CN105419781A - 一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及应用，利用点击化学高选择性、高效、快速的反应特点，设计了一种包括带肿瘤特异性因子的点击反应模块和带荧光标记的点击反应模块的肿瘤标记探针，两个点击反应模块之间可以通过点击反应快速结合。该肿瘤标记探针能高效快速结合于肿瘤组织或细胞，有效延长探针在活体肿瘤组织的寿命和检测时间，有效克服了现有探针特异性差的问题，为肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像以及进一步的肿瘤靶向诊治及生物学研究提供新方向。

Description

一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及应用
技术领域
本发明属于分子影像应用领域，涉及近红外分子影像技术中基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及其应用。
背景技术
分子影像技术在细胞分子水平上实现在体生理、病理的实时、无创、动态成像，可用于研究活体内疾病或肿瘤的发生、发展及转移等过程，其中近红外荧光分子影像具有无辐射、灵敏高、生物组织光损伤小等优点，在肿瘤在体监测研究领域中展现出巨大的潜力。近红外荧光探针实现了目标组织的可视化示踪检测，是活体内光学分子影像成功的先决条件。一般荧光探针利用病变基因、分子、组织等特异性因子(如核酸、多肽、蛋白质、抗体等)与荧光物相偶联，使得荧光探针具有了特异靶向识别的功能，再将具有特异性功能的荧光探针注射入活体体内，从而实现肿瘤的在体靶向监测。但是这种将染料与肿瘤特异分子直接偶联的方法由于染料与特异性因子相互之间的干扰，一般存在特异性差的问题。
点击化学(ClickChemistry)属于正交反应的一种(BioorthogonalChemistry)，通过高效、高选择性的化学反应来完成模块化的骨架连接，直接点击模块构建各类新化合物的组合化学新方法，具有如下几个特征：(1)符合绿色化学，原料易得、产率高、立体选择性好、易纯化、副产物对环境友好；(2)反应快速、高通量模块化合成，例如无铜点击化学-四嗪和环辛烯衍生物的反应速率常数大约为210-2,800,000M-1s-1(PBS，37℃)；(3)反应条件温和，对水、温度、氧不敏感，可以在生理条件下进行；(4)其反应模块几乎不与生物分子反应，不干扰细胞正常的生理功能。因此，点击化学能成为生物化学和药物研究等领域的研究热点。
发明内容
针对现有技术不足，本发明旨在提供一种基于点击化学的肿瘤标记探针、制备方法及其应用，肿瘤标记探针包括分别带有肿瘤特异性因子和荧光标记的点击反应模块，应用时将特异因子预靶向肿瘤组织后，利用点击化学高选择性、高效、快速的反应特点，再标记荧光物质，避免荧光物质与特异因子之间的相互干扰，解决现有肿瘤标记探针或方法特异性差的问题，并有效降低肝肾等对探针或药物的代谢清除，从而提高探针的生物利用度和监测灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于点击化学的肿瘤标记探针，包括肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL以及荧光标记点击反应模块Tz-FL，两个模块可通过点击化学反应快速结合；TCO-TL和Tz-FL的结构式如下：
TCO-TL：
Tz-FL：
其中，TCO为含环辛烯基团类化合物，TL为肿瘤特异性因子；Tz为含四嗪基团类化合物，FL为荧光标记物；
TCO-TL和Tz-FL通过点击化学反应结合后的结构式如下：
需要说明的是，荧光标记物FL可选自花菁染料、罗丹明染料、荧光素染料或量子点。
需要说明的是，肿瘤特异性因子TL可选自核酸、多肽、蛋白、酶、糖类、抗体、单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
作为优选，所述Tz为(苄胺-4-基)-3-四嗪。
作为优选，所述TCO为5-琥珀酰亚胺酯环辛烯。
上述基于点击化学的肿瘤标记探针的制备方法，包括步骤：利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TCO的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL，利用含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光标记物FL的活化羧基反应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL。
需要说明的是，利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TCO的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL的具体方法为：
