CN111334287B - 一类710nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类710nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法，该荧光染料为通过在苝酰亚胺9,10‑位引入乙二胺类似物设计合成的一系列高亮度的710nm荧光染料，其结构式如(1)所示，环己二胺结构的平面性使供电性进一步增加，乙醇中吸收波长达到712nm，荧光发射波长达到750nm。由于乙二胺结构与苝酰亚胺之间形成的强烈环张力导致分子内扭转受到严格的限制，这使得在近红外区分子仍然能够保持0.40以上的量子产率。此外本系列染料荧光半峰宽只有40nm，能够广泛应用于活细胞、活体等实时多色荧光成像。

Description

一类710nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法
技术领域
本发明属于近红外荧光染料领域，具体涉及一类710nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法。
背景技术
由于具有深的组织穿透性、低背景荧光干扰、小的生物样本光损伤等特点，近红外荧光生物成像技术引起了研究工作者越来越多的关注。在众多荧光信使中，有机小分子荧光染料以其生物相容性好、结构易改造等优势也被广泛应用于近红外荧光成像。但是，结构简小的有机小分子荧光染料荧光发射波长通常在400-700nm，吸收与发射波长达到700nm以上的单个共轭的有机小分子体极为匮乏，这也使得近红外区域的多色成像变得极为困难。
目前，被广泛应用于近红外荧光成像的有机小分子多为花菁染料染料及其类似物。Alexa系列染料中Alexa700为633-647nm激发，723nml发射；Alexa750 为Cy7类染料，激发与发射分别为753nm/782nm。可见在Alexa系列染料中 700-750nm激发与发射的染料存在一定空白，这也限制了多色的近红外荧光成像。如何通过分子的简单改造使荧光染料红移至近红外区的同时保持荧光的高亮度是亟待解决的问题，同时又极富挑战性。
发明内容
本发明的目的是提供一类710nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法，该系列染料荧光量子产率在不同溶剂中达到0.40以上。
本发明提供一类710nm激发的高亮度荧光染料，以苝酰亚胺为荧光团，通过9,10-位乙二胺类似结构的引入使苝酰亚胺的荧光稳定性、亮度得到大幅度提升，乙醇中荧光波长红移750nm。
一类710nm激发的高亮度荧光染料，该系列荧光染料具有如下结构 ：
Figure BDA0001910636550000021
其中R1为C1-C4烷基、(CH2CH2O)nH、(CH2)nCOOMe，n为1,2,3,4等整数。
一类710nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，此系列荧光染料合成路线，如下：
Figure BDA0001910636550000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺溶于N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中；将反应液加热至100-140℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体，真空干燥，硅胶柱(200-300目二氧化硅) 分离，以二氯甲烷：石油醚(体积比1:0.25～6)为洗脱剂，减压除去溶剂得深红色固体N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺。
其中，9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺的质量比为 1-5:1；9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的质量与N-甲基吡咯烷酮与醋酸混合液的体积比为1:20-60(g：mL)；N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为3:1-3。
(2)探针N-烷基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；而后将反应液缓慢升温至90-130℃，并在氮气保护下反应 10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：石油醚(体积比1:0～1)为洗脱剂，减压除去溶剂，得蓝色固体探针N-烷基-9,10- 二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺。
其中，N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺与反式环己二胺的质量比为1-4:1-6；反式环己二胺与乙二醇甲醚的质量与体积比为5-60:1(mg：mL)。
一类710nm激发的高亮度荧光染料荧光量子产率高，乙醇、DMSO、乙腈等多种溶剂中量子产率均在0.40以上，荧光发射波长达到750nm。
一类710nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，该方法操作简单、原料价廉等优点。
一类710nm激发的高亮度荧光染料在近红外单色及多色荧光成像、组织及活体成像领域的应用。
本发明具有以下特点：
本发明的染料拥有合成原料低廉、方法简单且易于衍生等优点。
本发明的染料在不同有机溶剂中吸收波长在690-710nm右，荧光发射波长在720-750nm。该类列染料荧光量子产率可达0.40以上。
本发明的染料吸收波长及荧光发射波长均达到了近红外区域，能够用于活细胞及活体近红外荧光成像，细胞损伤小、穿透能力强。
附图说明
图1实施例4制备的N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-710)的核磁谱图氢谱。
图2实施例4制备的N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-环己二胺基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-710)的核磁谱图碳谱。
图3实施例5制备的ELD-DBr的核磁谱图氢谱。
图4实施例5制备的ELD-DAC的核磁谱图氢谱。
图5为实施例4制备的染料OLD-710在乙醇、二甲基亚砜中的荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。。
图6为实施例4制备的染料OLD-710在乙醇、二甲基亚砜中中的紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图7中实施例4制备的脂滴染料OLD-710在HT29(结肠癌细胞)中结构光照明显微(SIM)荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
染料MLD-710的合成方法。
中间体N-甲基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
Figure BDA0001910636550000041
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液24mL(3:1,V/V),而后向其中滴加甲胺(240mg)醇溶液。100 ℃反应4h后，将反应液倒入200mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1，V/V)得红色固体453mg，产率37％。
其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,2H),8.12(s,2H),4.21(s,3H).
