JP2022546707A - 生体体液中の非結合ビリルビンの濃度の測定のための単一工程方法、キット、およびシステム - Google Patents
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Abstract
ビリルビンに結合すると蛍光指数が変化する、蛍光標識されたタンパク質の同定および使用を記載する。システインまたはリジン残基で標識され、また、システインおよびリジンの両方で２つの異なるフルオロフォアで標識されたプローブが開示される。これらのプローブは、液体試料中の非結合ビリルビンレベルの測定に有用である。【選択図】図１
Description
本出願は2019年8月30日に出願された米国仮出願第62／894,553号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
この研究は、National Institutes of HealthからのSBIR Grant No.R44HD080412によって一部サポートされた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有することができる。
本出願は、サイズが40KBである2020年8月24日に作成された、FFASC077WOSEQLIST.TXTと題する電子配列リストと共に出願される。電子配列表中の情報は、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
本開示は、非結合ビリルビンの測定に関する。
ビリルビンはヘモグロビン代謝回転の産物であり、水にほとんど溶解せず、したがって、血漿中のアルブミンと大きく関連する。しかしながら、全血漿ビリルビンの少量は水相に可溶である。この非結合型または遊離型分画は血液脳関門を透過でき、高値では神経毒性を示す[Ahlfors CE,Wennberg RP, Ostrow JD and Tiribelli C、非結合(フリー)ビリルビン： 新生児黄疸を評価するためのパラダイムの改善、Clin Chem 55：1288－1299, 2009］。正常な状態では、総血清ビリルビンがビリルビンの産生と排泄の調節されたバランスによって低レベルに維持される。しかしながら、新生児では、産生－排泄バランスが蓄積に有利になるように調節機構が十分に成熟していない可能性があり、新生児の約80％で黄疸により黄色くなることが多い[Maisels MJおよびMcDonagh AF、新生児黄疸のための光線治療、N Engl J Med 358： 920－928、2008; Bhutani VK, Stark AR, Lazzeroni LC, Poland R, Gourley GR, Kazmierczak Sら、ひどい新生児高ビリルビン血症のプレ解放検査は、光線治療を必要とする幼児を特定する、J Pediatr 2013；162：477－82］。ほとんどの場合、この不均衡は、良性であるか、または実際に有益であり得、そしてほとんどの新生児について自然に消散する、[Wennberg RP, Ahlfors CE, Bhutani VK, Johnson LHおよびShapiro SM、核黄疸を理解するために：黄疸の新生児の管理を改善するための挑戦、Pediatrics 117： 474－485、2006; Gopinathan V, Miller NJ, Milner ADおよびRice－Evans CA。新生児血漿中のビリルビンおよびアスコルビン酸の抗酸化活性、FEBS Lett 349：197－200, 1994］。非結合型ビリルビンの濃度は神経毒性を示すレベルまで上昇する可能性があり、その結果、可逆性の聴覚障害から、稀な例ではあるが死に至る核黄疸のより重度の神経学的後遺症までの範囲の障害が生じる[Ahlfors CE、Wennberg RP, Ostrow JD and Tiribelli C 非結合(フリー)ビリルビン：新生児黄疸を評価するためのパラダイムの改善、Clin Chem 55： 1288－1299, 2009］。
光線療法または交換輸血を用いた早期介入は、新生児におけるビリルビン媒介性神経毒性を治療できる[Maisels MJおよびMcDonagh AF、新生児黄疸の光線療法、N Engl J Med 358： 920－928, 2008; Morris BHら、極低出生体重児に対する侵攻性vs保存的光線療法、N Engl J Med 359：1885－1896、2008；Kuzniewicz MW、Escobar GJおよびNewman TB、一般的なビリルビンふるい分けの影響が重度の高ビリルビン血症および光線療法に及ぼす影響、Pediatrics 124： 1031－1039、2009］。介入のガイドラインは、主に総ビリルビン値に依存しており、在胎期間と危険因子を考慮に入れている[Bhutani VK、Johnson L and Sivieri EM、健康な正期産児および正期産に近い新生児におけるその後の重大な高ビリルビン血症に対する電荷時間特異的血清ビリルビンの予測能、Pediatrics 103： 6－14、1999］。しかし、基本的な生化学的証拠および増加する臨床的証拠から、総ビリルビンよりも非結合ビリルビンの方がビリルビン媒介神経毒性とより正確に相関することはずであることが予測される[Ahlfors CEら］。非結合型（フリー）ビリルビン：新生児黄疸を評価するためのパラダイムの改善、Clin Chem 55： 1288－1299，2009; Wennberg RPら。新生児高ビリルビン血症の介入ガイドライン：エビデンスに基づくクアグミア、Curr Pharm Des 15： 2939－2945，2009; Ahlfors CEら、非結合型ビリルビンは、多様な新生児集団において自動聴性脳幹反応の異常を予測する、J Perinatol 29： 305309，2009; Oh Wら。極低出生体重児における血漿総ビリルビンおよび非結合型ビリルビンと死亡または有害な神経発達転帰との関連性に対する臨床状態の影響、Acta Paediatr 99： 673－678、2010］。したがって、ビリルビン神経毒性のリスクがある新生児を特定するためには、総ビリルビンよりも非結合型ビリルビンの方が優れているはずである[Ahlfors CE.黄疸新生児におけるビリルビン神経毒性の予測、Curr Opin Pediatr 22： 129－133、2010; Watchko JF and Tiribelli C Bilirubin、誘発神経障害機序と管理アプローチN Engl J Med 2013； 369： 2021－30］。
未熟児における積極的な光線療法は、総ビリルビンを5mg／dL未満に維持するようにデザインされている[Morris BH ら、超低出生体重児に対する積極的対保守的光線療法、N Engl J Med 359： 1885－1896、2008］。Morrisらは、総ビリルビンを5mg／dL未満に維持する治療を受けた患者と８mg／dL未満に維持した患者の転帰（死亡および神経発達障害）に差を認めなかった。ある追跡研究では、転帰は総ビリルビンではなく、非結合型ビリルビンと十分に相関していることが明らかにされた[Oh Wら］。極低出生体重児における血漿総ビリルビンおよび非結合型ビリルビンと死亡または有害な神経発達転帰との関連性に対する臨床状態の影響、Acta Paediatr 99: 673－678、2010］。このことは、光線療法を実施する時期を決定するために総ビリルビンを用いることは、総ビリルビンのレベルがビリルビンの毒性分画である非結合ビリルビンと共役していなかったため、誤解を招いた可能性があることを示唆している。総ビリルビンと非結合型ビリルビンの脱共役(decoupling)は、アルブミンへのビリルビン結合を著しく妨げる分子の存在から生じることがある。例えば、総ビリルビンが1mg／dLほどの低さであったとしても、妨害分子による総ビリルビンのわずか０．２％の置換は、３４nMの非結合ビリルビンを生じる。これは正期産新生児に毒性があると考えられている値を超える非結合型ビリルビン値であり、Morrisらの試験[Morris BHら、超低出生体重児に対する積極的対保守的光線療法、N Engl J Med 359: 1885－1896、2008］のような未熟児に対しては、はるかに低い非結合型ビリルビン値が毒性を示すと一般に考えられた。
いくつかの治療および生理学的プロセスは、ビリルビンの分子変異体を産生し得る。ビリルビンの天然形態は、Ｚ，Ｚ異性体（Ｚ，Ｚ－ビリルビンＩＸα）である。４００～６００nmの間の光に暴露すると、３つの変異体が生成される；光異性体Ｚ，Ｅ－ビリルビンＩＸαおよびＥ，Ｚ－ビリルビンＩＸα、ならびに誘導体Ｚ－ルミルビンＩＸα[Jana Jasprovalら、PLoS ONE DOI:10．1371、2016; J. Jasheprovaら、ビリルビンのフォト分解生成物の神経刺激的な効果の科学的な報告 (2018） 8：7444］。現在、血清試料中の非結合ビリルビンレベルを測定するための唯一のＦＤＡ承認方法は、ＨＲＰペルオキシダーゼによるビリルビン酸化速度の測定に基づくarrows社ＵＢ解析装置である［HNakamura & Y、Lee、黄疸性新生児の血清の非結合ビリルビンのマイクロ決定：ペルオキシダーゼとブドウ糖オキシダーゼを用いた酵素方法、Clinica Chimica Acta, 79： 411417、1977］。ビリルビン光生成物は、ビリルビン吸光度の減少がＺ，Ｚ異性体のみによるものであると仮定するので、非結合ビリルビンについてのペルオキシダーゼ評価を破壊し得る。Ｚ，ＥおよびＥ，Ｚ異性体の吸収スペクトルは、Ｚ，Ｚ吸光度と重複する。[Antony F. McDonaghら、光異性体：非結合ビリルビンの臨床ぺルオキシターゼ測定における錯乱因子か？Pediatrics 2009；123；67－76］。これらおよび他の光異性体はＺ，Ｚ異性体よりはるかに可溶性であるが、はるかに毒性が低いので、ペルオキシダーゼ評価は誤って上昇したＢｆレベルを報告する。ビリルビン光産物に加えて、肝臓はビリルビンをグルクロン酸と抱合し、胆汁に溶けて排泄させ、そこで最終的に便に移行する。肝臓の健康状態によっては、抱合(conjugated)ビリルビンの一部が肝臓から血液循環に漏出することがある。グルクロニド修飾は非抱合ビリルビンと比較して溶解度を増加させるので、抱合ビリルビンは結合しておらず、しばしば、０～２μMの参照範囲で２～５０μMの濃度で存在する[Sanjiv Harpavatら、持続性黄疸の幼児と通常の新生児は、ビリルビン測定値を指示する. Clinical Chemistry 61：2 330－334（2015）］。これらのμM濃度はｎＭ（０～１００ｎＭ）非結合Ｚ，Ｚビリルビン濃度の測定、特に、結合ビリルビンと非結合ビリルビンとを容易に区別しないペルオキシダーゼ評価を妨害し得る。
多くの薬物および代謝物はアルブミン上の結合状態から置換されたビリルビンを生じるアルブミンに結合でき、それにより総ビリルビン濃度が上昇するか否かにかかわらず、ビリルビンの非結合型濃度が上昇する[Spear MLら、投与量を変えた１５時間脂肪注入がアルブミンへのビリルビン結合に及ぼす影響、JPEN J Parenter Enteral Nutr 9：144－147, 1985 Amin SB.未熟児におけるビリルビンアルブミン結合親和性および非結合型ビリルビンに及ぼす遊離脂肪酸の影響、JPEN J Parenteral Enteral Nutr 34： 414－420、2010］。特に重要なビリルビン置換代謝産物は遊離脂肪酸（ＦＦＡ）である。ＦＦＡは常に存在するが、低レベルに維持され、健康な正期産新生児に重大な影響を及ぼすことはない。しかし、例えば敗血症などによるストレス条件下では、ＦＦＡ濃度が有意に上昇する可能性がある[Nogueira ACら、敗血症患者における血漿遊離脂肪酸濃度の変化が心臓障害や心拍変動の減少と関連している、Shock 29： 342－348、2008］。ＮＩＣＵの早産児は疾患やストレスに加えて、Intralipid(登録商標)などの油乳剤を用いた非経口栄養により、ＦＦＡ濃度を極端に大きく上昇させることがある[Spear M ら、１５時間脂肪注入がアルブミンへのビリルビン結合に及ぼす影響、JPEN J Parenter Enteral Nutr 9： 144－147、1985; Amin SB遊離脂肪酸が未熟児のビリルビン－アルブミン結合親和性および非結合型ビリルビンに及ぼす影響、JPEN J Parenteral Enteral Nutr 34： 414－420、2010］ＦＦＡはビリルビンと同様に高い親和性でアルブミンと結合する。ＦＦＡはビリルビンとは異なり、アルブミン結合部位のかなりの部分がＦＦＡによって占有された場合にのみビリルビン置換が有意になるように、複数の親和性結合部位を有する[Spear MLら投与量を変えた15時間脂肪注入がアルブミンに及ぼす影響、JPEN J Parenter Nutr 9： 144－147、1985; Amin SB、未熟児におけるビリルビン－アルブミン結合親和性および非結合型ビリルビンに及ぼす遊離脂肪酸の影響、JPEN J Parenter Nutr 34： 414－420、2010］Intralipid(登録商標)を投与された新生児は、妊娠期間、酵素活性、脂肪蓄積等の因子が役割を果たすため、ビリルビンを置換するのに十分な量のＦＦＡを容易に予測できない。[Spear ML ら、アルブミンに対するビリルビン結合に対する１５時間脂肪注入の影響、JPEN J Parenter Enteral Nutr 9： 144－147、1985; Amin SB、未熟児におけるビリルビン－アルブミン結合親和性および非結合ビリルビンに対する遊離脂肪酸の影響、JPEN J Parenter Enteral Nutr 34： 414－420、2010］。脂質注入中のＦＦＡ(ＦＦＡu)の非結合濃度をモニタリングすると、ＦＦＡuレベルの上昇は非結合ビリルビンを危険レベルまで大きく増加させることが明らかになった[Hegyi Tら、総ビリルビン非結合型デカップルで治療された非結合の遊離脂肪酸は光線療法非有効、Neonatology, 2013；104:184-187;Hegyiら、非結合の遊離脂肪酸と非結合のビリルビンに及ぼすダイズ脂質注入の影響、J Pediatr 2017年；184：45－50］。さらに、これらの代謝物の非結合レベルは多くの患者特異的因子に依存しているため、Intralipid(登録商標)注入中の非結合ビリルビンを直接モニタリングすることによってのみ、ビリルビン神経毒性のリスクのある乳児を同定することができる。これは、Intralipid（登録商標）濃度の増加によって引き起こされるＦＦＡの上昇した血漿レベルが総ビリルビン濃度を変化させることなく、上昇した非結合ビリルビン濃度を生じるので、ビリルビンについて特に当てはまる。
細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）は、低分子量単鎖ポリペプチドのファミリーである。４つの認識されているサブファミリーがある。サブファミリーＩは、レチノイン酸およびレチノールのようなビタミンＡ誘導体に特異的なタンパク質を含む。サブファミリーIIは胆汁酸、エイコサノイド、ヘムに特異性をもつタンパク質を含む。サブファミリーIIIは腸型脂肪酸結合蛋白質（FABP）を含む。サブファミリーIVは他の全てのタイプの脂肪酸結合蛋白質[Haunerland NHおよびSpener F、脂肪酸結合蛋白質、遺伝子操作からの洞察、Prog Lipid Res 43： 328－349、2004］を含み、低親和性でビリルビンと結合するFABP[Di Pietro SMおよびSantome JA.、２種類のラット肝臓脂肪酸結合蛋白質アイソフォームの単離、キャラクタリゼーションおよび結合特性、Biochim Biophys Acta 1478： 186－200、2000］を含む。ファミリー全体は、共通の３次元折り畳みによって特徴付けられる。異なるサブファミリーのリガンド結合特性はかなり重複する。野生型タンパク質のサブファミリーＩ、[Richieri GVら、異なる組織からの脂肪酸結合タンパク質は、脂肪酸相互作用の異なったパターンを示す、Biochemistry 39： 7197－7204、2000］およびサブファミリーIIは、両方とも、脂肪酸ならびにそれらの天然リガンドに結合する。さらに、単一アミノ酸置換は、サブファミリーIおよびIIのタンパク質のリガンド結合特性を相互変換することができる[Jakoby MGら、リガンド－タンパク質静電相互作用は、レチノール－および脂肪酸－結合タンパク質の特異性を支配する、Biochemistry 32： 872－878，1993］。本明細書に記載される各参考文献の開示は、その全体が本明細書に参照される開示のために、参照により明示的に組み込まれる。
改良されたフルオロフォア、他の方法よりも低いレベルの薬物および代謝産物からの干渉、５μL未満の希釈されていない血液試料を用いた単一工程でのＢｆ測定を可能にする使い捨てカートリッジ、および評価の較正の方法を有する近赤外(ＮＩＲ)Ｂｆセンサに関する、組成物、キット、装置、システム、並びに方法が本明細書に記載される。本明細書中に記載されるように、プローブは、フルオロフォアで標識されたｉＬＢＰを含み得る。非結合ビリルビン（ＢｆまたはＵＢ）のプローブであって、ビリルビンが結合すると蛍光指数が変化し、流体中の非結合ビリルビンのレベルを測定するために使用することができるプローブが開示されている。蛍光指数は、例えば波長、強度、偏光、寿命、または蛍光の任意の測定可能な量であり得る。本明細書中に開示される非結合ビリルビンプローブは、非結合ビリルビンレベルが決定される流体中に存在する他の分析物の存在下で有意に結合しないか、または有意な蛍光変化を受けない。本明細書中に記載される非結合ビリルビンのプローブは、高ビリルビン血症の診断および処置において、ならびにビリルビン毒性のリスクを評価するために使用され得る。ビリルビンに結合せず、ビリルビンの存在下で蛍光指数の変化を受けず、その蛍光が、非抱合ビリルビンレベルが測定される流体中に一般に存在する他の分析物によって影響されない非応答プローブもまた同定される。一緒になって、第１のフルオロフォアを有する非結合ビリルビンプローブおよび異なるフルオロフォアを有する非応答プローブはＢｆセンサを生成することができ、これは、Ｂｆの存在下で、第２のフルオロフォアに対する第１のフルオロフォアからの蛍光指数の比の変化を受ける。Ｂｆセンサおよび専用の蛍光リーダーを含むカートリッジと一緒になって、評価はＵＢCheck評価と呼ばれる。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料中の遊離ビリルビンを測定するためのセンサに関する。いくつかの実施形態では、センサが第１のフルオロフォアで標識されたビリルビン応答性プローブと、第２のフルオロフォアで標識された非応答性プローブとを含む。いくつかの実施形態では第１および第２のフルオロフォアが同じ波長で励起し、第１および第２のフルオロフォアは異なる波長で蛍光を発する。いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブは第１の細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）を含み、ここで、第１のｉＬＢＰはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むペプチド配列を有し、１４個の接近可能なリジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるようなＫＲ１４）を置換するアルギニン；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示される配列を有するＣ末端二重Ｈｉｓタグリンカー（Ｃ２ＸＨ１１）；ＭＧＩのＮ末端付加；ならびに単一のシステインを含む６２個以下のアミノ酸置換および付加を含む。いくつかの実施形態では、ビリルビン応答性プローブが表１に記載のプローブのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、非応答プローブが第２のｉＬＢＰを含み、第２のｉＬＢＰはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1を含むペプチド配列を有し、７２、７３、７４、１２６および１３１位の置換；２７、３１、３３、５４、７３、７４、７６、または９８位のいずれか１つにおけるＣｙｓへの置換；３つ以下のさらなるアミノ酸置換；およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載の配列を有するＣ末端二重Ｈｉｓタグリンカー（Ｃ２ＸＨ１１）を含む。いくつかの実施形態では、非応答プローブが表２に記載のプローブのいずれか１つの配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアが異なるフルオロフォアである。いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブは、第１のフルオロフォアが結合されている単一のシステインを含む。いくつかの実施形態では、非応答プローブが第２のフルオロフォアが付着している単一のシステインを含む。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアが同じまたはほぼ同じ波長で励起される。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアがシステイン置換に結合したＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドまたはＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである。いくつかの実施形態では、ビリルビン応答性プローブがビリルビンの非抱合ＩＸ－α（Ｚ，Ｚ）異性体に結合するように構成される。いくつかの実施形態では、ビリルビン応答性プローブが結合ビリルビン（４mg／dl未満）に最小限に結合するように構成される。いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブは、ビリルビンのＺ，ＥまたはＥ，Ｚ光異性体、ルミルビン、脂肪酸、任意の他の天然に存在する血液成分、および／または新生児薬に結合しないように構成される。いくつかの実施形態において、新生児薬物は、スピロノラクトンではない。いくつかの実施形態では、非応答プローブがビリルビンまたは結合ビリルビンの非結合ＩＸ－α（Ｚ，Ｚ）異性体に結合しないように構成される。いくつかの実施形態において、非応答プローブは、ビリルビンのＺ，ＥまたはＥ，Ｚ光異性体、ルミルビン、脂肪酸、任意の他の天然に存在する血液成分、および／または新生児薬に結合しないように構成される。