将TCO-NHS溶于DMSO中，加入溶于TL肽的DMSO溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜反应，然后用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到粉末状固体TCO-TL，真空干燥，低温保存。
需要说明的是，含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光物质FL的活化羧基反应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL的方法如下：
取FL，加入DIC和NHS，反应溶剂选用DMSO，于室温条件下避光搅拌，反相TLC监测；反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到固体，真空干燥，得到产物FL-NHS；然后取FL-NHS溶于DMSO中，加入溶解有Tz的DMSO溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到Tz-FL固体，真空干燥，低温保存。
上述基于点击化学的肿瘤标记探针可在肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像进行应用。
需要说明的是，应用包括如下步骤：先将肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL提前注射入活体体内或体外活细胞中，让靶分子充分靶向目标组织或细胞，再将荧光标记点击反应模块Tz-FL注射入活体体内或体外活细胞中，利用TCO和Tz之间的点击化学反应，从而使荧光物质快速偶联于肿瘤特异性因子上，然后利用成像技术进行成像。
本发明的有益效果在于：提供了一种包括带肿瘤特异性因子的点击反应模块和带荧光标记的点击反应模块的肿瘤标记探针，两个点击反应模块之间可以通过点击反应快速结合，利用该肿瘤标记探针进行肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像，将特异因子预靶向肿瘤组织或细胞后，利用点击化学高选择性、高效、快速的反应特点再标记荧光物质，可避免荧光物质与特异因子之间的相互干扰，可有效实现肿瘤组织或细胞的在体监测或体外标记，有效降低肝肾等对探针或药物的代谢清除，从而提高探针的生物利用度和监测灵敏度。
附图说明
图1为基于TCO/Tz点击化学反应的肿瘤标记探针原理；
图2为探针A、B、C对SGC7901细胞标记荧光成像图，A为实验组TCO-RGD/Tz-Cy5.5，B为对照组RGD/Tz-Cy5.5，C为对照组Cy5.5-RGD；
图3为探针D、E、F对SGC7901细胞标记荧光成像图，D为实验组TCO-GEBP11/Tz-Cy5.5，E为对照组GEBP11/Tz-Cy5.5，F为对照组Cy5.5-GEBP11；
图4是探针D、E、F的在体成像，D为实验组TCO-GEBP11/Tz-Cy5.5，E为对照组GEBP11/Tz-Cy5.5，F为对照组Cy5.5-GEBP11。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
一种基于点击化学的肿瘤标记探针，包括肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL以及荧光标记点击反应模块Tz-FL，两个模块可通过点击化学反应快速结合，反应原理如图1所示。TCO-TL和Tz-FL的结构式如下：
TCO-TL：
Tz-FL：
其中，TCO为含环辛烯基团类化合物，TL为肿瘤特异性因子；Tz为含四嗪基团类化合物；FL为荧光标记物；
TCO-TL和Tz-FL通过点击化学反应结合后的结构式为：
进一步地，荧光标记物FL可选自花菁染料、罗丹明染料、荧光素染料或量子点，如Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、ICG、ICG-Der-01、ICG-Der-02、ICG-Der-03、IR820、AlexaFluor750、AlexaFluor700、AlexaFluor680、AlexaFluor660、AlexaFluor647、AlexaFluor635、AlexaFluor633、AlexaFluor610、AlexaFluor594、AlexaFluor568、AlexaFluor555、AlexaFluor546、AlexaFluor532、AlexaFluor514、AlexaFluor500、AlexaFluor488、FITC等。
