CN115974892B

CN115974892B - 三氮唑四嗪类化合物及其制备方法、应用

Info

Publication number: CN115974892B
Application number: CN202211684455.0A
Authority: CN
Inventors: 吴昊星; 杨豪杰; 孙洪宝; 袁芳; 杨成
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-09-08
Anticipated expiration: 2042-12-27
Also published as: CN115974892A

Abstract

三氮唑四嗪类化合物及其制备方法、应用，其中，三氮唑四嗪类化合物通过在1,2,4,5‑四嗪的3位或6位上连接取代的1,2,3‑三氮唑，利用三氮唑的吸电能力和空间位阻效应，使得这类三氮唑四嗪化合物在与亲二烯体发生生物正交反应时，能够在取得较快的反应动力学的同时具有更高的稳定性，进而能够作为更加有效的分子探针应用于活细胞成像、生物偶联实验、前药释放等领域。同时，其制备方法不仅反应条件温和，反应时间快且具有较高的收率，而且，基于乙炔基四嗪和叠氮化物的点击化学反应在理论上能够在1,2,3‑三氮唑基团的1位上引入任意的R'基团，从而极大地丰富了能够制备得到的三氮唑四嗪化合物的种类。

Description

三氮唑四嗪类化合物及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及分子探针领域，具体涉及三氮唑四嗪类化合物及其制备方法、应用。

背景技术

基于四嗪类化合物的生物正交探针能够在生物偶联标记后与环辛炔、反式环辛烯等亲二烯体试剂快速反应，并能够以多种方式功能化。因此，四嗪生物正交化学广泛地应用于活细胞成像、生物偶联实验以及前药释放等研究领域。

目前常用于生物正交探针受与四嗪连接的官能团的吸电能力、空间位阻等因素的影响，部分四嗪反应动力学快、但稳定性较差，而部分四嗪虽然稳定性好，但反应动力学较慢，难以兼顾四嗪生物正交反应的反应动力学和稳定性。为此，有必要对传统的四嗪类化合物的官能团进行设计，以更好地兼顾四嗪生物正交反应的稳定性和反应动力学，获得稳定性更高、反应动力学更快的四嗪类化合物。

发明内容

本发明的一个目的在于提供三氮唑四嗪类化合物，其利用与四嗪直接连接的三氮唑基团的吸电能力和空间位阻效应，在四嗪生物正交反应中反应动力学和稳定性都得到很好的兼顾，提高了生物正交反应的反应动力学和稳定性。

本发明通过下述技术方案实现：

三氮唑四嗪类化合物，其结构式如式I所示：

式I中，R选自取代或未取代的苯基，C₁～C₁₀链状烷基，C₁～C₁₀链状醚基，C₁～C₁₀链状羟基，C₁～C₁₀链状酯基，C₁～C₁₀链状羧基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₆杂芳基；

R'选自取代或未取代的苯基，苄基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₆杂芳基，C₁～C₁₀链状烷基，C₁～C₁₀链状醚基，C₁～C₁₀链状羟基，C₁～C₁₀链状酯基，C₁～C₁₀链状羧基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基，PEG₁～PEG₁₀烷基链，PEG₁～PEG₁₀的生物素，PEG₁～PEG₁₀的脂质酰胺，取代基胆碱，二棕榈酰基磷脂酰基，三乙酸四氮杂环十二烷，双吖丙啶。

本技术方案中，三氮唑四嗪类化合物取代的1,2,4,5-四嗪，其3位、6位上，一个被R基团取代，另一个连接有R'基团取代的1,2,3-三氮唑，其结构式如式I所示。

其中，R基团为取代或未取代的苯基，在一个或多个实施例中，所述R基团为未取代的苯基。在一个或多个实施例中，所述R基团可以是被氨基、羟基、卤素、羧基、醛基、酯基、氰基、硝基或三氟甲基取代的苯基。

在部分实施例中，R基团可以是取代或未取代的C₁～C₁₀的链状烷基、链状醚基、链状羟基、链状酯基、链状羧基。在部分优选的实施例中，碳原子数优选为C₁～C₆，进一步优选为C₁～C₄。

在部分实施例中，R基团可以是取代或未取代的杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基，杂环烷基的碳原子数优选为C₄～C₆。在一个或多个实施例中，杂环烷基为吡咯烷基、氮杂环丁基、氧杂环戊基或硫杂环戊基。

