,38.35,32.07,28.69,25.90,23.73,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C26H27N4O6[M+H]+491.1931,实测值491.1981.
经检测，其结构如上式NHSB-DAC所示，其在水中荧光发射波长为487nm，能够与活性氨基进行室温缩合。
实施例51
NEAN-DAC的合成
中间体N-(3-叠氮)丙基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(N3AN-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于10mL乙醇中，并向其中加入3-叠氮-正丙胺(500mg，5.00mmol)。60℃下反应1h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝1:2，V/V)分离得黄色固体429mg，产率68％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.21(d,J＝7.9Hz,1H),7.95(d,J＝7.8Hz,1H),3.69(t,J＝6.5Hz,2H),2.28(t,J＝6.6Hz,2H),1.40(m,2H).
NEAN-DAC的合成
将NEAN-NBr(50mg，0.12mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺100mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得黄色固体13mg，产率27％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.06(d,J＝8.7Hz,2H),7.48(s,2H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.02–3.79(m,2H),2.36(t,J＝7.0Hz,2H),2.21(d,J＝11.2Hz,2H),1.73-1.65(m,4H),1.54(dt,J＝14.9,7.6Hz,2H),1.30(dq,J＝14.3,7.2Hz,6H).
经检测，其结构如上式NEAN-DAC所示，其在水中荧光发射波长在487nm，可用于与炔基的生物正交反应。
实施例52
NEBAN-DAzi的合成
中间体N-(4-叠氮)丁基-4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺(N3BAN-NBr)的合成
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于50mL乙醇中，并向其中加入4-叠氮基-丁胺(300mg，2.63mmol)。40℃下反应2h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝1:2，V/V)分离得黄色固体339mg，产率52％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.73(d,J＝7.7Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.19(d,J＝7.7Hz,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),3.74(t,J＝6.4Hz,2H),2.32(t,J＝6.5Hz,2H),1.44(m,2H)，1.40(m,2H).
NEBAN-DAzi的合成
将N3BAN-NBr(80mg，0.19mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮丙啶40mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应24h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝150:1，V/V)，得黄色固体5mg，产率7％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(d,J＝8.7Hz,2H),6.11(d,J＝8.8Hz,2H),3.71(t,J＝6.5Hz,2H),2.52(s,8H),2.31(t,J＝6.6Hz,2H),1.43(m,2H)，1.40(m,2H).
经检测，其结构如上式NEBAN-DAzi所示，其在水中荧光发射波长在475nm，吸收波长为468nm，可用于与炔基的生物正交反应。
实施例53
Pyne-DAze的合成
OAN-DAze的合成
将OAN-Br(50mg，0.12mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷200mg。将反应液缓慢加热至120℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得黄色固体25mg，产率52％。其核磁谱图氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝8.5Hz,2H),6.38(d,J＝8.5Hz,2H),4.42(d,J＝5.3Hz,2H),4.09(s,8H),3.83(t,J＝5.4Hz,2H),3.68(s,4H),2.42(s,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.74,155.77,133.31,133.16,109.85,107.84,106.39,72.18,68.91,61.94,55.25,38.99,16.89.
高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实测值396.1919.
经检测，其结构如上式OAN-DAze所示，其在水中荧光发射波长在493nm，吸收波长为484nm。
Pyne-DAze的合成
将OAN-DAze(30mg，0.08mmol)与NaH(15mg，0.63mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将30μL溴丙炔溶于1mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌5h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体5mg，产率15％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.36(d,J＝8.6Hz,2H),6.36(d,J＝8.5Hz,2H),4.42(t,J＝6.7Hz,2H),4.27(s,2H),4.05(s,8H),3.80(t,J＝6.6Hz,2H),3.70–3.63(m,2H),3.44(t,J＝6.6Hz,2H),3.11(s,1H),2.44(s,4H).
经检测，其结构如上式OAN-DAze所示，其在水中荧光发射波长在492nm，吸收波长为484nm，可用于与叠氮的生物正价反应。
实施例54
Pyne-DAC的合成
OAN-DAC的合成
将OAN-NBr(100mg，0.24mmol)溶于20mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺300mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝70:1，V/V)，得黄色固体34mg，产率35％。核磁谱图氢谱与碳谱具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,21H),7.54(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.59(t,J＝4.7Hz,1H),4.15(t,J＝6.8Hz,2H),3.56(t,J＝6.8Hz,2H),3.46(s,4H),3.15(d,J＝9.4Hz,2H),2.20(d,J＝12.0Hz,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.43–1.22(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ163.43,154.65,134.84,133.40,110.63,107.62,106.40,72.53,67.69,60.66,59.48,46.17,32.07,23.63.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C22H26N3O4[M+H]+396.1923,实测值396.1919.
经检测，其结构如上式OAN-DAC所示，其在水中荧光发射波长在488nm，吸收波长为481nm。
Pyne-DAC的合成
将OAN-DAC(30mg，0.08mmol)与NaH(3mg，0.13mmol)置于10mL史莱克瓶中，用氮气置换三次。将15μL溴丙炔溶于2mL干燥的DMF后，并加入反应液。室温下搅拌5h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝100:1，V/V)，得棕色固体7mg，产率21％。
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C25H28N3O4[M+H]+434.2080,实测值434.2108.
经检测，其结构如上式Pyne-DAC所示，其在水中荧光发射波长在487nm，吸收波长为480nm，可用于与叠氮的生物正交反应。
实施例55
Col-DAC的合成
NHSB-DAC(20mg,0.04mmol)与氨基秋水仙素(15mg,0.04mmol)置于5mL史莱克瓶中，并用氮气置换3次。将5μL二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于2mL二甲基亚砜(DMSO)中，而后将混合液加入反应瓶。室温下搅拌3h后，将反应液倒入10mL水中，并用50mL二氯甲烷萃取得有机相，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱分离得(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)棕黄色固体23mg，产率77％。
实施例55制备的Col-DAC的高分辨质谱如图32所示，质谱数据为：高分辨质谱理论值C42H45N4O8[M+H]+733.3237,实测值733.3220.
