CN111333641A - 一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成，该探针以4,5‑双取代萘酰亚胺为母体，4‑甲基‑2,3,5,6‑氮杂苯为响应基团，其结构式如(1)所示，4,5‑位的环己二胺有效抑制了分子内扭转，使探针稳定性、亮度得到极大提升。此外，荧光母体的荧光半峰宽小，对温度、极性等均不敏感，在不同微环境下能够保持荧光信号的稳定性。本探针能够与亲二烯体系发生高速的生物正交反应，在与环辛烯结合后荧光增强约9倍，能够用于活细胞内的免洗荧光标记。

Description

一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成
技术领域
本发明属于荧光探针领域，涉及一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针及其合成。
背景技术
生物正交反应是一类在生理条件下能够特异性与目标分子发生的高速、高效的化学反应，被广泛应用于生物分子的定点标记。随着研究中对时间分辨率的更高要求，基于狄尔斯-桑尔德反应(Diels-Alder)机制的四嗪与亲二烯的生物正交反应凭借突出的反应速率、正交性、生物相容性，逐渐取代了金属催化的正交反应。因此，借助这类生物正交反应与有机小分子荧光染料，可以实现实时对活细胞内生物大分子的精准标记、成像等。
然而，针对四嗪类生物正交反应的荧光探针仍然匮乏，并且此类探针面临双重的问题。首先，荧光染料的稳定性限制了探针在超分辨领域及单分子检测技术中的应用：目前多数探针以Bodipy与荧光素类染料为荧光团，两类染料虽然荧光量子效率高但是在高强度激光下分子很容易被氧化而发生淬灭。其次，反应后能够实现高荧光增强倍数的探针较少：目前，为了达到活细胞内高的信噪比，洗去未反应的探针是必不可少的步骤，随之而带来时间分辨率的下降、细胞损伤等问题。因此，用于四嗪类生物正交反应的高稳定性免洗荧光探针存在很大需求，从而达到更高空间及时间分辨率下对生物分子的监测。
发明内容
本发明提供一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，该类染料稳定性高，与亲二烯反应后荧光恢复达到高的荧光增强倍数(9倍)。
本发明提供一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，该方法步骤简单、易于提纯等优点。
本发明一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，通过萘酰亚胺4,5-位环己二胺的引入达到了荧光稳定性、亮度得到大幅度提升。与Bodipy、荧光素相比稳定性更高，同时保持了亮度高、半峰宽窄等优势。
一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，该系列荧光探针具有如下结构：
Figure BDA0001910375320000021
一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，此系列荧光探针合成路线，如下：
Figure BDA0001910375320000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体BCOEt-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，4-氨基丁酸乙酯盐酸盐溶于无水乙醇中。将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h。将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比1:6-4的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体BCOEt-NBr。
(2)中间体BCOEt-DAC的合成：
将BCOEt-NBr，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入环己二胺。将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比400-50:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体BCOEt-DAC。
(3)中间体BCOOH-DAC的合成
取BCOEt-DAC溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液。室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC。
(4)中间体NHSB-DAC的合成
将BCOOH-DAC，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min。N-羟基琥珀酰亚胺溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中。2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比20-4:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHSB-DAC。
(5)荧光探针UAA-DAC的合成
将NHSB-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐置于史莱克瓶中，并用氮气置换2-5次。二异丙基乙基胺溶于干燥的二甲基亚砜中并加入反应瓶中。室温下搅拌3-10h后，水洗并用二氯甲烷萃取得有机相，硅胶柱分离得探针UAA-DAC。
步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-氨基丁酸乙酯盐酸盐、三乙胺的质量比为1:1-3:1-3；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL；
步骤(2)中，其中，BCOMe-NBr与环己二胺的质量比为1:1-3；
BCOMe-NBr的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-50:1g/mL；
步骤(3)中，BCOMe-DAC的质量与甲醇的体积比为10-20:1g/mL；
甲醇与2M氢氧化钠溶液、水的体积比为1:1:1；
步骤(4)中，BCOOH-DAC、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；
BCOOH-DAC的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1g/mL。
步骤(5)中，NHSB-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐的质量比为1:1-5；