在部分实施例中，R基团可以是取代或未取代的杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₆杂芳基。在一个或多个实施例中，杂芳基为吡啶基、甲氧基或氨基取代的吡啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、喹啉基、吡唑基或蝶啶基。

其中，R'基团选自取代或未取代的苯基，苄基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₆杂芳基，C₁～C₁₀链状烷基，C₁～C₁₀链状醚基，C₁～C₁₀链状羟基，C₁～C₁₀链状酯基，C₁～C₁₀链状羧基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基，PEG₁～PEG₁₀烷基链，PEG₁～PEG₁₀的生物素(Biotin)，PEG₁～PEG₁₀的脂质酰胺(lipoamido)，取代基胆碱，二棕榈酰基磷脂酰基(DPPE)，三乙酸四氮杂环十二烷(DOTA)，双吖丙啶。在一个或多个实施例中，R'基团为未取代的PEG₁～PEG₁₀烷基链，在一个或多个实施例中，R'基团为PEG₁～PEG₁₀的含羧基取代烷基链、PEG₁～PEG₁₀的含氨基取代烷基链、PEG₁～PEG₁₀的含酯基取代烷基链。

本技术方案中，发明人通过在1,2,4,5-四嗪的3位或6位上连接取代的1,2,3-三氮唑，利用三氮唑的吸电能力和空间位阻效应，使得这类三氮唑四嗪化合物在与亲二烯体发生生物正交反应时，能够在取得较快的反应动力学的同时具有更高的稳定性，进而能够作为更加有效的分子探针应用于活细胞成像、生物偶联实验、前药释放等领域；此外，这类三氮唑四嗪化合物能够利用乙炔基四嗪与叠氮化物的点击化学反应得到，反应速度快、产率高、且几乎能够得到R'基团为任意基团的三氮唑四嗪化合物，官能团更加丰富，具有广泛的应用前景。

作为本发明中R基团的优选实施方式，所述R基团选自取代或未取代的苯基，C₁～C₄链状烷基，C₁～C₄链状醚基，C₁～C₄链状酯基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基。

作为本发明中R'基团的优选实施方式，所述R'选自取代或未取代的苯基，苄基，C₁～C₄链状酯基，PEG₁～PEG₄烷基链，PEG₁～PEG₄的生物素，PEG₁～PEG₄的脂质酰胺，取代基胆碱，二棕榈酰基磷脂酰基，双吖丙啶。

作为本发明中优选的三氮唑四嗪类化合物，其具有以下任一种结构式：

进一步地，所述三氮唑四嗪类化合物的F取代为¹⁸F。¹⁸F标记的三氮唑四嗪类化合物能够用于PET成像。

本发明的另一个目的在于提供三氮唑四嗪类化合物的制备方法，该制备方法基于乙炔基四嗪和叠氮化物的点击化学反应得到官能团丰富的三氮唑四嗪类化合物，且反应条件温和、反应速度快、收率高。

本发明通过下述技术方案实现：

用于制备三氮唑四嗪类化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

向DMF水溶液加入乙炔基四嗪CuSO₄，三(3-羟丙基三唑甲基)胺(THPTA)，维生素C钠，搅拌均匀后得到第一溶液，向所述第一溶液中加入叠氮化物N₃-R'，搅拌反应后得到所述三氮唑四嗪类化合物。

本技术方案中，先将乙炔基四嗪、CuSO₄、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺，维生素C钠添加至DMF水溶液中形成第一溶液，优选地，DMF水溶液中DMF和水的体积比为4:1。之后向第一溶液中加入叠氮化物，反应体系室温搅拌30～120分钟直至反应结束得到所述三氮唑四嗪类化合物。

三氮唑四嗪类化合物的合成工艺如下：

本技术方案所提供的制备方法不仅反应条件温和，反应时间快且具有较高的收率，而且，更重要的是，发明人发现基于乙炔基四嗪和叠氮化物的点击化学反应在理论上能够在1,2,3-三氮唑基团的1位上引入任意的R'基团，从而极大地丰富了能够制备得到的三氮唑四嗪化合物的种类，为其作为分子探针在多种生物正交反应中发挥功能性作用提供了基础。