染料N-甲基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
Figure BDA0001910636550000051
将N-甲基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与反式环己二胺(1200mg，10.5mmol)溶于20mL乙二醇甲醚，并将其加热至130 ℃。12h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V) 得蓝绿色固体56mg，产率30％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.23(d,J＝3.8Hz,2H),8.15(s,2H),7.87(s, 1H),7.21(d,J＝11.0Hz,2H),,4.28(s,3H),3.22(d,J＝10.0Hz,2H),2.30(d,J＝10.9Hz,2H),1.78(s,2H),1.45(s,2H),1.26(s,2H).
经检测，其结构如上式MLD-710所示，其激发波长在680-720nm，适合 700nm左右的激光激发用于荧光标记及成像。
实施例2
染料BuLD-710的合成方法。
中间体N-丁基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
Figure BDA0001910636550000061
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液72mL(1:1,V/V),而后向其中滴加正丁胺(1200mg,16.4 mmol)。120℃反应6h后，将反应液倒入200mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1，V/V)得红色固体600 mg，产率46％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(s,2H),8.14(s,2H),4.38–4.11(m,2H), 1.94–1.66(m,2H),1.56–1.38(m,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H).
染料N-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
Figure BDA0001910636550000062
将N-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与反式环己二胺(228mg，2.00mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至110℃。 14h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V) 得蓝绿色固体56mg，产率30％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,J＝3.7Hz,2H),8.11(s,1H),7.96(s, 1H),7.17(d,J＝10.8Hz,2H),,4.28(t,J＝6.5Hz,2H),3.21(d,J＝10.0Hz,2H), 2.26(d,J＝10.9Hz,2H),1.94-1.68(m,2H),1.77(s,2H),1.56-1.38(m,2H),1.41(s, 2H),1.25(s,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H).
经检测，其结构如上式BuLD-710所示，其在乙醇中吸收波长达到710nm，适合710nm左右的激光激发用于荧光标记及成像。
实施例3
染料OELD-710的合成方法。
中间体N-2-羟乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
Figure BDA0001910636550000071
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液80mL(2:1,V/V),而后向其中滴加乙醇胺400mg。140℃反应1 h后，将反应液倒入250mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1-1:4，V/V)得红色固体448mg，产率35％。
其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(s,2H),8.15(s,2H),4.62–4.36(m,2H), 3.88(t,J＝6.2Hz,2H).
染料N-2-羟乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-710)的合成：
Figure BDA0001910636550000081
将N-2-羟乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与反式环己二胺(50mg，0.44mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至120 ℃。18h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂：二氯甲烷)得蓝绿色固体41mg，产率22％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.26(d,J＝3.8Hz,2H),8.11(s,1H),7.96(s, 1H),7.12(d,J＝10.5Hz,2H),4.80(s,1H),4.30(t,J＝6.4Hz,2H),3.64(t,J＝6.7 Hz,2H),3.22(d,J＝10.1Hz,2H),2.28(d,J＝11.0Hz,2H),1.74(s,2H),1.42(s, 2H),1.24(s,2H).
经检测，其结构如上式OELD-710所示，其在乙醇中吸收波长达到711nm，适合710nm左右的激光激发用于荧光标记及成像。
实施例4
染料OLD-710的合成方法。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
Figure BDA0001910636550000082
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液80mL(2:1,V/V),而后向其中滴加二甘醇胺(303mg,8.79 mmol)。100℃反应6h后，将反应液倒入250mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1-1:4，V/V)得红色固体380mg，产率55％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,2H),8.13(s,2H),4.67–4.41(m,2H), 3.88(d,J＝5.3Hz,2H),3.71(d,J＝4.5Hz,2H),3.67(d,J＝3.6Hz,2H),2.38(s, 1H).
染料N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-710)的合成：
Figure BDA0001910636550000091
将N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基--9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(200mg，0.28mmol)与反式环己二胺(228mg，2.00mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。24h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂：二氯甲烷)得蓝绿色固体80mg，产率43％。实施例4制备的OLD-710的核磁谱图氢谱与碳谱分别如图1、2所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.24(d,J＝3.7Hz,2H),8.10(s,1H),7.94(s, 1H),7.17(d,J＝10.8Hz,2H),4.60(s,1H),4.26(t,J＝6.5Hz,2H),3.65(t,J＝6.6 Hz,2H),3.48(s,4H),3.21(d,J＝10.0Hz,2H),2.26(d,J＝10.9Hz,2H),1.76(s, 2H),1.40(s,2H),1.22(s,2H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ162.80,152.57, 152.42,138.40,132.20,131.79,131.26,126.23,126.05,116.19,115.66,113.54, 110.25,110.04,72.57,67.38,60.65,59.54,31.96,23.56,23.52.