经检测，其结构如上式Col-DAC所示，其在水中荧光发射波长为489nm，吸收为481nm。
实施例56
DTX-DAC的合成
NHSB-DAC(10mg,0.02mmol)与氨基紫杉醇(14mg,0.02mmol)置于5mL史莱克瓶中，并用氮气置换3次。将3μL二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)中，而后将混合液加入反应瓶。室温下搅拌2h后，将反应液倒入10mL水中，并用50mL二氯甲烷萃取得有机相，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1，V/V)得棕黄色固体16mg，产率72％。
实施例56制备的DTX-DAC的高分辨质谱如图33所示，质谱数据为：高分辨质谱理论值C60H67N4O15[M+H]+1083.4603,实测值1083.4603.
经检测，其结构如上式DTX-DAC所示，其在水中荧光发射波长为488nm，吸收为481nm。
实施例57
UNAA-DAC的合成
NHSB-DAC(30mg,0.06mmol)与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐(19mg,0.06mmol)置于5mL史莱克瓶中，并用氮气置换4次。将20μL二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于2mL二甲基亚砜(DMSO)中，而后将混合液加入反应瓶。室温下搅拌2h后，将反应液倒入10mL水中，并用100mL二氯甲烷萃取得有机相，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱分离得(二氯甲烷：甲醇＝40:1，V/V)棕黄色固体21mg，产率60％。实施例57制备的UNAA-DAC的核磁谱图氢谱如图26所示，氢谱与碳谱具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(t,J＝5.9Hz,1H),8.46(d,J＝8.3Hz,2H),8.11(d,J＝8.6Hz,2H),7.58(d,J＝8.4Hz,4H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),4.43(d,J＝5.9Hz,2H),4.07(t,J＝7.1Hz,2H),3.21(d,J＝9.1Hz,2H),3.04(s,3H),2.27(dd,J＝16.9,8.9Hz,4H),1.93(dd,J＝14.8,7.5Hz,2H),1.78(d,J＝7.9Hz,2H),1.40(dd,J＝21.3,9.5Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.39,167.51,163.65,163.51,154.57,144.96,134.79,133.38,130.74,128.47,127.87,110.59,107.79,106.45,59.49,42.30,39.02,33.79,32.07,24.80,23.63,21.27.
经检测，其结构如上式UNAA-DAC所示，其在水中荧光发射波长为487nm，吸收为481nm；由于四唑的引入荧光得到有效淬灭。
实施例58
脂滴荧光染料MLD-DAze的合成
中间体N-甲基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(MLD-DBr)的合成：
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(400mg，0.65mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液48mL(2:1,V/V),而后向其中滴加甲胺400mg。100℃反应3h后，将反应液倒入200mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1，V/V)得红色固体482mg，产率39％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(s,2H),8.14(s,2H),4.33(s,3H).
染料N-甲基-9,10-二-氮丙啶基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺MLD-DBr(200mg，0.32mmol)与氮丙啶(25mg，0.46mmol)溶于20mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。12h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:3，V/V)得蓝绿色固体18mg，产率11％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(s,2H),6.57(s,2H),4.31(s,3H),2.76(s,8H).
经检测，其结构如MLD-DAzi所示，其荧光发射波长在不同溶剂中达670-700nm，实现了近红外荧光发射。
实施例59
荧光染料BuLD-DAze的合成
染料N-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与氮杂环丁烷(86mg，1.50mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。12h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得蓝绿色固体46mg，产率25％。实施例59制备的N-丁基-9,10-二氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(BuLD-DAze)的核磁谱图氢谱如图27所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(s,2H),6.55(s,2H),4.25–4.19(m,2H),4.09(s,8H),2.48(s,4H),1.79–1.67(m,2H),1.48(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
经检测，其结构如上式BuLD-DAze所示，其乙醇中荧光发射波长为720nm左右，已达到近红外区。
实施例60
荧光染料OLD-DAze的合成方法。
染料N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-DAze)的合成：
将LD-DBr(200mg，0.28mmol)与氮杂环丁烷(104mg，1.42mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。24h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂：二氯甲烷)得蓝绿色固体60mg，产率32％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,2H),6.57(s,2H),4.57–4.37(m,2H),4.10(s,8H),3.88(d,J＝4.9Hz,2H),3.71(s,4H),2.50(s,4H).
经检测，其结构如上式OLD-DAze所示，其乙醇中荧光发射波长为750nm左右，已达到近红外区。
实施例60
近红外染料BuLD-710的合成方法。
中间体N-丁基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液60mL(2:1,V/V),而后向其中滴加正丁胺(428mg,5.86mmol)。140℃反应1h后，将反应液倒入200mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1，V/V)得红色固体600mg，产率46％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(s,2H),8.14(s,2H),4.38–4.11(m,2H),1.94–1.66(m,2H),1.56–1.38(m,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H).
染料N-丁基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与反式环己二胺(228mg，2.00mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至130℃。14h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得蓝绿色固体56mg，产率30％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,J＝3.7Hz,2H),8.11(s,1H),7.96(s,1H),7.17(d,J＝10.8Hz,2H),,4.28(t,J＝6.5Hz,2H),3.21(d,J＝10.0Hz,2H),2.26(d,J＝10.9Hz,2H),1.94-1.68(m,2H),1.77(s,2H),1.56-1.38(m,2H),1.41(s,2H),1.25(s,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H).
经检测，其结构如上式BuLD-710所示，其乙醇中荧光发射波长为750nm左右，已达到近红外区。
实施例61
荧光染料OLD-710的合成方法。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液24mL(2:1,V/V),而后向其中滴加二甘醇胺(120mg,3.48mmol)。120℃反应6h后，将反应液倒入250mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1-1:4，V/V)得红色固体380mg，产率55％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,2H),8.13(s,2H),4.67–4.41(m,2H),3.88(d,J＝5.3Hz,2H),3.71(d,J＝4.5Hz,2H),3.67(d,J＝3.6Hz,2H),2.38(s,1H).