进一步地，所述乙炔基四嗪与三(3-羟丙基三唑基甲基)胺的反应当量比为10:1～20:1。优选地，所述乙炔基四嗪与三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺的反应当量比为10:1～15:1。在一个或多个优选的实施例中，乙炔基四嗪、CuSO₄、三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺、维生素C钠的反应当量比为10:1:1:2。

作为本发明中三氮唑四嗪类化合物的一种优选制备工艺，所采用的原料乙炔基四嗪的制备方法包括以下步骤：

在惰性气体保护下，向含有钯催化剂和铜试剂的1,4-二氧六环溶液中加入硫甲基四嗪和炔基锡试剂/>反应后得到TMS炔基四嗪/>

将TMS炔基四嗪溶解于MeOH后，加入碳酸钾，脱保护后得到所述乙炔基四嗪。

本发明中，乙炔基四嗪可以采用发明人在专利CN112812074B公开的制备工艺制备获得。

现有的CN112812074B中公开的乙炔基四嗪的制备工艺是利用对位甲基或者苯基取代的溴四嗪实现Sonogashira偶联反应，再经过脱保护获得乙炔基四嗪，但是，溴四嗪的合成路线更长、产率较低，并且官能团兼容性有限，仅能够制备一部分乙炔基四嗪。

为解决该问题，本技术方案基于容易获得的硫甲基四嗪直接实现铜促进钯催化的Liebeskind-Srogl偶联反应，随后经过脱保护，获得高产率、丰富官能团、稳定性高的乙炔基四嗪，并利用该乙炔基四嗪与叠氮化物的点击化学反应获得官能团更加丰富的三氮唑四嗪类衍生物。

具体地，本技术方案中，在惰性气体，优选氮气保护下，向含有钯催化剂和铜试剂的1,4-二氧六环溶液中加入硫甲基四嗪和炔基锡试剂，反应后即得到TMS取代的炔基四嗪，之后将TMS炔基四嗪溶解，并与碳酸钾反应脱保护后，得到乙炔基四嗪。

乙炔基四嗪的合成工艺如下：

进一步地，所述钯催化剂为20mol％的PdCl₂(PPh₃)₂，所述铜试剂为CuI，CuI的用量为2当量，所述硫甲基四嗪和炔基锡试剂的反应当量比为1:2～1:3。当降低钯的催化量和铜的当量时，反应产率明显下降。因此，本技术方案中，将钯的用量设置为20mol％，CuI的用量为2当量。此外，炔基锡试剂的当量降低时，也将造成反应的收率下降，因此，将硫甲基四嗪和炔基锡试剂的反应当量比设置为1:2～1:3，优选地，反应当量比为1:2。

在部分实施例中，反应温度优选为25～70℃，进一步优选为50℃；反应时间优选为6～18小时，进一步优选为12小时。在部分实施例中，由于Liebeskind-Srogl反应的溶剂浓度通常需要非常小，不利于放大生产，通过实验发现，在1,4-二氧六环溶液的浓度为0.1M时，仍然具有较高的产率，有利于放大量生产，故优选将0.1M溶剂浓度作为最优选择。

本发明的又一个目的在于提供前述任一种三氮唑四嗪类化合物作为分子探针在生物正交化学中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明通过在1,2,4,5-四嗪的3位或6位上连接取代的1,2,3-三氮唑，利用三氮唑的吸电能力和空间位阻效应，使得这类三氮唑四嗪化合物在与亲二烯体发生生物正交反应时，能够在取得较快的反应动力学的同时具有更高的稳定性，进而能够作为更加有效的分子探针应用于活细胞成像、生物偶联实验、前药释放等领域；

2、本发明所提供的制备方法不仅反应条件温和，反应时间快且具有较高的收率，而且，更重要的是，基于乙炔基四嗪和叠氮化物的点击化学反应在理论上能够在1,2,3-三氮唑基团的1位上引入任意的R'基团，从而极大地丰富了能够制备得到的三氮唑四嗪化合物的种类，为其作为分子探针在多种生物正交反应中发挥功能性作用提供了基础；

3、本发明基于容易获得的硫甲基四嗪直接实现铜促进钯催化的Liebeskind-Srogl偶联反应，随后经过脱保护，获得高产率、稳定性高的乙炔基四嗪，同时，该制备方法使得乙炔基四嗪的乙炔基对位的基团种类更加丰富，进而能够与叠氮化物通过点击化学反应获得R基团种类更加丰富的三氮唑四嗪类衍生物；

