CN111334071B - 一类680nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类680nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法，该荧光染料为通过在苝酰亚胺9,10‑位引入氮杂环丁烷结构设计合成的一系列高亮度的680nm荧光染料，其结构式如(1)所示，氮杂环丁烷的供电性将苝酰亚胺的荧光发射波长拓展至700nm以上，激发波长也红移至680nm左右。而较为刚性的结构也限制了分子本身的非辐射弛豫，量子产率在近红外区仍然能够保持在0.40。本系列荧光染料能够广泛应用于活细胞、活体等实时荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于近红外荧光染料领域，具体涉及一类680nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法。
背景技术
近红外荧光成像技术被认为是活体相关研究中重要的技术手段，由于650nm以上为动物细胞自发荧光的沉默区，所以近红外区域能够得到更高的信噪比。此外，光的散射能力与光波长的四次方成反比，波长长则散射能力弱组织穿透能力强，即近红外成像能够得到更深组织的荧光信息。但是，结构简单的近红外有机小分子荧光染料均存在光稳定差、荧光亮度低等问题，很难实现长时间对细胞及活体的监测。
目前，应用最为广泛的近红外荧光染料为花菁染料，其也被认为是最理想的用于活体成像的有机荧光染料。680nm激发的花菁染料基于Cy5.5母体，光稳定性较差，在基态即很容易被单线态氧氧化而发生变质。此外，Cy5.5荧光发射波长通常小于710nm，斯托克斯位移为30nm，在最大激发波长的作用下不能得到较完整的发射光谱数据，容易发生自淬灭的现象，造成信噪比的下降。因此，在680nm波段仍亟需新型高亮度、大斯托克斯位移、长荧光发射的荧光染料，以应用于荧光多色成像及活体研究中。
发明内容
本发明的目的提供一类680nm激发的高亮度荧光染料及其合成方法。，
一类680nm激发的高亮度荧光染料该系列染料荧光量子产率在不同溶剂中达到0.40以上。
本发明提供一类680nm激发的高亮度荧光染料，以苝酰亚胺为荧光团，通过9,10-位刚性结构的引入使苝酰亚胺的荧光稳定性、亮度得到大幅度提升。同时，双供电子体使荧光波长红移至710-750nm。
一类680nm激发的高亮度荧光染料，该系列荧光染料具有如下结：
其中：R1为
n为0,1,2,3等整数。
一类680nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，此系列荧光染料合成路线，如下：
具体合成步骤如下：
(1)中间体N-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺溶于N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中；将反应液加热至100-140℃，搅拌1-10h；将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体，真空干燥，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：石油醚(体积比1:0.25～6)为洗脱剂，减压除去溶剂得深红色固体N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺。
其中，9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺与醇伯胺或脂肪伯胺的质量比为1-10:1；9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的质量与N-甲基吡咯烷酮与醋酸混合液的体积比为1:20-120(g：mL)；N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为1-3:3-4。
(2)探针N-烷基-9,10-二氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；而后将反应液缓慢升温至90-130℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱(200-300目二氧化硅)分离，以二氯甲烷：石油醚(体积比1:0～1)为洗脱剂，减压除去溶剂，得蓝色固体探针N-烷基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺。
其中，N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺与氮杂环丁烷的质量比为1-4:1-6；氮杂环丁烷与乙二醇甲醚的质量与体积比为5-120:1(mg：mL)。
一类680nm激发的高亮度荧光染料荧光量子产率高，DMSO中量子产率0.40，荧光发射波长达到710-750nm。
本发明一类680nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，该方法具有操作简单、容易提纯等优点。
一类680nm激发的高亮度荧光染料在活细胞、组织及活体近红外荧光成像与检测领域的应用
本发明具有以下特点：
本发明涉及的染料拥有合成原料低价、方法简单且便于功能化、修饰等优点。
本发明涉及的染料在不同有机溶剂中吸收波长在670-710nm右，荧光发射波长在710-750nm。该类列染料斯托克斯位移最大可以达到60nm。
本发明涉及的染料吸收波长及荧光发射波长均达到了近红外区域，能够用于活细胞及活体荧光成像，组织穿透能力强，对细胞损伤小。
附图说明
图1实施例2制备的N-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(BuLD-DAze)的核磁谱图氢谱。
图2实施例3制备的N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-DAze)的核磁谱图氢谱。
图3为实施例2制备的染料BuLD-DAze在不同溶剂中的归一化荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图4为实施例2制备的染料BuLD-DAze在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图5为实施例3制备的染料OLD-DAze在不同溶剂中的归一化荧光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM。
图6为实施例3制备的染料OLD-DAze在不同溶剂中的归一化紫外吸收谱图，横坐标为波长，纵坐标为吸收强度，荧光探针的浓度为10μM。
图7为实施例3制备的染料OLD-Daze在斑马鱼中成像图，左图为斑马鱼显微镜下宽敞成像图，右图为斑马鱼荧光成像图。
具体实施方式
实施例1
染料MLD-DAze的合成方法。
中间体N-甲基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.0g，1.62mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液120mL(4:1,V/V),而后向其中滴加甲胺(100mg)醇溶液。100℃反应3h后，将反应液倒入200mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1，V/V)得红色固体459mg，产率45％。
其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,2H),8.12(s,2H),4.21(s,3H).