染料N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-710)的合成：
将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(200mg，0.28mmol)与反式环己二胺(1200mg，10.5mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。24h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂：二氯甲烷)得蓝绿色固体80mg，产率43％。实施例2制备的N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-710)的核磁谱图氢谱如图28所示，具体数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,J＝3.7Hz,2H),8.10(s,1H),7.94(s,1H),7.17(d,J＝10.8Hz,2H),4.60(s,1H),4.26(t,J＝6.5Hz,2H),3.65(t,J＝6.6Hz,2H),3.48(s,4H),3.21(d,J＝10.0Hz,2H),2.26(d,J＝10.9Hz,2H),1.76(s,2H),1.40(s,2H),1.22(s,2H).
经检测，其结构如上式OLD-710所示，其荧光性能如下：
将该染料溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要制配成不同浓度测试溶液，检测其荧光光谱变化及细胞、活体内脂滴荧光成像。
乙醇中的荧光激发与发射光谱测试。每次取20μL染料母液，分别加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光探针测试液，并进行荧光激发与发射光谱测试。
OLD-710在乙醇中的激发与发射光谱如图36所示：OLD-710在乙醇中的归一化荧光谱图。OLD-710乙醇中的荧光发射波长达到了750nm，激发波长为712nm，激发与发射波长达到了近红外发射波长。
实施例62
中间体ELD-DBr的合成
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐O-DBr(1.6g，2.43mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液80mL(2:1,V/V),而后向其中滴加4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(1.00g，5.97mmol)。100℃反应3h后，将反应液倒入150mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得红色固体150mg，产率8％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,2H),7.84(s,2H),4.28(t,J＝7.1Hz,2H),4.12(q,J＝7.1Hz,2H),2.46(t,J＝7.4Hz,2H),2.18–1.93(m,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.82,162.58,135.45,134.89,133.68,133.40,132.93,132.78,131.63,129.51,123.78,123.63,122.91,121.86,60.53,39.95,31.86,29.71,23.39.
染料ELD-DAC的合成
将ELD-DBr(200mg，0.27mmol)与1,2-环己二胺(228mg，2.00mmol)溶于20mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。16h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得蓝绿色固体75mg，产率40％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.25(s,2H),7.93(s,2H),7.15(s,2H),4.11(t,J＝6.6Hz,2H),3.97(dt,J＝13.3,6.5Hz,2H),3.21(d,J＝9.6Hz,2H),2.38(t,J＝7.3Hz,2H),2.26(d,J＝11.8Hz,2H),1.97–1.87(m,2H),1.77(d,J＝6.4Hz,2H),1.35(dd,J＝21.4,8.0Hz,4H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H).
经检测，其结构如上式ELD-DAC所示，其乙醇中荧光发射波长为752nm左右，发射波长已达到近红外区。
实施例63
BuLD-DAzi的合成
将N-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺BuLD-DBr(200mg，0.30mmol)与氮丙啶(100mg，2.32mmol)溶于20mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。12h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:3，V/V)得蓝绿色固体14mg，产率8％。
其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,2H),6.56(s,2H),4.25–4.19(m,2H),2.78(s,8H),1.79–1.66(m,2H),1.47(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
经检测，其结构如上式BuLD-DAzi所示，其乙醇中荧光发射波长为730nm左右，发射波长已达到近红外区。
实施例64
目标染料Rho-1的合成
称取500mg的5-羟基四氢喹啉和595mg的邻苯二甲酸酐于烧瓶中，氮气保护下加入30mL甲苯，加热回流搅拌5h后，停止反应，冷却至室温后冰浴30min，抽滤，用石油醚洗涤滤饼，烘干，得粗产物458mg，产率46％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.15(s,1H),9.07(d,J＝111.2Hz,1H),7.87(d,J＝56.8Hz,1H),7.44(s,2H),6.91(s,1H),6.42(d,J＝64.0Hz,1H),3.34(s,4H),2.67(t,J＝6.6Hz,2H),1.91(s,2H).
分别称取135mg的5-羟基四氢喹啉和290mg中间体5-羟基四氢喹啉苯酮酸，氮气保护下，加入4mL甲磺酸和4mL三氟乙酸。先升温到120℃，再升温到150℃，搅拌两天。减压除去大部分的酸，加入碳酸钠水溶液将pH调到9-10。二氯甲烷萃取，减压出去有机溶剂后硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇20：1-5：1为洗脱剂，减压除去有机溶剂得紫红色固体178mg，产率48％。实施例64制备的Rho-1的核磁谱图氢谱如图29所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(d,J＝7.6Hz,1H),7.74(t,1H),7.66(t,J＝7.4Hz,1H),7.22(d,J＝7.6Hz,1H),6.29(s,2H),6.22(q,J＝8.7Hz,4H),3.20(s,4H),2.84(t,J＝6.3Hz,4H),1.95–1.82(m,4H).
经检测，其结构如上式Rho-1所示，可以进行细胞中线粒体的成像，其光性能如下：
罗丹明类染料分子Rho-1在乙醇中的吸收与发射光谱测试。取实施例64得到的罗丹明类染料分子Rho-1，溶解于DMSO中配置成2mM的母液。取20μL的母液溶于4mL乙醇中，配置成终浓度10μM的测试液，测得其吸收和发射光谱图。
Rho-1在乙醇中的吸收与发射谱图如图37所示：染料Rho-1在乙醇中吸收为533nm，发射波长为558nm，经计算得乙醇中荧光量子产率为0.91。
实施例65
目标染料Rho-2的合成
分别称取100mg的5-羟基四氢喹啉和215mg中间体5-羟基四氢喹啉苯酮酸，氮气保护下，加入4mL甲磺酸和4mL三氟乙酸。先升温到120℃，再升温到150℃，搅拌两天。减压除去大部分的酸，加入碳酸钠水溶液将pH调到9-10。二氯甲烷萃取，减压出去有机溶剂后硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇20:1-5:1为洗脱剂，减压除去有机溶剂得紫红色固体144mg，产率52％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.93(d,J＝7.4Hz,1H),7.75(t,J＝6.0Hz,1H),7.66(t,J＝7.1Hz,1H),7.22(d,J＝7.6Hz,1H),6.33(t,J＝14.3Hz,2H),6.26–6.19(m,2H),6.17(dd,J＝9.0,2.1Hz,1H),6.09(d,J＝11.5Hz,1H),3.18(dd,J＝10.9,4.9Hz,4H),2.81(dt,J＝20.3,6.4
Hz,2H),2.44(dd,J＝16.3,6.4Hz,2H),1.72–1.65(m,2H),1.23(s,2H).