4、本发明通过在R'基团上引入¹⁸F同位素标记，使得三氮唑四嗪化合物能够应用于PET成像。

5、本发明通过在R'基团上引入荧光基团，使得三氮唑四嗪化合物能够应用于蛋白标记双色成像。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1示出了本发明具体实施例中四嗪探针与对比例的生物正交反应的反应动力学；

图2示出了本发明具体实施例中四嗪探针的生物正交反应的反应动力学；

图3示出了本发明具体实施例中四嗪探针与对比例的生物正交反应的稳定性；

图4示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针5(左)和¹⁸F标记对应的三氮唑四嗪探针37(右)的HPLC共进样曲线；

图5示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针22(左)和¹⁸F标记对应的三氮唑四嗪探针38(右)的HPLC共进样曲线；

图6示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针24(左)和¹⁸F标记对应的三氮唑四嗪探针39(右)的HPLC共进样曲线；

图7示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针24和¹⁸F标记对应的三氮唑四嗪探针39的DMEM稳定性及生物正交的放射性示踪色谱图，其中，最上面图为三氮唑四嗪探针24的HPLC图谱，其次是¹⁸F标记对应的三氮唑四嗪探针39的放射性图谱；之后是三氮唑四嗪探针24与d-TCO反应的产物，最下图为¹⁸F标记三氮唑四嗪探针39与d-TCO反应的产物；

图8示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针37的PET成像结果；

图9示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针39的PET成像结果；

图10示出了本发明具体实施例中三氮唑四嗪探针30的蛋白标记结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明中所使用的“第一”、“第二”等(例如第一溶液、第二溶液等)只是为了描述清楚起见而对相应试剂、部件进行区别，不旨在限制任何次序或者强调重要性等。此外，在本发明中使用的术语“连接”在不进行特别说明的情况下，可以是直接相连，也可以使经由其他官能团间接相连。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法即可制备。本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯或四嗪类化合物制备领域常规的纯度要求。本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或者通过常规方法制备得到。

本发明对所述取代基的表达方式没有特别限制，均采用本领域技术人员熟知的表达方式，本领域技术人员基于常识，可根据其表达方式正确理解其含义。

一、乙炔基四嗪化合物的合成

第一合成路线：

【实施例1～实施例21】

在氮气保护下，向PdCl₂(PPh₃)₂(28.0mg,0.04mmol,20mol％)和CuI(76.2mg,0.4mmol,2.0当量)的1,4-二氧六环(2mL)溶液中，依次加入硫甲基四嗪(0.2mmol,1.0当量)和炔基锡试剂(0.4mmol,2.0当量)，将反应液加热至50℃并反应12小时。反应结束后，反应液减压蒸馏，用硅胶柱柱层析分离(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)，得到TMS炔基四嗪。

将TMS炔基四嗪溶解在5mL MeOH中，加入碳酸钾(0.1当量,2.8mg)，室温搅拌1-5分钟。反应结束后，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏。用硅胶柱柱层析分离(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)得到对应的乙炔基四嗪。

实施例1～实施例21的反应物硫甲基四嗪的结构式，以及产物乙炔基四嗪的结构式、表征、收率如表1所示。

第二合成路线：

【实施例22，23】

将反应物乙炔基四嗪(0.1mmol)溶解在5mL DCM中，加入三氟乙酸(500μL,10％)，室温搅拌2小时。反应结束后，过滤，洗涤得产物。

【实施例26】

将反应物乙炔基四嗪(0.1mmol)溶解在5mL DCM中，加入三氟乙酸(500μL,10％)，室温搅拌2小时。反应结束后，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏。用硅胶柱柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇)得到对应的乙炔基四嗪。

第三合成路线：

【实施例24，25】

在DMF溶液中加入乙炔基四嗪22和五氟苯基三氟乙酸盐。在氩气气氛下将混合物在室温下搅拌12小时。反应结束后，乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏。用硅胶柱柱层析分离(洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯)得到对应的乙炔基四嗪。