二异丙基乙基胺与二甲基亚砜的体积比为1:250-1000；
NHSB-DAC的质量与二甲基亚砜的体积比为5-60:1mg/mL。
一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针能够用于与亲二烯的生物正交反应，且反应后荧光增强9倍。此外，此类染料光稳定性得到大幅提升，在荧光成像、标记领域有较大应用前景。
本发明具有以下特征：
该探针拥有合成原料低价、方法简单通用等优点。
该探针4,5-位环己二胺的引入使分子内扭转受限，荧光量子产率大幅升，水中量子产率在0.80以上，摩尔消光系数达到40000M-1/cm-1以上。
该探针能够与亲二烯发生高速率的生物正交反应用以标记生物分子。
附图说明
图1实施例1制备的BCOOH-DAC的核磁谱图氢谱。
图2实施例1制备的UAA-DAC的核磁谱图氢谱。
图3实施例1制备的UAA-DAC的高分辨质谱。
图4实施例1制备的探针BCOOH-DAC在在乙醇中不同温度下(25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃)的荧光发射谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为10μM。
图5实施例1制备的探针UAA-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐在水中的归一化紫外吸收光谱图，横坐标为波长，纵坐标为归一化吸收强度，荧光染料的浓度为10μM。
图6实施例1制备的探针UAA-DAC与环辛烯结合后荧光变化图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光染料的浓度为1μM。
具体实施方式
实施例1
中间体6-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基丁酸乙酯(BCOMe-NBr)的合成
Figure BDA0001910375320000051
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于80mL乙醇中，并向其中加入4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(1.04g，6.22mmol)与1.00g三乙胺。80℃下反应10h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体608mg，产率45％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J＝7.8Hz,1H),8.52(d,J＝7.9Hz,1H),8.22(d,J＝7.9Hz,1H),7.93(d,J＝7.8Hz,1H),4.25(t,J＝7.1Hz,2H),4.10(q,J＝7.1Hz,2H),2.44(t,J＝7.4Hz,2H),2.09(p,J＝7.3Hz,2H),1.24(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.72,162.85,162.09,151.33,136.00,132.40,131.30,130.57,125.65,124.24,123.56,122.36,121.24,60.53,40.11,31.82,23.20,14.23.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C18H16BrN2O6[M+H]+435.0192,实测值435.0193.
BCOMe-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000061
将BCOMe-NBr(200mg，0.46mmol)溶于30mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺500mg。将反应液缓慢加热至100℃，并反应12h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体103mg，产率53％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.51(s,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),4.00(dt,J＝14.1,5.3Hz,4H),3.14(d,J＝8.8Hz,2H),2.30(t,J＝7.5Hz,2H),2.19(d,J＝11.7Hz,2H),1.89–1.80(m,2H),1.73(d,J＝6.8Hz,2H),1.31(dt,J＝30.1,15.8Hz,4H),1.14(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.88,163.49,154.56,134.79,133.35,110.58,107.74,106.44,60.18,59.48,38.55,32.07,31.80,23.75,23.63,14.53.
其高分辨质谱数据如下：高分辨质谱理论值C24H28N3O4[M+H]+422.2080,实测值422.2108.
BCOOH-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000071
BCOMe-DAC(80mg,0.19mmol)溶于20mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液20mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应1h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用10mL水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC 65mg，产率87％。其核磁谱图氢谱如图1所示,核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.01(s,1H),8.04(d,J＝8.6Hz,2H),7.51(s,2H),6.82(d,J＝8.7Hz,2H),3.99(dd,J＝9.2,4.6Hz,2H),3.15(d,J＝9.1Hz,2H),2.21(dd,J＝16.7,9.3Hz,4H),1.88–1.76(m,2H),1.72(d,J＝8.0Hz,2H),1.42–1.19(m,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ174.48,163.50,154.57,134.79,133.36,110.58,107.76,106.47,59.50,47.97,33.82,32.08,31.90,25.79,24.93,23.86,23.63.
