JP6980383B2 - デヒドロゲナーゼ活性の向上したアマドリアーゼ - Google Patents
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Description
[1] デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合(OX/DH)が、改変前のアマドリアーゼと比較して低減している改変アマドリアーゼであって、
(i) アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位、267位、269位、54位及び241位からなる群より選択される位置に対応する位置の1以上のアミノ酸が置換されており、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ、
(ii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位、267位、269位、54位及び241位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ、
(iii) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号44、配列番号53又は配列番号67のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ、或いは
(iv) 前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号44、配列番号53又は配列番号67のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有するアマドリアーゼ。
[2] 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における54位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸又はヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、1に記載のアマドリアーゼ。
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における54位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、2に記載のアマドリアーゼ。
[4] 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における54位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、3に記載のアマドリアーゼ。
[5] 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、又はセリンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、3に記載のアマドリアーゼ。
[6] 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン又はヒスチジンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、3に記載のアマドリアーゼ。
[7] 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、3に記載のアマドリアーゼ。
[8] デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合(OX/DH)が、改変前のアマドリアーゼ(100%)と比較して80%未満に低減されている、1〜7のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[9] 前記アマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、又はアルスロバクター(Arthrobacter)属由来である、1〜8のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[10] 配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号44、配列番号53又は配列番号67に示すアミノ酸配列を有し、1〜7のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、1〜9のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
[11] さらに、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換又は欠失を1以上有し、かつデヒドロゲナーゼ活性を有する、1〜10のいずれかに記載のアマドリアーゼ、
(A)62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位及び356位、
(B)262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位及び81位、並びに
(C)カルボキシル末端の435位、436位及び437位の3アミノ酸残基の欠失。
(A)62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換、
63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸の、ヒスチジン又はアラニンへの置換、
102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の、リジンへの置換
106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の、アラニン、リジン、又はアルギニンへの置換、
110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のロイシン又はチロシンへの置換、
113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジン又はアルギニンへの置換、
355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
419位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、
68位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、
356位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のトレオニンへの置換、
(B)262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、
257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステイン、セリン、トレオニンへの置換、
249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換、
44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
256位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
231位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
81位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、並びに
(C)435位のプロリン、436位のリジン及び437位のロイシンに対応する位置のカルボキシル末端3アミノ酸の欠失。
[13] 1〜12のいずれかに記載のアマドリアーゼを含むHbA1c測定試薬キット。
[15] 14に記載の酵素電極を作用電極として有する酵素センサー。
[16] 1〜12のいずれかに記載のアマドリアーゼ又は14に記載の酵素電極若しくは15に記載の酵素センサー及び電子メディエーターを用いる、HbA1cの測定方法。
(糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c)
本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンA1c(HbA1c)と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
(糖化ペプチド、フルクトシルペプチド)