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドであり、第２のフルオロフォアはシステイン置換に結合したＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドであり、第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである場合、第２のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドである。いくつかの実施形態において、第１のフルオロフォアまたは第２のフルオロフォアはシステイン置換に結合され、ここで、システイン置換はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位にある。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアまたは第２のフルオロフォアの発光強度がビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光度によって影響されない。いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブまたは非応答性プローブは、少なくとも１つのリンカーをさらに含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載されるセンサのいずれかを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物が遊離ビリルビン（Ｂｆ）センサを含む。いくつかの実施形態ではセンサがビリルビンに結合し、第１のフルオロフォアで標識される第１の細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）と、ビリルビンに結合せず、第２のフルオロフォアで標識される第２のｉＬＢＰとを含み、第２のフルオロフォアは第１のｉＬＢＰに結合されず、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアは同じ波長で励起し、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアの発光波長は異なり、第２のフルオロフォアはビリルビンの存在下でその発光を変化させない。いくつかの実施形態では第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドであり、第２のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドであるか、または第１のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドであり、第２のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドである。いくつかの実施形態において、蛍光指数の比の変化は、２つの異なる波長で測定され、非結合ビリルビンの濃度を決定するために使用される。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアまたは第２のフルオロフォアの発光強度がビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光度によって影響されない。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、本明細書に記載のセンサを含むか、または本明細書に記載の組成物を含む固体基材に関する。いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブおよび／または非応答性プローブは、固体基材に付着される。いくつかの実施形態では、固体基材がＮｉ－ポリスチレン、Ｎｉ－ラテックス、またはＮｉ－アガロースビーズである。いくつかの実施形態では、Ｎｉ－ポリスチレン、Ｎｉ－ラテックス、またはＮｉ－アガロースビーズは鉄を含む。いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブまたは非応答性プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載の置換７Ｒ １６Ｒ ２０Ｒ ２９Ｒ ３７Ｒ ４６Ｒ ５０Ｒ ８８Ｒ ９２Ｒ ９４Ｒ １００Ｒ １２５Ｒ １２９Ｒおよび／または１３０Ｒ（ＫＲ１４）を含む。いくつかの実施形態では、ビリルビン応答性プローブおよび／または非応答性プローブはタグを含み、固体基材はタグの受容体を含む。いくつかの実施形態では、タグがＨｉｓ－タグ、ビオチン、Flag－エピトープ、ｃ－ｍｙｃエピトープ、HA－タグ、グルタチオン－S－トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β－ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、または金属親和性タグのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、タグはポリヒスチジンタグであり、固体基材は固定化金属キレートを含む。いくつかの実施形態において、第１のフルオロフォアは、ビリルビン応答プローブ上のシステイン残基に結合される。いくつかの実施形態において、第２のフルオロフォアは、非応答プローブ上のシステイン残基に結合される。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ＫｄおよびＲｍを決定するためにビリルビンセンサを較正する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法が前述のセンサのいずれか１つのセンサを既知濃度のビリルビンＢｔの水性試料と混合するステップと、蛍光を測定するステップと、下記式（1）に当てはめることによって測定された蛍光から較正パラメータを決定するステップとを含む：
ここで、Ｒは測定された蛍光比（（Ｉλ1／Ｉλ２）、Ｉλ1は試料からバックグラウンドを差し引いた波長λ１の第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は試料からバックグラウンドを差し引いた波長λ２の第２のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｒｏはビリルビン非存在下での比であり、ＢＴは総ビリルビン濃度であり、ＰＴは応答プローブ濃度であり、ｒは第２のフルオロフォア非存在下でのビリルビンプローブフルオロフォアのＩλ2／Ｉλ１比であり、Ｋｄはビリルビンプローブの平衡解離定数であり、Ｒｍは無限ＢＴに外挿された比Ｒである。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料中の遊離ビリルビン［Ｂｆ］の濃度を測定する方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法が試料のベースライン蛍光を測定するステップと、本明細書に記載のセンサのいずれか１つに試料を適用するステップと、試料蛍光を測定するステップと、試料蛍光からベースライン蛍光を差し引いて測定蛍光を取得するステップと、測定蛍光から［Ｂｆ］の濃度を決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ベースラインを測定する工程および／またはベースラインを減算する工程が任意選択で実行される。
いくつかの実施形態では、式（1）がセンサを較正するために使用され、式（2）が［Ｂｆ］を決定するために使用され、式中、Ｒは測定された蛍光比（（Ｉλ１／Ｉλ２）であり、Ｉλ１は波長λ１での第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ2は波長λ２での第２のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｒｏはビリルビンの非存在下での比であり、ｒは第２のフルオロフォアの非存在下でのプローブのＩλ２／Ｉλ１比であり、Ｋｄは解離定数であり、Ｒｍは∞Ｂｆでの最小Ｒ値であり、Ｒｍはプローブのビリルビン飽和でのＲである。
いくつかの実施形態において、試料は、ビリルビンのための１つ以上の担体巨大分子と混合される。いくつかの実施形態において、１つ以上の担体巨大分子は、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、またはシクロデキストリンを含む。いくつかの実施形態では、センサは固体支持体に取り付けられる。いくつかの実施形態において、Ｂｆ濃度は使い捨てマイクロフルイディクスデバイスを使用して決定され、これは、任意に、希釈されていない血液試料の測定を可能にする。いくつかの実施形態では、試料がヒト、動物、または植物由来である。いくつかの実施形態では、試料が全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液、またはリンパである。いくつかの実施形態では、試料が油エマルジョンの静脈内注入を受けている患者からのものである。いくつかの実施形態では、試料がアルブミンからビリルビンを置換する薬物を受けている患者からのものであり、および／またはそのような患者は注入された油エマルジョンから、アルブミンからビリルビンを置換する分子を産生している可能性がある。いくつかの実施形態では、試料が光線療法、輸血、またはビリルビンレベルを低下させる他の治療を受けている患者由来である。いくつかの実施形態では、Ｒｏが試料を光退色させることによって得られ、それによってゼロレベル測定値を得る。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、カートリッジに関する。いくつかの実施形態では、カートリッジが試料中のビリルビンを測定するように構成される。いくつかの実施形態では、カートリッジが基板と、基板に結合するように構成され、試料を受容するための試料ポートを備えるレンズと、ビリルビン応答性プローブ、非応答性プローブ、およびそれに固定化された抗ヘモグロビンペプチドを有する基材とを含む。いくつかの実施形態では、基板が約１４５nm～約２２５nmの範囲の波長のＵＶ光で処理され、それによって、光処理されたポリスチレンポリマー鎖が基材のポリマー鎖に連結するる。いくつかの実施形態では、基板はポリスチレン基板である。いくつかの実施形態では、基材が６６０nmの励起光の反射強度を低減するように構成された暗色を有する材料を含む。いくつかの実施形態では、レンズはアクリルレンズである。いくつかの実施形態では、レンズがＯ２プラズマで処理される。いくつかの実施形態では、レンズをポリスチレン基板に結合することにより、約０．１mm以下の深さを有する溝が形成され、カートリッジを封止する。いくつかの実施形態では、試料が全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液、またはリンパである。いくつかの実施形態では、試料は希釈されていない試料である。いくつかの実施形態では、カートリッジが平衡状態でビリルビンを測定するように構成される。いくつかの実施形態では、カートリッジがビリルビン標準の追跡可能性によって較正される。いくつかの実施形態では、ビリルビン標準がプローブを較正するために使用される市販のビリルビンであり、プローブは較正複合体を較正するために使用され、較正複合体はカートリッジを較正するために使用される。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態はキットに関する。いくつかの実施形態において、キットは、患者から試料を収集するための１つ以上の収集デバイス、本明細書に記載されるようなセンサのいずれか１つ、または適切なキャリア中の１つ以上のプローブを含む本明細書に記載されるような組成物のいずれか１つ、および医学的決定レベル未満および／またはそれ以上の非結合ビリルビンの既知濃度を含む１つ以上の参照標準を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の参照標準は任意である。
以下の詳細な説明では、その一部を形成する添付の図面を参照する。図面において、同様の記号は文脈が別段の指示をしない限り、典型的には同様の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載される例示的な実施形態は、限定することを意味しない。本明細書に提示される主題の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書で一般的に説明され、図面に示される本開示の態様は広範な様々な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、および設計することができ、そのすべてが本明細書で明示的に企図されることが容易に理解されるのであろう。
米国特許番号第5,470,714号、第6,444,432号、第7,601,510号、第9,134,317号、第9,529,003号、および第9,817,004号は、非結合分析物の決定のためのプローブを生成する方法を記載しており、その全体が参照により本明細書に明示的に援用される。これらのプローブは、細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）ファミリー由来のタンパク質の天然型または突然変異型のいずれかを用いて構築した。上記のように、このファミリーは脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）を含む［Banaszakら、脂質結合タンパク質Aファミリーの脂肪酸およびレチノイド輸送タンパク質Adv Protein Chem 45：89－151, 1994;Bernlohr DAら、細胞内脂質結合タンパク質およびそれらの遺伝子Annu Rev Nutr 17：277303,1997］。ｉＬＢＰは約１５ｋＤａの分子量の細胞内タンパク質であり、野生型タンパク質において１または２のＦＦＡならびに他の代謝産物に結合する結合部位を有する。
本明細書に開示および記載される特許および刊行物は、それぞれ、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれ、本明細書で特に参照される任意の開示について、１つのフルオロフォアおよびビリルビンに結合または応答しないタンパク質に遊離または付着した第２のフルオロフォアを有するビリルビン感受性ｉＬＢＰから構成される、本明細書で遊離ビリルビン（Ｂｆ）比センサとも呼ばれる非結合ビリルビン（ＵＢ）を記載する。本開示は例えば、改良されたフルオロフォアを有する近赤外(ＮＩＲ)Ｂｆセンサ、他の方法よりも低いレベルの薬物および代謝産物からの干渉、５μL未満の希釈されていない血液試料での単一ステップでのＢｆ決定を可能にする使い捨てカートリッジ、および評価の較正の方法を含む、先行特許および公報に対する改良を記載する。
本明細書中に記載されるビリルビン感受性のＮＩＲ蛍光標識ｉＬＢＰ変異体は、改善されたビリルビン特異性および感受性として開発された。以前の開示、例えば、米国特許第9,529,003号は、主にリジン、末端アミノ基、またはシステインでフルオロフォア標識されたｉＬＢＰを記載する。米国特許第9,134,317号に開示されているように、単一のシステインでの標識は複数の部位（野生型ＦＡＢＰ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有するタンパク質を含む）または変異ＦＡＢＰタンパク質（例えば、表１および２に示される配列を有する変異タンパク質はシステイン残基を有さない））でのフルオロフォア標識を排除することによって、ｉＬＢＰへのリガンド結合の検出に対する感度および特異性を改善する。ほとんどの部位のフルオロフォアはリガンド結合の際にそれらの蛍光を変化させないので、ほとんどの部位での標識はリガンド結合の際の蛍光シグナル対ノイズ比を減少させる。ｉＬＢＰは末端アミノ基に加えて、１４もの表面アクセス可能なリジンを有し、その全ては、アミノ反応性フルオロフォアで標識され得る。本開示の１つの改善は、２つのフルオロフォアＬＩＣＯＲ７００ＤＸおよびＬＩＣＯＲ８００ＣＷの新たに利用可能なシステイン特異的形態（マレイミド）の使用に関する。ＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドは以前の開示の時点では入手できず、または知られておらず、ＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドは米国特許第9,529,003号では研究されていなかった。本明細書に開示されるビリルビン感受性ｉＬＢＰは、ＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドで標識される特異的な単一システイン変異を有する。ビリルビンの存在下で蛍光の変化を示さず、ＬＩＣＯＲ８００ＣＷ－マレイミドで単一のシステイン突然変異で標識されたｉＬＢＰ突然変異体も開発されている。
本明細書に開示されるプローブは新生児に最も処方された薬物の５０を超えるもの（例えば、表４に列挙されるもの）、抱合ビリルビン、ビリルビンの光異性体、未熟児または他のリスクのある乳児に非経口栄養を提供するために使用される静脈内脂質エマルジョンに対して感受性でなくてもよく、遊離脂肪酸に対して感受性でない。
本開示はまた、試料中の非結合ビリルビン濃度を決定するためのデバイスに関する。いくつかの実施形態では、デバイスが血液試料マイクロチャネル（例えば、１～５０μL、いくつかの実施形態では５μLの体積を有する）の中心に乾燥スポットとしてＮＩＲ蛍光Ｂｆセンサを含む使い捨てプラスチックカートリッジを含む。カートリッジからの蛍光は、この測定のために特別に開発された蛍光リーダーにカートリッジを挿入することによって、血液試料を適用した後に測定することができる。使い捨て試料カートリッジおよびリーダーのこの構成は非結合ビリルビンの血液レベルが単一のステップで、いくつかの実施形態ではマイクロリットル容量の試料を使用して測定されることを可能にし得る。
カートリッジ上のＢｆセンサを乾燥させると、ビリルビン感受性プローブの蛍光のビリルビン媒介不完全消光が生じる。これは、センサの特徴付けのための、およびビリルビン感受性プローブからの蛍光をビリルビン非感受性プローブからの蛍光で割った比からの非結合ビリルビン濃度の計算のための新しい分析方法を必要とする。
したがって、本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、非結合ビリルビンに高度に特異的である蛍光標識タンパク質（またはｉＬＢＰ突然変異タンパク質）およびビリルビンに非応答性である蛍光標識のｉＬＢＰ突然変異タンパク質を同定するための方法を対象とする。いくつかの実施形態は、ビリルビン応答性のｉＬＢＰ突然変異タンパク質上および非応答性ｉＬＢＰ突然変異タンパク質上での異なる近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォアの使用を対象とする。Ｂｆセンサ内で組み合わされた場合、Ｂｆの存在は、２つの異なるNIRフルオロフォアの屈折率の比の変化を生じる。本明細書に提供される実施形態は単純な水溶液からヒト流体（血液、ＣＳＦ、尿、間質液）を含む複雑な生物学的試料までの範囲の試料中の非結合ビリルビン濃度を決定するための蛍光比センサを作製するために、２つの蛍光標識タンパク質を使用する方法に関する。いくつかの実施形態において、この方法は、米国特許第7,601,510号および第9,529,003号の方法を使用してプローブを作製する工程、ならびに第２の蛍光標識された非応答タンパク質の使用によって比Ｂｆセンサを作製する工程を包含する。一方または両方の蛍光タンパク質は、溶液中に遊離していてもよく、または一方または両方が例えば、ポリデキストラン、またはポリスチレンなどの固体基材（マトリックス）または樹脂ポリマーに付着していてもよい。いくつかの実施形態では、本方法が式（1）を用いてセンサの較正定数を決定するためにセンサを較正することを含む。いくつかの実施形態は、プローブを固体基材に連結することに関する。固体基材に連結されたプローブの特徴は、このようなデバイスにおける非結合ビリルビンレベルの正確かつ正確な決定を評価するために試験され得る。このような特徴は例えば、プローブ解離、アルブミン緩衝、またはポリマーへのビリルビン結合の効果を含み得るが、ポリマーに対するプローブおよび平衡速度は含まない。いくつかの実施形態では、Ｂｆセンサ特異性が一般的な代謝産物、薬物、ビリルビン光異性体、結合ビリルビン、または１nM未満の非結合ビリルビンまたはいくつかの医学的に適切なレベルに相当する他の分析物寄与を含む、潜在的な干渉物質のパネルに対して試験することによって精緻化され得る。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ヒト血液試料中の非結合ビリルビンに対する特異性を確実にするために、ビリルビンを添加した、定義されたヒト血漿、血清または全血中の非結合ビリルビンの測定による定量を試験することを含む。いくつかの実施形態では、方法が式（2）に記載されるように、非結合ビリルビン濃度を計算することをさらに含む。
いくつかの実施形態は、１つ以上のアミノ酸置換およびフルオロフォアを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応する脂質結合タンパク質などのｉＬＢＰに基づくプローブを対象とする（表１および２の実施例を参照されたい）。いくつかの実施形態では、フルオロフォアが単一の反応性システインのみを有するｉＬＢＰのシステイン残基に結合される。いくつかの実施形態ではビリルビン感受性ｉＬＢＰがビリルビンのＩＸα－Ｚ，Ｚ異性体に結合するが、光異性体Ｚ，Ｅ、Ｅ，Ｚおよびルミルビン、抱合ビリルビン、または脂肪酸に有意に結合せず、非応答性ｉＬＢＰも単一の反応性システインのみを有し、これらの検体のいずれにも結合または応答しない。
いくつかの実施形態において、ビリルビン感受性プローブは、Ｎ末端ＭＧＩ置換、Ｃ末端二重ＨＩＳタグ置換Ｃ２ＸＨ１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１４、１８、２３、２８、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、３８、５４、６０、７３、７４、７６、９７、９８、１０６、１１５、１１７、または１３２から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の脂質結合タンパク質に対応する。