其高分辨质谱理论值C22H24N3O4[M+H]+394.1767,实测值394.1824.
经检测，其结构如上式BCOOH-DAC所示，其光性能如下：
探针BCOOH-DAC在在乙醇中不同温度下(25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃)的荧光发射谱图测试。取20μL BCOOH-DAC母液，加入4mL乙醇中，配制成10μM的荧光染料测试液。通过金属加热块升温，水循环降温，调节至所需温度并稳定5min后进行荧光光谱的测试。
探针BCOOH-DAC在在乙醇中不同温度下(25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃)的荧光发射谱图如图4所示：BCOOH-DAC在乙醇中随着温度的逐渐变化荧光强度与峰型均没有变化，这说明染料BCOOH-DAC对温度变化并不敏感，能够保持荧光信号的稳定性。
NHSB-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000081
BCOOH-DAC(50mg,0.12mmol)与二环己基碳亚(DCC)(112mg,0.54mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌20min。N-羟基琥珀酰亚胺(200mg,1.74mmol)溶于2mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。3h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体55mg，产率89％。其核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.19–7.93(m,2H),7.53(s,2H),6.83(d,J＝8.7Hz,2H),4.05(t,J＝6.5Hz,2H),3.15(d,J＝9.2Hz,2H),2.80(s,4H),2.72(t,J＝7.7Hz,2H),2.19(d,J＝11.4Hz,2H),1.97–1.88(m,2H),1.73(d,J＝7.2Hz,2H),1.31(dt,J＝28.8,15.2Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ170.66,169.11,163.47,154.65,134.87,133.42,110.63,107.66,106.43,59.48,38.35,32.07,28.69,25.90,23.73,23.63.
其高分辨质谱理论值C26H27N4O6[M+H]+491.1931,实测值491.1981.
UAA-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000091
NHSB-DAC(30mg,0.06mmol)与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐(19mg,0.06mmol)置于5mL史莱克瓶中，并用氮气置换4次。将20μL二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于2mL二甲基亚砜(DMSO)中，而后将混合液加入反应瓶。室温下搅拌2h后，将反应液倒入10mL水中，并用100mL二氯甲烷萃取得有机相，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱分离得(二氯甲烷：甲醇＝40:1，V/V)棕黄色固体21mg，产率60％。其核磁谱图氢谱如图2所示，核磁谱图氢谱与碳谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.54(t,J＝5.9Hz,1H),8.46(d,J＝8.3Hz,2H),8.11(d,J＝8.6Hz,2H),7.58(d,J＝8.4Hz,4H),6.88(d,J＝8.7Hz,2H),4.43(d,J＝5.9Hz,2H),4.07(t,J＝7.1Hz,2H),3.21(d,J＝9.1Hz,2H),3.04(s,3H),2.27(dd,J＝16.9,8.9Hz,4H),1.93(dd,J＝14.8,7.5Hz,2H),1.78(d,J＝7.9Hz,2H),1.40(dd,J＝21.3,9.5Hz,4H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ172.39,167.51,163.65,163.51,154.57,144.96,134.79,133.38,130.74,128.47,127.87,110.59,107.79,106.45,59.49,42.30,39.02,33.79,32.07,24.80,23.63,21.27.
其高分辨质谱如图3所示，具体数据如下：高分辨质谱理论值C32H33N8O3[M+H]+577.2676,实测值577.2627.
