CN114544571A - 一种构建生物正交反应基纸器件的方法及其在单胺氧化酶检测上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种构建生物正交反应基纸器件的方法及其在单胺氧化酶检测上的应用。通过在纸基表面用W1化合物进行修改，修饰后的纸基器件带有1,2,4,5‑四嗪衍生物结构，原有1,2,4,5‑四嗪结构基于光致电子转移机制淬灭了原本的荧光。当特异性结合的蛋白‑探针溶液滴加在纸上时，与蛋白特异性结合的探针的反式环辛烯端可与纸基上的W1的1,2,4,5‑四嗪结构端发生生物正交反应，反应后会有荧光增强效果，以荧光信号对样本的单胺氧化酶含量进行检测。本发明生物正交反应的纸基器件作为体外检测平台，该过程无需昂贵的抗体、复杂的仪器以及繁琐的检测，比免疫印迹检测更加方便，并且能够实现高通量的检测。
Description
技术领域
本发明涉及单胺氧化酶检测技术领域，具体涉及一种构建生物正交反应基纸器件的方法及其在单胺氧化酶检测上的应用。
背景技术
蛋白质对所有生物体都是必不可少的物质，可以用作健康状况和疾病状态的重要生物标记，快速检测蛋白质对疾病的诊断和治疗至关重要。如今常用于检测蛋白质水平表达的方法有蛋白质免疫印迹法。蛋白质免疫印迹是一种用特异性抗体检测某特定抗原的蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。该检测方法存在很多弊端，如抗体孵育时间长，抗体成本高，操作过程繁杂。现有其他检测蛋白的方法有免疫荧光法，液相色谱与质谱，酶联免疫吸附测定等，这些方法仍然摆脱不了抗体，需要价格昂贵的仪器和专业的技术人员，并且难以实现定量检测等缺点。因此，亟需开发低成本、高通量、高特异性、少用甚至无需抗体的蛋白质检测方法，用以分析复杂样本中的蛋白质。
近年来纸基器件在临床诊断、食品安全分析以及环境监控方面具有广泛应用，为便携式检测和现场实时监测提供广阔的分析平台。此外，对于医疗器件和医护人员紧缺的欠发达地区，纸基器件更是实现低成本即时诊断的有效工具。纸基器件因其独特的优势，应用在癌症、传染病以及其他生理疾病的检测方面，引起了越来越多研究者的关注。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种构建生物正交反应基纸器件的方法及其在单胺氧化酶检测上的应用。生物正交荧光探针颠覆性取缔了传统检测中的抗体使用，所述的检测过程所运用的新型蛋白质检测方法与传统方法相比优势明显，能够特异性识别蛋白、检测速度快、操作便捷、灵敏度高、并且能够实现蛋白的定性和半定量检测。
一种构建生物正交反应基纸器件的方法，包括以下步骤：
步骤1，用蜡打印方法在层析纸上做出图案，并在等离子体表面处理机中预处理，使纸基表面羟基变为醛基；
步骤2，制备化合物W1，具体结构式为
步骤3，利用化合物W1对所制备的纸基进行修饰，得到生物正交反应的纸基器件；
其中，步骤2中所述制备化合物W1的步骤如下：
第一步：合成6-溴-N-甲基萘-2-胺，合成温度为120±40℃，搅拌时间为7-20h；
第二步：合成6-(甲氨基)-2-萘腈，合成温度为200±40℃，搅拌时间为4-20h；
第三步：合成N-甲基-6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-胺，合成加热时间为48-96h，合成反应后加入盐酸溶液调pH至2.0-3.0；
第四步：合成N-甲基-N-(6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-基)甘氨酸甲酯，合成过程中加热回流时间为24-48h；
第五步：合成2-(甲基(6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-基)氨基)乙酰肼，合成过程中加热回流时间为4-20h。
上述生物正交反应基纸器件在单胺氧化酶检测上的应用。