本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する(ポリ)ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα−アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε−アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α−糖化ペプチド(α−フルクトシルペプチド)である。α−糖化ペプチドは、N末端のα−アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼによる限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンA1c(HbA1c)である場合、該当するα−糖化ペプチドは、N末端が糖化されているHbA1cのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。146残基のアミノ酸により構成されているHbA1cのβ鎖もまたα−糖化ペプチドに該当する(αF146P)。
(アマドリアーゼ)
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ2酢酸またはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
(デヒドロゲナーゼ活性の向上/オキシダーゼ活性の低減をもたらす置換)
デヒドロゲナーゼ活性の向上及び/又はオキシダーゼ活性の低減をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。
(1)280位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸への置換。
(2)267位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン又はアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸残基への置換。
(3)269位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン、メチオニン、トリプトファン、イソロイシン、バリン又はアラニンからなる群より選択される疎水性アミノ酸残基への置換。
(4)54位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンへの置換。
(5)241位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、アルギニン又はヒスチジンへの置換。
(1)280位のシステインの置換、例えば、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、リシン、アルギニン、又はアスパラギンへの置換。
(2)267位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン又はメチオニンへの置換。
(3)269位のフェニルアラニンの置換、例えばチロシン、ロイシン又はメチオニンへの置換。
(4)54位のアスパラギン酸の置換、例えばアスパラギン、アラニンへの置換。
(5)241位のチロシンの置換、例えばグルタミン、リシン、又はグルタミン酸への置換。
(さらなる置換)
(アマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換について)
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその基質特異性を変化させることができることを以前に報告した(例えば国際公開2013/162035号を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有してもよい。
(a)62位のアルギニン
(b)63位のロイシン
(c)102位のグルタミン酸
(d)106位のアスパラギン酸
(e)110位のグルタミン
(f)113位のアラニン
(g)355位のアラニン
(h)419位のアラニン
(i)68位のアスパラギン酸
(j)356位のアラニン
場合により62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸は、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸へと置換されてもよい。
場合により(b)63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸は、ヒスチジン又はアラニンへと置換されてもよい。
場合により(c)102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸は、リジンへと置換されてもよい。
場合により(d)106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換されてもよい。
場合により(e)110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はロイシン又はチロシンへと置換されてもよい。
場合により(f)113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリジン又はアルギニンへと置換されてもよい。
場合により(g)355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はセリンへと置換されてもよい。
場合により(h)419位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はリジンへと置換されてもよい。
場合により(i)68位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はアスパラギンへと置換されてもよい。
場合により(j)356位のアラニンに対応する位置のアミノ酸はトレオニンへと置換されてもよい。
(アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換について)
本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤耐性を向上させることができることを確認している。例えば特願2013−221515号及びPCT/JP2014/071036号明細書を参照のこと。これらの文献は参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。
(i)262位のアスパラギン、
(ii)257位のバリン、
(iii)249位のグルタミン酸
(iv)253位のグルタミン酸、
(v)337位のグルタミン、
(vi)340位のグルタミン酸、
(vii)232位のアスパラギン酸、
(viii)129位のアスパラギン酸、
(ix)132位のアスパラギン酸、
(x)133位のグルタミン酸、
(xi)44位のグルタミン酸、
(xii)256位のグリシン、
(xiii)231位のグルタミン酸、及び
(xiv)81位のグルタミン酸、
場合により262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸はヒスチジンへと置換されてもよい。
場合により257位のバリンに対応する位置のアミノ酸はシステイン、セリン、トレオニンへと置換されてもよい。
場合により249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。
場合により232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はプロリンへと置換されてもよい。
場合により256位のグリシンに対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により231位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
場合により81位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸はリジン、アルギニンへと置換されてもよい。
(アマドリアーゼの熱安定性を向上させるアミノ酸欠失について)
本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、3アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した(国際公開第2013/100006号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる)。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。本明細書においてカルボキシル末端からの3アミノ酸残基の欠失を、熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。
(アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得)
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
(ベクター)
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(STRATAGENE社製)等が好ましい。
(アマドリアーゼ遺伝子の変異処理)
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
(形質転換・形質導入)
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体DNAを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌K−12株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株(ともにタカラバイオ社製)や大腸菌B株、好ましくは大腸菌BL21株(ニッポンジーン社製)等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
(アミノ酸配列の同一性又は類似性)
アミノ酸配列の同一性又は類似性は、GENETYX Ver.11(ゼネティックス社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro(日立ソリューションズ社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、2以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該2以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。
、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号44、配列番号53又は配列番号67に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに50%以上、例えば60%以上、70%以上、71%以上、72%以上、73%以上、74%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、デヒドロゲナーゼ活性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号1における相同性領域のアミノ酸配列と75%以上、例えば80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、例えば99%以上の配列同一性を有する。
(アミノ酸に対応する位置の特定)
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
(置換箇所に対応する位置)
なお、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の280位のシステインに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの280位のシステインに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基(相当する位置のアミノ酸残基)」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1−3より特定することができる。
(基質特異性改変変異の対応位置)
なお、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の62位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの62位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
(界面活性剤耐性向上変異の対応位置)
なお、本明細書において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の44位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの44位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1により特定することができる。
(熱安定性向上欠失の対応位置)
本明細書において「配列番号1記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの3アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を意味する。Coniochaeta属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の3残基の配列は、435位のプロリン、436位のリジン及び437位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図1より特定することができる。
(本発明のアマドリアーゼの生産)
上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
(本発明のアマドリアーゼにおけるデヒドロゲナーゼ活性の向上)
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してオキシダーゼ活性が低下し、かつ/又はデヒドロゲナーゼ活性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のものと比較して、「デヒドロゲナーゼ活性」に対する「オキシダーゼ活性」の割合が低減していることを特徴とする。オキシダーゼ活性とは、基質を酸化する際、酸素分子に電子を受け渡す活性をいう。デヒドロゲナーゼ活性とは、基質を酸化する際、ヒドリド(H-)を電子アクセプターに受け渡す活性をいう。
(ハイスループットスクリーニング)
アマドリアーゼはさらに、機能性アマドリアーゼ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したアマドリアーゼ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、または液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ(例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005)、イーストディスプレイ(例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34)、バクテリアルディスプレイ(例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007)等を用いて、変異アマドリアーゼの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。アマドリアーゼバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の位置又はそれに対応する位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはデヒドロゲナーゼ活性の有無を利用しうる。変異導入と選別は複数回反復してもよい。
(アマドリアーゼ活性の測定方法)
アマドリアーゼの活性は、オキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性があり、種々の方法を用いることにより測定できる。一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
(アマドリアーゼのオキシダーゼ活性の測定方法)
本発明におけるアマドリアーゼのオキシダーゼ活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
A.試薬の調製
(1)試薬1:POD−4−AA溶液
4.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(東京化成工業社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、1Lに定容する。
(2)試薬2:TOOS溶液
500mgのTOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
(3)試薬3:基質溶液(30mM;終濃度 1mM)
フルクトシルバリン83mgをイオン交換水に溶解して10mlに定容する。
B.測定法