经检测，其结构如上式UAA-DAC所示，其光性能如下：
UAA-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐在水中紫外吸收光谱测试。每次取20μL UAA-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐母液分别加入4mL水中，配制成10μM的测试液，进行紫外吸收光谱的测试。
UAA-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐在水中紫外吸收光谱如图5所示：UAA-DAC在水中吸收波长在482nm，在525nm处出现新的吸收峰且为四嗪分子的吸收，4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐在400-550nm范围内出现较宽的吸收峰。
实施例2
中间体6-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基丁酸乙酯(BCOMe-NBr)的合成
Figure BDA0001910375320000111
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于20mL乙醇中，并向其中加入4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(3.00g，18.0mmol)与3.00g三乙胺。40℃下反应24h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体500mg，产率37％。
BCOMe-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000112
将BCOMe-NBr(200mg，0.46mmol)溶于4mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺200mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应10h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体86mg，产率44％。
BCOOH-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000121
BCOMe-DAC(200mg,0.48mmol)溶于10mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液10mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应3h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用10mL水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC 65mg，产率87％。
NHSB-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000122
BCOOH-DAC(20mg,0.05mmol)与二环己基碳亚(DCC)(100mg,0.48mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌10min。N-羟基琥珀酰亚胺(200mg,1.74mmol)溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。2h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体19mg，产率77％。
UAA-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000131
NHSB-DAC(10mg,0.02mmol)与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐(10mg,0.03mmol)置于5mL史莱克瓶中，并用氮气置换4次。将2μL二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于0.5mL二甲基亚砜(DMSO)中，而后将混合液加入反应瓶。室温下搅拌2h后，将反应液倒入10mL水中，并用100mL二氯甲烷萃取得有机相，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱分离得(二氯甲烷：甲醇＝40:1，V/V)棕黄色固体10mg，产率60％。
经检测，其结构如上式UAA-DAC所示，该染料在水中吸收波长在482nm，荧光发射波长在490nm。
实施例3
中间体6-(N-(4-溴-5-硝基-1,8萘酰亚胺))氨基丁酸乙酯(BCOMe-NBr)的合成
Figure BDA0001910375320000141
4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(1.00g,3.11mmol)溶于20mL乙醇中，并向其中加入4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(3.00g，18.0mmol)与3.00g三乙胺。60℃下反应18h后，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱(二氯甲烷：石油醚＝3:1，V/V)分离得白色固体743mg，产率55％。
BCOMe-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000142
将BCOMe-NBr(200mg，0.46mmol)溶于4mL乙二醇甲醚中，并向其中加入1,2-环己二胺200mg。将反应液缓慢加热至140℃，并反应8h。减压除去乙二醇甲醚，残余物经硅胶柱分离残余物(二氯甲烷：甲醇＝80:1，V/V)，得深黄色固体90mg，产率46％。
BCOOH-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000151
BCOMe-DAC(200mg,0.48mmol)溶于10mL甲醇中，并向反应液中缓慢滴加2M氢氧化钠溶液10mL。滴加完毕后，反应液在室温下反应2h后，减压蒸馏除去甲醇，浑浊液过滤并用10mL水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC 62mg，产率83％。