染料N-甲基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-甲基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与氮杂环丁烷(50mg，0.87mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至120℃。12h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得蓝绿色固体33mg，产率18％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.51(s,2H),6.57(s,2H),4.20(s,3H),4.11(s,8H),2.50(s,4H).
经检测，其结构如上式MLD-DAze所示，其激发波长在650-700nm，适合680nm激光激发用于荧光标记及成像。
实施例2
染料BuLD-DAze的合成方法。
中间体N-丁基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液24mL(1:1,V/V),而后向其中滴加正丁胺(1.2g,16.4mmol)。140℃反应1h后，将反应液倒入200mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1，V/V)得红色固体600mg，产率46％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.59(s,2H),8.14(s,2H),4.38–4.11(m,2H),1.94–1.66(m,2H),1.56–1.38(m,2H),0.99(t,J＝7.1Hz,3H).
染料N-丁基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-丁基-1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酰亚胺(200mg，0.30mmol)与氮杂环丁烷(86mg，1.50mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至130℃。12h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:4，V/V)得蓝绿色固体46mg，产率25％。实施例2制备的BuLD-DAze的核磁谱图氢谱如图1所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(s,2H),6.55(s,2H),4.25–4.19(m,2H),4.09(s,8H),2.48(s,4H),1.79–1.67(m,2H),1.48(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.99(t,J＝7.4Hz,3H).
经检测，其结构如上式BuLD-DAze所示，其荧光性能检测如下：
将BuLD-DAze溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱、紫外光谱的检测。
BuLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜等溶剂中的荧光发射光谱测试与紫外吸收光谱测试。每次取20μL BuLD-DAze母液，分别加入4mL乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行荧光光谱的测试与紫外吸收光谱测试。
BuLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜中的归一化的荧光谱图如图3所示：BuLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜中的荧光发射波长在710-750nm，DMSO中荧光量子产率达到0.40。
BuLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜中的归一化的紫外吸收谱图如图4所示：由于双氨基供体的强供电性BuLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的紫外吸收波长在达到670-700nm。
实施例3
染料OLD-DAze的合成方法。
中间体N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将1,6,7,12-四氯-9,10-二溴-3,4-苝酐(1.2g，1.96mmol)溶于乙酸与N-甲基吡咯烷酮混合液80mL(2:1,V/V),而后向其中滴加二甘醇胺(303mg,8.79mmol)。100℃反应6h后，将反应液倒入150mL冰水中，沉降并过滤得黑色固体。黑色固体经硅胶柱分离(石油醚：二氯甲烷＝1:1-1:4，V/V)得红色固体380mg，产率55％。其核磁氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.60(s,2H),8.13(s,2H),4.67–4.41(m,2H),3.88(d,J＝5.3Hz,2H),3.71(d,J＝4.5Hz,2H),3.67(d,J＝3.6Hz,2H),2.38(s,1H).
染料N-(2-(2-羟基)-乙氧基)乙基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺(OLD-DAze)的合成：
将OLD-DBr(200mg，0.28mmol)与氮杂环丁烷(1.2g，16.4mmol)溶于10mL乙二醇甲醚，并将其加热至90℃。24h后减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(展开剂：二氯甲烷)得蓝绿色固体60mg，产率32％。实施例3制备的OLD-DAze的核磁谱图氢谱如图2所示，具体数据为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,2H),6.57(s,2H),4.57–4.37(m,2H),4.10(s,8H),3.88(d,J＝4.9Hz,2H),3.71(s,4H),2.50(s,4H).