いくつかの実施形態において、ビリルビン応答性プローブのためのフルオロフォアは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７３、７４、７６、９７または９８位のシステイン置換に結合される。
いくつかの実施形態において、プローブは、２９位がシステインに変異している場合を除いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の７Ｒ１６Ｒ２０Ｒ２９Ｒ３７Ｒ４６Ｒ５０Ｒ８８Ｒ９２Ｒ９４Ｒ１００Ｒ１２５Ｒ１２９Ｒおよび／または1３０Ｒ（ＫＲ１４－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）位においてアルギニンで置換される。
いくつかの実施形態では、プローブが配列ＲＧＡＡＳＨＨＨＨＨＨＳＨＲＡＴＰＮＴＳＰＨＨＨＨＨＨＨ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３)を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＣ末端にリンカー（Ｃ２ＸＨ１１）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド鋳型が切断可能または非切断可能な親和性タグを有するｉＬＢＰ突然変異タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では鋳型ポリヌクレオチド鋳型がポリヒスチジン親和性タグを有するｉＬＢＰ突然変異タンパク質をコードし、固体基材は固定化金属キレートを含む。
いくつかの実施形態では、ビリルビン応答性および非応答性ｉＬＢＰ突然変異タンパク質が８未満のｐＨで単一のフルオロフォアで標識される。８未満のｐＨでは、フルオロフォアはシステイン側鎖と反応することができる。いくつかの実施形態では、フルオロフォアが約６６０nmの波長で励起し、約７００nmおよび８１９nmの波長で発光するチオール特異的フルオロフォア、例えば、ＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドおよびＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである。
いくつかの実施形態では、第２のフルオロフォアが非応答性ｉＬＢＰ突然変異タンパク質などの非応答性プローブへのフルオロフォアの添加によって提供される。非応答性ｉＬＢＰはまた、８未満のｐＨでシステイン側鎖と優先的に反応する単一のフルオロフォアで標識される。いくつかの実施形態では、フルオロフォアがＬＩＣＯＲ８００ＣＷ－マレイミドまたはBiotiumＣＦ８００マレイミドである。いくつかの実施形態では、非応答性ｉＬＢＰがビリルビン応答性（ビリルビン結合性)ｉＬＢＰムテインプローブの蛍光と比較して、ビリルビンへの暴露時のその蛍光指数においてゼロまたは有意に減少した応答を有する。
いくつかの実施形態において、非応答プローブは、１つ以上のアミノ酸置換およびフルオロフォアを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応する脂質結合タンパク質のようなｉＬＢＰに基づく（表２の実施例を参照のこと）。いくつかの実施形態では、フルオロフォアが単一の反応性システインのみを有するｉＬＢＰのシステイン残基に結合される。
いくつかの実施形態において、非応答プローブは、１４、１８、２０、２３、２７、２９、３３、５４、７２、７３、７４、７６、９８、１００、１１７、１２６、または１３１から選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1の脂質結合タンパク質に対応する。
いくつかの実施形態において、非応答プローブのためのフルオロフォアは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２７、３１、３３、５４、７３、７４、７６、または９８位のシステイン置換に結合される。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、第１のフルオロフォアで標識されたｉＬＢＰ突然変異タンパク質と、ビリルビンに結合しない別個の非結合ｉＬＢＰに結合された第２のフルオロフォアとを有する組成物を対象とする。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアが同じ波長で励起することができ、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアの発光波長は異なる。いくつかの実施形態では、第２のフルオロフォアがビリルビン非応答ｉＬＢＰ突然変異タンパク質へのビリルビン結合に応答して影響を受けず（その放出を変化させない）、および／または非応答ｉＬＢＰはビリルビンに結合しない。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドであり、第２のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである。
いくつかの実施形態では蛍光指数の比の変化が２つの異なる波長で測定され、この比は非結合ビリルビン濃度を決定するために使用される。
いくつかの実施形態では、指数がｉＬＢＰ突然変異タンパク質に付着したフルオロフォアの発光強度であり、これは本明細書に記載されるように、ビリルビンおよびヘモグロビンなどの血液成分の光吸収（６００ｎｍを超える）によって有意に影響されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムおよび方法が溶血とは無関係である。溶血は、試料中のヘモグロビンおよびヘムによる重大な干渉を引き起こす。しかしながら、本明細書に提供される方法、システム、および組成物は、溶血に関連する妨害を克服する。いくつかの実施形態において、ペプチドはＢｆプローブが付着される固体基材に添加され、そしてこのペプチドは溶血からの干渉を排除するか、または有意に減少させる。
いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアはシステインに結合され、ＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドであり、第２のフルオロフォアはまた、異なるｉＬＢＰ上のシステインに結合され、ＬＩＣＯＲ８００ＣＷ－マレイミドである。
他の実施形態では、第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ８００ＣＷ－マレイミドであり、ビリルビン感受性ムテインに結合され、第２のフルオロフォアはＬＩＣＯＲ７００ＤＸレイミドであり、非応答性ムテインに結合される。
本明細書中に記載される他の実施形態において、第２の異なるフルオロフォアは、ビリルビンに結合しないタンパク質に結合される。ビリルビン応答性ｉＬＢＰ突然変異タンパク質に結合した第１のフルオロフォアと、第２のフルオロフォアを結合したプローブとを結合したプローブはビリルビン非応答性ｉＬＢＰ突然変異タンパク質に結合し、したがって、応答性プローブと非応答性プローブとの混合物は、ビリルビンに応答して２つの異なる波長で測定された蛍光指数の比を変化させるＢｆセンサを生じる。第２のフルオロフォアは第１（応答性ｉＬＢＰ突然変異タンパク質）フルオロフォアよりも長いまたは短い発光波長を有することができるが、両方のフルオロフォアは共通の励起波長を有するべきである。例えば、いくつかの実施形態では第１（タンパク質結合）フルオロフォアがＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドであり、第２の例としてはＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミド、および／またはビリルビン非応答タンパク質に結合したBiotiumＣＦ８００マレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。一方または両方の蛍光標識タンパク質は、溶液中に遊離していてもよく、または別のポリマーまたは固体基材中に埋め込まれていてもよい。この配置は第２のフルオロフォアの最大励起波長が第１のフルオロフォアの最大励起波長と異なる場合でさえ、両方のフルオロフォアの発光強度が類似するように、フルオロフォアの濃度を調節することができるという望ましい利点を有する。第１のフルオロフォアと同じタンパク質に結合していない第２の異なるフルオロフォアを使用するこのタイプの比プローブは典型的には両方のフルオロフォアが同じタンパク質上に位置する場合に、２つのフルオロフォアの一方が他方によってエネルギー移動消光するという問題を排除する。
いくつかの実施形態において、第２のフルオロフォアは、アクセプタータンパク質に結合される。いくつかの実施形態において、プローブは、これらの位置の１つがシステイン置換を有する場合を除いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の置換７Ｒ１６Ｒ２０Ｒ２９Ｒ３７Ｒ４６Ｒ５０Ｒ８８Ｒ９２Ｒ９４Ｒ１００Ｒ１２５Ｒ１２９Ｒおよび１３０Ｒ（ＫＲ１４－ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む。
いくつかの実施形態では、プローブが配列ＲＧＡＡＳＨＨＨＨＨＨＳＨＲＡＴＰＮＴＳＰＨＨＨＨＨＨＨ(ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）から構成されるＣ末端リンカーＣ２ＸＨ１１を含む。
本明細書中に提供される実施形態はフルオロフォアがシステイン残基（例えば、ＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミド、ＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミド、ＬＩＣＯＲ、ＩＲDye６８０ＬＴマレイミド、Alexafluor６８０マレイミドまたはBiotiumＣＦ８００マレイミド）に結合されるプローブに関する。
いくつかの実施形態において、上記のプローブのいずれかは、固体支持体への付着のための１つ以上のリンカーと組み合わせて、プローブのＣ末端またはＮ末端に２つ以上のタグを含み得る。
いくつかの実施形態において、プローブは、２つのＨｉｓタグおよび２つのリンカーを使用して、固体支持体に付着される。
本明細書中に提供される実施形態は、上記のようなプローブを含む組成物を対象とする。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は溶液中に遊離のビリルビン感受性プローブ（例えば、ＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミド）およびビリルビン非応答プローブ（例えば、ＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミド）に関する。いくつかの実施形態において、ビリルビン感受性プローブおよびビリルビン非応答性プローブは、溶液中の固体基材に付着される。
本明細書で提供される実施形態は、固体基材に取り付けられた上述のプローブのいずれかを含む固体基材を対象とする。いくつかの実施形態では、固体基材が任意選択で鉄を含有する、ポリスチレンまたはラテックスビーズ、Ｎｉ－ポリスチレンビーズである。固体基材への付着のために選択されるプローブは単独で、またはＮ末端修飾およびＣ末端修飾、リンカーおよび表面リジン（ＫＲ１４）の置換を含むが、これらに限定されない、上記の修飾のいずれかを組み合わせて含み得る。異なる発光波長を有する２つのプローブは、ナノ粒子またはビーズである同じまたは異なる固体基材上に固定化されてもよい。
いくつかの実施形態では、プローブが固体基材への付着のためにタグ付けされる。いくつかの実施形態では、タグがＨｉｓタグ、ビオチン、Ｆｌａｇエピトープ、ｃ－ｍｙｃエピトープ、ＨＡタグ、グルタチオン－S－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β－ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ－糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、または金属親和性タグのうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態はプローブがタグを有し、固体基材がタグの受容体を含む固体基材を対象とする。いくつかの実施形態ではタグが追加のリンカーを有するかまたは有さないポリヒスチジンタグであり、固体基材は固定化金属キレートを含む。
他の実施形態はデキストラン、ポリスチレン、ラテックス、アガロースビーズ、またはＮｉ－ＮＴＡポリスチレンビーズ（任意選択で鉄を含有する）などのポリマーを含むが、これらに限定されない、ナノ粒子である固体基材に付着されるビリルビンプローブを含む。これらのナノ粒子基材は、肉眼で見える表面上にさらに固定化することができる。このような表面の使用の例としては、使い捨てマイクロ流体デバイスの溝（単回使用試料カートリッジを含む）が挙げられるが、これらに限定されない。表面上に固定化されるように設計されたビリルビンプローブの例としては、表１および２からの各々の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されず、その二重Ｈｉｓタグおよびリンカーはポリスチレン、ラテックスまたはアガロースビーズ上のＮｉ、ＣｏまたはＣｕを含むがこれらに限定されない種々のポリマー樹脂上の種々の金属リガンドとキレート化することを可能にする。プローブが付着したこのようなビーズは溶液中で自由に使用することができ、ビリルビン応答性および非応答性プローブは同じまたは異なるビーズに添加することができ、両方の構成について、２つの異なるフルオロフォアはエネルギー移動を排除し、それによってビリルビン結合に対する比応答を得るように十分に十分に分離される。いくつかの実施形態では、基板がマイクロ流体デバイスまたはマルチウェルプレートである。いくつかの実施形態では、基板がカートリッジの表面に取り付けられるように、本明細書に記載の検出デバイスに含まれる。
本明細書に提供される実施形態は、蛍光色素で標識された単一のシステインを有するｉＬＢＰ突然変異タンパク質を対象とする。いくつかの実施形態において、システイン／リジン特異的標識条件下で蛍光標識活性を有する任意の表面リジンまたは任意の他のシステインは例えば、アラニンまたはアルギニンを含む別のアミノ酸で置き換えられる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応するｉＬＢＰムテイン鋳型を利用するいくつかの実施形態において、２７位のリジンは高度に反応性であり、そして標識がその位置に向けられない限り、典型的にはアラニンに変異され得る。
いくつかの実施形態では、ビリルビンがアルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞またはシクロデキストリンなどの担体高分子と複合体を形成する。ビリルビンと担体高分子との複合体は非結合ビリルビンの濃度を緩衝し、非結合ビリルビンのレベルのクランピングを提供する。いくつかの実施形態では、担体高分子はアルブミンである。さらなる実施形態において、アルブミンは例えば、ウシ血清アルブミンよりもビリルビンに対してより大きな親和性を有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であり、したがって、いくつかの実施形態において、ビリルビンのためのより好ましいアルブミン緩衝液であり得る。
本明細書で提供される実施形態は水性媒体中で、ビリルビン濃度（ＢＴ）が増加するビリルビンの試料とセンサを混合し、各濃度でセンサの蛍光強度Ｒの比を測定し、式（1）に適合させることによって測定された蛍光から較正パラメータ（Ｋｄ、Ｒｍ、およびＲｏ）を決定することによって、ビリルビンプローブを較正する方法を対象とし、式中、Ｒは測定された蛍光比（Ｉλ1／Ｉλ2）であり、ここで、Ｉλ１は波長λ１での第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ２は波長λ２での第２のフルオロフォアからの蛍光強度であり、λ１およびＩλ２の両方はバックグラウンドを差し引かれ、Ｒｏはビリルビンが存在しない場合の比である。ＢＴは総ビリルビン濃度であり、ＰＴはセンサの濃度であり、ｒは第２のフルオロフォアの不在下でのビリルビン感受性プローブの蛍光のＩλ2／Ｉλ1比であり、Ｋｄはセンサの平衡解離定数であり、Ｒｍは、無限ＢＴに外挿された比Ｒである。式（1）はＲｍが＞0である場合に、米国特許第9,529,003号の式（5）ではなく、いくつかの実施形態で使用される。
本明細書で提供される実施形態は、任意選択で試料の蛍光を測定する工程と、センサを試料と混合する工程と、蛍光を測定する工程と、任意選択で、センサが存在する試料蛍光強度からセンサが存在しない場合の試料の蛍光強度（バックグラウンドまたはブランク）を差し引く工程と、バックグラウンド差し引かれたセンサ強度からＲを計算する工程と、式（2）から［Ｂｆ］の濃度を決定する工程とを含む、以下の工程の組合せによって遊離ビリルビン［Ｂｆ］の濃度を測定する方法を対象とする。
いくつかの実施形態において、式２はセンサを較正し、かつ／またはＢｆを測定するために使用され、式中、Ｒは測定された蛍光比（（Ｉλ1／Ｉλ2）であり、Ｉλ1は波長λ１での第１のフルオロフォアからの蛍光強度であり、Ｉλ2は波長λ２での第２のフルオロフォアからの蛍光強度であり、試料ブランクを差し引いた両方の強度であり、Ｒｏはビリルビンの非存在下での比であり、ｒは第２のフルオロフォアの非存在下でのセンサのＩλ2／Ｉλ1比であり、Ｋｄは解離定数であり、Ｒｍは∞Ｂｆでの最小Ｒ値であり、Ｒｍは、プローブのビリルビン飽和でのＲである。
いくつかの実施形態ではセンサがビリルビン応答性ｉＬＢＰと１つのフルオロフォアとの組み合わせによる２つのフルオロフォアから構成され、第２のフルオロフォアは溶液中で遊離のポリマーまたは溶液中で遊離のタンパク質に結合され、ビリルビンに結合しない。いくつかの実施形態ではセンサがビリルビンに結合または応答し、固体基材に付着する１つのフルオロフォアを有するタンパク質から構成され、第２のフルオロフォアはやはり固体基材に付着するが、第１のフルオロフォアを有するタンパク質から分離されるビリルビンに結合または応答しない別のタンパク質に付着する。
いくつかの実施形態では、試料がアルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞またはシクロデキストリンなどのビリルビンのための担体高分子を含む。
いくつかの実施形態では、ビリルビン応答性プローブおよび非応答性プローブが使い捨てマイクロ流体チャネルのチャネルに取り付けられ、未希釈血液試料中のＢｆの測定を可能にする。
いくつかの実施形態では、試料がヒト、動物または植物由来である。いくつかの実施形態では、試料が全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパからのものである。いくつかの実施形態では、試料が油エマルジョンの静脈内注入を受けている患者からのものである。いくつかの実施形態において、試料は疾患またはストレスから、ビリルビンをアルブミンから置換する分子を産生し得る患者に由来する。いくつかの実施形態において、試料は、アルブミンからビリルビンを置換し得る薬物で処置されている患者由来である。いくつかの実施形態では、試料が光線療法、輸血、またはビリルビンレベルを低下させる他の治療を受けている患者由来である。
本明細書中に提供される実施形態は、患者から試料を収集するための１つ以上の収集デバイス、上記のような１つ以上のセンサ、または適切なキャリア中に１つ以上のセンサを含む組成物、および必要に応じて、非結合ビリルビンの既知濃度を含む参照標準を含み得るキットを対象とする。
本明細書に提供される実施形態は、表１または２のいずれかに定義されるプローブを対象とする。
本開示の目的のために、ビリルビンは非抱合ビリルビンＩＸαのＺ，Ｚ異性体である[McDonagh AFら、光異性体：非結合ビリルビンの臨床ぺルオキシターゼ測定における錯乱因子か？Pediatrics 123： 67－76、2009］非結合ビリルビンは、血漿中で一般にアルブミンに結合していることが見出されるビリルビンとは異なる非結合Ｚ，ＺＩＸαビリルビンの水性モノマーである。
本開示の目的のために、用語「脂質」はその通常の慣用的な意味を有すると解釈され、有機溶媒に最も可溶性であるが、水相（結合されていない画分）にいくらかのレベルの溶解性を有する化合物を定義する。したがって、「脂質結合タンパク質」は脂質が本明細書で定義されるように、脂質に結合することができる任意のタンパク質を含む。
非結合分子、例えばビリルビン、脂肪酸を含む脂質、ホルモン、および代謝産物のレベルは、適切なヒトまたは動物の体液中で測定した場合、健康および疾患の診断情報を提供することができる。このような分子の非結合（本明細書中では「水相」または「遊離」濃度とも呼ばれる）濃度の決定が生理学的ホメオスタシスに関する重要な情報を提供することは、ますます明らかになっている。多くの代謝産物は疎水性分子であり、水溶性が低く、「全」濃度よりもはるかに低い非結合濃度を有し、「全」の大部分はタンパク質または細胞に結合することができる。生体液中では、非結合分子の濃度が通常の生理学的条件下で比較的一定の非結合濃度を維持するように調節されることが多い。この調節は、分子と、例えばアルブミンなどの担体タンパク質との相互作用を介して起こる。したがって、分子の大部分は、一般にアルブミンまたは他の担体に結合している。しかし、少量の分子がアルブミンから水相に解離（および再結合）することがあり、これらは結合していない分子である。
本開示の目的のために、いくつかの実施形態では「ビリルビンセンサ」がシステイン残基で２つの異なるフルオロフォアで標識された２つのｉＬＢＰであり、ここで、第１のｉＬＢＰはビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を受け、第２のｉＬＢＰはビリルビン（非応答プローブ）の存在下でその蛍光を有意に変化させない。いくつかの実施形態では、ビリルビンセンサはまた、溶液中で遊離であり、異なる分子またはポリマーに付着し、ビリルビンの存在下で第２のフルオロフォアが蛍光を変化させない第２のフルオロフォアによって提供される追加の蛍光で、システイン残基で蛍光標識されたｉＬＢＰを含んでもよい。この場合、ビリルビンに結合すると、フルオロフォアのうちの１つのみの蛍光が変化する場合、２つの波長における蛍光指数の比は異なる。このようなプローブは非結合ビリルビンの水性濃度を特異的に決定するために使用することができ、これは、そうでなければ、水溶液中でのその不十分な溶解特性のため、および他の代謝産物、特に遊離脂肪酸の存在のために困難である。蛍光応答の比率の変化は非結合ビリルビンの細胞内濃度の正確な決定に特に重要であり、非結合ビリルビンの細胞外濃度の決定の正確さおよび精度を改善するために重要である。