上述应用的步骤如下：合成特异性探针，以MAOs的两种亚型—MAO-A和MAO-B为目标蛋白，目标蛋白与所设计的特异性探针实现共价结合；通过分离柱将探针-蛋白缀合物与多余的特异性探针分子分离；向生物正交反应的纸基器件上滴加30-50μL含有目标蛋白-特异性探针共价结合的缀合物样本溶液；固定在纸基上的W1结构中的1,2,4,5-四嗪结构与缀合物上的反式环辛烯结构发生生物正交反应，反应后会有荧光增强的效果，检测荧光强度；构建目标蛋白的浓度与荧光强度相关的关系图。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种构建生物正交反应基纸器件的方法及其在单胺氧化酶检测上的应用，蛋白-探针缀合物与W1发生生物正交反应，反应后有荧光增强的效果，通过荧光强度的变化实现对MAOs的分型检测。该方法具有普适性、检测快速简便等优点，具有如下优势：
1、普适性：普通纸基器件无法实现体外分型检测蛋白，而W1能和任何带有反式环辛烯结构的特异性蛋白探针发生生物正交反应，并产生荧光增强。以此为依据，将W1修饰在纸基表面，能够在体外检测各种蛋白的含量。
2、反应速度快：W1本身有微弱荧光，与蛋白特异性探针中的反式环辛烯结构发生生物正交反应后，产物荧光增强，该反应速率高，反应后荧光强度增强效果明显；
3、制备成本低、操作简便：W1经化学合成获得，合成原料廉价易得，合成工艺简单易行；
4、检测快速便捷：检测步骤无需复杂的抗体孵育与清洗；检测过程操作简单。
附图说明
图1为化合物W1的合成路线；
图2为化合物A2的分析图谱；
图3为化合物A3的分析图谱；
图4为化合物A4的分析图谱；
图5为化合物A5的分析图谱；
图6为化合物W1的分析图谱；
图7为实施例2的纸基器件制备及应用流程图；
图8为W1与蛋白-探针缀合物的反应方程式；
图9为纸基器件检测MAOs的荧光图谱，其中，(a)为MAO-A与CL-TCO缀合物，(b)为MAO-B与PA-TCO缀合物。
具体实施方式
实施例1 W1的化学合成方法
W1结构如
合成过程如图1所示。
步骤1，将微波管中的6-溴萘-2-醇(1.0g，4.48mmol)，二甲胺溶液(2mL，30.16mmol)，硫代硫酸钠(1.78g，9.37mmol)和水(15mL)的混合物在140℃下搅拌7h。产物用氯溶液洗涤，水相用乙酸乙酯萃取，然后通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到6-溴-N-甲基萘-2-胺；结果如图2所示。
步骤2，将6-溴-N-甲基萘-2-胺(2g、8.5mmol)，氰化亚铜(1.1g、12.3mmol)和吡啶(50mL)的混合物在220℃搅拌1.5h。将产物冷却至室温，用乙酸乙酯萃取，再用10％乙酸乙酯洗涤。然后用无水硫酸钠干燥。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到6-(甲氨基)-2-萘腈；结果如图3所示。
步骤3，将6-(甲氨基)-2-萘腈(1.1mmol)，水合肼(38.3eq.)，三氟甲磺酸锌(1eq.)溶于乙腈，在氮气条件下，加热回流48h。用薄层色谱板监测反应。待反应结束后加入亚硝酸钠(76eq.)水溶液淬灭反应，后加入1M HCl溶液调pH至3.0。用二氯甲烷萃取，再用无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到N-甲基-6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-胺；结果如图4所示。
步骤4，将N-甲基-6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-胺和1,8-双二甲氨基萘(0.44g，2.1mmol)溶于干燥的乙腈(20mL)中，然后加入溴乙酸甲酯(3.3mmol)。在氮气下，将反应混合物回流搅拌16h。反应结束后旋干溶剂。加二氯甲烷和水萃取，有机层用稀释的硫酸洗涤。通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到N-甲基-N-(6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-基)甘氨酸甲酯；结果如图5所示。