经检测，其结构如上式Rho-2所示，其光性能如下：染料Rho-2在乙醇中吸收为534nm，发射波长为559nm，经计算得乙醇中荧光量子产率为0.85。
实施例66
目标染料Rho-3的合成
称取500mg的N-乙基-5-羟基四氢喹啉和654mg的邻苯二甲酸酐于烧瓶中，氮气保护下加入30mL甲苯，加热回流搅拌5h后，停止反应，冷却至室温后冰浴30min，抽滤，用石油醚洗涤滤饼，烘干，得粗产物514mg，产率56％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.94(s,1H),7.94(dd,1H,J＝7.8,1.1Hz),7.66(td,1H,J＝7.5,1.3Hz),7.59(td,1H,J＝7.6,1.3Hz),7.33(dd,1H,J＝7.6,1.1Hz),6.40(s,1H),3.35(s,1H),3.25(t,2H,J＝5.7Hz),3.23(t,2H,J＝6.2Hz),2.59(t,2H,J＝6.4Hz),1.85(m,2H),1.67(t,2H).
分别称取200mg的N-乙基-5-羟基四氢喹啉和404mg的中间体N-乙基-5-羟基苯酮酸，氮气保护下，加入5mL甲磺酸和5mL三氟乙酸。先升温到120℃，再升温到150℃，搅拌两天。减压除去大部分的酸，加入碳酸钠水溶液将pH调到9-10。二氯甲烷萃取，减压出去有机溶剂后硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇20:1-5:1为洗脱剂，减压除去有机溶剂得紫红色固体173mg，产率36％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.91(d,J＝7.6Hz,1H),7.64(t,1H),7.56(t,J＝7.4Hz,1H),7.22(d,J＝7.6Hz,1H),6.26(s,2H),6.12(q,J＝8.7Hz,4H),3.40(s,4H),3.37(q,J＝7.1Hz4H),2.84(t,J＝6.3Hz,4H),1.95–1.82(m,4H),1.10–1.14(t,6H)
经检测，其结构如上式Rho-3所示，其光性能如下：Rho-3在乙醇中的吸收和荧光发射波长分别为：吸收波长为538nm，发射波长为561nm，经计算得乙醇中荧光量子产率为0.81。
实施例67
目标染料Rho-4的合成
称取1.0g的4-羟基吲哚啉和1.3g的邻苯二甲酸酐于烧瓶中，氮气保护下加入30mL甲苯，加热回流搅拌5h后，停止反应，冷却至室温后冰浴30min，抽滤，用石油醚洗涤滤饼，烘干，得粗产物白色固体1.0g，产率48％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.55(s,1H),7.95(d,J＝7.6Hz,1H),7.63(d,J＝7.9Hz,1H),7.55(s,1H),7.46(t,J＝7.4Hz,1H),7.31(d,J＝7.3Hz,1H),7.00(t,J＝8.0Hz,1H),6.51(d,J＝8.1Hz,1H),3.64(t,2H),2.87(t,J＝8.4Hz,2H).
分别称取135mg的4-羟基吲哚啉和290mg的中间体4-羟基吲哚啉苯酮酸，加入8mL甲磺酸和2mL三氟乙酸，氮气保护下。先升温到120℃，再升温到150℃，搅拌两天。减压除去大部分的酸，加入碳酸钠水溶液将pH调到9-10.二氯甲烷萃取，减压出去有机溶剂后硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇20:1-5:1为洗脱剂，减压除去有机溶剂得白色固体106mg，产率27.6％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.21–8.16(m,1H),7.68–7.62(m,2H),7.29–7.23(m,1H),7.08(d,J＝8.9Hz,2H),6.68(d,J＝8.9Hz,2H),4.03(t,J＝8.8Hz,4H),3.42–3.37(m,4H).
经检测，其结构如上式Rho-5所示，可以进行细胞中线粒体的成像，其光性能如下：Rho-5在乙醇中的吸收为551nm，发射波长为574nm，斯托克斯位移为23nm，发射波谱的半峰宽为26nm，经计算得乙醇中荧光量子产率为0.93。
实施例68
目标染料Rho-5的合成
称取500mg的N-乙基-4-羟基吲哚啉和454mg的邻苯二甲酸酐于烧瓶中，氮气保护下加入20mL甲苯，加热回流搅拌5h后，停止反应，冷却至室温后冰浴30min，抽滤，用石油醚洗涤滤饼，烘干，得粗产物白色固体391mg，产率41％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.04(s,1H),8.44(t,J＝7.5Hz,1H),8.18(t,J＝7.9Hz,1H),7.96(d,1H),7.03(d,J＝7.4Hz,1H),6.39(d,J＝7.3Hz,1H),3.61(t,J＝8.0Hz,2H),3.40(m,J＝8.1Hz,2H),3.12(t,J＝8.4Hz,2H),1.12(s,3H).