在DMSO溶液中加入乙炔基四嗪24和丙氨酸。在氩气气氛下将混合物在室温下搅拌2小时。反应结束后，用反向色谱柱等方式分离得到对应的乙炔基四嗪。

表1

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二、三氮唑四嗪类化合物的合成路线如下：

【实施例27～实施例62】

第一合成路线：

向乙炔基四嗪(1当量)，CuSO₄(0.1当量)，三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(0.1当量)和维生素C钠(0.2当量)的2mL DMF/H₂O(4:1)混合溶液中，加入叠氮化物N₃-R’(10mg,1当量)。室温搅拌。反应结束后，二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸馏，用硅胶柱柱层析、正向色谱柱、或反向色谱柱等方式分离得到三氮唑四嗪。

第二合成路线：

三氮唑四嗪11，23的合成：

反应物三氮唑四嗪(1当量)，三甲基氢氧化锡(2.5当量)加入到1，2-二氯乙烷中，80℃条件下加热过夜。反应结束后，用硅胶柱柱层析分离得到三氮唑四嗪。

第三合成路线：

反应物三氮唑四嗪(1当量)，氨基酸(1.5当量)加入到二甲基亚砜中，室温反应。反应结束后，进行分离纯化得到不同的三氮唑四嗪类化合物。其中R₂选自不同的氨基取代基团；R₃选自取代或未取代的苯基，苄基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₆杂芳基，C₁～C₁₀链状烷基，C₁～C₁₀链状醚基，C₁～C₁₀链状羟基，C₁～C₁₀链状酯基，C₁～C₁₀链状羧基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基，PEG₁～PEG₁₀烷基链，PEG₁～PEG₁₀的生物素，PEG₁～PEG₁₀的脂质酰胺，取代基胆碱，二棕榈酰基磷脂酰基，三乙酸四氮杂环十二烷，双吖丙啶。

三氮唑四嗪28的合成：

反应物三氮唑四嗪(1当量)，β-丙氨酸(1.5当量)加入到二甲基亚砜中，室温2小时。反应结束后，用反向色谱柱等方式分离得到三氮唑四嗪。

实施例27～实施例62的反应物乙炔基四嗪/三氮唑四嗪，以及产物三氮唑四嗪的结构式、表征、收率如表2所示。

表2

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三、三氮唑四嗪类化合物的性能测试：

三氮唑四嗪中，直接连接在四嗪3位或者6位上的三氮唑基团的吸电能力和空间位阻效应使得这类四嗪化合物的生物正交反应能够在反应动力学和稳定性之间取得了更好的兼顾。

1)反应动力学

在反应动力学实验中，对比了实施例39制备的三氮唑探针13、对比例1、对比例2和对比例3的反应二阶速率常数k₂。其中，对比例1为对比例2为对比例3为/>

具体地，将4a-TCO溶解于干燥的DMSO中，使其浓度达到100mM。然后再将四嗪类化合物溶解于干燥的DMSO中，使其浓度达到20mM(对比例3浓度为5mM)。在二级条件下，通过紫外-可见光谱测定四嗪衍生物与4a-TCO在MeCN/PBS(1:1,v/v)中在25℃反应的二级速率常数。取500μL的四嗪溶液(0.1mM,50％MeCN/PBS)在比色皿中，然后加入TCO(0.5μL,100mM,DMSO,0.05μmol)，立即测定其在520nm处的吸收变化。二阶速率常数k₂由1/c-1/c₀与时间的曲线斜率计算得到。每个实验重复3次，使用GraphPad Prism 6.0进行数据分析。实验结果如图1所示，结果显示为平均值±标准差(n＝3)。

此外，在PBS中分别制备四嗪探针13(0.08mM)溶液(5mL)和1.0mM d-TCO溶液(5mL)。用停流分光光度计测定四嗪探针13与d-TCO的反应。将等量的四嗪和d-TCO通过5mL注射器在23℃下注入到停流光谱仪中，得到终浓度为0.04mM的三氮唑四嗪和0.50mM的d-TCO。反应通过与四嗪相关的吸光度在310nm的衰减来监测。反应重复三次。使用Prism软件，通过非线性回归得到观察到的速率常数(k_obs＝19.703±0.081s^-1)。实验结果如图2所示，平均二阶速率常数k₂计算为39406±162M^-1s^-1。