进一步地，肿瘤特异性因子TL可选自核酸、多肽、蛋白、酶、糖类、抗体、单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。包括RGD、RGDS、GRGES、GRGDS、GRGDNP、c(RGDfC)、c(RADfC)、c(RADfV)、c(RGDyC)、c(RGEfK)、c(RGDyE)、c(RGDfE)、c(RGDfK)、c(RADfK)、c(RGDfV)、c(RADyK)、E[c(RGDfK)]2、E[c(RGDyK)]2、GX1、GEBP11、TPS、CA15-3、CEA、CA125、CA153、CA199、CA724、NSE、PSA、CA242、β-HCG、PSA、G3BP、AFP、AFP-L3、DCP、AFU、Flt-1、KDR、Flt-4、NP-1、NP-2、pHLIP、T7、T12、MMPs、SF等。
作为优选，所述Tz为(苄胺-4-基)-3-四嗪。
作为优选，所述TCO为5-琥珀酰亚胺酯环辛烯。
实施例1
肿瘤特异因子点击反应模块TCO-RGD的制备：
将TCO-NHS0.64mg溶于128μLDMSO中于2mLEP管，加入溶于1.5mgRGD肽的DMSO溶液70μL，再加入2μLTEA，室温避光搅拌过夜反应(12h)，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到白色粉末状固体TCO-RGD，真空干燥，低温保存。TCO-NHS是商品级的，也可以通过以下方法制得：取TCO，加入DIC和NHS，反应溶剂选用DCM，于室温条件下避光搅拌，HPLC监测；反应结束后，用乙醚析出产物的方法纯化分离得到固体，真空干燥，得到产物TCO-NHS。
实施例2
肿瘤特异因子点击反应模块TCO-GEBP11的制备：
将TCO-NHS0.5mg溶于50μLDMSO中于2mLEP管，加入溶解有2mgGEBP11肽的DMSO溶液250μL，再加入4μLTEA，室温避光搅拌过夜反应(12h)，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到白色粉末状固体TCO-GEBP11，真空干燥，低温保存。
实施例3
荧光标记点击反应模块Tz-Cy5.5的制备：
取1mgCy5.5于2mL的EP管中，加入7μLDIC，4.6mgNHS(Cy5.5∶DIC∶NHS的摩尔投料比为1∶40∶40)，反应溶剂选用DMSO500μL，于室温条件下避光搅拌6h，反相TLC监测。反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到蓝色固体，真空干燥，得到产物Cy5.5-NHS。
取Cy5.5-NHS0.5mg溶于300μLDMSO中于2mLEP管中，加入溶解有0.28mgTz的DMSO溶液28μL，再加入4μLTEA(Cy5.5-NHS∶Tz的摩尔投料比为1∶3)，室温避光搅拌过夜(12h)，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到蓝色固体，真空干燥，低温保存。
实施例4
荧光标记点击反应模块Tz-ICG的制备：
取1mgICG于2mL的EP管中，加入8.5μLDIC，6.3mgNHS(ICG∶DIC∶NHS的摩尔投料比为1∶40∶40)，加入反应溶剂DMSO/DCM(170μL/180μL)，于室温条件下避光搅拌4h，反相TLC监测。反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到绿色固体，真空干燥，得到产物ICG-NHS。
取Cy5.5-NHS0.5mg溶于300μLDMSO中于2mLEP管中，加入溶解有0.34mgTz的DMSO溶液34μL，再加入4μLTEA(Cy5.5-NHS∶Tz的摩尔投料比为1∶3)，室温避光搅拌过夜(12h)，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到绿色固体，真空干燥，低温保存。
实施例5
点击反应TCO-RGD和Tz-Cy5.5对胃癌细胞的荧光成像实验：
将浓度为6.66×10-3mol/L的TCO-RGD储存液，浓度为1.95×10-3mol/L的Tz-Cy5.5储存液，浓度为2.0×10-3mol/L的Cy5.5-RGD储存液，3.0×10-3mol/L的RGD储存液，分别以RPMI1640培养液稀释成工作液。待培养细胞系SGC7901处对数生长期时，常规消化，用含10％的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成1×106/mL的单细胞悬体，加入EP管中。
实验组A：将TCO-RGD加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养2.5小时后，用PBS清洗两次；再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
对照组B：将RGD加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养2.5小时后，用PBS清洗两次；再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