2.7mlの試薬1,100μlの試薬2、および100μlの試薬3を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、酵素液を100μl加えてよく混ぜた後、分光光度計(U−3010、日立ハイテクノロジーズ社製)により、555nmにおける吸光度を測定する。測定値は、555nmにおける1分後から3分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。37℃、1分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
ΔAs : 反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0 : 対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2: 反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数(mM−1・cm−1)
0.5 : 1molの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のmol数
df : 希釈係数。
(アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の測定方法)
本発明におけるアマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性の測定方法としては、酸素以外の電子メディエーターを電子アクセプターとして利用し、酸化型電子メディエーターの消費量を測定する方法や酵素反応により得られたホルマザン色素の生成量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、ホルマザン色素の生成量を測定する方法について示す。
C.試薬の調製
(4)試薬4:WST−3溶液
700mgのWST−3(2−(4−Iodophenyl)−3−(2,4−dinitrophenyl)−5−(2,4−disulfophenyl)−2H−tetrazolium, monosodium salt、同仁化学社製)をイオン交換水(pH7.0)に溶解し、100mLに定容する。
(5)試薬5:メトキシPMS(mPMS)溶液
50mgのmPMS(1−Methoxy−5−methylphenazinium methylsulfate、同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、10mlに定容する。
D.測定法
541μlの95mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に150μlの試薬4,9μlの試薬5、および25μlの酵素液を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、試薬3を25μl加えてよく混ぜた後、分光光度計(U−3010、日立ハイテクノロジーズ社製)により、433nmにおける吸光度を測定する。測定値は、433nmにおける1分後から2分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、25μlの試薬3の代わりに25μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。37℃、1分当たりに生成されるWST−3のホルマザン色素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
ΔAs : 反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0 : 対照液の1分間あたりの吸光度変化
31: 反応により生成されるWST−3のホルマザン色素のミリモル吸光係数(mM−1・cm−1)
df : 希釈係数。
(測定試薬キット、センサー)
ある実施形態において、本発明は、デヒドロゲナーゼ活性の向上した本発明のアマドリアーゼを含む、HbA1c測定キット及びHbA1c測定装置を提供する。このキット又は装置は、場合により電子メディエーターを含んでもよい。
[実施例1]
(デヒドロゲナーゼ活性向上型変異について)
(1)組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7 DNAの調製
CFP−T7遺伝子(配列番号2)を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)株(国際公開2007/125779号参照)を、LB−amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。
(2)組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7 DNAの部位特異的改変操作
得られた組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7 DNAを鋳型として、配列番号14、15の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
(3)各種改変型アマドリアーゼの生産
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB−amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
(4)各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、上記のオキシダーゼ活性測定法およびデヒドロゲナーゼ活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の評価を行った。結果の一例を表1に示す。
[実施例2]
(CFP−T7、CFP−T7−280Qの精製)
実施例1で得たCFP−T7およびCFP−T7−280Qの粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で平衡化した4mlのQ Sepharose Fast Flow樹脂(GEヘルスケア社製)に吸着させ、次に80mlの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて100mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
(オキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価)
上記のようにして得た精製酵素CFP−T7およびCFP−T7−280Qのオキシダーゼ活性、デヒドロゲナーゼ活性を評価した。実施例1に準じたオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性測定方法に従って、評価を行った。ただし、用いた基質は30mMのαFVHであり、測定に用いた酵素の280nmの吸光度が1あたりの酵素活性値(U/A280)を算出した。結果の一例を表2に示す。表中のOX/DH(%)は、元酵素CFP−T7のOX/DH比を100とした場合のパーセンテージを示す。
[実施例3](各種アマドリアーゼの部位特異的改変操作)
(組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5 DNAの調製)
配列番号44はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(EFP-T5)の改変型酵素のアミノ酸配列であり、配列番号44のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号45)を挿入した組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5を保持する大腸菌により生産できる(国際公開第2007/125779号公報参照)。pUTE100K’-EFP-T5を保持する大腸菌JM109株を「実施例1 (1)組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pUTE100K’-EFP-T5を抽出、精製した。
(Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
EFP-T5にデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpUTE100K’-EFP-T5を鋳型にして、配列番号46、47の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のEFP-T5変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号44記載のアミノ酸配列の280位のシステインがグルタミンに置換されたEFP-T5遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pUTE100K’-EFP-T5−280Q)を得た。