步骤5，将水合肼(2eq.)加热至50℃，将N-甲基-N-(6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-基)甘氨酸甲酯(1eq.)溶于乙醇并缓慢滴加入水合肼中，回流48h，反应完全后旋干。再加水和二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，通过快速柱色谱法纯化，旋干，得到最终产物W1。结果如图6所示。
实施例2纸基器件的制备
步骤1，利用蜡打印技术在纸上打印出直径3mm，以7列7行的形式排列的圆孔作为检测区，并将打印好的层析纸置于150℃烘箱中烘烤1min，使蜡熔化并穿透纸张厚度，形成亲水-疏水壁垒；
步骤2，利用工作电源为13.56MHz、射频功率为100W的等离子清洗机处理层析纸4min，在纸表面生成醛基；
步骤3，在层析纸的检测区域滴加10μM的W1溶液10μL，待W1氨基与预处理后的纸基上的醛基反应5min后，吸取多余溶液，制备得到可进行生物正交反应的纸基器件。
实施例3实施例2制备的纸基器件在检测单胺氧化酶上的应用
步骤1，向实施例2中制备的纸基器件上滴加40μL含有MAO-A与CL-TCO/MAO-B与PA-TCO共价结合的缀合物样本溶液；
其中，MAO-A的特异性探针CL-TCO的化学合成方法如下所示，
第一步，2-氯-4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚的合成过程所需反应时间为4-10h。
第二步，叔丁基(2-氯-4-甲基苯氧基)二甲基硅烷的合成过程加热回流时间为2-8h。
第三步：(4-(溴甲基)-2-氯苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷的合成过程的反应时间为5-10h。
第四步：(E)-叔丁基(2-氯-4-((环辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯氧基)二甲基硅烷的合成过程的反应时间为2-10h。
第五步：MAO-A的特异性探针CL-TCO的合成过程将(E)-2-氯-4-((环辛-4-烯-1-丙氧基)甲基)苯酚、1,3-二溴丙烷溶于乙腈，加入碳酸钾，在氮气保护下回流2-4h。冷却至室温后加入N-甲基丙-2-胺，和碳酸钾在40±10℃条件下搅拌22-48h。
MAO-B的特异性探针PA-TCO的化学合成方法如下所示，
第一步：(E)-环辛-4-烯-1-基(4-硝基苯基)碳酸酯的反应过程在室温下反应10-20h。
第二步：(E)-环辛-4-烯-1-基(2-溴乙基)氨基甲酸酯的反应过程在室温下反应14-22h。
第三步：4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚反应过程在室温下搅拌30-90min后，加入乙酸钠反应4-10h。
第四步：MAO-B的特异性探针PA-TCO的反应过程中将4-((甲基(丙-2-炔-1-基)氨基)甲基)苯酚、(E)-环辛-4-烯-1-基(2-溴乙基)氨基甲酸酯、碳酸钾溶于乙腈溶液中，氮气保护下加热回流10-20h。
步骤2，固定在纸基上的W1的1,2,4,5-四嗪衍生物结构与蛋白-探针缀合物上的反式环辛烯结构发生生物正交反应，出现荧光增强现象，用荧光分光光度计检测荧光强度；
步骤3，改变蛋白-探针缀合物溶液的浓度为5μg/mL，0.5μg/mL，5ng/mL，0.5ng/mL，0ng/mL，将5个浓度的缀合物溶液15μL分别滴加在修饰有W1的检测微区中，待发生生物正交反应15min后，出现荧光增强的效果，放入光学检测器检测荧光强度并记录数值，绘制荧光强度图。操作过程如图7、图8所示，荧光强度图如图9所示。
由图9表明，本发明一种构建生物正交反应基纸器件的方法及单胺氧化酶检测应用，可根据检测出的荧光强度对比图中荧光强度的值，从而得知待测液中单胺氧化酶的浓度范围，可对样品中的单胺氧化酶半定量检测。
本发明基于生物正交反应的纸基器件作为体外检测平台。所设计的修饰在纸基表面的分子结构式为