对照组C：将Cy5.5-RGD加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
如图2，细胞核荧光染色采用DAPI染料(蓝色荧光通道)，近红外荧光染色采用A、B、C三组探针(红色荧光通道)，A为基于点击化学探针TCO-RGD/Tz-Cy5.5，B为对照组RGD/Tz-Cy5.5(无点击化学特性)，C为对照组Cy5.5-RGD(探针与多肽直接偶联)。与B和C两组探针相对比，探针A对胃癌细胞具有较高的特异结合性，活细胞膜通透性，对细胞质进行选择性染色，发出红色荧光，细胞核几乎无荧光；探针B对胃癌细胞具有一定的染色能力，这是因为游离的Cy5.5无特异性，其可以对大多数细胞进行染色；而探针C对胃癌细胞染色能力最差，说明传统肿瘤特异性标记方式C，即将探针与多肽直接偶联的方式，会导致特异性因子和探针之间的互相干扰，降低多肽的特异性靶向识别能力的同时，也影响荧光染料对细胞的染色能力。
实施例6
点击反应TCO-GEBP11和Tz-Cy5.5对胃癌细胞的荧光成像实验：
将浓度为2.88×10-3mol/L的TCO-GEBP11储存液，浓度为1.95×10-3mol/L的Tz-Cy5.5储存液，浓度为2.0×10-3mol/L的Cy5.5-GEBP11储存液，3.0×10-3mol/L的GEBP11储存液，分别以RPMI1640培养液稀释成工作液。待培养细胞系SGC7901处对数生长期时，常规消化，用含10％的胎牛血清的RPMI1640培养液将其稀释成1×106/mL的单细胞悬体，加入EP管中。
实验组D：将TCO-GEBP11加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养2.5小时后，用PBS清洗两次；再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
对照组E：将GEBP11加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养2.5小时后，用PBS清洗两次；再将Tz-Cy5.5加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中继续培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
对照组F：将Cy5.5-GEBP11加入其中，使得其终浓度为5μM，在37℃5％的CO2的培养箱中培养0.5小时后，用PBS清洗两次，采用荧光显微镜观察。
如图3，细胞核荧光染色采用DAPI染料(蓝色荧光通道)，近红外荧光染色采用D、E、F三组探针(红色荧光通道)，D为基于点击化学探针TCO-GEBP11/Tz-Cy5.5，E为对照组GEBP11/Tz-Cy5.5(无点击化学特性)，F为对照组Cy5.5-GEBP11(探针与多肽直接偶联)。为了进一步验证，又采用了GEBP11多肽，探针D表现出点击化学探针的优越性，对胃癌细胞具有较高的特异结合性，具有活细胞膜通透性，对细胞质染色。
实施例7
点击反应TCO-GEBP11和Tz-Cy5.5对胃癌小鼠在体光学分子成像实验：
胃癌裸鼠荷瘤模型的建立：调整带有荧光素酶的SC7901-luc人胃癌细胞为对数生长期后用0.25％胰蛋白酶消化，含10％的胎牛血清的RPMI1640培养液重悬，PBS溶液洗涤两次后，用PBS溶液制备成单细胞悬液，稀释成细胞密度为1×107/mL，用1mL注射器抽取肿瘤细胞悬液(2×106)接种于裸鼠前肢背部外侧皮下，每组6只裸鼠，带肿瘤体积长至50mm3左右进行光学成像检测。
实验组D：将TCO-GEBP11以8nM/200μL/mouse通过尾静脉注射到所建立的胃癌裸鼠荷瘤模型上。孵化24小时后再将Tz-Cy5.5以4nM/200μL/mouse通过尾静脉注射到胃癌裸鼠荷瘤模型上，以2-3％异氟烷吸入麻醉小鼠，采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像，连续观测48小时。
对照组E：将GEBP11以8nM/200μL/mouse通过尾静脉注射到所建立的胃癌裸鼠荷瘤模型上。孵化24小时后再将Tz-Cy5.5以4nM/200μL/mouse通过尾静脉注射到胃癌裸鼠荷瘤模型上，以2-3％异氟烷吸入麻醉小鼠，采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像，连续观测48小时。
对照组F：将Cy5.5-GEBP11以4nm/200μL/mouse通过尾静脉注射到所建立的胃癌裸鼠荷瘤模型上，以2-3％异氟烷吸入麻醉小鼠，采用FMT光学成像系统对裸鼠进行荧光成像，连续观测48小时。