分别称取100mg的N-乙基-4-羟基吲哚啉和190mg的N-乙基-4-羟基吲哚啉苯酮酸，加入4mL甲磺酸和1mL三氟乙酸，氮气保护下。先升温到120℃，再升温到150℃，搅拌两天。减压除去大部分的酸，加入碳酸钠水溶液将pH调到9-10，二氯甲烷萃取，减压出去有机溶剂后，硅胶柱分离(200-300目)，用二氯甲烷：甲醇20:1-5:1为洗脱剂，减压除去有机溶剂得白色固体70mg，产率26％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.19–8.15(m,1H),7.67–7.63(m,2H),7.20–7.15(m,1H),7.07(d,J＝8.9Hz,2H),6.68(d,J＝8.9Hz,2H),3.99(t,J＝8.8Hz,4H),3.42–3.37(m,4H),3.33(m,J＝8.8Hz,4H),1.12(t,J＝8.8Hz,6H).
经检测，其结构如上式Rho-5所示，其光性能如下：
Rho-5在乙醇中的吸收与发射波长分别为：吸收波长为553nm，发射波长为577nm，经计算得乙醇中荧光量子产率为0.90。
实施例69
目标染料SiR-1的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯96mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入220μL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入20mg中间体Si-ket6的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1，减压除去有机溶剂后得到无色固体14mg，产率55％。实施例69制备的SiR-1的核磁谱图氢谱如图30所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.48(td,J＝7.5,1.0Hz,1H),7.39(td,J＝7.4Hz,1H),7.08(d,J＝7.7Hz,1H),6.78(d,J＝8.8Hz,2H),6.49(d,J＝8.9Hz,2H),3.26(t,J＝6.1Hz,4H),2.97–2.89(m,J＝11.1,5.5Hz,4H),2.01(t,4H),0.76(s,3H),0.67(s,3H).
经检测，其结构如上式SiR-1所示，可以进行细胞中线粒体的成像，其光性能如下：
硅基取代罗丹明类染料分子SiR-1在乙醇中的吸收与发射光谱测试。将实施例1所得到的染料分子SiR-1溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，取20μL母液于4mL甲醇中，配成终浓度10μM的测试液，测试其吸收与荧光光谱。
SiR-1在乙醇中的吸收与发射归一化谱图分别如图38所示：染料分子SiR-1在甲醇中的吸收为648nm，发射波长在663nm，经计算得量子产率为0.34。
实施例70
目标染料SiR-2的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯93mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入0.21mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入中间体Si-ket5(18mg)溶于四氢呋喃溶液注入反应体系，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1，减压除去有机溶剂后得到无色固体11mg，产率47％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(td,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.49(td,1H),7.24(d,1H),6.71(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝8.5Hz,2H),3.42(dd,J＝15.5,8.3Hz,2H),3.32(dd,J＝17.0,8.6Hz,2H),3.12(dd,4H),2.71(s,6H),0.65(s,J＝16.3Hz,6H).
经检测，其结构如上式SiR-2所示，其光性能如下：
染料分子SiR-2在甲醇中的吸收和荧光归一化图，其吸收为649nm，发射波长在659nm，经计算得量子产率高达0.4。
实施例71
目标染料SiR-3的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯36mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入80μL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入中间体Si-kets5硅酮7mg溶于四氢呋喃溶液注入反应体系，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1，减压除去有机溶剂后得到无色固体2mg，产率24％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝7.7Hz,1H),7.52(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(t,2H),7.16(d,J＝7.7Hz,1H),6.64(d,J＝8.5Hz,1H),6.59(s,1H),6.57(s,2H),6.23(d,J＝8.5Hz,1H),3.65(t,J＝7.0Hz,5H),3.20(t,J＝8.2Hz,2H),3.04(t,J＝8.2Hz,2H),2.73(s,4H),2.64(s,3H),0.57(s,J＝3.1Hz,3H),0.53(s,3H).
经检测，其结构如上式SiR-3所示，其光性能如下：染料分子SiR-3在甲醇中的吸收为662nm，发射波长在684nm，经计算得量子产率为0.36。
实施例72
目标染料SiR-4的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯115mg于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入0.26mL 1.7M异丁基锂的庚烷溶液，搅拌30min后。加入中间体Si-ketBu(22mg)溶于四氢呋喃溶液注入反应体系，升至室温搅拌避光过夜。饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品。粗产品经过硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝30:1，减压除去有机溶剂后得到无色固体13mg，产率49％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.92(d,J＝7.6Hz,1H),7.60(td,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.49(td,1H),7.24(d,1H),6.71(d,J＝8.5Hz,2H),6.31(d,J＝8.5Hz,2H),3.42(dd,J＝15.5,8.3Hz,2H),3.32(dd,J＝17.0,8.6Hz,2H),3.12(dd,4H),2.71(t,J＝8.5Hz,4H),1.2-1.6c(m,J＝8.2Hz,8H),1.06(s,6H).0.65(s,J＝16.3Hz,6H).