2)反应稳定性

在反应稳定性实验中，对比了实施例39制备的三氮唑探针13、对比例1、对比例2和对比例3以及H-Tz的稳定性。

具体地，取四嗪化合物的10μL母液(20mM)加入到含10％胎牛血清的DMEM或者胎牛血清(390μL)中(四嗪化合物终浓度为500μM，对比例3化合物的终浓度为200μM)，在37℃条件下进行孵育。在选定的时间点(0、3、9、12、24和48小时)，取30μL的原液用体积为60μL的MeCN沉淀血清蛋白。使用离心机在15000g离心3分钟后，取上清液用LC-MS检测样品在520nm处峰面积的减小。每次稳定性试验测定三次。在含10％胎牛血清的DMEM中的稳定性数据如表3所示，在胎牛血清中的稳定性数据如表4所示。

表3：

表4：

实验结果如图3所示，其中，Ta-Tz、Me-Tz、Py-Tz，Ph-Tz分别为三氮唑探针13、对比例1、对比例2和对比例3，H-tz为

从图1至图3可以看出，三氮唑四嗪的反应动力学快于对比例1和对比例3而慢于对比例2，同时，其稳定性高于对比例2而低于对比例1和对比例3。由此可见，三氮唑四嗪的生物正交反应在反应动力学和稳定性得到很好的兼顾，有利于拓宽其生物正交反应应用。

四、¹⁸F标记的三氮唑四嗪类化合物的制备和应用：

1)¹⁸F标记的三氮唑四嗪类化合物的制备

使用活化过的QMA柱装载[¹⁸F]氟化物，并且用1.0mL K_2.2.2/K₂CO₃溶液(33mg K₂CO₃，390mg K_2.2.2，24mL MeCN，6毫升水)洗脱小玻璃瓶中。在氮气条件下，加热至100℃蒸发溶剂5分钟，重复三次，每次加入1.0mL无水MeCN。然后向含有[¹⁸F]FK的干燥残余物中加入在干燥MeCN(400μL)中的前体pAz(6.6mg，20μmol)，之后将混合物在80℃条件下加热30分钟。待反应完成后混合物用MeCN/H₂O淬灭反应(1/1，v/v；2mL)并/使用H₂O/MeCN混合物(70/30,vv)作为洗脱剂在Agilent ZORBAX SB-C18柱(9.4×250mm)上通过HPLC半制备纯化。收集的纯净物在Sep-Pak C18 plus light柱上富集，用EtOH洗脱。在Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×250mm)上通过放射性HPLC收集等分试样进行分析。对于所有梯度，流动相均为H₂O/MeCN，流速为1mL/分钟。[¹⁸F]Az(30mCi,RCY为60％，RCP>99％)。

通过如下步骤进行点击反应：使用注射器将四嗪化合物(0.02mmol)、抗坏血酸钠(0.79mg，0.004毫摩尔)、三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(0.87mg，0.002mmol)和CuSO₄(0.32mg，0.002mmol)在0.4mL DMF/H₂O(4/1，v/v)中的溶液加入到分离的[¹⁸F]Az中。然后将密封的小瓶在35℃条件下加热30分钟。待反应完成后，用MeCN:H₂O(1/1，v/v；1.5mL)淬灭反应并通过使用H₂O/MeCN混合物(v/v)作为洗脱剂的半制备HPLC纯化。收集的纯化合物在Sep-Pak C18 plus light柱上富集，用EtOH洗脱。收集等分试样用于通过Radio-HPLC计算放射化学转化(RCC)，并在Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6×250mm))上通过放射HPLC分析。对于所有梯度，流动相为H₂O/MeCN，流速为1mL/分钟。

通过上述制备方法，制得¹⁸F取代的三氮唑四嗪探针37、38、39，其半制备HPLC纯化的放射性示踪色谱图如图4至如6所示。三氮唑四嗪探针39的DMEM稳定性及生物正交的放射性示踪色谱图如图7所示。其中，图7中，4分钟为四嗪探针39和d-TCO的反应产物，7分钟为四嗪探针39。

2)¹⁸F标记的三氮唑四嗪类化合物的PET成像

采用Inveon Micro-PET/CT扫描仪对雄性SPFICR小鼠进行正电子发射计算机断层动态成像。将麻醉的雄性SPFICR小鼠置于小动物PET(n＝3)扫描仪中俯卧位，静脉注射三氮唑四嗪探针37和39。其中，三氮唑四嗪探针37的注射量为29.3g(4.0MBq)，三氮唑四嗪探针39的注射量为27.7g(3.4MBq)。