如图4所示，D为基于点击化学探针TCO-GEBP11/Tz-Cy5.5，E为对照组GEBP11/Tz-Cy5.5(无点击化学特性)，F为对照组Cy5.5-GEBP11(探针与多肽直接偶联)。对照组F在肿瘤部位几乎无聚集，这与细胞实验结果一致，探针与多肽直接偶联的方式会导致特异性因子和探针之间的互相干扰；对照组E游离Cy5.5在肿瘤部位有一定聚集，但在24小时就几乎无荧光信号，并且背景干扰强，信号强度低；相比，实验组D其荧光信号在注射探针后3-4小时达到最大值，表现出优异的肿瘤靶向特异性，并且注射探针后48小时监测，其荧光信号依然明亮。
基于点击化学介导的肿瘤特异性荧光探针，可以解决现有传统近红外肿瘤标记探针或方法特异性差的问题，可以有效降低肝肾等对探针或药物的代谢清除，从而提高探针的生物利用度和监测灵敏度，并可应用于肿瘤监测和治疗评估的分子成像技术中。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，作出各种想要的改变和变形，而所有的这些改变和变形都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，包括肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL以及荧光标记点击反应模块Tz-FL，两个模块可通过点击化学反应快速结合；TCO-TL和Tz-FL的结构式如下：
其中，TCO为含环辛烯基团类化合物，TL为肿瘤特异性因子；Tz为含四嗪基团类化合物，FL为荧光标记物；
TCO-TL和Tz-FL通过点击化学反应结合后的结构式如下：
2.根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，荧光标记物FL可选自花菁染料、罗丹明染料、荧光素染料或量子点。
3.根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，肿瘤特异性因子TL可选自核酸、多肽、蛋白、酶、糖类、抗体、单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
4.根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，所述Tz为(苄胺-4-基)-3-四嗪。
5.根据权利要求1所述的基于点击化学的肿瘤标记探针，其特征在于，所述TCO为5-琥珀酰亚胺酯环辛烯。
6.权利要求1-5任一所述的基于点击化学的肿瘤标记探针的制备方法，其特征在于，包括步骤：利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TCO的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL，利用含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光标记物FL的活化羧基反应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，利用肿瘤特异性因子TL的氨基基团和含环辛烯基团类化合物TCO的活化羧基反应，得到肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL的具体方法为：
将TCO-NHS溶于DMSO中，加入溶于TL的DMSO溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜反应，然后用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到粉末状固体TCO-TL，真空干燥，低温保存。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，利用含四嗪基团类化合物Tz的氨基基团和荧光标记物FL的活化羧基反应，得到荧光标记点击反应模块Tz-FL的方法如下：
取FL，加入DIC和NHS，反应溶剂选用DMSO，于室温条件下避光搅拌，反相TLC监测；反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯析出产物的方法纯化分离得到固体，真空干燥，得到产物FL-NHS；然后取FL-NHS溶于DMSO中，加入溶解有Tz的DMSO溶液，再加入TEA，室温避光搅拌过夜，反应结束后，用乙醚与乙酸乙酯混合洗涤的方法纯化分离得到Tz-FL固体，真空干燥，低温保存。
9.如权利要求1-5任一所述的基于点击化学的肿瘤标记探针在肿瘤活体光学分子影像及活细胞成像的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：先将肿瘤特异因子点击反应模块TCO-TL提前注射入活体体内或体外活细胞中，让靶分子充分靶向目标组织或细胞，再将荧光标记点击反应模块Tz-FL注射入活体体内或体外活细胞中，利用TCO和Tz之间的点击化学反应，荧光标记物快速偶联于肿瘤特异性因子上，最后利用成像技术进行成像。
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