NHSB-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000152
BCOOH-DAC(20mg,0.05mmol)与二环己基碳亚(DCC)(80mg,0.38mmol)溶于2mL N,N-二甲基甲酰胺中，并在室温下搅拌10min。N-羟基琥珀酰亚胺(150mg,1.31mmol)溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺后，滴加至反应液。2h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以二氯甲烷：乙酸乙酯＝5:1为洗脱剂，除去溶剂得土黄色固体20mg，产率81％。
UAA-DAC的合成
Figure BDA0001910375320000161
NHSB-DAC(10mg,0.02mmol)与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐(50mg,0.15mmol)置于10mL史莱克瓶中，并用氮气置换4次。将20μL二异丙基乙基胺(DIPEA)溶于2mL二甲基亚砜(DMSO)中，而后将混合液加入反应瓶。室温下搅拌2h后，将反应液倒入10mL水中，并用100mL二氯甲烷萃取得有机相，无水硫酸钠干燥后经硅胶柱分离得(二氯甲烷：甲醇＝40:1，V/V)棕黄色固体21mg，产率60％。
经检测，其结构如上式UAA-DAC所示，该染料在水中吸收波长在482nm，荧光发射波长在490nm。
实施例4
实施例1制备的探针UAA-DAC与环辛烯结合前后荧光光谱测试。每次取0.5μL UAA-DAC母液分别加入1mL水中，配制成1μM的测试液，测试荧光光谱；而后加入1当量环辛烯10min后进行荧光光谱测试。
实施例1制备的探针UAA-DAC与环辛烯结合前后荧光光谱测试如图6所示：UAA-DAC在结合环辛烯之后荧光峰型及发射波长均未发生变化，而荧光增强约9倍，即UAA-DAC可用作四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针。

Claims (8)

1.一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针，其特征在于该探针的结构如下：
Figure FDA0001910375310000011
2.根据权利要求1所述的一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)中间体BCOEt-NBr的合成：
将4-溴-5-硝基-1,8-萘酐，4-氨基丁酸乙酯盐酸盐溶于无水乙醇中；将反应液加热至40-90℃，搅拌1-24h；将反应液泠却至室温后，减压除去溶剂后，硅胶柱分离，以体积比1:6-4的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得米白色固体BCOEt-NBr；
(2)中间体BCOEt-DAC的合成：
将BCOEt-NBr，溶于乙二醇甲醚中，并向其中依次加入环己二胺；将反应液缓慢升温至50-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比400-50:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体BCOEt-DAC；
(3)中间体BCOOH-DAC的合成
取BCOEt-DAC溶于甲醇中，并向反应液中滴加2M氢氧化钠溶液；室温下反应1-3h后，减压蒸馏除去甲醇，过滤并用水洗涤滤饼干燥后得BCOOH-DAC；
(4)中间体NHSB-DAC的合成
将BCOOH-DAC，DCC溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺后，室温搅拌10-40min；N-羟基琥珀酰亚胺溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺并加入反应液中；2-5h后减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比20-4:1的二氯甲烷和乙酸乙酯为洗脱剂，除去溶剂后得NHSB-DAC；
(5)荧光探针UAA-DAC的合成
将NHSB-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐置于史莱克瓶中，并用氮气置换2-5次；二异丙基乙基胺溶于干燥的二甲基亚砜中并加入反应瓶中；室温下搅拌3-10h后，水洗并用二氯甲烷萃取得有机相，硅胶柱分离得探针UAA-DAC。
3.根据权利要求2所述的一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中，4-溴-5-硝基-1,8-萘酐、4-氨基丁酸乙酯盐酸盐、三乙胺的质量比为1:1-3:1-3；
4-溴-5-硝基-1,8-萘酐的质量与乙醇的体积比为1:20-80g/mL。
4.根据权利要求2所述的一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(2)中，其中，BCOMe-NBr与环己二胺的质量比为1:1-3；
BCOMe-NBr的质量与乙二醇甲醚的体积比为10-50:1g/mL。
5.根据权利要求2所述的一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(3)中，BCOMe-DAC的质量与甲醇的体积比为10-20:1g/mL；
甲醇与2M氢氧化钠溶液、水的体积比为1:1:1。
6.根据权利要求2所述的一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(4)中，BCOOH-DAC、DCC、NHS质量比为1:1-5:1-10；
BCOOH-DAC的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20:1g/mL。
7.根据权利要求2所述的一种用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(5)中，NHSB-DAC与4-(4-甲基-2,3,5,6-氮杂苯)基苄胺盐酸盐的质量比为1:1-5；
二异丙基乙基胺与二甲基亚砜的体积比为1:250-1000；
NHSB-DAC的质量与二甲基亚砜的体积比为5-60:1mg/mL。
8.一种如权利1所述的用于四嗪类生物正交标记的增强型荧光探针用于与亲二烯的正交反应。
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