经检测，其结构如上式SiR-4所示，其光性能如下：SiR-4在甲醇中的吸收和荧波长分别为：吸收波长为660nm，发射波长为681nm，经计算得量子产率为0.31。
将本发明涉及染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱变化及细胞内荧光成像。
实施例73
BuAN-DAze在500W钨灯照射下荧光强度随时间变化测试。取20μL BuAN-DAze及商业染料母液加入4mL PBS(磷酸缓冲液，pH 7.4)中，而后加入螺纹比色皿中，正面放置于钨灯50cm处，分别采取0,0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10h为时间节点进行荧光光谱测试，并选取各自染料荧光发射峰值对时间进行曲线图。
不同染料光稳定性图如图39所示：BuAN-DAze荧光强度在光照10h后仍然能够保持较高强度(97％)，而商业绿色线粒体染料、罗丹明123、荧光素、Bodipy等荧光强度均大幅降低，这说明BuAN-DAze光稳定性极高。
实施例74
本项目部分染料在活细胞内(RWPE、HeLa、脂肪细胞等)荧光共聚焦成像及结构光照明显微成像。取0.5μL以上探针母液溶于1mL细胞培养液中，而后置于37℃下对细胞进行孵育10-30分钟后进行荧光成像。
染料Mito-DAze的RWPE细胞活细胞荧光共聚焦成像图如图40所示：染料定位准确线粒体轮廓清晰，与商业染料MitoTracker Deep Red能够有很好共定位效果。
线粒体染料Mito-DAze的RWPE细胞活细胞结构光照明显微成像图如图41所示：RWPE细胞内线粒体清晰呈线条型，且能够清晰看到线粒体内脊。
Mito-DAC对活细胞线粒体成像图如图42所示：染料Mito-DAC能够特异性标记HeLa细胞线粒体，且具有较高信噪比。
OLD-DAze对活细胞脂滴成像图如图43所示：脂滴染料OLD-DAze能够特异性标记脂肪细胞内脂滴，且特异性，能够监测不同大小的脂滴颗粒。
实施例75
SNAP-tag或Halo-tag在转染的融合有标签蛋白的H2B的HeLa细胞中荧光共聚焦成像。取0.5μL染料母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育30分钟后，用于荧光共聚焦成像。
Halo-DAze对活细胞内细胞核共聚焦成像图如图44所示：染料Halo-DAze在能够精准定位细胞核内，与融合有Halo-tag的组蛋白进行特异性反应，细胞核轮廓清晰。
SNAP-DAze对活细胞内细胞核共聚焦成像图如图45所示：染料SNAP-DAC在能够精准定位细胞核内，与融合有SNAP-tag的组蛋白进行特异性反应，细胞核轮廓清晰，且信噪比较高。
实施例76
SNAP-DAC在转染的pSNAPf-H2B的HeLa细胞中STED超分辨荧光成像。取0.5μLSNAP-DAC母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育30分钟后，通过4％甲醛溶液对细胞进行固定后置于1mL PBS缓冲液中，用于STED超分辨荧光成像。
SNAP-DAC对细胞核的超分辨成像图如图46所示：SNAP-DAC能够对HeLa细胞内细胞核进行特异性标记。由于光稳定性的提升，SNAP-DAC能够在GW/cm2级高强度激光下进行多次成像、重构得到更高分辨率图像。
实施例77
Rho-4与Nu-DAC对RWPE细胞的结构光照明显微多色成像实验。取0.5μL以上探针母液同时溶于1mL细胞培养液中，而后置于37℃下对细胞进行孵育10-30分钟后进行荧光成像。
Rho-4与Nu-DAC对RWPE细胞的结构光照明显微多色成像图如图47所示：(a)为Rho-4通道成像图，其能够对细胞线粒体进行特异性标记；(b)为Nu-DAC通道成像图，其能够对细胞核进行特异性染色；(c)为上述两者叠加图。这说明Rho-4与Nu-DAC能够同时使用对活细胞进行多色荧光成像。
实施例78
OLD-DAze与Nu-DAC对HT29细胞的结构光照明显微多色成像实验。取0.5μL以上探针母液同时溶于1mL细胞培养液中，而后置于37℃下对细胞进行孵育10-30分钟后进行荧光成像。
OLD-DAze与Nu-DAC对HT29细胞的结构光照明显微多色成像图如图48所示：(a)为OLD-DAze通道成像图，其能够对细胞脂滴进行特异性标记；(b)为Nu-DAC通道成像图，其能够对细胞核进行特异性染色。这说明OLD-DAze与Nu-DAC能够同时使用对活细胞进行多色荧光成像。
Claims (28)
1.一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：该染料在供电子一端通过刚性环胺结构的调节抑制了分子内扭转，实现了荧光量子效率的提高，光稳定性的提升，该染料由4-酰胺基取代萘酰亚胺类染料、双烷氧基取代的萘酰亚胺类荧光染料、双氨基取代萘酰亚胺类荧光染料、9,10-双氨基取代苝酰亚胺、六元环并罗丹明类染料、五元环并罗丹明类染料、硅基罗丹明类染料中的一种或几种按任意比混合。
2.根据权利要求1所述的一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：
所述的4-酰胺基取代萘酰亚胺类染料，其吸收波长覆盖350-400nm可用于360nm，405nm激发进行荧光检测及成像，其结构式为：
其中，R1为H、C1-4烷基、芳基、(CH2)mCOOMe、生物靶向基团如N-乙基吗啉，苄基鸟嘌呤等。X为1,2,3,4及其他整数。
3.根据权利要求1所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述的双烷氧基取代的萘酰亚胺类荧光染料，其吸收波长位于390nm，荧光发射波长在用于405nm激发，其结构式如下：
R3,R4分别独立则为
若R3,R4不独立则为
以整体结构存在
p为0-2整数。
4.根据权利要求1所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述双氨基取代的萘酰亚胺类荧光染料，其吸收波长为440-490nm，能够通过450nm、488nm激光进行激发，通过靶向基团的改变可用作以下染料：线粒体荧光染料、SNAP-tag荧光染料、Halo-tag荧光染料、活性酯荧光染料、药物靶向荧光染料，其结构式如下：
其中R2为H、C1-16烷基、芳基、取代芳基、(CH2CH2O)nH、(CH2)mCOOMe和(CH2)mSO3H、杂芳基或取代杂芳基，生物靶向基团如N-乙基吗啉，苄基鸟嘌呤，正己烷基-三苯基膦，叶酸，秋水仙素，紫杉醇，6-氯己烷基等。
R5,R6分别独立则为
中的一种，若R5,R6不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；Y为砜基，亚砜基，二甲基硅烷基，硼烷基；
m、n为0-4整数。
5.根据权利要求4所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述线粒体荧光染料，能够特异性标记细胞内线粒体，其结构式如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
6.根据权利要求4所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：SNAP-tag荧光染料，能够特异性识别SNAP-tag蛋白，实现活细胞免洗标记，其结构式如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
7.根据权利要求4所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：Halo-tag荧光染料，能够特异性识别Halo-tag蛋白，实现活细胞免洗标记，其结构式如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
8.根据权利要求4所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：活性酯荧光染料，能够用于与氨基的缩合实现对目标的共价连接，其结构式如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n 为0-4整数。
9.根据权利要求4所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：药物靶向荧光染料，可用于450nm及488nm激光进行激发用于检测与成像，其结构式如下：
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
10.根据权利要求1所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述9,10-位双氨基取代苝酰亚胺类染料，其可用于680nm，710nm激光进行发，并可实现细胞及活体内脂滴成像，其结构式如下：
其中：R11为
R9,R10分别独立则为
中的一种，若R9,R4不独立则为
以整体结构存在，
R7，R8各自独立为H、C1-4烷基、(CH2CH2O)nH；若R7不为H时，R8必为非H取代基；n为0-4整数。
11.根据权利要求1所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述六元环并罗丹明类染料能够用于532nm激发，其结构式如下：
R12为5-位并六元环或者7-位并六元环；
R13为H或者C1-4烷烃。
12.根据权利要求1所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述五元环并罗丹明类染料能够用于550nm激发，其结构式如下：
其中，R13为H或者C1-4烷烃。
13.根据权利要求1所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料，其特征在于：所述硅基罗丹明类染料能够用于640nm激发从而进行荧光标记与成像，其结构式如下：
其中：q＝0或1；
R13为H、C1-4烷基。
14.一种如权利要求2所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-烷基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺溶于四氢呋喃中，并在0℃下向该反应液中滴加氯取代烷基酰氯；滴加完毕后将混合液转移至室温反应6-10h。减压除去溶剂后，去离子水洗涤残余物，抽滤得白色滤饼并用甲醇洗涤，真空干燥得N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物；