(組換え体プラスミドpET22b-PnFX DNAの調製)
配列番号9はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(PnFX)のアミノ酸配列であり、配列番号9のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号49)を挿入した組換え体プラスミドpET22b-PnFXを保持する大腸菌により生産できる(国際公開第2013/162035号公報参照)。pET22b-PnFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例1 (1)組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pET22b-PnFXを抽出、精製した。
(Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
PnFXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドpET22b-PnFXを鋳型にして、配列番号50、51の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のPnFX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号9記載のアミノ酸配列の276位のシステインがグルタミンに置換されたPnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b-PnFX-276Q)を得た。
(組換え体プラスミドpET22b-AnFX DNAの調製)
配列番号53はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために59位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(AnFX)のアミノ酸配列であり、配列番号53のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号54)を挿入した組換え体プラスミドpET22b-AnFXを保持する大腸菌により生産できる(国際公開第2012/018094号公報参照)。pET22b-AnFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例1 (1)組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pET22b-AnFXを抽出、精製した。
(Aspergillus nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
AnFXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpET22b-AnFXを鋳型にして、配列番号55、56の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のAnFX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号53記載のアミノ酸配列の280位のシステインがグルタミンに置換されたAnFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pET22b-AnFX-280Q)を得た。
(組換え体プラスミドpKK223-3-CcFX DNAの調製)
配列番号6はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ(CcFX)のアミノ酸配列である(国際公開第WO2004/104203号)。配列番号6のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号58)を挿入した組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを保持する大腸菌により生産できる(国際公開第2015/020200号公報参照)。pKK223-3-CcFXを保持する大腸菌JM109株を「実施例1 (1)組換え体プラスミドpK223-3-CFP-T7 DNAの調製」に記載の方法に従って培養し、pKK223-3-CcFXを抽出、精製した。
(Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
CcFXにデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合を改善する変異を導入するために、組換え体プラスミドpKK223-3-CcFXを鋳型にして、配列番号59、60の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、実施例1と同様の条件でPCR反応、大腸菌JM109の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドDNA中のCcFX変異体をコードするDNAの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号6記載のアミノ酸配列の278位のシステインがグルタミンに置換されたCcFX遺伝子をコードする組換え体プラスミド(pKK223-3-CcFX-278Q)を得た。
(Emericella nidulans由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入)
配列番号67はEmericella nidulans由来糖化ヘキサペプチドオキシダーゼ(En42FX)のアミノ酸配列である(国際公開第WO2015/005258号)。配列番号67のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号68)を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した(終止コドンTAAを含む)。続いて、取得した配列番号69の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.製)のユーザーマニュアルに従って、配列番号68の遺伝子を含む断片を、配列番号69,70の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。平行して、pET22bを含む断片を、配列番号71、72の合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。続いて、In-fusion反応により、配列番号68の遺伝子を含む断片を、pET22bを含む断片にサブクローニングし、組換え体プラスミドpET22b-En42FXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109 (pET22b-En42FX)株を得た。
(各種改変型アマドリアーゼの生産)
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株、もしくは大腸菌BL21(DE3)株を、0.1mMのIPTGを添加したLB−amp培地3mlにおいて、25℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
(各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性およびデヒドロゲナーゼ活性評価)
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、上記のオキシダーゼ活性測定法およびデヒドロゲナーゼ活性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼのオキシダーゼ活性とデヒドロゲナーゼ活性の評価を行った。結果を表3−7に示す。表4、5、6中、オキシダーゼ活性(%)とデヒドロゲナーゼ活性(%)は、それぞれの野生型酵素または元酵素のオキシダーゼ活性(U/mL)を100とした場合のパーセンテージで示す。また表3−7中のOX/DH(%)は、それぞれの野生型酵素または元酵素のOX/DH比を100とした場合のパーセンテージを示す。
[実施例4]
(印刷電極によるαFVHの定量)
実施例2で得たCFP−T7及びCFP−T7−280Qの精製酵素を用いて、印刷電極測定によるαFVHの定量を行った。具体的には、カーボンの作用電極、銀塩化銀の参照電極が印刷されてなる、DEP Chip電極(DEP−EP−PP,丸形・カーボン・ダムリング付き;バイオデバイステクノロジー社製)上に、終濃度3.75mM又は7.5mMのmPMS、終濃度約10mMのリン酸緩衝液(pH7.0)及び1mM αFVHに対して50mUの各種精製酵素液を15μLに溶解した液を載せた。その後、DEP Chip専用コネクターを用いて、小型ポテンショスタット BDT miniSTAT 100(バイオデバイステクノロジー社製)に接続した。そして、+200mV(v.s. Ag/AgCl)の電圧を印加して、所定濃度のαFVH溶液5μLをそれぞれ電極上に載せて反応を行い、120秒後の電流値を測定した。CFP−T7を用いて反応させた各αFVH濃度における電流応答値をプロットした結果を図3に、CFP−T7−280Qを用いて反応させた各αFVH濃度における電流応答値をプロットした結果を図4に示す。