米国特許第7,601,510号、第9,134,317号および第9,529,003号、[Huber AHら、脂肪酸特異的蛍光プローブ、ならびにアルブミンと平衡状態にある異なる非結合遊離脂肪酸の混合物を分離する際のそれらの使用、Biochemistry,45：14263－14274, 2006］および[Huber AHおよびKleinfeld AM、ヒト血漿中の非結合遊離脂肪酸プロフィールおよび非結合パルミトオレイン酸の予期せぬ欠如、J.Lipid Res.58:578－585, 2017］は、非結合分析物の決定を可能にする高度に特異的なプローブの高スループット生成のための方法を記載している。米国特許第7,601,510号、第9,134,317号および第9,529,003号は、ビリルビン特異的プローブの開発を記載している。本明細書で提供される実施形態は、米国特許第7,601,510号、第9,134,317号、および第9,529,003号に記載されたビリルビン技術の改善に関する。本開示の実施形態は非結合ビリルビンレベルの決定のための精度および精度を改善し、この技術が異なる計測フォーマットで使用されることを可能にする。米国特許第7,601,510号、第9,134,317号、および第9,529,003号［Huberら、非結合45:ビリルビン濃度の定量化のための蛍光センサ、Clin Chem 58: 869－876、2012］に記載されているビリルビンプローブは主に、水性懸濁液中でプローブを使用し（キュベットベースの蛍光測定）、主に、希釈血漿または血清試料を使用。本明細書に開示される実施形態は、２つのプローブ、近赤外線で蛍光を発するフルオロフォアで標識されたｉＬＢＰ突然変異タンパク質を使用することによってＢｆセンサを生成する方法に関する。最初のｉＬＢＰは700nmで蛍光を発するＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドで標識され、その蛍光はＺ，Ｚビリルビンに結合すると消光される。第２のｉＬＢＰは８１９ｎｍで蛍光を発し、ビリルビンに応答しないＬＩＣＯＲ８００CW－マレイミドで標識される。ＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドとＬＩＣＯＲ８００CW－マレイミドの両方を６６０nmで励起することができる。本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、ビリルビンによる長波長プローブの消光に関する。さらに、いくつかの実施形態は、ビリルビンプローブを固体表面に付着させる方法、およびマイクロフルイディクスデバイスおよび使い捨て試料カートリッジにおいて非結合ビリルビンを測定するためにそのような組成物を使用する方法に関する。
ビリルビンセンサは血液試料中の非結合ビリルビンレベルを決定するために使用され、脂肪酸はビリルビンに類似した特性を有する血液中の最も豊富な代謝産物である。脂肪酸はアルブミンへの結合に関してビリルビンと競合し、非結合ビリルビンと同様の非結合濃度を有する。ビリルビン感受性プローブは、一般に脂肪酸に対して高い親和性を有するｉＬＢＰ突然変異体から出発して開発される。したがって、ｉＬＢＰ突然変異タンパク質プローブからビリルビンプローブを発見する第１のステップは脂肪酸に有意に応答しないプローブを同定するために、最も豊富な脂肪酸のうちの１１までを用いて300,000を超えるそのようなプローブをスクリーニングすることである。一般に、蛍光標識なしの突然変異タンパク質は、分析物結合時に測定可能なシグナルを誘発しないので、突然変異タンパク質の系統的なハイスループットスクリーニングは不可能である。ΔＲ／ΔＲＡＤＩＦＡＢ２＜０．１という知見により、10,000を超えるこのような脂肪酸非応答者（「非応答者ライブラリー」）が同定された。この定量的ベンチマークは、脂肪酸に対するこれらのプローブの親和性が一般に、ＡＤＩＦＡＢ２参照プローブよりも少なくとも１０倍小さいことを示す。これらの非応答プローブをビリルビンでスクリーニングすることにより、新たに同定された鋳型タンパク質のさらなる突然変異誘発によって、新たなムテインプローブライブラリーの生成のために使用される潜在的なビリルビンプローブおよび／または鋳型が同定される。生成されたライブラリーは脂肪酸およびビリルビンに対する応答についてスクリーニングされ、そしてビリルビンに対して最も応答性であり、そして脂肪酸に対して最も応答性でないと同定されたプローブは、ビリルビンプローブとして同定されるか、またはさらなるラウンドの突然変異誘発およびスクリーニングのための鋳型として使用され得る。これは本明細書（例えば、表１および２）に記載されるビリルビンおよび非応答性ムテインのすべてについて行われ、得られたビリルビンセンサは脂肪酸に対して有意な応答を有さない。
ビリルビンに対する有意な応答および脂肪酸に対する低い応答に対するゼロを含む有用な特性を有するとこれらの方法によって同定されたビリルビンプローブをさらに特徴付ける。ＦＦＡに結合することを手段するＦＦＡに有意に応答しないプローブは、ビリルビンに結合するよりも１０倍以上少ない。いくつかの実施形態では、ＦＦＡへの結合がビリルビンへの結合よりも１００倍少ない。これは、プローブビリルビン結合親和性および蛍光特性を決定するための較正、ならびに脂肪酸との潜在的競合を同定するためにビリルビンおよびヒト血清アルブミンを含有する水溶液中の非結合ビリルビンレベルをモニターすることを含む。脂肪酸がプローブに結合するが、蛍光の変化を生じない非応答プローブが生成され得る。この場合、血液試料中の脂肪酸はプローブへの結合についてビリルビンと競合し、それによって、非結合ビリルビンレベルの不正確な決定をもたらすかもしれない。脂肪酸との競合は、ビリルビンプローブ＋ビリルビンの蛍光応答が脂肪酸の添加によって変化するかどうかを決定することによって評価される。
ビリルビンおよびアルブミンを含む溶液中で正確なビリルビン濃度をもたらし、検出可能な脂肪酸競合を示さない、本明細書に記載の方法によって見出されるビリルビンプローブを、ヒト血液試料におけるさらなる試験のために選択する。個々の新生児および成人ドナーからの血漿試料、ならびに商業的供給源からのプールされた試料は、ビリルビンプローブがヒト血液試料中に一般に存在する非ビリルビン分析物の本質的に未知のレベルを有する試料中の正確な血清または血漿非結合ビリルビン濃度を提供するかどうかを決定するために使用される。健康な成人はビリルビンレベルが低く、ビリルビン：ＨＳＡモル比は０．１未満であり、したがって、それらのＢｆ濃度はゼロに近づく（＜１ｎＭ）。血液試料をビリルビンでスパイクし、アルブミン濃度を測定して、１ｎＭ未満である評価の検出限界（ＬＯＤ）を超えるＢｆレベルを生じる明確なビリルビン：アルブミン比を得る。次いで、種々の試料中の非結合ビリルビンの濃度をＢｆセンサで測定し、その結果をペルオキシダーゼ分析[Jacobsen JおよびWennberg、ＲＰ非結合ビリルビンの定量新生児のセラミ中の非結合ビリルビンの定量Clin Chem 20： 783、1974］と比較する。Ｂｆについて唯一のＦＤＡクリア試験、Arrows ＵＢ－２解析装置[Nakamura HおよびLee Y、黄疸性新生児血清中の非結合ビリルビンの微量定量：ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼを採用した酵素法、Clinica Chimica Acta、79（1977）411－417］を用いて実施した。Ｂｆセンサが測定した血漿非結合ビリルビン濃度とペルオキシダーゼ評価で測定したものとの同等性は、非結合ビリルビン以外の血液成分がプローブ性能に検出可能な影響を及ぼさないことを確認する。
米国特許第7,601,510号、9,134,317号および第9,529,003号は、省略されるべきタンパク質へのビリルビン結合の特徴付けの以前に必要かつ時間のかかる工程を必要とし；プローブ自体のみが特徴付けられる。これは、タンパク質の特徴付けを回避するためだけでなく、プローブの特性がリガンド－タンパク質結合特性から予測できないことが多いためにも必要であった。例えば、異なるタンパク質は非常に類似した結合親和性を有し得るが、それらの誘導体プローブの蛍光応答は変動し得る。
以前に記載されたほとんどのビリルビンプローブは主にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のリジン２７においてアクリロダンのみで標識された（米国特許第7,601,510号、第9,134,317号および第9,529,003号、ならびに［Huberら、非結合ビリルビン濃度の定量化のための蛍光センサ、Clin Chem 58:869－876、2012］を含む）。追加のビリルビンプローブを、２つの異なるフルオロフォア、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のリジン２７のアクリロダンおよびＮ末端付加物のシステインのテキサスレッドマレイミドで、２つのバージョンで標識し、一方はＫＲ１４を伴わず、他方はＫＲ１４を伴わない（「ＫＲ１４」は７Ｒ１６Ｒ２０Ｒ２９Ｒ３７Ｒ４６Ｒ５０Ｒ８８Ｒ９２Ｒ９４Ｒ１００Ｒ１２５Ｒ１２９Ｒおよび１３０Ｒを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の以下の１４表面リジンからアルギニンへの変異を指す略語であり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）に示されるような置換を有し、複数のアクリロダン標識を減少させる配列を有する）。これらのプローブはビリルビンに対する良好な親和性および応答を有し、ヒト血液試料中の非ビリルビン代謝産物によって有意に影響されなかった。しかし、ビリルビン濃度が高い検体、重症新生児高ビリルビン血症の病態[Bhutani VK and Johnson L、救急部門の黄疸にかかった新生児：核黄疸の防止、Clin Ped Emerg Med 9：149－159、2008］、および血液検体中のヘモグロビンの存在により、アクリロダンのみのプローブがビリルビンを介した興奮内部フィルター効果に悪影響を及ぼす可能性がある。アクリロダンとより長い波長のフルオロフォア（例えば、Texas Red)とを有する二重標識プローブはアクリロダンと二次フルオロフォアとの間のエネルギー移動に起因して、アクリロダン蛍光強度を著しく減少させ、このようなプローブは臨床的に重要な濃度の範囲におけるＢｆについての正確な値を得ることができない。
これらの欠点を克服するために、本明細書で提供される実施形態は、非結合ビリルビンレベルを決定するためのセンサおよび方法に関する。ビリルビンによって消光されたフルオロフォアが単一のシステイン側鎖を標識し、この側鎖の位置がビリルビン結合時の蛍光変化を最適化するために重要であることが見出されたムテインライブラリーを同定した。ビリルビンによって消光されたフルオロフォアが異なるシステイン側鎖を標識し、側鎖の位置がビリルビン結合時の蛍光変化を最適化するために重要であることが見出されているビリルビンプローブも記載されている。また、フェルスター型エネルギー移動によるビリルビン消光が起こってはならない長波長で吸収および放出するビリルビン消光性フルオロフォアも記載されている。本開示はまた、赤外線中に広がるものを含む非常に長波長のフルオロフォアのビリルビンによる蛍光消光に関する。それらの長波長吸光度および蛍光のために、そのようなフルオロフォアは、ビリルビンまたはヘモグロビン吸光度、または血液試料中に潜在的に存在する実質的に任意の他の発色団の吸光度によって影響されない。
本明細書に記載されるさらなる実施形態は、ビリルビン結合タンパク質上の単一のフルオロフォアを用いて生成され、その蛍光がビリルビンに結合すると減少し、ビリルビンに応答しないおよび／またはビリルビンに結合しないタンパク質（非応答プローブ）に結合した第２の異なるフルオロフォアを用いて生成されるビリルビン比センサを生成する方法に関する。このようなセンサは、２つの異なる波長で測定された蛍光指数の比率の変化で、プローブのタンパク質部分へのビリルビン結合に応答する。独立した第２のフルオロフォアを使用するこのタイプの比センサは、両方のフルオロフォアがタンパク質などの同じ高分子上に位置する場合に典型的に観察されるフルオロフォア間のエネルギー移動消光の問題を排除する。このような消光は、シグナル強度を大幅に低下させ、それによって、非結合ビリルビン濃度の測定の精度および精度を低下させる。このエネルギー移動の回避は、両方のフルオロフォアを同じプローブ分子に付着させないことによって達成される。
また、ポリスチレンまたはラテックスビーズなどの固体基材に付着することができるビリルビンプローブ、および使い捨てマイクロフルイディクスデバイスで使用するために表面上に固定することができるビーズも記載されている。第１および第２のフルオロフォアは、それぞれビリルビン応答性ｉＬＢＰおよびビリルビン非応答性ｉＬＢＰに付着させることができる。いくつかの実施形態では、エネルギー移動が有意でないように２つのフルオロフォアが十分に分離されたままであるように、両方のプローブを同じまたは異なる固体ビーズ基材に付着させることができ、これらのビーズを使い捨てプラスチックマイクロ流体デバイス上に固定化することができる。水性緩衝液（スラリー）中のセンサ－ビーズ複合体の混合物を、２μl未満の体積でマイクロ流体デバイスの溝に分配し、乾燥させて、約２mmの直径の円形スポットを形成し、溝の底部に付着させる。希釈されていない血液試料は、溝の入口に適用され、乾燥したビリルビンセンサスポットを横切って急速に流れ、再構成する。次いで、血液試料含有デバイスを、ビリルビン応答性プローブおよび非応答性プローブ（センサ）からの蛍光の比を測定する蛍光リーダーに配置し、そこからＢｆ濃度を計算する。
また、本明細書に記載されるビリルビンセンサを較正し、使用して、Ｂｆ濃度が、単一の工程で、約５μlの未希釈血液試料中で決定され得るようにするための方法も記載される。これらの少量の血液試料は、乾燥ビリルビン比センサを含む使い捨てプラスチックマイクロ流体カートリッジに適用される。カートリッジを含むビリルビンセンサは好ましくは単一の測定のために使用され、較正パラメータ（Ｋｄ、Ｒｍ、Ｒｏ）は同一に製造されたカートリッジの「ロット」内で決定されなければならない。較正は、十分な数のカートリッジを、明確なＢｆレベルが増加する水性試料で滴定することによって行われる。プラスチックは非結合ビリルビンに結合し、マイクロ流体チャネル内の表面対体積比が大きいので、較正Ｂｆ試料はアルブミンとの複合体によって高度に緩衝されなければならない。各複合体のＢｆ濃度は、水溶液中にフリーの較正されたセンサを使用して、キュベット蛍光光度法によって各複合体を測定することによって決定される。遊離センサはビリルビンの水溶液を用いた滴定によって較正され、これらの非結合ビリルビン溶液の濃度は吸光度によって決定される。遊離プローブの応答（Ｒ値対Ｂｆ濃度）を使用して、遊離センサの較正（Ｋｄ、Ｒｍ、Ｒｏ)(式1）を決定する。各ＢＲ：ＨＳＡ複合体の試料と混合された較正されたフリーセンサを使用して、式２を使用してキュベット蛍光測定法によって各複合体のＢｆ濃度を決定する。これらの較正された複合体は、血液試料に適した、温度、ｐＨ、および溶液組成の規定された条件下で、平衡解離定数（Ｋｄ）、最小蛍光比（Ｒｍ）および初期比（Ｒｏ）を含む使い捨てカートリッジの結合パラメータを決定するために使用される。結合等温線は、ビリルビン濃度の増加に応答したビリルビンセンサの蛍光の変化を測定することによって、水性緩衝液中で行われる（「滴定データ」）。各ビリルビン濃度における蛍光応答のセットは、Ｂｆ濃度、特異的分光特性、およびＫｄの関数として蛍光応答を正確に記述する適切な方程式（「較正方程式（3）」）に適合される。
遊離ビリルビン濃度（［Ｂｆ］）は、［Ｂｆ］がアルブミン結合平衡によって緩衝され、したがってビリルビンプローブの存在によって有意に摂動されない試料において決定される。式（2）は、Ｒｍが＞0である比率センサの［Ｂｆ］を決定するために使用される。
本明細書中に提供されるいくつかの実施形態は、非結合分析物の濃度を決定するために使用され得る蛍光タンパク質分子の開発に関する。より詳細にはいくつかの実施形態が、1）米国特許第7,601,510号、第9,134,317号、および第9,529,003号の方法によって生成されたビリルビンプローブの同定に関し、これらの方法は本明細書中に参考として明確に援用され、そしてこれらの方法の改変もまた記載され；2）臨床医学および基礎科学のためのこのようなプローブの使用に関し；または3）異なる流体中の非結合ビリルビン濃度の決定のためのこれらのプローブの例に関する。
ビリルビンプローブは、ビリルビンに結合すると蛍光指数の変化を示す１つ以上の蛍光分子（フルオロフォア）の共有結合的付加によって「標識」されたｉＬＢＰタンパク質である。いくつかの実施形態では、プローブがフルオロフォアが共有結合している単一のシステインを含む。
いくつかの実施形態では２つの異なるフルオロフォアが使用され、２つのフルオロフォアのうちの１つはビリルビン結合に応答し、ビリルビンがプローブに結合すると蛍光指数の変化を示すｉＬＢＰを標識する。第２のフルオロフォアは、ビリルビンに応答しないかまたは結合しないｉＬＢＰを標識する。第２のプローブはビリルビン結合時に２つの異なる波長における蛍光の比率の差が観察されるように、基準点を提供する。第２のプローブは、ビリルビン結合に反応しなくてもよく、または第１のフルオロフォアとは異なる様式で反応してもよい。いくつかの実施形態では、第２のフルオロフォアが第１のフルオロフォアとは異なる波長に発光点を有する。第２のフルオロフォアとして使用され得る化学染料の例としては、ＬＩ－ＣＯＲ８００ＣＷマレイミド、Ｃｙ７マレイミド、Cｙ７．５マレイミド、Vivoタグ－Ｓ７５０－Ｍ、およびAlexa Fluor７５０が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第２のフルオロフォアがＬＩ－ＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである。
いくつかの実施形態では１つのフルオロフォアがシステインに結合され、このフルオロフォアがビリルビン結合に応答性ですなわち、ビリルビンが蛍光標識されたｉＬＢＰムテインに結合する際の蛍光指数の変化を実証する、２つの異なるフルオロフォアが使用され、第２のフルオロフォアはビリルビン結合ｉＬＢＰムテインに化学的に結合されず、ｉＬＢＰムテインに結合するビリルビンに感受性ではない。第２のフルオロフォアはビリルビン結合時に２つの異なる波長における蛍光の比率の差が観察されるように、基準点を提供する。一実施形態では、第２のフルオロフォアが第１のフルオロフォアよりも長い波長に発光点を有する。第１のフルオロフォアとして使用され得る化学染料の例としては、ＬＩ－ＣＯＲ７００ＤＸマレイミド、BiotumＣＦ６８０－Ｍ、ＣＦ６８０Ｒ－Ｍ、LumiprobeＣｙ５、Ｃｙ７、Perkin Elmer Vivoタグ６４５－Ｍ、Vivoタグ６８０XL－M、Atto Tek Atto６８０、Atto７００、DyomicsＤＹ６７７、またはＤＹ６８９が挙げられるが、これらに限定されない。第２のフルオロフォアとして使用することができる化学染料の例にはLI－COR800CWマレイミドが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、第１のフルオロフォアはＬＩ－ＣＯＲ７００ＤＸマレイミドであり、第２のフルオロフォアはＬＩ－ＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである。
ｉＬＢＰ突然変異タンパク質は、それらが高い親和性で固体支持体に結合するように「タグ付け」され得る。これにはビオチン、Ｆｌａｇ－エピトープまたはｃ－ｍｙｃエピトープまたはＨＡ－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β－ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ－糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、または６ＸＨｉｓタグなどの金属親和性タグでのタグ付けが含まれるが、これらに限定されない。アフィニティータグと固体支持体材料との特異的な会合はマルチウェルプレートおよびマイクロフルイディクスデバイスを含むがこれらに限定されない、平坦な表面構成における非結合ビリルビン測定を容易にする。固体支持体へのそれらの付着のために、プローブは、制限された、効果的に二次元の領域に濃縮され得る。これにより、プローブを横切って流れる試料溶液の薄層内の非結合ビリルビンの測定が可能になり、これは、有効な二次元領域に限定される。これは、ビリルビンおよびヘモグロビンによる吸光度を減少させ、全血における測定を容易にする前面蛍光測定を有効に可能にする。親和性タグは例えば表１および２に示されるように、ＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかで、または両方の末端で同時に融合され得る。いくつかの実施形態では、６Ｘヒスチジンタグを、タンパク質のビリルビン結合特性を有意に変化させることなく、ｉＬＢＰ突然変異タンパク質のＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかに、または両方の末端で同時に融合させた。いくつかの実施形態において、融合ペプチドは、プローブのＣＯＯＨ末端における２つの分離されたヒスチジン領域から構成される。いくつかの実施形態では、プローブがＮｉ-ポリスチレンビーズを含むがこれに限定されない固体支持体上に固定化される。