之后在表格模式下进行动态扫描60分钟。分别于雄性SPFICR小鼠尾静脉注射后30分钟采集PET数据。成像结果如图8和图9所示，其中，左图为PET成像，右图为动物各器官放射含量分布图。

五、三氮唑四嗪类化合物的蛋白标记应用

配置浓度为10mM的三氮唑四嗪探针30DMSO母液和400μM的BSA PBS(pH 7.4)母液。然后取130μL PBS(pH 7.4)和50μL的DMSO于1.5mL的离心管中混匀，加入10μL的BSA母液混匀，最后加入10μL的三氮唑四嗪探针30母液混匀，反应液1置于4℃条件下过夜。第二天取2个Zeba spin脱盐柱(Zeba脱盐离心柱7kDa 0.5mL Thermo Scientific)1000RCF离心1分钟，然后加入200μL的PBS(pH 7.4)重复置换2次。之后，取100μL的反应液1于Zeba spin脱盐柱中，再加入30μL的PBS(pH 7.4)，1500RCF离心2分钟，离心除去过量的三氮唑四嗪探针30，得到混合液2。取50μL的混合液加入0.5μL的4eTCO-Cy5(10mM in DMSO)混匀在37℃条件下孵育1小时。之后，将该反应液加入到Zeba spin脱盐柱中，再加入30μL的PBS(pH 7.4)，1500RCF离心2分钟，离心除去过量的4eTCO-Cy5，得到混合液3。用紫外分光光度计进行蛋白含量定量。然后用凝胶电泳对产物进行分析，如图10所示，四嗪三氮唑探针30可以标记在蛋白上，并且标记蛋白之后的三氮唑四嗪30还具有良好的生物正交反应性能，可以与4eTCO-Cy5进行生物正交反应。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.三氮唑四嗪类化合物，其特征在于，其结构式如式I所示：

式I中，R为未取代的苯基，或者，R为氨基、羟基、卤素、羧基、醛基、酯基、氰基、硝基或三氟甲基取代的苯基；

R'选自未取代的苯基，苄基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₆杂芳基，C₁～C₁₀链状烷基，C₁～C₁₀链状醚基，C₁～C₁₀链状羟基，C₁～C₁₀链状酯基，C₁～C₁₀链状羧基，杂原子为硫、氧或氮的C₄～C₇杂环状烷基，PEG₁～PEG₁₀的生物素，PEG₁～PEG₁₀的硫辛酰胺，二棕榈酰基磷脂酰基，三乙酸四氮杂环十二烷，双吖丙啶。

2.根据权利要求1所述的三氮唑四嗪类化合物，其特征在于，R'选自未取代的苯基，苄基，C₁～C₄链状酯基，PEG₁～PEG₄的生物素，PEG₁～PEG₄的硫辛酰胺，二棕榈酰基磷脂酰基，双吖丙啶。

3.三氮唑四嗪类化合物，其特征在于，所述三氮唑四嗪类化合物的结构选自：

4.根据权利要求3所述的三氮唑四嗪类化合物，其特征在于，所述三氮唑四嗪类化合物的F取代为¹⁸F。

5.用于制备如权利要求1～4中任一项所述的三氮唑四嗪类化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

向DMF水溶液加入乙炔基四嗪CuSO₄，三(3-羟丙基三唑基甲基)胺，维生素C钠，搅拌均匀后得到第一溶液，向所述第一溶液中加入叠氮化物N₃-R'，搅拌反应后得到所述三氮唑四嗪类化合物。

6.根据权利要求5所述的三氮唑四嗪类化合物的制备方法，其特征在于，所述乙炔基四嗪与三(3-羟丙基三唑基甲基)胺的反应当量比为10:1～20:1。

7.根据权利要求5所述的三氮唑四嗪类化合物的制备方法，其特征在于，所述乙炔基四嗪的制备方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的三氮唑四嗪类化合物的制备方法，其特征在于，所述钯催化剂为20mol％的PdCl₂(PPh₃)₂，所述铜试剂为CuI，CuI的用量为2当量，所述硫甲基四嗪的用量为1当量，所述硫甲基四嗪和炔基锡试剂的反应当量比为1:2～1:3。

9.根据权利要求1～4中任一项所述的三氮唑四嗪类化合物作为分子探针在生物正交化学中的应用。