配列の簡単な説明
配列番号1 CFP−T7のアミノ酸配列
配列番号2 CFP−T7の遺伝子配列
配列番号3 Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号4 Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号5 Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号6 Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号7 Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号8 Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号9 Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号10 Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号11 Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号12 Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号13 Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号14 C280Q-Fw
配列番号15 C280Q-Rv
配列番号16 C280S-Fw
配列番号17 C280D-Fw
配列番号18 C280E-Fw
配列番号19 C280M-Fw
配列番号20 C280K-Fw
配列番号21 C280R-Fw
配列番号22 C280V-Fw
配列番号23 C280N-Fw
配列番号24 F267Y-Fw
配列番号25 F267X-Rv
配列番号26 F269Y-Fw
配列番号27 F269X-Rv
配列番号28 D54N-Fw
配列番号29 D54X-Rv
配列番号30 D54A-Fw
配列番号31 Y241E-Fw
配列番号32 Y241X-Rv
配列番号33 Y241Q-Fw
配列番号34 Y241K-Fw
配列番号35 CFP-T7 C280X r
配列番号36 CFP-T7 C280H f
配列番号37 CFP-T7 C280T f
配列番号38 CFP-T7 F267X r
配列番号39 CFP-T7 F267L f
配列番号40 CFP-T7 F267M f
配列番号41 CFP-T7 F269X r
配列番号42 CFP-T7 F269L f
配列番号43 CFP-T7 F269M f
配列番号44 EFP-T5 protein
配列番号45 EFP-T5 gene
配列番号46 EFP C280X r
配列番号47 EFP C280Q f
配列番号48 EFP C280S f
配列番号49 PnFX gene
配列番号50 Pn C276X r
配列番号51 Pn C276Q f
配列番号52 Pn C276S r
配列番号53 AnFX protein
配列番号54 AnFX gene
配列番号55 An C280X r
配列番号56 An C280Q f
配列番号57 An C280S f
配列番号58 CcFX gene
配列番号59 Cc C278X r
配列番号60 Cc C278Q f
配列番号61 Cc C278S f
配列番号62 Cc F265X r
配列番号63 Cc F265L f
配列番号64 Cc F265M f
配列番号65 Cc F267X r
配列番号66 Cc F267L f
配列番号67 En42FX protein
配列番号68 En42FX gene
配列番号69 In-fusion En42X insert
配列番号70 In-fusion En42X insert
配列番号71 In-fusion pET22b vector
配列番号72 In-fusion pET22b vector
配列番号73 En C280X r
配列番号74 En C280Q f
配列番号75 En C280S f
配列番号76 En F267X r
配列番号77 En F267L f
配列番号78 En F267M f
配列番号79 En I269X r
配列番号80 En I269L f
配列番号81 En I269M f
配列番号82 Cc F267M f
Claims (16)
- デヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合(OX/DH)が、改変前のアマドリアーゼと比較して低減している改変アマドリアーゼであって、
(i) 前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号44、配列番号53又は配列番号67のアミノ酸配列と70%以上の配列同一性を有し、配列番号1の第10位〜32位、36〜41位、49〜52位、54〜58位、63〜65位、73〜75位、84〜86位、88〜90位、120〜122位、145〜150位、156〜162位、164〜170位、180〜182位、202〜205位、207〜211位、214〜224位、227〜230位、236〜241位、243〜248位、258〜261位、266〜268位、270〜273位、275〜287位、295〜297位、306〜308位、310〜316位、324〜329位、332〜334位、341〜344位、346〜355位、357〜363位、370〜383位、385〜387位、389〜394位、405〜410位及び423〜431位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが90%以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
(ii) 前記改変前のアマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号44、配列番号53又は配列番号67のアミノ酸配列を有するものであり、前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、さらに、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置以外の位置における1又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、或いは
(iv) 前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が置換されており、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号1、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号44、配列番号53又は配列番号67のアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有し、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する改変アマドリアーゼ、