いくつかの実施形態では固体支持体上に固定化されたビリルビンセンサが同じ波長で励起するが、２つの異なる波長で発光する異なるフルオロフォアで標識された２つのプローブの組み合わせである。２つのプローブのうちの１つは、ビリルビン結合に応答性であり、すなわち、ビリルビンがタンパク質に結合すると、蛍光指数の変化を示す。異なるフルオロフォアで標識された第２のプローブは、ビリルビンの結合に応答しないか、またはビリルビンに応答して第１のプローブとは異なって変化する。第２のプローブのフルオロフォアはビリルビン結合時に２つの異なる波長における蛍光の比率の差が観察されるように、基準点を提供する。いくつかの実施形態では第１のビリルビン感受性タンパク質がＬＩ－ＣＯＲ７００ＤＸマレイミドで標識され、第２のビリルビン非感受性タンパク質はＬＩ－ＣＯＲ８００ＣＷマレイミドで標識される。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、図１０Ａ～１０Ｄ、１１Ａ～１１Ｄ、および１２に示されるような、Ｂｆセンサを含む使い捨て試料カートリッジに関する。試料を添加した後、カートリッジを蛍光リーダーに入れ、試料のＢｆ濃度を測定する。いくつかの実施形態において、カートリッジは図１０Ａ～１０Ｄおよび１１Ａ～１１Ｄにおけるように、ポリスチレンベースおよびアクリルレンズから構成される。いくつかの実施形態では、センサが表１からのビリルビン感受性ｉＬＢＰ、表２からのＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドおよび非応答ｉＬＢＰ、ＬＩＣＯＲ８００ＣＷ－マレイミドから構成され、２つのプローブは別個のビーズ上または同じビーズ上のいずれかでＮｉ－ＮＴＡポリスチレンビーズ（例えば、ダイナール１μmＮＴＡビーズ）に結合される。いくつかの実施形態はヘモグロビンおよび／または溶血物からの干渉を低減するのを助けるために、表４からのペプチドを、結合したプローブを有するＮｉ－ＮＴＡポリスチレンビーズに添加する。プローブおよびペプチド標識ビーズを水性緩衝液中に懸濁してスラリーを形成し、これを２５０～２０００nL容量の液滴としてポリスチレン基板に分配する。Ｂｆセンサビーズのこのスポットを乾燥させ、次いで、乾燥したセンサスポットを含むチャネルを形成するアクリルレンズによって封入する。いくつかの実施形態では、ポリスチレン基板がセンサスラリーを適用する前にＵＶ照射で処理される。いくつかの実施形態では、約１８５nmの波長でのＵＶ照射がポリスチレンビーズセンサを固定し、ポリスチレン基板上に明確に画定された円形センサスポットを形成するために、２５４nmの照射よりも優れている。いくつかの実施形態ではセンサスポットが乾燥された後、プラズマ処理されたアクリルレンズは幅２．７mm、高さ０．１mm、および長さ１３．７mm（総体積＝３．７μl）の密封溝を形成するポリスチレン基板上にスナップ留めされる。次いで、試料はレンズの試料ポートに適用され、これは、チャネルを迅速に満たし、そして乾燥されたセンサを再構成する。
いくつかの実施形態では、カートリッジがマイクロ流体デバイスであり、ポリスチレン基板と、アクリルレンズと、ビリルビン応答性プローブ、非応答性プローブ、およびそれに固定化された抗ヘモグロビンペプチドを有する基材とを含む。いくつかの実施形態では、ポリスチレン基板がダークグレー基板など、６６０nmの励起光の反射強度を低減するように構成された暗色を有する材料を含む。いくつかの実施形態では、基質がプローブおよび／または抗ヘモグロビンペプチドが付着しているビーズである。いくつかの実施形態において、ビーズは２μL未満の体積のスラリーとして、基板上の規定された領域に適用され、次いで、例えば、光処理によって硬化させられる。いくつかの実施形態では、基板が約１４５nm～約２２５nmの範囲の波長のＵＶ光で処理され、それによって、基材のポリマー鎖でポリスチレンポリマー鎖を光処理する。いくつかの実施形態では硬化（光処理）後、乾燥センサは約２mmの直径を有するスポットなどのスポットをカートリッジ上に形成する。いくつかの実施形態では、レンズがベース上の位置に配置され、試料ポートからセンサを数mm超えたところまでチャネルを形成する（図１０Ａ～１０Ｄ、１１Ａ～１１Ｄ、および１２）。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイス（カートリッジ）が乾燥剤を含むSteriflex W1Fパウチ内に配置される。
図１０Ａ～１０Ｄは、カートリッジの基板の一実施形態の複数の図を示す。図１０Ａは、カートリッジベース１０００の上面図を示す。カートリッジベース１０００は、基板を含む開放領域１０１０を含む。カートリッジ基板１０００は、カートリッジを把持するため、および／またはカートリッジを読取装置に挿入または取り外すためを含む、取扱いのためのリブ１０２０を含むことができるハウジングをさらに含むことができる。カートリッジ基板１０００は、例えばポリスチレンを含む任意の適切な材料から調製することができる。いくつかの実施形態では、ベース１０００がダークグレー基板など、６６０nmの励起光の反射強度を低減するように構成された暗色を有する材料を含む。いくつかの実施形態では、基板の開放領域１０１０が約１４５nm～約２２５nmの範囲の波長のＵＶ光で処理される。いくつかの実施形態では、光処理がポリスチレンポリマー鎖を基材との反応に対して光不安定にする。いくつかの実施形態では光処理に続いて、基板は開口領域１０１０内の特定の領域で基材を基板に結合する、基板の光処理された領域と接触される。基材は、本明細書に開示される任意の基材を含むことができる。
図１０Ｂは基板を載置することができる開口領域１０１０を有し、リブ１０２０を含むカートリッジベース１０００の側面図を示す。図１０Ｃは、カートリッジベース１０００の底面図を示す。図１０Ｄは開口領域１０１０の拡大断面図を描いており、ベースカートリッジ１０００のレンズへの結合時に押しつぶされるリブ１０３０を描いている。
図１１Ａ～図１１Ｄは、カートリッジベース１０００に結合するように構成されたレンズ１１００の実施形態の多面図を示す。図１１Ａは、試料ポート１１０５、流体流路１１１０、およびビリルビンセンサ１１１５を含むレンズ１１００の上面図を示す。図１１Ｂは、レンズ１１００の側面図を示す。図１１Ｂに示されるように、レンズ１１００は試料ポート１１０５と、カートリッジベース１０００に結合し、流体流路１１１０を形成し、流体の漏れを防ぐためにカートリッジをシールするように構成された挿入部分１１２０とを含む。図１１Ｃは、レンズ１１００および流体流路１１１０の底面図を示す。図１１Ｄは、試料ポート１１０５および流体流路１１１０を示すレンズ１１００の断面図を示す。
レンズ１１００は、カートリッジ基板１０００の開放領域１０１０に結合するようなサイズおよび形状に構成される。結合すると、レンズはカートリッジベースのリブ１０３０を押しつぶし、それによって、カートリッジを密閉し、それによって、カートリッジからの流体の漏出を防止する。さらに、レンズ１１００をカートリッジベース１０００に結合することにより、流体流路１１１０が形成され、流体流路を通って試料ポート１１０５に入り、流体が基材へ流れる。
いくつかの実施形態では、流体流路が試料中のビリルビンの正確な測定のための特定のサイズおよび寸法である。いくつかの実施形態では、流体流路の表面対体積比は大きく、希釈されていない試料中のビリルビンを測定するのに十分である。いくつかの実施形態では、試料が全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液、またはリンパ液の無希釈試料などの無希釈試料である。いくつかの実施形態では、カートリッジが０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０μLなど、０．５μL未満から１０μLを超える範囲の量の試料を受け取るように構成される。
いくつかの実施形態では、カートリッジが平衡状態で試料を測定するように構成される。市販されているような従来の測定装置および／またはシステムは、平衡状態ではないビリルビンを測定することができる。しかしながら、本発明のカートリッジは、平衡状態で試料中のビリルビンを測定するように構成されている。
いくつかの実施形態では、カートリッジが追跡可能性を通じてビリルビン測定の精度を改善するように構成される。追跡可能性は例えば、本明細書中に記載されるプローブを較正するために使用される、Sigmaから得られる標準的なビリルビン試料を使用することによって、実施され得る。次いで、較正されたプローブを使用して、ビリルビン－ヒト血清アルブミン複合体のセットを較正する。次いで、較正された複合体を使用して、カートリッジロットを較正する（本明細書中で実施例においてより詳細に記載されるように）。
本明細書で提供されるいくつかの実施形態は、試料含有カートリッジが挿入されるカスタムQiagen LR3蛍光リーダーに関する。読取装置は６６０nmの励起光源を用いてセンサを横切って走査し、センサの前後からの蛍光（バックグラウンド強度）を測定することによっても、試料自体からの任意の蛍光を含む、７００ｎｍおよび８１９ｎｍの蛍光強度を測定する。リーダーは測定された蛍光強度を使用してＲ値を形成し、式（2）を使用してＢｆ濃度を計算する。各カートリッジは乾燥剤を含む密封されたパウチ内に保管することができ、較正パラメータを含むバーコードがパウチ上に印刷され、読取装置によって走査される。試料をカートリッジに適用し、それをリーダーに挿入した後、Ｂｆは約９０秒で表示され得る。
センサの使用
いくつかの実施形態では、非結合ビリルビンの測定に使用される試料がヒト、動物または植物に由来する流体試料である。いくつかの実施形態では、流体が全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパである。他の実施形態では、非結合ビリルビンの決定がセンサを細胞にマイクロインジェクションまたは他の方法でトランスフェクトすることによって、細胞の細胞質内で行われるか、または細胞もしくは組織切片の細胞外媒体中で行われる。
いくつかの実施形態では、非結合ビリルビンの測定に使用される試料がヒト、動物または植物に由来する流体試料である。いくつかの実施形態では、流体が全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液またはリンパである。他の実施形態では、非結合ビリルビンの決定がセンサを細胞にマイクロインジェクションまたは他の方法でトランスフェクトすることによって、細胞の細胞質内で行われるか、または細胞もしくは組織切片の細胞外媒体中で行われる。
非結合型ビリルビンの範囲は健康な集団から決定されることがあり、この正常範囲からの逸脱は疾患を示すことがある。
ゼロＲｍを有する非結合ビリルビンセンサは米国特許第9,529,003号および[Huberら、非結合ビリルビ濃度の定量化のための蛍光センサ、Clin Chem 58： 869－876、2012］に記載されているように、［Ｂｆ］の測定のために較正および使用することができる。Ｒｍ＞0のプローブの較正および使用の方法は、本明細書において、式（1-3）（較正）およびＢｆ、式（2）の計算において初めて記載される。
非結合型ビリルビンセンサは過剰なビリルビンを排除するには肝機能が不十分であるため、全新生児の８０％など、ビリルビンを介した毒性のリスクがある患者のＢｆの測定に用いられる［Bhutaniら、重度の新生児高ビリルビン血症の退院前スクリーニングでは光線療法を必要とする乳児が同定される、J Pediatr 2013； 162： 47782］。
非結合型ビリルビンセンサは、溶血性疾患患者、油性乳剤の点滴静注を受けている患者、アルブミンからビリルビンを置換する可能性のある薬剤を投与されている患者、並びに未熟児に多い敗血症等、アルブミンに対するビリルビンの結合親和性が低下しＦＦＡ濃度が上昇することによりＢｆが上昇する可能性のある疾患患者［Nogueiraら、敗血症患者における血漿遊離脂肪酸濃度の変化は心臓障害および心拍変動の減少と関連する、Shock 29： 342－348、2008、［Hegyiら、未熟児において、大豆脂質注入が非結合型遊離脂肪酸および非結合型ビリルビンに及ぼす影響、J Pediatr 2017; 184: 45－50］。
非結合型ビリルビンセンサは、光線療法、輸血またはビリルビン毒性を低減するように設計された他の療法を受けている患者におけるＢｆの測定のために使用され得る。
総ビリルビンではなく非結合型ビリルビンに毒性があるため、光線療法中は総ビリルビンではなく非結合型ビリルビンをモニタリングし、非結合型ビリルビンが有意に減少することを確認してもよい。総ビリルビンは光線療法に反応して減少することが示されているが、ＦＦＡや新生児に処方されるある種の薬物などのビリルビン置換分子が存在する場合、総ビリルビンと非結合ビリルビンはほぼ完全に切り離されることがある。このような条件下では、非結合型ビリルビン値を非毒性と考えられる値まで低下させるには実質的に総ビリルビンを完全に破壊する必要があると考えられる。このように、積極的な治療を行っても現在達成されているよりもはるかに低い総ビリルビン値が必要となるのであろう［Hegyiら、Intralipidで治療された早産児の非結合型遊離脂肪酸は、総ビリルビンから非結合型遊離脂肪酸を切り離し、光線療法が無効となる可能性がある、Neonatology 2013； 104： 184－187およびHegyiら、早産児における非結合型遊離脂肪酸および非結合型ビリルビンに対する大豆脂質注入の影響、J Pediatr 2017; 184: 45－50］。さらに、この試験はビリルビンまたは抱合ビリルビンの光異性体と「天然の」非抱合ＩＸ－α（Ｚ，Ｚ）異性体とを区別しないので、ペルオキシダーゼ評価は、光線療法中に非結合ビリルビンをモニターするために使用することができない。対照的に、本出願に記載されるＵＢCheckセンサで測定される非結合ビリルビンは、天然の非共役IX－α（Ｚ，Ｚ）異性体に特異的である。
非結合ビリルビンを決定するために現在使用されている唯一の方法は、ビリルビンの西洋ワサビペルオキシダーゼ酸化に基づく[Jacobsen JおよびWennberg RP、新生児血清中の非結合ビリルビンの決定、Clin Chem 20: 783, 1974］。ペルオキシダーゼ評価の実施は、ＦＤＡ承認評価(Arrows Ltd、大阪、日本）を使用して入手可能である。正確な非結合ビリルビン測定を複雑にするArrows方法[Ahlfors CE、血漿非結合非抱合ビリルビンの測定 Anal Biochem, 279: 130－135, 2000; Ahlforsら、早産新生児での非結合ビリルビンの試料希釈、パーオキシターゼ共摂食および塩素イオンの影響、Clin Biochem 40: 261－267, 2007］の問題から、黄疸新生児で一般的である。重要なことに、複数の比較的大きな試料容量（２０～２５μＬ）の血漿または血清が、ArrowsＵＢ解析装置UA－2を用いてＢｆを測定するために必要とされる。さらに、試料を５２倍に希釈するArrows評価は、平衡非結合ビリルビン濃度を決定せず、Arrows法［Ahlforsら未熟児における非結合ビリルビンの測定に対する試料希釈、ペルオキシダーゼ濃度、および塩化物イオンの影響、Clinical Biochemistry 40 （2007） 261－267; Ahlforsら、非結合(フリー)ビリルビン: 新生児黄疸を評価するためのパラダイムの改善、.Clinical Chemistry 55：7 1288－1299 （2009）］を用いた干渉物質の補正が必要である。
本明細書で提供される実施形態は、単一ステップで非結合ビリルビンを測定するための方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法がペルオキシダーゼArrows法の欠点を克服する。いくつかの実施形態では、本方法が希釈されていない血液試料中の平衡非結合ビリルビン濃度の直接モニタリングを可能にする、蛍光標識された変異脂肪酸結合タンパク質（非結合ビリルビンセンサ）を使用する。プローブは非抱合ビリルビンのＺ，Ｚ異性体に特異的であり、Ｚ，Ｚ異性体ビリルビンに高い親和性で結合することができる。さらに、非結合ビリルビンセンサは、非結合ビリルビンに対して高度に特異的であり得、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、ビリルビンの光異性体、抱合ビリルビン、他の代謝産物、および血液中に存在するほとんどの薬物に応答しないか、または有意に結合しない。非結合型ビリルビンセンサはビリルビン神経毒性の潜在的リスクを評価し、それによりこのような毒性の結果を防止するために正確に治療を指示するために、新生児を含む黄疸患者における非結合型ビリルビンレベルを決定するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、方法がビリルビン神経毒性のリスクの結果に基づいて、ビリルビン神経毒性を有するか、または罹患しているものとして選択または同定された被検体に治療または治療を施すことをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療または治療は、光線療法、交換輸血、静脈内免疫グロブリン治療（ＩＶＩｇ）、またはビリルビン阻害剤による薬物治療である。いくつかの実施形態では、光線療法治療または治療が青緑色スペクトルの光を放出するランプへの暴露を含み、光への暴露はビリルビン排泄を増加させる。いくつかの実施形態では、交換輸血が血液を繰り返し抜き取り、それをドナーからの血液などの影響を受けていない血液で置き換えることを含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＩｇ治療または治療がビリルビン神経毒性に罹患している対象の血液中の抗体のレベルを低下させることができる血液タンパク質の静脈内輸血を含む。他の治療または治療は例えば、胆管閉塞の治療または阻害または改善、感染性原因または遺伝的障害（例えば、Crigler－NajjarおよびGilbert症候群）の治療または阻害または改善を含む、ビリルビン神経毒性の基礎原因の治療または阻害を含み得る。
実施形態は、以下の実施例においてさらに定義される。これらの実施例は、例示のためにのみ与えられることが理解されるべきである。上記の議論およびこれらの実施例から、当業者は本明細書に記載された実施形態の特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、実施形態に様々な変更および修正を加えて、それを様々な用途および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され、説明されたものに加えて、実施形態の様々な修正が、前述の説明から当業者には明らかになるのであろう。また、そのような変更は添付の特許請求の範囲内に該当する。本明細書に記載された各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書で参照される開示のためのものである。
実施例１
野生型腸脂肪酸結合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の突然変異によって産生されるビリルビン感受性（応答）プローブおよび非応答プローブの配列
ラット由来の野生型腸脂肪酸結合タンパク質(ＷＴ ｒＩＦＡＢＰ)は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有する。表１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２４～９８位の単一置換システインで標識されたＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドを有するＢｆ感受性プローブを示す。さらに、表１に列挙される各プローブは、Ｎ末端ＭＧＩを有する。Ｂｆ応答性プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒおよび１３０Ｒ（ＫＲ１４）である１４個の接近可能なリジンで１４個のアルギニンの置換を有する。ＫＲ１４の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。応答性および非応答性変異体はＣ末端ダブルＨＩＳタグリンカー、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ (Ｃ２ＸＨ１１; ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３)を有する。従って、表１に列挙される各プローブは、表に示されるさらなる置換および付加に加えて、Ｎ末端ＭＧＩ－ＫＲ１４－Ｃ２ＸＨ１１を含む。
野生型腸脂肪酸結合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）の突然変異によって産生されるビリルビン感受性（応答）プローブおよび非応答プローブの配列
ラット由来の野生型腸脂肪酸結合タンパク質(ＷＴ ｒＩＦＡＢＰ)は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有する。表１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２４～９８位の単一置換システインで標識されたＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドを有するＢｆ感受性プローブを示す。さらに、表１に列挙される各プローブは、Ｎ末端ＭＧＩを有する。Ｂｆ応答性プローブは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の７Ｒ、１６Ｒ、２０Ｒ、２９Ｒ、３７Ｒ、４６Ｒ、５０Ｒ、８８Ｒ、９２Ｒ、９４Ｒ、１００Ｒ、１２５Ｒ、１２９Ｒおよび１３０Ｒ（ＫＲ１４）である１４個の接近可能なリジンで１４個のアルギニンの置換を有する。ＫＲ１４の配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示す。応答性および非応答性変異体はＣ末端ダブルＨＩＳタグリンカー、Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｈｉｓ (Ｃ２ＸＨ１１; ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３)を有する。従って、表１に列挙される各プローブは、表に示されるさらなる置換および付加に加えて、Ｎ末端ＭＧＩ－ＫＲ１４－Ｃ２ＸＨ１１を含む。
実施例２
Ｂｆ結合特性に非フルオロフォア位置の影響とノンレスポンダー蛋白質の発光スペクトルに非突然変異の影響
表１および２のＬＩＣＯＲ８００CW－マレイミドプローブで標識されたＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドおよび非応答プローブで標識されたすべての応答プローブは、それぞれ、Ｂｆに対する定性的に類似した依存性を有する。プローブは、タンパク質発現、結合パラメータ（Ｋｄ、ＲｏおよびＲｍ）および安定性において大部分が異なる。ＫｄおよびＲｍに対する異なる突然変異タンパク質およびフルオロフォア標識位置の効果は、好ましい応答プローブがビリルビン結合によってプローブが消光される程度を示し、低いＫｄおよび／または低いＱｓ（Ｑｓ=Ｒｍ/Ｒｏ）を有するものであり得ることを示す（表３）。非応答者はビリルビン結合パラメータによって特徴付けられないが、８００ＣＷ－マレイミドの発光スペクトルはＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミド強度を変化させることができる特異的置換に感受性である。例えば、７００ＤＸ－マレイミドの非存在下では、多くの初期非応答性突然変異体が８１９nmに対して７００nmでの発光の時間依存性増加を明らかにした。これらの突然変異体のいくつかでは、７００～８１９nmの比が４℃での貯蔵中に約１％～２０％まで増加した。適当な突然変異により、この不安定性は排除された。例えば、Mut:ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ｂ 表２のＣ７３は、１日目および６日目で同じ７００／８１９比（1％）を示した。