经检测，其结构如上式OLD-DAze所示，其荧光性能检测如下：
将OLD-DAze溶解于DMSO溶液中，配制成2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以检测其荧光光谱、紫外光谱的检测。
OLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜等溶剂中的荧光发射光谱测试与紫外吸收光谱测试。每次取20μL OLD-DAze母液，分别加入4mL乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜，配制成10μM的荧光染料测试液，并进行荧光光谱的测试与紫外吸收光谱测试。
OLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜中的归一化的荧光谱图如图5所示：OLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜中的荧光发射波长在710-750nm，乙醇中荧光发射波长达到731nm。
OLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜中的归一化的紫外吸收谱图如图6所示：OLD-DAze在乙腈、氯仿、乙醇、二甲基亚砜、水中的紫外吸收波长在680nm左右，可用于680nm激光激发。
将该类染料分别溶解于DMSO溶液中，配制成不同染料的2mM母液，根据需要配制成不同浓度测试溶液，以用于细胞及活体内荧光成像。
实施例4
OLD-DAze对活体斑马鱼染色后荧光成像测试。取1μL OLD-DAze母液溶于1mL斑马鱼幼鱼(3-5天)培养液中，并在室温孵育20分钟后进行共聚焦荧光成像。
OLD-DAze终浓度为2μM的斑马鱼培养液孵育斑马鱼幼鱼20分钟后共聚焦荧光成像图如图7所示：右图荧光成像图中OLD-DAze能够对斑马鱼体内脂类代谢中心肝脏进行特异性标记，实现活体荧光成像。
Claims (5)
1.一类680 nm激发的高亮度荧光染料，其特征在于：通过在苝酰亚胺9,10-位引入氮杂环丁烷结构将苝酰亚胺的荧光发射波长拓展至700 nm以上，激发波长也红移至680 nm，其结构如下：
其中：R1 为 
n为0,1,2,3。
2. 一种如权利要求1所述的一类680 nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，其特征在于包含步骤如下：
（1）中间体N-烷基-9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酐与醇伯胺或脂肪伯胺溶于N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液中；将反应液加热至100-140 ℃，搅拌1-10 h；将反应液泠却至室温后倒入冰水中抽滤得黑色固体，真空干燥，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比为1:0.25~6的二氯甲烷和石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂得深红色固体N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺；其中探针N-烷基-9,10-二氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺的合成：
将N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入氮杂环丁烷；而后将反应液缓慢升温至90-130 ℃，并在氮气保护下反应10-24 h；减压除去溶剂，经200-300目二氧化硅硅胶柱分离，以体积比1:0~1的二氯甲烷：石油醚为洗脱剂，减压除去溶剂，得蓝色固体探针N-烷基-9,10-二-氮杂环丁基-1,6,7,12-四氯苝酰亚胺。
3.根据权利要求2所述的一类680 nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，其特征在于步骤（1）中， 9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酐与醇伯胺或脂肪伯胺的质量比为1-10:1；
9,10-二溴-1,6,7,12-四氯苝酐的质量与N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸混合液的体积比为1:20-120 g/mL；
N-甲基吡咯烷酮与冰醋酸的体积比为1-3:3-4。
4.根据权利要求2所述的一类680 nm激发的高亮度荧光染料的合成方法，其特征在于步骤（2）中， N-烷基-9,10-二溴-1,6，7,12-四氯苝酰亚胺与氮杂环丁烷的质量比为1-4:1-6；
氮杂环丁烷的质量与乙二醇甲醚的体积比为5-120:1mg/ml。
5.一种如权利要求1所述的一类680 nm激发的高亮度荧光染料在活细胞、组织及活体近红外荧光成像与检测领域的应用。
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| CN104603112A (zh) * | 2012-08-30 | 2015-05-06 | 巴斯夫欧洲公司 | 经由多功能结构单元双给体官能化苝和萘单酰亚胺的迫位 |
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| Heteroatom-substituted rhodamine dyes: Structure and spectroscopic properties;Deng Fei et al.;《Chinese Chemical Letters》;20181213;第30卷(第10期);1667-1681 * |
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