からなる群より選択され、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、トレオニン及びアスパラギンからなる群より選択される極性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択される荷電アミノ酸、又はメチオニンに置換されている、前記改変アマドリアーゼ。 - さらに、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン、トリプトファン、バリン又はアラニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における54位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、グリシン又はバリンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸又はヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、請求項1に記載の改変アマドリアーゼ。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン、チロシン、イソロイシン又はトリプトファンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における54位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、請求項2に記載の改変アマドリアーゼ。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、セリン、ヒスチジン、トレオニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン又はメチオニンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における54位に対応する位置のアミノ酸が、アスパラギン又はアラニンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、グルタミン酸又はリシンに置換されている、請求項3に記載の改変アマドリアーゼ。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン、又はセリンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン、ロイシン又はチロシンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における241位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、請求項3に記載の改変アマドリアーゼ。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミン又はヒスチジンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、請求項3に記載の改変アマドリアーゼ。 - 配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置のアミノ酸が、グルタミンに置換されている、
配列番号1に示すアミノ酸配列における267位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、或いは
配列番号1に示すアミノ酸配列における269位に対応する位置のアミノ酸が、メチオニン又はロイシンに置換されている、請求項3に記載の改変アマドリアーゼ。 - 前記改変アマドリアーゼのデヒドロゲナーゼ活性に対するオキシダーゼ活性の割合(OX/DH)が、配列番号1に示すアミノ酸配列における280位に対応する位置についての改変が行われる前のアマドリアーゼ(100%)と比較して80%未満に低減されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- 前記改変前のアマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属由来である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- 前記改変前のアマドリアーゼが、配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号44、配列番号53又は配列番号67に示すアミノ酸配列を有し、前記改変アマドリアーゼが請求項1〜7のいずれかに規定したアミノ酸置換を有する、請求項1〜9のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ。
- さらに、前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置にアミノ酸置換又は欠失を1以上有し、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ、
(A)62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位及び356位、
(B)262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位及び81位、並びに
(C)カルボキシル末端の435位、436位及び437位の3アミノ酸残基の欠失。 - さらに、前記改変アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号1に示すアミノ酸配列における以下からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸の1以上が、以下からなる群より選択されるアミノ酸に置換されており又は欠失しており、かつデヒドロゲナーゼ活性及びオキシダーゼ活性を有する、請求項11に記載の改変アマドリアーゼ、
(A)62位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸の、アラニン、アスパラギン又はアスパラギン酸への置換、
63位のロイシンに対応する位置のアミノ酸の、ヒスチジン又はアラニンへの置換、
102位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸の、リジンへの置換
106位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸の、アラニン、リジン、又はアルギニンへの置換、
110位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のロイシン又はチロシンへの置換、
113位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジン又はアルギニンへの置換、
355位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換、
419位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、
68位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のアスパラギンへの置換、
356位のアラニンに対応する位置のアミノ酸のトレオニンへの置換、
(B)262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、
257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステイン、セリン、トレオニンへの置換、
249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換、
44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、
256位のグリシンに対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
231位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、
81位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジン、アルギニンへの置換、並びに(C)435位のプロリン、436位のリジン及び437位のロイシンに対応する位置のカルボキシル末端3アミノ酸の欠失。 - 請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼを含むHbA1c測定試薬キット。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼを含む酵素電極。
- 請求項14に記載の酵素電極を作用電極として有する酵素センサー。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の改変アマドリアーゼ又は請求項14に記載の酵素電極若しくは請求項15に記載の酵素センサー及び電子メディエーターを用いる、HbA1cの測定方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP2520650A3 (en) | 2006-04-25 | 2012-11-21 | Kikkoman Corporation | Eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability, gene and recombinant DNA for the eukaryotic amadoriase, and process for production of eukaryotic amadoriase having excellent thermal stability |
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