Ｂｆ結合特性に非フルオロフォア位置の影響とノンレスポンダー蛋白質の発光スペクトルに非突然変異の影響
表１および２のＬＩＣＯＲ８００CW－マレイミドプローブで標識されたＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミドおよび非応答プローブで標識されたすべての応答プローブは、それぞれ、Ｂｆに対する定性的に類似した依存性を有する。プローブは、タンパク質発現、結合パラメータ（Ｋｄ、ＲｏおよびＲｍ）および安定性において大部分が異なる。ＫｄおよびＲｍに対する異なる突然変異タンパク質およびフルオロフォア標識位置の効果は、好ましい応答プローブがビリルビン結合によってプローブが消光される程度を示し、低いＫｄおよび／または低いＱｓ（Ｑｓ=Ｒｍ/Ｒｏ）を有するものであり得ることを示す（表３）。非応答者はビリルビン結合パラメータによって特徴付けられないが、８００ＣＷ－マレイミドの発光スペクトルはＬＩＣＯＲ７００ＤＸ－マレイミド強度を変化させることができる特異的置換に感受性である。例えば、７００ＤＸ－マレイミドの非存在下では、多くの初期非応答性突然変異体が８１９nmに対して７００nmでの発光の時間依存性増加を明らかにした。これらの突然変異体のいくつかでは、７００～８１９nmの比が４℃での貯蔵中に約１％～２０％まで増加した。適当な突然変異により、この不安定性は排除された。例えば、Mut:ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ｂ 表２のＣ７３は、１日目および６日目で同じ７００／８１９比（1％）を示した。
実施例３
ビリルビン応答性（７００nm）および非応答性（８００nm）プローブの蛍光の変化およびそれらの比（７００／８００）
図１はビリルビン応答性ＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドＭｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－７６Ｃプローブ（表１）およびビリルビン非応答性ＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドＭｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ｂ－７３Ｃプローブ（表２）から構成されるＢｆセンサの強度および強度比を示し、両方とも水性緩衝液中で遊離であり、使用される濃度では主に非結合ビリルビン（Ｂｆ）であるＢＴ(総ビリルビン）が増加している。６７５nm励起での７１０および８０５nm強度の測定を、Horiba Fluorolog２において、それぞれ１．５nMおよび１０nMのプローブ濃度で行った。結果は、ビリルビン感受性ｉＬＢＰに付着したＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミド強度（７１０nmで測定）の単調減少、および非応答ｉＬＢＰに付着したＬＩＣＯＲ８００CWマレイミド（８０５nmで測定）の強度変化の欠如（cv＝２．５％）を示す。インサートは、７１０／８０５比の挙動を示す。
ビリルビン応答性（７００nm）および非応答性（８００nm）プローブの蛍光の変化およびそれらの比（７００／８００）
図１はビリルビン応答性ＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドＭｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－７６Ｃプローブ（表１）およびビリルビン非応答性ＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドＭｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ Ｂ－７３Ｃプローブ（表２）から構成されるＢｆセンサの強度および強度比を示し、両方とも水性緩衝液中で遊離であり、使用される濃度では主に非結合ビリルビン（Ｂｆ）であるＢＴ(総ビリルビン）が増加している。６７５nm励起での７１０および８０５nm強度の測定を、Horiba Fluorolog２において、それぞれ１．５nMおよび１０nMのプローブ濃度で行った。結果は、ビリルビン感受性ｉＬＢＰに付着したＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミド強度（７１０nmで測定）の単調減少、および非応答ｉＬＢＰに付着したＬＩＣＯＲ８００CWマレイミド（８０５nmで測定）の強度変化の欠如（cv＝２．５％）を示す。インサートは、７１０／８０５比の挙動を示す。
実施例４
キュベット蛍光法によるフリーＮＩＲ比センサの較正
水性緩衝液中に遊離した、それぞれ表１および２からのＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミド標識ビリルビン感受性ｉＬＢＰ(Ｍｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－７６Ｃ）およびＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミド非応答性ｉＬＢＰ(Ｍｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１Ｂ－７３Ｃ）からなるＢｆセンサを、ｐＨ１２の水性緩衝液中に可溶化したSigmaビリルビン（Cat：B4126）のストック溶液からの漸増濃度で滴定した（図２）。ＢＴ濃度は、４４１nmでの吸光度によって決定した。各ビリルビン濃度で、６６０nmで励起された蛍光、ならびに７００nmおよび８０５nmでの発光の測定値を使用して、バックグラウンドから７００～８０５発光を引いた比（Ｒ）を決定した。滴定の各段階でのキュベット中の総ビリルビンＢＴは可溶性であり、センサに結合する部分を除く総遊離ビリルビンである。得られた滴定曲線（Ｒ対ＢＴ)(図２）への最小二乗フィットを、プローブ結合ビリルビンを考慮する式（1）を用いて行う。この手順では、その校正パラメータ（Ｋｄ、Ｒｍ、およびＲｏ）を決定することによって、フリープローブを校正する。この場合のフィットの結果は、１２．４±０．４ｎＭのＫｄ、３．０２のＲｏの０．４２のＲｍ、および０．１３９±０．００７のＲｍ／ＲｏであるＱｓであった。
キュベット蛍光法によるフリーＮＩＲ比センサの較正
水性緩衝液中に遊離した、それぞれ表１および２からのＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミド標識ビリルビン感受性ｉＬＢＰ(Ｍｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－７６Ｃ）およびＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミド非応答性ｉＬＢＰ(Ｍｕｔ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１Ｂ－７３Ｃ）からなるＢｆセンサを、ｐＨ１２の水性緩衝液中に可溶化したSigmaビリルビン（Cat：B4126）のストック溶液からの漸増濃度で滴定した（図２）。ＢＴ濃度は、４４１nmでの吸光度によって決定した。各ビリルビン濃度で、６６０nmで励起された蛍光、ならびに７００nmおよび８０５nmでの発光の測定値を使用して、バックグラウンドから７００～８０５発光を引いた比（Ｒ）を決定した。滴定の各段階でのキュベット中の総ビリルビンＢＴは可溶性であり、センサに結合する部分を除く総遊離ビリルビンである。得られた滴定曲線（Ｒ対ＢＴ)(図２）への最小二乗フィットを、プローブ結合ビリルビンを考慮する式（1）を用いて行う。この手順では、その校正パラメータ（Ｋｄ、Ｒｍ、およびＲｏ）を決定することによって、フリープローブを校正する。この場合のフィットの結果は、１２．４±０．４ｎＭのＫｄ、３．０２のＲｏの０．４２のＲｍ、および０．１３９±０．００７のＲｍ／ＲｏであるＱｓであった。
実施例５
ビリルビン－アルブミン（ＨＳＡ）錯体の較正
Ｂｆ試験カートリッジを較正するために、高度に緩衝化されたＢｆ濃度を増加させた一連の水性試料を調製する。高度に緩衝化されたＢｆ試料は、そのＢｆ濃度がカートリッジの溝の壁へのビリルビン結合によっても、溝中の乾燥ビリルビンプローブへの結合によっても影響されないものである。ＨＳＡ（ＢＲ：ＨＳＡ）に結合したビリルビンと４００～１０００μMの濃度のＨＳＡとの複合体は、ビリルビン壁結合が無視できる場合に較正されたレベルからＢｆが変化しないままである試験カートリッジ中のＢｆ濃度を緩衝またはクランプするのに十分である。ＢＲ：ＨＳＡ複合体は、典型的には０．０５～０．１の段階で０．１～１．０のモル比でビリルビン対ＨＳＡで調製される。複合体はキュベット中の各複合体によって生成されたＢｆ濃度を、各無希釈複合体に、実施例４のように較正された遊離Ｂｆセンサを約１～２０ｎＭで添加することによって測定することによって較正される。典型的には、Ｂｆ値がＢＲ：ＨＳＡが０から０．９に増加することにつれて指数関数的に増加し、ここで、０．１から始まり、Ｂｆは２から３００ｎＭに増加する（図３）。
ビリルビン－アルブミン（ＨＳＡ）錯体の較正
Ｂｆ試験カートリッジを較正するために、高度に緩衝化されたＢｆ濃度を増加させた一連の水性試料を調製する。高度に緩衝化されたＢｆ試料は、そのＢｆ濃度がカートリッジの溝の壁へのビリルビン結合によっても、溝中の乾燥ビリルビンプローブへの結合によっても影響されないものである。ＨＳＡ（ＢＲ：ＨＳＡ）に結合したビリルビンと４００～１０００μMの濃度のＨＳＡとの複合体は、ビリルビン壁結合が無視できる場合に較正されたレベルからＢｆが変化しないままである試験カートリッジ中のＢｆ濃度を緩衝またはクランプするのに十分である。ＢＲ：ＨＳＡ複合体は、典型的には０．０５～０．１の段階で０．１～１．０のモル比でビリルビン対ＨＳＡで調製される。複合体はキュベット中の各複合体によって生成されたＢｆ濃度を、各無希釈複合体に、実施例４のように較正された遊離Ｂｆセンサを約１～２０ｎＭで添加することによって測定することによって較正される。典型的には、Ｂｆ値がＢＲ：ＨＳＡが０から０．９に増加することにつれて指数関数的に増加し、ここで、０．１から始まり、Ｂｆは２から３００ｎＭに増加する（図３）。
実施例６
ＢＲ：ＨＳＡ複合体による試験カートリッジの較正
「ロット」と呼ばれる、例えば５００～２０００またはそれ以上の所与の期間に製造されるかなりの数の試験カートリッジは各ビリルビン－アルブミン複合体が複製カートリッジに適用され得るように、十分な数のカートリッジをランダムに選択することによって較正される。ロットの単一の較正は、各複合体の少なくとも３回の測定を必要とし、これは、ＢＲ：ＨＳＡステップサイズに依存して、３３～６０カートリッジの範囲である。各カートリッジは、単一の測定にのみ使用され、廃棄される。各カートリッジおよび各複合体からの測定されたＲ値はカートリッジロットのＲｏ、Ｋｄ、およびＲｍを得るために、式２を用いて最小二乗法によってフィッティングされる。ＢＲ：ＨＳＡ複合体を使用するカートリッジ較正の例は、見かけのＫｄおよびＱｓが遊離プローブパラメータと同様であり得るか、またはそれより大きくなり得ることを明らかにする（図３）。Ｋｄの増加は、カートリッジ上のプローブ－ビーズを乾燥させる際のプローブの隣接する表面との固定化および相互作用の結果であり得る。
ＢＲ：ＨＳＡ複合体による試験カートリッジの較正
「ロット」と呼ばれる、例えば５００～２０００またはそれ以上の所与の期間に製造されるかなりの数の試験カートリッジは各ビリルビン－アルブミン複合体が複製カートリッジに適用され得るように、十分な数のカートリッジをランダムに選択することによって較正される。ロットの単一の較正は、各複合体の少なくとも３回の測定を必要とし、これは、ＢＲ：ＨＳＡステップサイズに依存して、３３～６０カートリッジの範囲である。各カートリッジは、単一の測定にのみ使用され、廃棄される。各カートリッジおよび各複合体からの測定されたＲ値はカートリッジロットのＲｏ、Ｋｄ、およびＲｍを得るために、式２を用いて最小二乗法によってフィッティングされる。ＢＲ：ＨＳＡ複合体を使用するカートリッジ較正の例は、見かけのＫｄおよびＱｓが遊離プローブパラメータと同様であり得るか、またはそれより大きくなり得ることを明らかにする（図３）。Ｋｄの増加は、カートリッジ上のプローブ－ビーズを乾燥させる際のプローブの隣接する表面との固定化および相互作用の結果であり得る。
実施例７
単一工程使い捨てカートリッジ
単一工程使い捨てカートリッジは、本発明の必須構成要素である。カートリッジは患者の血液試料を添加して、カートリッジをリーダに挿入する際に、Ｂｆの測定に必要な全ての構成要素を含む。新生児の体重は４００ｇ程度と少なく、Ｂｆの測定には非常に少ない血液量を用いることが必須である。使い捨てカートリッジの最小試料容量は３．８μlである。さらに、全血、ならびに血漿、血清および他の流体が測定されるので、励起光路および放出光路の光路長は、可能な限り短くなければならない。これらの考察は、図１０Ａ～１０Ｄおよび１１Ａ～１１Ｄに示されるカートリッジの開発につながった。この装置では、試料がポートに加えられ、溝の中心にビリルビンセンサスポットを含むカートリッジベース上にスナップ留めされたアクリルレンズによって形成された溝を満たす。得られた溝は、０．１ｍｍの高さ、２．７ｍｍの幅、および３．８μLの試料容量を収容する１４ｍｍの長さを有する。
単一工程使い捨てカートリッジ
単一工程使い捨てカートリッジは、本発明の必須構成要素である。カートリッジは患者の血液試料を添加して、カートリッジをリーダに挿入する際に、Ｂｆの測定に必要な全ての構成要素を含む。新生児の体重は４００ｇ程度と少なく、Ｂｆの測定には非常に少ない血液量を用いることが必須である。使い捨てカートリッジの最小試料容量は３．８μlである。さらに、全血、ならびに血漿、血清および他の流体が測定されるので、励起光路および放出光路の光路長は、可能な限り短くなければならない。これらの考察は、図１０Ａ～１０Ｄおよび１１Ａ～１１Ｄに示されるカートリッジの開発につながった。この装置では、試料がポートに加えられ、溝の中心にビリルビンセンサスポットを含むカートリッジベース上にスナップ留めされたアクリルレンズによって形成された溝を満たす。得られた溝は、０．１ｍｍの高さ、２．７ｍｍの幅、および３．８μLの試料容量を収容する１４ｍｍの長さを有する。
これらの寸法を維持するためには、成形における高い公差が必要である。この装置の重要かつ新規な構成要素は、ポリスチレンベース上に透明アクリルレンズを単にスナップ留めすることによって、乾燥したＢｆビリルビンセンサ－ポリスチレンビーズ上に密封溝を形成する能力である（図１０Ａ～１０Ｄ、１１Ａ～１１Ｄ、および図１２）。これは、レンズが所定の位置にスナップされると、レンズがベースに楕円形の溝を作り、ベースの表面の下にある押しつぶしリブに押し付けることによって密封されたチャネルを形成することによって達成される。ビリルビンセンサスポット上の試料の迅速な毛管流動を達成するために、アクリルレンズは、ＮＩＲにおけるその光学的透明性を損なうことなくレンズの親水性を増加させるレベルでＯ２プラズマで処理される。さらに、ポリスチレンベースはその親水性を増加させ、迅速な毛管流動を増強し、そしてセンサスポットサイズを調節するために、ＵＶ放射線で処理される。ＵＶ照射はまた、ビリルビンセンサのポリスチレンビーズがポリスチレン基板にしっかりと付着することを可能にするために重要である。２５４ｎｍでのＵＶ照射はポリマー結合を破壊し、それによって対向する表面のポリマー鎖のインターカレーションを可能にし、表面間の結合親和性を増加させることが示されている。[Maedaら、ポリマー表面上のポリマーの粘着力と摩擦メカニズム Science(2002）297、379382］。２５４ｎｍ源からの照射は、ポリスチレン表面間の結合親和性を増加させる。しかしながら、接着の程度は２５４ｎｍバルブの寿命に非常に敏感であり、照射時間は６０分より長くすることができる。本出願の発明は典型的な２５４nmバルブがまた、１８５ｎｍ放射線の低レベルを生成するという発見であり、１８５ｎｍ放射線が、増加したポリマー接着の主な原因であることを示唆する。１８５ｎｍ光源への切り替えは、照射距離に応じて、露光時間を数秒または数分に短縮する。さらに、１８５±４０ｎｍ照射カートリッジ上にセンサをスポットすることにより、より均一なスポット形状が得られる。したがって、いくつかの実施形態では、波長が１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、または２２５ｎｍなどの約１４５ｎｍから約２２５ｎｍの範囲、または前述の値のいずれか２つによって定義される範囲内の波長である。
カートリッジ表面に取り付けられたＢｆセンサは米国特許第9,529,003号に記載された完全にクエンチされたセンサとは対照的に、ビリルビンによって不完全にクエンチされる。例えば、米国特許第9,529,003号は「使い捨てカートリッジ」のウェルに固定化された、Ｎｉ－アガロースビーズに付着したＨＩＳタグおよびポリスチレンタグ（ＰＳ）を有するビリルビンプローブを記載しているが、そのようなカートリッジの詳細はない。米国特許第9,529,003号の図８に示すように、そのプローブのＱｓ（Ｒｍ/Ｒｏ)は０．０２±０．０３（Ｒｍ＝０）であり、完全にクエンチされたＢｆセンサを示した。本開示の有限制限消光（Ｒｍ＞0）は、正確なＢｆレベルを決定するために異なる分析を使用する。本願明細書に記載される分析は式１および２に数学的に詳述され、それはＲＭ＝０についての米国9,529,003の式２および３に帰着される。
米国特許第9,529,003号は、磁石を使用して、鉄を含有するポリスチレンビーズ上のＢｆセンサがマルチウェルプレートの底部に濃縮されるマイクロ流体デバイスにおいて、全血中のＢｆを測定することを記載している。この構成は、試料カートリッジが乾燥剤収容パウチ内に密封され、したがってセンサがカートリッジ表面にしっかりと結合されなければならない単一工程評価には実用的ではない。代わりに、本開示では、ポリスチレンビーズに付着したビリルビン感受性および非応答性ｉＬＢＰ突然変異体を含有するスラリーが調製され、それぞれがシステイン残基で標識された異なるＮＩＲフルオロフォアを有し、すべて水性緩衝液中にある。このスラリーの小滴（＜２μl）をＵＶ処理カートリッジ上に分配し、乾燥させ、パウチを含む乾燥剤中に入れる。
実施例８
平衡Ｂｆ濃度の決定
血液試料中のＢｆは、ビリルビンとアルブミンとの結合および解離によって平衡状態にある。典型的なアルブミン濃度は４００～６００μMであり、成人ヒトアルブミンについてのビリルビンの平衡解離定数（Ｋｄ）は、高親和性部位について約２０ｎＭである。平衡で０．５のビリルビン－アルブミンモル比は、約２０ｎＭのＢｆを生成する。各カートリッジのＢｆセンサの推定容量は2x10-13モルである。したがって、５μlの試料では、センサ濃度は４０ｎＭである。これはせいぜい、センサは４０ｎＭ未満のビリルビン、または５００μMアルブミンに結合した２５０μM総ビリルビンの約１．６×１０-4に結合することを意味する。ＢｆはおよそＫｄ＊ＢＴ／アルブミンであるので、ＢＴのわずかな変化は、Ｂｆに対して無視できるほどの効果しか有さない。実際のアルブミン緩衝Ｂｆ平衡濃度に対するセンサの影響は無視できるので、ＵＢCheckは平衡Ｂｆ濃度に近似するというこの手段である。ビリルビン－アルブミン複合体のために試料を希釈せずに、センサによって結合された量によって妨害されないままである高度に緩衝されたＢｆレベルを生成することが重要である。血液試料中のＢｆを測定するための他の方法は、平衡状態での測定ではない。最も重要なことには４５年間使用されており、ＦＤＡ認証ArrowsＵＢ分析器によって実施されているペルオキシダーゼ法は平衡状態でＢｆを生じない[Jacobsenら、新生児血漿中の非結合ビリルビンの決定、Clin Chem(1974）20, 183］。これは、一部にはＦＤＡ認証Arrows法における大きな試料希釈率（４２～５２倍）、およびＢｆの実質的な画分を酸化するペルオキシダーゼ法によるものである。異なるペルオキシダーゼ濃度で試料を測定し、ペルオキシダーゼ濃度ゼロを外挿することにより、より平衡に近いＢｆのより良い推定値を得ることができる［Ahlforsら、非結合(フリー)ビリルビン：新生児黄疸を評価するためのパラダイムの改善、Clin Chem(2009） 55：7 1288－1299］。しかしながら、この方法はＦＤＡ承認されておらず、最終的にはより良好な平衡近似をもたらすに過ぎない。しかし、平衡を測定せず、本発明またはペルオキシダーゼ法で得られた結果よりも数桁大きいＢｆ濃度を得る、Ｂｆを測定するためのより最近の方法が提案されている。[Bellら、血清中のフリーのビリルビンの紙ベースの電位差測定検知、Biosensors and Bioelectronics, 126(2019)115－121］。この方法は、フィルターおよび起電力を使用してビリルビンをアルブミンから分離することによって、アルブミンとの平衡状態でＢｆを破壊する。
平衡Ｂｆ濃度の決定