其中，N-烷基-4-氨基-1,8-萘酰亚胺的质量与四氢呋喃的体积比为2-25:1mg/mL；氯取代烷基酰氯与四氢呋喃体积比为1:10-80；氯取代烷基酰氯与去离子水体积比为1:5-50；氯取代烷基酰氯与甲醇的体积比为1:10-20；
(2)染料N-烷基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物的合成：
将N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物，溶于乙腈中，并向其中加入碳酸钾。将反应液缓慢升温至50-90℃，并持续反应1-3h。减压除去溶剂，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比为200～800:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得米白色固体N-烷基-4-环酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物；
其中，N-烷基-4-酰胺基-1,8-萘酰亚胺类化合物与碳酸钾质量比1:1-4；碳酸钾的质量与乙腈的体积比为10-20:1mg/mL。
15.一种如权利要求3所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)染料N-丁基-4,5-二烷氧基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将多元醇溶于干燥的四氢呋喃中，鼓吹氮气下加入Na块，0.5-1h后向反应液中加入N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺并加热至60-90℃,2-10h。减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比为1:1～4的二氯甲烷和石油醚＝为洗脱剂，减压除去溶剂得白色固体N-丁基-4,5-二烷氧基-1,8-萘酰亚胺；
其中，多元醇、钠块的质量比为2-1:1；多元醇、N-丁基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量比为2:1-12；多元醇的质量与四氢呋喃的体积比为1-10:1mg/mL。
16.一种如权利要求4所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐和脂肪伯胺溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以石油醚与二氯甲烷或体积比为800-100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺；
其中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐：脂肪伯胺的质量比为1:0.5-2；4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与无水乙醇的体积比为1:20-80g/mL。脂肪伯胺包括甲胺、乙胺、丁胺、正十二胺、正十六胺等直链烷基胺、苄胺类似物、氨基取代烷基磺酸、氨基醇；
(2)染料N-烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的合成：
将N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪环胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为400-30:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-烷基-4,5-二脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺；
其中，N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺与脂肪环胺的质量比为1:1-3；N-烷基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:50-200g/mL；所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶、环己亚胺、乙二胺衍生物及环己二胺衍生物。
17.一种如权利要求5所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含以下步骤：
(1)中间体N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的合成：
将N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐于乙酸乙酯，向其中滴加三溴化磷，缓慢升温至60-80℃搅拌4-12h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐；
其中，N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐与三溴化磷的质量比为1:1.7-5；N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的质量与乙酸乙酯的体积比为20-30:1mg/mL；
(2)中间体N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的合成：
将N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐和三苯基膦溶于乙腈中，升温至120-140℃，反应18-30 h结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐；
其中，N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐与三苯基膦的质量比为：1:2.7-8；N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的质量与乙腈的体积比为15-30:1mg/mL；
(3)线粒体探针的合成：
将N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐溶于乙二醇甲醚，向其中滴加脂肪胺，升温至100-140℃搅拌，反应10-15h后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到线粒体探针；
其中，N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐与脂肪胺的质量比为：1.6-2.4:1；N-三苯基膦基烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的质量与乙二醇甲醚的体积比为5.3-24:1；所述脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶、环己亚胺、乙二胺衍生物及环己二胺衍生物。
18.一种如权利要求6所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)SNAP-tag探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾和2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应3-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100-10:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP-tag蛋白的荧光探针；
其中，N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺、叔丁醇钾、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤的质量比为1:1-5:1-5；N-(4-羟甲基)苄基-4,5-脂肪胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:80-200g/mL。
19.一种如权利要求7所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)Halo-tag探针的合成
将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺与NaH置于史莱克瓶中，并氮气置换2-5次；将1-碘-6-氯己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，加入反应液中；室温下搅拌1-5h后，减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为100～400:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得到靶向Halo-tag蛋白的荧光探针；
其中，N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺与NaH的质量比为5-10:1；N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺的质量与1-碘-6-氯己烷体积比为0.5-1mg/μL；N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-4,5-取代-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺体积比为5-20:1mg/mL。
20.一种如权利要求8所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-1-(羧基)烷基-4,5-二脂肪氨基-1,8-萘酰亚胺COOH-DF系列化合物