记为W1。该1,2,4,5-四嗪衍生物接上1,2,4,5-四嗪结构之前有荧光，接上1,2,4,5-四嗪结构之后基于光致电子转移机制淬灭了原本的荧光。其中，
可与纸基上的
缩合反应，将W1固定在纸基表面。当特异性结合的蛋白-探针缀合物溶液滴加在纸上时，特异性探针另一端的
可与纸基上的W1发生生物正交反应。反应后会有荧光增强效果，通过荧光信号的变化检测样本中的蛋白含量。该过程无需昂贵的抗体、复杂的仪器以及繁琐的检测，比免疫印迹检测更加方便，并且能够实现高通量的蛋白检测。
在单胺氧化酶检测上的应用中，单胺氧化酶(MAOs)是一种表达在线粒体外膜上的蛋白，根据其对天然底物或探针结合的特异性和细胞分布等不同，MAOs分为两种亚型—MAO-A和MAO-B，异常表达的MAO-A或MAO-B均会引起神经退行性疾病和紊乱，如人体内MAO-A的过度表达与精神分裂症和抑郁症有着重要联系，MAO-B在帕金森病和阿兹海默症患者大脑中大量表达。MAO-A的特异性探针
记为CL-TCO，该探针的特征结构——
可以作为靶向部分，特异性定量共价结合MAO-A；MAO-B的特异性探针
记为PA-TCO，该探针的特征结构——
可以作为靶向部分，特异性定量共价结合MAO-B。同时，这两种探针分子的
可与W1的
发生生物正交反应，反应后荧光增强，以荧光强度作为检测蛋白表达水平的信号，通过检测荧光强度的变化对MAO-A/MAO-B进行定性和半定量分析。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种构建生物正交反应基纸器件的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，用蜡打印方法在层析纸上做出图案，并在等离子体表面处理机中预处理，使纸基表面羟基变为醛基；
步骤2，制备化合物W1，具体结构式为
步骤3，利用化合物W1对所制备的纸基进行修饰，得到生物正交反应的纸基器件；
其中，步骤2中所述制备化合物W1的步骤如下：
第一步：合成6-溴-N-甲基萘-2-胺，合成温度为120±40℃，搅拌时间为7-20h；
第二步：合成6-(甲氨基)-2-萘腈，合成温度为200±40℃，搅拌时间为4-20h；
第三步：合成N-甲基-6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-胺，合成加热时间为48-96h，合成反应后加入盐酸溶液调pH至2.0-3.0；
第四步：合成N-甲基-N-(6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-基)甘氨酸甲酯，合成过程中加热回流时间为24-48h；
第五步：合成2-(甲基(6-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)萘-2-基)氨基)乙酰肼，合成过程中加热回流时间为4-20h。
2.基于权利要求1所述的生物正交反应基纸器件在单胺氧化酶检测上的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：合成特异性探针，以MAOs的两种亚型—MAO-A和MAO-B为目标蛋白，目标蛋白与所设计的特异性探针实现共价结合；通过分离柱将探针-蛋白缀合物与多余的特异性探针分子分离；向生物正交反应的纸基器件上滴加30-50μL含有目标蛋白-特异性探针共价结合的缀合物样本溶液；固定在纸基上的W1结构中的1,2,4,5-四嗪结构与缀合物上的反式环辛烯结构发生生物正交反应，反应后会有荧光增强的效果，检测荧光强度；构建目标蛋白的浓度与荧光强度相关的关系图。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性探针为CL-TCO或PA-TCO，当特异性探针为CL-TCO时，与目标蛋白MAO-A结合，当特异性探针为PA-TCO，与目标蛋白MAO-B结合。
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