血液試料中のＢｆは、ビリルビンとアルブミンとの結合および解離によって平衡状態にある。典型的なアルブミン濃度は４００～６００μMであり、成人ヒトアルブミンについてのビリルビンの平衡解離定数（Ｋｄ）は、高親和性部位について約２０ｎＭである。平衡で０．５のビリルビン－アルブミンモル比は、約２０ｎＭのＢｆを生成する。各カートリッジのＢｆセンサの推定容量は2x10-13モルである。したがって、５μlの試料では、センサ濃度は４０ｎＭである。これはせいぜい、センサは４０ｎＭ未満のビリルビン、または５００μMアルブミンに結合した２５０μM総ビリルビンの約１．６×１０-4に結合することを意味する。ＢｆはおよそＫｄ＊ＢＴ／アルブミンであるので、ＢＴのわずかな変化は、Ｂｆに対して無視できるほどの効果しか有さない。実際のアルブミン緩衝Ｂｆ平衡濃度に対するセンサの影響は無視できるので、ＵＢCheckは平衡Ｂｆ濃度に近似するというこの手段である。ビリルビン－アルブミン複合体のために試料を希釈せずに、センサによって結合された量によって妨害されないままである高度に緩衝されたＢｆレベルを生成することが重要である。血液試料中のＢｆを測定するための他の方法は、平衡状態での測定ではない。最も重要なことには４５年間使用されており、ＦＤＡ認証ArrowsＵＢ分析器によって実施されているペルオキシダーゼ法は平衡状態でＢｆを生じない[Jacobsenら、新生児血漿中の非結合ビリルビンの決定、Clin Chem(1974）20, 183］。これは、一部にはＦＤＡ認証Arrows法における大きな試料希釈率（４２～５２倍）、およびＢｆの実質的な画分を酸化するペルオキシダーゼ法によるものである。異なるペルオキシダーゼ濃度で試料を測定し、ペルオキシダーゼ濃度ゼロを外挿することにより、より平衡に近いＢｆのより良い推定値を得ることができる［Ahlforsら、非結合(フリー)ビリルビン：新生児黄疸を評価するためのパラダイムの改善、Clin Chem(2009） 55：7 1288－1299］。しかしながら、この方法はＦＤＡ承認されておらず、最終的にはより良好な平衡近似をもたらすに過ぎない。しかし、平衡を測定せず、本発明またはペルオキシダーゼ法で得られた結果よりも数桁大きいＢｆ濃度を得る、Ｂｆを測定するためのより最近の方法が提案されている。[Bellら、血清中のフリーのビリルビンの紙ベースの電位差測定検知、Biosensors and Bioelectronics, 126(2019)115－121］。この方法は、フィルターおよび起電力を使用してビリルビンをアルブミンから分離することによって、アルブミンとの平衡状態でＢｆを破壊する。
実施例９
平衡に及ぼす希釈の影響－ビリルビン－アルブミン置換基がＨＳＡ Ｋｄを増加させる場合
ＵＢCheckは、平衡Ｂｆを最も厳密に測定し、それによって循環中の定常状態Ｂｆレベルを最も厳密に近似する。ビリルビン：アルブミン複合体の緩衝能の直接的な説明は、アルブミンの有無にかかわらず、カートリッジ中のセンサの応答である。カートリッジに１００nMの濃度で遊離ビリルビンを添加すると、Ｂｆセンサによって検出されるように≦１nMが得られ、１０００nMの遊離ビリルビンを添加すると５０nMのＢｆが検出される。遊離ビリルビンのこの損失は特に試料溝の大きな表面対体積比（２０）のために、カートリッジ内の試料溝を画定するポリスチレンおよびアクリル表面へのその結合による。
平衡に及ぼす希釈の影響－ビリルビン－アルブミン置換基がＨＳＡ Ｋｄを増加させる場合
ＵＢCheckは、平衡Ｂｆを最も厳密に測定し、それによって循環中の定常状態Ｂｆレベルを最も厳密に近似する。ビリルビン：アルブミン複合体の緩衝能の直接的な説明は、アルブミンの有無にかかわらず、カートリッジ中のセンサの応答である。カートリッジに１００nMの濃度で遊離ビリルビンを添加すると、Ｂｆセンサによって検出されるように≦１nMが得られ、１０００nMの遊離ビリルビンを添加すると５０nMのＢｆが検出される。遊離ビリルビンのこの損失は特に試料溝の大きな表面対体積比（２０）のために、カートリッジ内の試料溝を画定するポリスチレンおよびアクリル表面へのその結合による。
表面に結合しなくても、平衡Ｂｆ濃度は、ビリルビン－ＨＳＡ反応の動力学のおかげで試料希釈に依存する。さらに、希釈の効果は、ビリルビンに対するＨＳＡの結合親和性を効果的に低下させるアルブミンからのビリルビンの置換体の存在下で増幅される。これは、オレイン酸を６オレイン酸対１ＨＳＡのモル比でＨＳＡに添加した場合の、０．１～０．５のモル比でのビリルビン－ＨＳＡ複合体の関数としてのＢｆの測定結果に示されている（図４）。５５０μMのＨＳＡ濃度で開始すると、Ｂｆ濃度は、４２倍の希釈（元のArrowsＵＢ解析装置によって使用される希釈）で１桁以上減少する。オレイン酸は強力なＦＦＡ置換体であり、ＮＩＣＵの未熟児に一般的に処方されるIntralipidの主要成分である。
実施例１０
ＵＢCheckＢｆ測定にヘモグロビン／溶血は及ぼす影響なし
Ｂｆ応答プローブおよび非応答プローブをＮｉ－ポリスチレンビーズに適用した後、表４のペプチドをビーズに添加し、二重ＨＩＳタグを通してビーズのＮｉ－ＮＴＡに付着させる。次いで、組み合わせたプローブおよびペプチドビーズをカートリッジ上にスポットする。全血溶血物の効果を、増加するヘモグロビン濃度でビリルビンを添加した新生児血清を滴定することによって試験した。ヘモグロビン滴定の前後のＢｆ濃度を測定し、ゼロヘモグロビンに対するＢｆ濃度が、少なくとも４g／lほどの高さのヘモグロビン濃度によって影響されないことを明らかにした（図５）。
ＵＢCheckＢｆ測定にヘモグロビン／溶血は及ぼす影響なし
Ｂｆ応答プローブおよび非応答プローブをＮｉ－ポリスチレンビーズに適用した後、表４のペプチドをビーズに添加し、二重ＨＩＳタグを通してビーズのＮｉ－ＮＴＡに付着させる。次いで、組み合わせたプローブおよびペプチドビーズをカートリッジ上にスポットする。全血溶血物の効果を、増加するヘモグロビン濃度でビリルビンを添加した新生児血清を滴定することによって試験した。ヘモグロビン滴定の前後のＢｆ濃度を測定し、ゼロヘモグロビンに対するＢｆ濃度が、少なくとも４g／lほどの高さのヘモグロビン濃度によって影響されないことを明らかにした（図５）。
実施例１１
新生児に処方された薬剤の効果
本明細書に記載される実施形態は、新生児におけるＢｆの濃度を測定することに関する。ＮＩＣＵの乳児は頻繁に投薬を受けるため、ビリルビン神経毒性のリスクが高い未熟児は特に懸念される。[Hsiehら、新生児集中治療室での薬物使用、Am J Perinatol（2014）31、811-822］。表５は、ＮＩＣＵにおいて最も頻繁に処方されるもの中でも、特定の薬物が実施例７のワンステップカートリッジを用いたＢｆの測定において決定されるように、アルブミンおよび干渉からのビリルビンの強力な置換体であることを示す。薬剤のランクは、最も処方されている薬剤がランク１のアンピシリンから開始したＮＩＣＵでの使用頻度を示している。「置換または干渉」欄の要素は、薬物が効果を有さない場合、ブランクである。ディスプレーサーは陽性であり、薬物なしと比較して３倍の薬物濃度の増加パーセントを示す。スピロノラクトンの負の値は、Ｂｆセンサとの干渉を示す。表５に示すように、いくつかの薬物は強力な置換体であり、スピロノラクトンは、Ｂｆ評価を妨害することが見出された唯一のＮＩＣＵ薬物である。図６は、アルブミンからのビリルビンの強力な置換体である表５の薬物の処方された（低、中、高および３×高）薬物濃度の関数としてのＢｆに対する効果を示す。
新生児に処方された薬剤の効果
本明細書に記載される実施形態は、新生児におけるＢｆの濃度を測定することに関する。ＮＩＣＵの乳児は頻繁に投薬を受けるため、ビリルビン神経毒性のリスクが高い未熟児は特に懸念される。[Hsiehら、新生児集中治療室での薬物使用、Am J Perinatol（2014）31、811-822］。表５は、ＮＩＣＵにおいて最も頻繁に処方されるもの中でも、特定の薬物が実施例７のワンステップカートリッジを用いたＢｆの測定において決定されるように、アルブミンおよび干渉からのビリルビンの強力な置換体であることを示す。薬剤のランクは、最も処方されている薬剤がランク１のアンピシリンから開始したＮＩＣＵでの使用頻度を示している。「置換または干渉」欄の要素は、薬物が効果を有さない場合、ブランクである。ディスプレーサーは陽性であり、薬物なしと比較して３倍の薬物濃度の増加パーセントを示す。スピロノラクトンの負の値は、Ｂｆセンサとの干渉を示す。表５に示すように、いくつかの薬物は強力な置換体であり、スピロノラクトンは、Ｂｆ評価を妨害することが見出された唯一のＮＩＣＵ薬物である。図６は、アルブミンからのビリルビンの強力な置換体である表５の薬物の処方された（低、中、高および３×高）薬物濃度の関数としてのＢｆに対する効果を示す。
これらの薬物によるＢｆの増加はＮＩＣＵ児の正常上限を大きく超える可能性があり、その健康に重大な結果をもたらす可能性がある。さらに、実施例７に記載されるようなこれらの薬物によるＢｆの増加はＮＩＣＵ児の正常上限を大きく超える可能性があり、その健康に重大な結果をもたらす可能性がある。さらに、実施例７に記載されるようなＦＦＡ(オレイン酸）の効果と同様に、希釈の効果は、薬物によって引き起こされる置換の程度に大きく影響する。表６は、ビリルビン、次いで１．１２および３．７６mMのセファゾリンでスパイクした成人血清のＢｆレベルを比較することによるこの効果を示す。Ｂｆの測定は、ArrowsＵＢ２解析装置（５２倍希釈）およびＵＢCheck（希釈なし）を用いて行った。表６が示すように、１．１２および３．７６ｍMのセファゾリンの存在下でのＢｆは、ＵＢCheckにおいて、Arrowsよりも約３倍および５倍大きい。
実施例１２
抱合ビリルビンによる干渉の減少
Ｂｆを正確に測定するＵＢCheckの能力に対するジタウロビリルビンの効果を測定することによって、抱合ビリルビンとビリルビンプローブとの潜在的な干渉を決定する。また、ＵＢCheckの結果を、ArrowsＵＢ解析装置ＵＡ－２法を用いた測定と比較した。測定は、新生児血清を非抱合ビリルビンでスパイクして約１０nMのＢｆを得、次いでスパイクした試料をジタウロビリルビンで２０mg／dlまで滴定することによって行う（図７）。各工程において、ＢｆをＵＢCheckおよびArrowsによって測定し、直接（結合）ビリルビン濃度を、Sigma directビリルビンキットを使用して決定する。ゼロジタウロビリルビンではＵＢCheckおよびArrowsの両方が１０nMのＢｆを収率が直接ビリルビン測定は約０．５mg／ｄｌの非ゼロ値を収率（図７）。ジタウロビリルビンの濃度が増加することにつれて、ＵＢCheckは変化しないが、Arrowsは約０．５mg／dlのジタウロビリルビンで開始して増加し、次いで、Arrowsの評価がＢｆ≧５０nMで飽和する４mg／dlのジタウロビリルビンまで急速に増加する。対照的に、ＵＢCheckは４mg／dlのジタウロビリルビンでのみ増加し始め、ここで、そのＢｆは約１２nMに増加し、最初の１０nMレベルから２０％増加し、そして２０mg／dlのジタウロビリルビンでのみＢｆは３３nMに増加する。したがって、ＵＢCheckはたとえArrows試料が５２倍に希釈されたとしても、Ｂｆに対してArrowsよりも優れた特異性を有するが、ＵＢCheck試料は希釈されていない。
抱合ビリルビンによる干渉の減少
Ｂｆを正確に測定するＵＢCheckの能力に対するジタウロビリルビンの効果を測定することによって、抱合ビリルビンとビリルビンプローブとの潜在的な干渉を決定する。また、ＵＢCheckの結果を、ArrowsＵＢ解析装置ＵＡ－２法を用いた測定と比較した。測定は、新生児血清を非抱合ビリルビンでスパイクして約１０nMのＢｆを得、次いでスパイクした試料をジタウロビリルビンで２０mg／dlまで滴定することによって行う（図７）。各工程において、ＢｆをＵＢCheckおよびArrowsによって測定し、直接（結合）ビリルビン濃度を、Sigma directビリルビンキットを使用して決定する。ゼロジタウロビリルビンではＵＢCheckおよびArrowsの両方が１０nMのＢｆを収率が直接ビリルビン測定は約０．５mg／ｄｌの非ゼロ値を収率（図７）。ジタウロビリルビンの濃度が増加することにつれて、ＵＢCheckは変化しないが、Arrowsは約０．５mg／dlのジタウロビリルビンで開始して増加し、次いで、Arrowsの評価がＢｆ≧５０nMで飽和する４mg／dlのジタウロビリルビンまで急速に増加する。対照的に、ＵＢCheckは４mg／dlのジタウロビリルビンでのみ増加し始め、ここで、そのＢｆは約１２nMに増加し、最初の１０nMレベルから２０％増加し、そして２０mg／dlのジタウロビリルビンでのみＢｆは３３nMに増加する。したがって、ＵＢCheckはたとえArrows試料が５２倍に希釈されたとしても、Ｂｆに対してArrowsよりも優れた特異性を有するが、ＵＢCheck試料は希釈されていない。
実施例１３
ビリルビン光異性体からの干渉の欠如
新生児の高ビリルビン血症は、アルブミンに結合したビリルビンを光－異性化する青緑色光線療法を用いて最も頻繁に治療される。［Newmanら、新生児高ビリルビン血症と長期成績：共同周産期プロジェクトのもう一つの観察、Pediatrics(1993）92、651－657、Ennery JF、青色光、緑色光、白色光、他の光：新生児黄疸の治療周産期医学における臨床（1990）17、467－481］。ビリルビン光異性体（４Ｚ，１５Ｅ）、(４Ｅ，１５Ｚ）およびルミルビンはるかに溶解性が高いため、天然のビリルビンＩＸａ(４Ｚ，１５Ｚ）分子と比較して容易に排泄される。光線療法はＺ，Ｚ異性体を容易に減少させ、それにより新生児高ビリルビン血症を効率的に治療する。光異性体はまた、周囲光への暴露によって生成され得る[McDonaghら 光異性体：非結合ビリルビンの臨床ぺルオキシターゼ測定における錯乱因子か？Pediatrics(2009）123、67-76］。図９Ａおよび９Ｂに示すように、Ｂｆ評価はビリルビンのＺ，Ｚ異性体のみを検出するが、ArrowsはＺ，Ｚおよびすべての光異性体に感受性である。しかし、光異性体ではなくＺ，Ｚのみが毒性である[Jasparovaら、ビリルビンの光異性体（2016)PLoS ONE 11(2):e0148126.doi: 10.1371／journal. pone. 0148126］。光線療法を受けなかったが、ＨＰＬＣ分析が相当なレベルの光異性体（おそらく血清の周囲光曝露による）を示す健康な新生児からの血清試料も、図９Ａに示すように、ＵＢCheckＢｆ評価と比較して、Arrowsによって２倍を超えるＢｆレベルを示す。図９Ｂに示すように、成人血清試料をビリルビンでスパイクし、次いで光線療法ランプ(Natus Neoblue)に５時間暴露した。上のパネルは、５時間の暴露にわたる複数回のＨＰＬＣスキャンから決定されたＺ，Ｚおよび３光異性体の相対強度の結果を示す。これは、Ｚ，Ｚが単調に低レベルに減少し、一方、光異性体は約１．５～２時間でピークに達し、次いでゼロに向かって減少することを示す。下のパネルはビリルビンでスパイクした２つの試料の結果を示し、そのＢｆレベルは、ArrowsおよびＢｆ評価の両方による光線療法の前に８および１２nMであった。Arrowsとは対照的に、Ｂｆ評価はＺ，Ｚ単調減少をゼロに向かって追跡し、一方、ArrowsＢｆは１時間に達するまでに急速に上昇し、その飽和レベル５０ｎＭに達した。したがって、Arrowsは、光異性体に対して非常に敏感である。
ビリルビン光異性体からの干渉の欠如
新生児の高ビリルビン血症は、アルブミンに結合したビリルビンを光－異性化する青緑色光線療法を用いて最も頻繁に治療される。［Newmanら、新生児高ビリルビン血症と長期成績：共同周産期プロジェクトのもう一つの観察、Pediatrics(1993）92、651－657、Ennery JF、青色光、緑色光、白色光、他の光：新生児黄疸の治療周産期医学における臨床（1990）17、467－481］。ビリルビン光異性体（４Ｚ，１５Ｅ）、(４Ｅ，１５Ｚ）およびルミルビンはるかに溶解性が高いため、天然のビリルビンＩＸａ(４Ｚ，１５Ｚ）分子と比較して容易に排泄される。光線療法はＺ，Ｚ異性体を容易に減少させ、それにより新生児高ビリルビン血症を効率的に治療する。光異性体はまた、周囲光への暴露によって生成され得る[McDonaghら 光異性体：非結合ビリルビンの臨床ぺルオキシターゼ測定における錯乱因子か？Pediatrics(2009）123、67-76］。図９Ａおよび９Ｂに示すように、Ｂｆ評価はビリルビンのＺ，Ｚ異性体のみを検出するが、ArrowsはＺ，Ｚおよびすべての光異性体に感受性である。しかし、光異性体ではなくＺ，Ｚのみが毒性である[Jasparovaら、ビリルビンの光異性体（2016)PLoS ONE 11(2):e0148126.doi: 10.1371／journal. pone. 0148126］。光線療法を受けなかったが、ＨＰＬＣ分析が相当なレベルの光異性体（おそらく血清の周囲光曝露による）を示す健康な新生児からの血清試料も、図９Ａに示すように、ＵＢCheckＢｆ評価と比較して、Arrowsによって２倍を超えるＢｆレベルを示す。図９Ｂに示すように、成人血清試料をビリルビンでスパイクし、次いで光線療法ランプ(Natus Neoblue)に５時間暴露した。上のパネルは、５時間の暴露にわたる複数回のＨＰＬＣスキャンから決定されたＺ，Ｚおよび３光異性体の相対強度の結果を示す。これは、Ｚ，Ｚが単調に低レベルに減少し、一方、光異性体は約１．５～２時間でピークに達し、次いでゼロに向かって減少することを示す。下のパネルはビリルビンでスパイクした２つの試料の結果を示し、そのＢｆレベルは、ArrowsおよびＢｆ評価の両方による光線療法の前に８および１２nMであった。Arrowsとは対照的に、Ｂｆ評価はＺ，Ｚ単調減少をゼロに向かって追跡し、一方、ArrowsＢｆは１時間に達するまでに急速に上昇し、その飽和レベル５０ｎＭに達した。したがって、Arrowsは、光異性体に対して非常に敏感である。
図９Ｂのような光線療法ランプで血清を漂白することは、５時間後にＵＢCheckによるＢｆ濃度が実質的にゼロであることを明らかにする。このような実験は検出限界の定量、定量限界を可能にし、さらに、それらは、ビリルビンを欠く血清または血漿において、ＵＢCheckが脂肪酸、他の脂質、ペプチド、核酸などのような他の疎水性代謝産物を含む任意の他の血液含有分子によって影響されないことを実証する。重要なことは、乳児に対する光線療法治療が典型的にはるかに長い時間（典型的には２４～７２時間）使用されることを考えると、光線療法ランプからの光線が他の血液成分に対して破壊的である可能性が低いことである。ＵＢCheckの応答傾向がゼロであることは、評価がＦＦＡ、ペプチド、核酸、または任意の他の天然血液成分を含む全ての天然血液代謝産物に対して感受性でないことを示すので、ＵＢCheckは光異性体に対して感受性でないだけではない。
実施例１４
Intralipidおよびトリグリセリドからの干渉の欠如
図８Ａ～８Ｂは、脂質内がトリグリセリドとして、Ｂｆを減少させることができ（図８）、脂肪分解の際に、ビリルビンをアルブミンから置換することによってＢｆを増加させることができる非結合ＦＦＡを生成することを示す（図８Ｂ）。図８Ａにおいて、24ｎＭのＢｆを生じるようにビリルビンでスパイクした新生児血清試料を、１０mMまでトリグリセリド（Intralipid）で滴定し、これは、１８ｎＭへのＢｆの単調な減少を生じた。これらの結果は、ヘパリンなしの脂質内注入に対応するよう。Ｂｆの減少は、ＵＢCheck方法によって正確にモニターされ、その結果、トリグリセリドはビリルビンのシンクを生成し、従って、干渉物質ではない。図８Ｂは、ヘパリンの存在下で、１g／kg／日（ＩＬ１）から始まり２g／kg／日（ＩＬ２）および３g／kg／日（ＩＬ３）まで、Intralipid注入を受けた未熟児約１００例の結果を示している。各イントラリピド工程において、Ｂｆレベルは、アルブミンからビリルビンを置換する非結合ＦＦＡ(ＦＦＡu)のヘパリン活性化リパーゼ産生のために増加した。これらの結果は、Ｂｆ測定に対するトリグリセリドまたはＦＦＡの干渉がないことと一致する。換言すれば、濁度（光散乱）は少なくとも以下の理由：１）蛍光の励起（６６０nm）および発光（７００および８１９nm）がＮＩＲ(波長の増加に伴って光散乱が減少する）にあること、２)カートリッジの光路長が０．１mmであること、および３）７００／８１９比が散乱によって影響を受けた場合、７００強度が８１９強度よりも大きく減少し、それによってＲ値を減少させ、それによって図８ＡのようにＢｆを減少させるのではなく、Ｂｆを増加させるので、比を減少させるのであろうことのために、評価に影響を及ぼさない。対照的に、Arrowsによって実施されるペルオキシダーゼ法（この測定は、４６０nmで行われる）はArrowsがイントラリピドレベルの増加に伴う総ビリルビンの増加を報告するので、散乱によって非常に影響される。
Intralipidおよびトリグリセリドからの干渉の欠如
図８Ａ～８Ｂは、脂質内がトリグリセリドとして、Ｂｆを減少させることができ（図８）、脂肪分解の際に、ビリルビンをアルブミンから置換することによってＢｆを増加させることができる非結合ＦＦＡを生成することを示す（図８Ｂ）。図８Ａにおいて、24ｎＭのＢｆを生じるようにビリルビンでスパイクした新生児血清試料を、１０mMまでトリグリセリド（Intralipid）で滴定し、これは、１８ｎＭへのＢｆの単調な減少を生じた。これらの結果は、ヘパリンなしの脂質内注入に対応するよう。Ｂｆの減少は、ＵＢCheck方法によって正確にモニターされ、その結果、トリグリセリドはビリルビンのシンクを生成し、従って、干渉物質ではない。図８Ｂは、ヘパリンの存在下で、１g／kg／日（ＩＬ１）から始まり２g／kg／日（ＩＬ２）および３g／kg／日（ＩＬ３）まで、Intralipid注入を受けた未熟児約１００例の結果を示している。各イントラリピド工程において、Ｂｆレベルは、アルブミンからビリルビンを置換する非結合ＦＦＡ(ＦＦＡu)のヘパリン活性化リパーゼ産生のために増加した。これらの結果は、Ｂｆ測定に対するトリグリセリドまたはＦＦＡの干渉がないことと一致する。換言すれば、濁度（光散乱）は少なくとも以下の理由：１）蛍光の励起（６６０nm）および発光（７００および８１９nm）がＮＩＲ(波長の増加に伴って光散乱が減少する）にあること、２)カートリッジの光路長が０．１mmであること、および３）７００／８１９比が散乱によって影響を受けた場合、７００強度が８１９強度よりも大きく減少し、それによってＲ値を減少させ、それによって図８ＡのようにＢｆを減少させるのではなく、Ｂｆを増加させるので、比を減少させるのであろうことのために、評価に影響を及ぼさない。対照的に、Arrowsによって実施されるペルオキシダーゼ法（この測定は、４６０nmで行われる）はArrowsがイントラリピドレベルの増加に伴う総ビリルビンの増加を報告するので、散乱によって非常に影響される。
実施例１５
ＦＦＡuからの干渉の不足
脂質注入、例えばヘパリンの存在下でのインタラリピッドは例外的に高濃度の非結合ＦＦＡ（ＦＦＡｕ)を産生することができ、その多くはビリルビンをアルブミンから置換する（図４）。増加する濃度でインタラリピッドを受けている新生児において、ＦＦＡｕレベルは１００ｎＭを超えて増加し得る［Hegyi T.ら、未熟児において、大豆脂質注入が非結合型遊離脂肪酸および非結合型ビリルビンに及ぼす影響、(2017)J Pediatr 184, 45－50e41］。しかしながら、図４の結果は、オレイン酸とアルブミンのモル比が６：１の場合、非結合オレイン酸濃度が５００ｎＭよりも大きく［Richieriら、長鎖脂肪酸とアルブミンの相互作用：蛍光プローブADIFABを用いた遊離脂肪酸レベルの測定、Biochemistry 32 7574－7580（1993）］、しかしＢｆを増加させることによって、ビリルビンからアルブミンへの増加のみがセンサに影響するので、ＦＦＡがＢｆセンサに干渉しないことを明らかにしている。
ＦＦＡuからの干渉の不足