COEt-DF系列化合物溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得COOH-DF系列化合物；
其中，COEt-DF系列化合物的质量与甲醇的体积比为10-20:1mg/mL；COEt-DF系列化合物的质量与2M氢氧化钠溶液的体积比为10-20:1mg/mL；COEt-DF系列化合物的质量与水的体积比为10-20:1mg/mL；
(2)带有NHS活性基团的荧光染料合成
将COOH-DF系列化合物，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于1mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中；2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比20:1-4:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHS活性基团的荧光染料染料；
其中，COOH-DF系列化合物、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；COOH-DF系列化合物的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1mg/mL。
21.一种如权利要求9所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)含药物性的荧光染料的合成
10-30mg带有NHS活性基团的系列染料与带有活性氨基的药物分子置于史莱克瓶中，并用氮气置换2-5次；2-20μL二异丙基乙基胺溶于0.5-2mL干燥的二甲基亚砜中并加入反应瓶中；室温下搅拌3-10h后，水洗并用二氯甲烷萃取得有机相，硅胶柱分离得药物分子为靶向基团的荧光染料；
其中，NHS活性基团的系列染料与药物分子的质量比为1:0.5-1；NHS活性基团的系列染料的质量与二异丙基乙基胺的体积比为2-5:1mg/μL；二异丙基乙基胺与二甲基亚砜的体积比为1:100-300；
所述的药物分子包括紫杉醇、秋水仙素、磺胺、生物素或叶酸。
22.一种如权利要求10所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺溶于N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中；将反应液加热至100-140℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体，真空干燥，200-300目硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷：石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得深红色固体N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺；
其中，9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺的质量比为1-10:1；9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与N-甲基吡咯烷酮的质量与体积比为1:20-120g/mL；N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为1-3:3-4；
(2)探针N-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入脂肪胺；而后将反应液缓慢升温至90-130℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，200-300目分离，以体积比为1:0-1的二氯甲烷：石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂，得蓝色固体探针N-烷基-9,10-二脂肪胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺；
其中，N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺与脂肪胺的质量比为1:6-8；脂肪胺与乙二醇甲醚质量与体积比为5-120:1mg/mL；脂肪环胺为氮丙啶、氮杂环丁烷、四氢吡咯、哌啶、环己亚胺、乙二胺衍生物及环己二胺衍生物。
23.一种如权利要求11所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸的合成
将中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉和邻苯二甲酸酐溶于甲苯中，加热回流4-8h后停止反应，冷却至室温后，再用冰水浴静置30min–60min后，过滤，滤饼用少量石油醚洗涤，滤饼干燥得中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸粗产品；
其中，中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸和邻苯二甲酸酐的质量比1:1-2，中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸的质量与甲苯的体积比为1:40-80g/mL；
(2)目标染料的合成
中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉(或者其类似物N-取代-7-羟基四氢喹啉)与中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸溶于甲磺酸和三氟乙酸的混合酸性溶剂中，氮气保护下，加热到140℃，反应两天后，减压除去大部分溶剂后用弱碱性水溶液调节pH值到9-10，二氯甲烷萃取，收集有机相后干燥，除去有机溶剂后，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得最终产品；
其中，中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉(或者其类似物N-取代-7-羟基四氢喹啉)与中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉基苯酮酸的质量比为1:2-4；三氟乙酸和甲磺酸的体积比为1:1-5；中间体N-烷基-5-羟基四氢喹啉(或者其类似物N-取代-7-羟基四氢喹啉)的质量与三氟乙酸的体积比为1:30-80g/mL。
24.一种如权利要求12所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸的合成
中间体N-烷基-4羟基吲哚啉和邻苯二甲酸酐溶于甲苯中，加热回流4-8h后停止反应，冷却至室温后，于冰水浴静置30min-60min后，过滤，滤饼用少量石油醚洗涤，滤饼干燥得中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸；
其中，中间体N-烷基-4羟基吲哚啉与邻苯二甲酸酐的质量比为1:1-2；中间体N-烷基-4羟基吲哚啉的质量与甲苯的体积比为1:20-40g/mL；
(2)目标染料的合成
中间体N-烷基-4羟基吲哚啉和中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸溶于甲磺酸和三氟乙酸的混合酸性溶剂中，氮气保护下，加热到140℃,反应两天后，减压除去大部分溶剂后用弱碱性水溶液调节pH值到9-10，二氯甲烷萃取，收集有机相后干燥，除去有机溶剂后，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得最终产品；
其中，中间体N-烷基-4羟基吲哚啉和中间体N-烷基-4-羟基吲哚啉基苯酮酸的质量比为1:2-3；三氟乙酸和甲磺酸的体积比为1:1-5；中间体N-烷基-4羟基吲哚啉的质量与三氟乙酸的体积比为1：10-30g/mL。
25.一种如权利要求13所述的全光谱高亮度、高稳定性荧光染料的合成方法，其特征包含步骤如下：
(1)目标荧光分子对称型硅基罗丹明的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体Si-keto的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品，经200-300目硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，得到目标荧光染料分子；
其中，中间体Si-keto与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-8；中间体Si-keto的质量与丁基锂溶液的体积比为10-20：1mg/mL；
(2)目标荧光染料不对称型硅基罗丹明的合成
2-溴苯甲酸叔丁酯于史莱克瓶中，氮气保护下加入四氢呋喃溶液，-78℃搅拌条件下加入丁基锂溶液，搅拌20-40min后；加入中间体Si-ketos的四氢呋喃溶液，升至室温搅拌避光过夜；饱和氯化铵水溶液淬灭后，加水稀释，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤干燥，减压除去有机溶剂后得到粗产品；粗产品经过柱层析分离，洗脱剂为体积比为50-20:1的石油醚和乙酸乙酯，减压除去有机溶剂后得到目标荧光染料分子；
其中，中间体Si-ketos与2-溴苯甲酸叔丁酯的质量比为1:4-7；丁基锂溶液与四氢呋喃的体积比为1：30-50；中间体Si-ketos的质量与丁基锂的体积比为1:10-20mg/μL。
26.根据权利要求1所述的一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料在活细胞、组织及活体的荧光成像领域的应用。
27.根据权利要求1所述的一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料在SNAP-tag、Halo-tag的识别标记领域的应用。
28.根据权利要求1所述的一种全光谱高亮度、高稳定性荧光染料在活细胞、组织及活体的荧光成像领域的应用。
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