经检测，其结构如上式OLD-710所示，其荧光性能如下：
将OLD-710溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱、紫外光谱的检测。
OLD-710在乙醇、二甲基亚砜等溶剂中的荧光发射光谱测试与紫外吸收光谱测试。每次取20μL OLD-710母液，分别加入4mL乙醇、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行荧光光谱的测试与紫外吸收光谱测试。
OLD-710在乙醇、二甲基亚砜中的归一化的荧光谱图如图5所示：OLD-710 在乙醇、二甲基亚砜中的荧光发射波长在710-750nm，DMSO中荧光量子产率达到0.40。
OLD-710在乙醇、二甲基亚砜中的归一化的紫外吸收谱图如图6所示：由于环己二胺供体的强供电性OLD-710在乙醇、二甲基亚砜中的紫外吸收波长分别达到了712nm，714nm，可被应用于710nm左右的激光激发，作为近红外荧光染料。
实施例5
染料ELD-DAC的合成方法。
中间体ELD-DBr的合成
Figure BDA0001910636550000111
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐O-DBr(1.6g，2.43mmol)溶于乙酸与 N-甲基吡咯烷酮混合液80mL(2:1,V/V),而后向其中滴加4-氨基丁酸乙酯盐酸盐(1.00g，5.97mmol)。100℃反应3h后，将反应液倒入150mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V) 得红色固体150mg，产率8％。实施例5制备的ELD-DBr的核磁谱图氢谱如图 3所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,2H),7.84(s,2H),4.28(t,J＝7.1Hz,2H), 4.12(q,J＝7.1Hz,2H),2.46(t,J＝7.4Hz,2H),2.18–1.93(m,2H),1.25(t,J＝7.1 Hz,3H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ172.82,162.58,135.45,134.89,133.68, 133.40,132.93,132.78,131.63,129.51,123.78,123.63,122.91,121.86,60.53,39.95, 31.86,29.71,23.39.
染料ELD-DAC的合成
Figure BDA0001910636550000112
将ELD-DBr(200mg，0.27mmol)与1,2-环己二胺(228mg，2.00mmol) 溶于20mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。16h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得蓝绿色固体75mg，产率40％。
实施例5制备的ELD-DAC的核磁谱图氢谱如图4所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.25(s,2H),7.93(s,2H),7.15(s,2H),4.11(t, J＝6.6Hz,2H),3.97(dt,J＝13.3,6.5Hz,2H),3.21(d,J＝9.6Hz,2H),2.38(t,J＝ 7.3Hz,2H),2.26(d,J＝11.8Hz,2H),1.97–1.87(m,2H),1.77(d,J＝6.4Hz,2H), 1.35(dd,J＝21.4,8.0Hz,4H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H).
经检测，其结构如上式ELD-DAC所示，其在乙醇中吸收波长为712nm，是710nm激发波段的理想荧光染料。
实施例6
OLD-710对活细胞染色后结构光照明显微荧光成像检测。取0.5μL染料母液溶于1mL细胞培养液中，37℃，5％CO2下孵育10分钟后SIM成像。
OLD-710终浓度为1μM的细胞培养液孵育结肠癌细胞(HT-29)10分钟后 SIM成像图如图7所示：HT-29内脂滴结构清晰，OLD-710能够用于活细胞内的近红外超分辨荧光成像。

Claims (5)

1.一类710nm激发的高亮度荧光染料，其特征在于：该高亮度荧光染料基于苝酰亚胺在供电子端通过环己二胺的引入，实现了量子产率的提升，荧光半峰宽只有40nm，吸收红移至710nm，其结构如下：
Figure FDA0003386274460000011
其中R1为C1-C4烷基、(CH2CH2O)nH、(CH2)nCOOMe，n为1,2,3,4。
2.如权利要求1所述的一类710nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
(1)中间体
Figure FDA0003386274460000012
的合成：
将
Figure FDA0003386274460000013
与醇伯胺或脂肪伯胺溶于N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中；将反应液加热至100-140℃，搅拌1-10h；将反应液冷却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体，真空干燥，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比为1:0.25～6的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得深红色固体
Figure FDA0003386274460000021
(2)蓝色固体探针
Figure FDA0003386274460000022
的合成：
将
Figure FDA0003386274460000023
溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入环己二胺；而后将反应液缓慢升温至90-130℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比1:0～1的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂，得蓝色固体探针
Figure FDA0003386274460000024
3.根据权利要求2所述的一类710nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(1)中，
Figure FDA0003386274460000025
与醇伯胺或脂肪伯胺的质量比为1-5:1；
Figure FDA0003386274460000031
的质量与N-甲基吡咯烷酮与醋酸混合液的体积比为1:20-60g/mL；
N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为3:1-3。
4.根据权利要求2所述的一类710nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，其特征在于步骤(2)中，
Figure FDA0003386274460000032
与环己二胺的质量比为1-4:1-6；
环己二胺与乙二醇甲醚的质量与体积比为5-60:1g/mL。
5.根据权利要求1所述的一类710nm激发的高亮度荧光染料在近红外单色及多色荧光成像、组织及活体成像领域的应用。
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