脂質注入、例えばヘパリンの存在下でのインタラリピッドは例外的に高濃度の非結合ＦＦＡ（ＦＦＡｕ)を産生することができ、その多くはビリルビンをアルブミンから置換する（図４）。増加する濃度でインタラリピッドを受けている新生児において、ＦＦＡｕレベルは１００ｎＭを超えて増加し得る［Hegyi T.ら、未熟児において、大豆脂質注入が非結合型遊離脂肪酸および非結合型ビリルビンに及ぼす影響、(2017)J Pediatr 184, 45－50e41］。しかしながら、図４の結果は、オレイン酸とアルブミンのモル比が６：１の場合、非結合オレイン酸濃度が５００ｎＭよりも大きく［Richieriら、長鎖脂肪酸とアルブミンの相互作用：蛍光プローブADIFABを用いた遊離脂肪酸レベルの測定、Biochemistry 32 7574－7580（1993）］、しかしＢｆを増加させることによって、ビリルビンからアルブミンへの増加のみがセンサに影響するので、ＦＦＡがＢｆセンサに干渉しないことを明らかにしている。
実施例１６
ビリルビンスパイクおよび非スパイクヒト血清／血漿中のＢｆの分析仕様および測定
ＣＬＳＩガイドラインに従って、ＵＢCheck評価の分析仕様を、複数のカートリッジロットおよび２つ以上のリーダーを用いて決定した。結果には、血清試料の完全漂白によって決定されたブランクの限界(ＬＯＢ＝０．７ｎＭ）、検出限界（ＬＯＤ＝０．９ｎＭ）および定量限界（ＬＯＱ＝）が含まれる。３つのリーダー、３つの異なるカートリッジロットおよびビリルビンスパイクした新生児および成人の血清試料を用いて、３施設精密試験を実施した。３つのリーダーおよびカートリッジロットの平均としての結果は、以下（ＵＢレベル(nM)およびＣＶ(％)）：４．４、９％；８．０、７％；１１．４、８％；１９．１、７％；３８．２、８％）であった。
ビリルビンスパイクおよび非スパイクヒト血清／血漿中のＢｆの分析仕様および測定
ＣＬＳＩガイドラインに従って、ＵＢCheck評価の分析仕様を、複数のカートリッジロットおよび２つ以上のリーダーを用いて決定した。結果には、血清試料の完全漂白によって決定されたブランクの限界(ＬＯＢ＝０．７ｎＭ）、検出限界（ＬＯＤ＝０．９ｎＭ）および定量限界（ＬＯＱ＝）が含まれる。３つのリーダー、３つの異なるカートリッジロットおよびビリルビンスパイクした新生児および成人の血清試料を用いて、３施設精密試験を実施した。３つのリーダーおよびカートリッジロットの平均としての結果は、以下（ＵＢレベル(nM)およびＣＶ(％)）：４．４、９％；８．０、７％；１１．４、８％；１９．１、７％；３８．２、８％）であった。
アルブミンの濃度が６２０μＭであるプールしたヒト血漿(Golden West Biologicals)にビリルビンをスパイクして、約０～０．９のビリルビン／アルブミンモル比を有する血漿試料を生成した。［Ｂｆ］の測定も、Arrows Ｂｆ 分析器で実施されたペルオキシダーゼ法を用いて、同じ試料について行った。これらの結果はビリルビンプローブの応答が完全にビリルビンとの相互作用によるものであり、ビリルビンプローブがヒト血液試料中に存在する他の代謝産物に応答しないことを実証する。さらに、ペルオキシダーゼ法およびビリルビン－アルブミン平衡の予測との一致はまた、プローブが正確な非結合ビリルビン濃度を生じることを実証する。
本明細書で使用されるように、セクション見出しは、組織的な目的のためだけのものであり、説明された主題をいかなる形でも限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、本、論文、およびインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない、本出願において引用されるすべての文献および類似の材料は本明細書において特に参照される開示を含む、任意の目的のために、それらの全体が参照によって明示的に組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義が、本開示において提供される定義と異なるように見える場合、本開示において提供される定義が支配するものとする。本開示において議論される温度、濃度、時間などの前に、わずかな逸脱およびわずかな逸脱が本明細書における本開示の範囲内であるように、暗示される「約」が存在することが理解される。
本出願において、単数形の使用は特に断らない限り、複数形を含む。また、「備える（comprise）」、「備える（comprises）」、「備える（comprising）」、「含む（contains）」、「含む（contains）」、「含む（containing）」、「含む（include）」は、限定することを意図しない。
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」および「the」は内容が別段の明確な指示をしない限り、複数の参照を含む。
本開示は特定の実施形態および実施例の文脈で説明されてきたが、当業者は本開示が具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態および／またはその使用、ならびにその明らかな修正および均等物に及ぶことを理解するのであろう。加えて、いくつかの変形が示され、詳細に説明されたが、本開示の範囲内にある他の修正は本開示に基づいて当業者に容易に明らかになるのであろう。また、実施形態の特定の特徴および態様の様々な組み合わせまたはサブコンビネーションを行うことができ、それでも本開示の範囲内に入ることも企図される。開示された実施形態のさまざまな特徴および態様はさまざまなモードまたは実施形態を形成するために、互いに組み合わされ、または置換されうることが理解されるべきである。したがって、本明細書に記載された本開示の範囲は、上記に記載された特定の開示された実施形態によって限定されるべきではないことが意図されている。
しかし、この詳細な説明は様々な実施形態を示しているが、その精神および範囲内の様々な変更および修正が当業者には明らかになるので、例示のみのために与えられていることを理解されたい。
本明細書で提示される説明で使用される用語は、限定的または限定的な方法で解釈されることを意図していない。むしろ、用語は単に、システム、方法、および関連する構成要素の実施形態の詳細な説明と併せて利用されているに過ぎない。さらに、実施形態はいくつかの新規な特徴を含むことができ、そのうちの１つだけが、その望ましい属性に単独で責任を負うわけではなく、または本明細書で説明される実施形態を実施するために必須であると考えられるわけではない。
Claims (58)
- 試料中の遊離ビリルビンを測定するためのセンサであって、該センサは、
第１のフルオロフォアで標識されたビリルビン応答プローブ、および
第２のフルオロフォアで標識された非応答プローブを含み、
ここで、第１および第２のフルオロフォアが同じ波長で励起し、第１および第２のフルオロフォアが異なる波長で蛍光を発する、センサ。 - 前記ビリルビン応答性プローブは、第１の細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）を含み、該第１のｉＬＢＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含むペプチド配列を有し、
１４個の接近可能なリジン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載のＫＲ１４）を置換するＡｒｇ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載の配列を有するＣ末端二重Ｈｉｓタグリンカー（Ｃ２ＸＨ１１）；
Ｎ末端付加のＭＧＩおよび
単一のシステインを含む６２個以下のアミノ酸置換および付加；
を含む、請求項１に記載のセンサ。 - 前記ビリルビン応答性プローブは、表１に記載のプローブのいずれか１つの配列を含む、請求項１～２のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記非応答プローブは、第２のｉＬＢＰを含み、該第２のｉＬＢＰは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1を含むペプチド配列を有し、
７２、７３、７４、１２６、および１３１位での置換；
２７、３１、３３、５４、７３、７４、７６、または９８位のいずれか１つにおけるＣｙｓへの置換；
３個以下のさらなるアミノ酸置換；および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載の配列を有するＣ末端二重Ｈｉｓタグリンカー（Ｃ２ＸＨ１１）；
を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のセンサ。 - 前記非応答プローブが、表２に記載のプローブのいずれか１つの配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記第１のフルオロフォアおよび前記第２のフルオロフォアが異なるフルオロフォアである請求項１～５のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記ビリルビン応答性プローブが、前記第１のフルオロフォアが付着される単一のシステインを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記非応答プローブが、前記第２のフルオロフォアが付着している単一のシステインを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記第１のフルオロフォアが、システイン置換に付着したＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドまたはＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである請求項１～８のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記ビリルビン応答性プローブが、ビリルビンの非抱合ＩＸ－α（Ｚ，Ｚ）異性体に結合するように構成される、請求項１～９のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記ビリルビン応答性プローブが、抱合ビリルビン（４mg／dl未満）に最小限に結合するように構成される、請求項１～１０のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記ビリルビン応答性プローブが、ビリルビンのＺ，ＥまたはＥ，Ｚ光異性体と、ルミルビンと、脂肪酸と、任意の他の天然に存在する血液成分と、および／または新生児薬と結合しないように構成される、請求項１～１１のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記新生児薬がスピロノラクトンではない、請求項１２に記載のセンサ。
- 前記非応答プローブが、ビリルビンの非抱合ＩＸ－α（Ｚ，Ｚ）異性体とまたは抱合ビリルビンと結合しない、請求項１～１３のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記非応答プローブが、ビリルビンのＺ，ＥまたはＥ，Ｚ光異性体と、ルミルビンと、脂肪酸と、任意の他の天然に存在する血液成分と、および／または新生児薬と結合しないように構成される、請求項１～１４のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドである場合には、前記第２のフルオロフォアはシステイン置換に結合したＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドであり、前記第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドである場合には、前記第２のフルオロフォアは、ＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドである請求項１～１５のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記第１のフルオロフォアまたは第２のフルオロフォアがシステイン置換に付着され、前記システイン置換がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２２、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３３、５４、７４、７６、９７、または９８位にある請求項１～１６のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記第１のフルオロフォアまたは前記第２のフルオロフォアの発光強度が、ビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光度によって影響されない、請求項１～１７のいずれか１項に記載のセンサ。
- 前記ビリルビン応答性プローブまたは前記非応答性プローブが、少なくとも１つのリンカーをさらに含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載のセンサ。
- 請求項１～１９のいずれか１項に記載のセンサを含む組成物。
- 遊離ビリルビン（Ｂｆ）センサを含む組成物であって、該Ｂｆセンサは、ビリルビンに結合し、第１のフルオロフォアで標識される第１の細胞内脂質結合タンパク質（ｉＬＢＰ）；およびビリルビンに結合せず、第２のフルオロフォアで標識される第２のｉＬＢＰを含み、
ここで、第２のフルオロフォアが第１のｉＬＢＰに結合されず、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアが同じ波長で励起し、第１のフルオロフォアおよび第２のフルオロフォアの発光波長が異なり、第２のフルオロフォアがビリルビンの存在下でその発光を変化させない、
組成物。 - 前記第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドであり、前記第２のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドであり、または
前記第１のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ８００ＣＷマレイミドであり、前記第２のフルオロフォアがＬＩＣＯＲ７００ＤＸマレイミドである、請求項２１に記載の組成物。 - 蛍光指数の比の変化が、２つの異なる波長で測定され、非結合ビリルビンの濃度を決定するために使用される、請求項２１～２２のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記第１のフルオロフォアまたは前記第２のフルオロフォアの発光強度がビリルビンおよびヘモグロビンから選択される血液成分の吸光度によって影響されない、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ビリルビン応答性プローブおよび／または前記非応答性プローブが固体基材に付着している、請求項１～１９のいずれか１項に記載のセンサまたは請求項２０～２４のいずれか１項に記載の組成物を含む固体基材。
- 前記固体基材が、Ｎｉ－ポリスチレン、Ｎｉ－ラテックス、またはＮｉ－アガロースビーズである、請求項２５に記載の固体基材。
- 前記Ｎｉ－ポリスチレン、Ｎｉ－ラテックス、またはＮｉ－アガロースビーズが鉄を含む、請求項２６に記載の固体基材。
- 前記ビリルビン応答性プローブまたは前記非応答性プローブが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載の７Ｒ １６Ｒ ２０Ｒ ２９Ｒ ３７Ｒ ４６Ｒ ５０Ｒ ８８Ｒ ９２Ｒ ９４Ｒ １００Ｒ １２５Ｒ １２９Ｒおよび１３０Ｒ(ＫＲ１４）置換を含む、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の固体基材。
- 前記ビリルビン応答性プローブおよび／また前記は非応答性プローブがタグを含み、前記固体基材がタグの受容体を含む、請求項２５～２８のいずれか１項に記載の固体基材。
- 前記タグが、Ｈｉｓ－タグ、ビオチン、Ｆｌａｇ－エピトープ、ｃ－ｍｙｃエピトープ、ＨＡ－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、β－ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ糖タンパク質、カルモジュリン結合タンパク質、ポリスチレン（ＰＳ）疎水性タグ、または金属親和性タグのうちの１つ以上を含む、請求項２９に記載の固体基材。
- 前記タグがポリヒスチジンタグであり、前記固体基材が固定化金属キレートを含む、請求項２９～３０のいずれか１項に記載の固体基材。
- 前記第１のフルオロフォアが、前記ビリルビン応答プローブ上のシステイン残基に付着している、請求項２５～３１のいずれか１項に記載の固体基材。
- 前記第２のフルオロフォアが、前記非応答プローブ上のシステイン残基に付着している、請求項２５～３２のいずれか１項に記載の固体基材。
- ＫｄおよびＲｍを測定するためにビリルビンセンサを較正する方法であって、
請求項１～１９のいずれか１項に記載のセンサを既知濃度のビリルビン（ＢＴ）の水性試料と混合する工程；
蛍光を測定する工程；および
式（1）に当てはめて測定した蛍光から検量線パラメータを求める工程；
を含む方法。 - 試料中の遊離ビリルビン［Ｂｆ］の濃度を測定する方法であって、
任意選択で、試料のベースライン蛍光を測定する工程；
請求項１～１９のいずれか一項に記載のセンサへ試料を適用する工程；
試料の蛍光を測定する工程；
任意選択で、試料の蛍光からベースライン蛍光を差し引いて測定した蛍光を得る工程；および
測定した蛍光から［Ｂｆ］の濃度を決定する工程、
を含む方法。 - 式（1）がセンサを較正するために使用され、下記式（2）が［Ｂｆ］を決定するために使用される、
- 前記試料が、前記ビリルビンのための１つ以上の担体巨大分子と混合される、請求項３５～３６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記１つ以上の担体巨大分子が、アルブミン、脂質結合タンパク質、脂質小胞、またはシクロデキストリンを含む、請求項３７に記載の方法。
- 前記センサが固体支持体に取り付けられている、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記Ｂｆ濃度が、希釈されていない血液試料の測定を任意に可能にする使い捨て微小流体デバイスを使用して決定される、請求項３５～３９のいずれか１項に装置の方法。
- 前記試料が、ヒト、動物、または植物由来である請求項３５～４０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液、またはリンパである請求項３５～４１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、油エマルジョンの静脈内注入を受けている患者からのものである請求項３５～４２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料がアルブミンからビリルビンを置換する薬物を受けている患者からのものであり、および／またはそのような患者が注入された油エマルジョンから、疾患またはストレスから、アルブミンからビリルビンを置換する分子を産生し得る、請求項３５～４３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、ビリルビンレベルを低下させる光線療法、輸血または他の療法を受けている患者由来である請求項３５～４４のいずれか１項記載の方法。
- Ｒｏが、試料を光漂白することによって得られ、それによってゼロレベル測定値を得る、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の方法。
- 基板；
該基板に結合するように構成され、試料を受容するための試料ポートを含むレンズ；および、
ビリルビン応答性プローブ、非応答性プローブ、およびそれに固定された抗ヘモグロビンペプチドを有する基材；
を含むカートリッジであって、前記基板が、約１４５nm～約２２５nmの範囲の波長のＵＶ光で処理され、それによって、光処理されたポリスチレンポリマー鎖が前記基材のポリマー鎖に連結する、カートリッジ。 - 前記基材がポリスチレン基材である請求項４７に記載のカートリッジ。
- 前記基材が、６６０ｎｍの励起光の反射強度を低減するように構成された暗色を有する材料を含む、請求項４７～４８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記レンズがアクリルレンズである請求項４７～４９のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記レンズがＯ２プラズマで処理される、請求項４７－５０のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記レンズを前記ポリスチレン基材に結合することが、約０．１ｍｍ以下の深さを有するチャネルを形成し、前記カートリッジを密封する、請求項４７～５１のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記試料が、全血、血漿、血清、尿、ＣＳＦ、唾液、胃液、間質液、またはリンパである請求項４７～５２のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記試料が無希釈試料である請求項４７～５３のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記カートリッジは、平衡状態でビリルビンを測定するように構成される、請求項４７～５４のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- 前記カートリッジは、ビリルビン標準の追跡可能性によって較正される、請求項４７～５５のいずれか１項に記載のカートリッジ。
- ビリルビン標準がプローブを較正するために使用される市販のビリルビンであり、プローブが較正複合体を較正するために使用され、較正複合体がカートリッジを較正するために使用される、請求項５６に記載のカートリッジ。
- 患者から試料を収集するための１つ以上の収集デバイス、
請求項１～１９のいずれか１項に記載のセンサ、または適切なキャリア中に１つ以上のプローブを含む請求項２０～２４のいずれか１項に記載の組成物、および
任意選択で、医学的決定レベル未満および／またはそれを超える既知濃度の非結合ビリルビンを含む１つ以上の参照標準、
を含むキット。
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