JP2009511044A - 導入遺伝子発現のリピート誘発サイレンシングを減少させる方法および改良された蛍光バイオセンサー - Google Patents

導入遺伝子発現のリピート誘発サイレンシングを減少させる方法および改良された蛍光バイオセンサー Download PDF

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Abstract

導入遺伝子のリピートおよび相同性誘発サイレンシングを回避する方法であって、遺伝子サイレンシングの影響を減少するよう導入遺伝子配列が遺伝子改変されている方法、細胞株またはインビボにおける発現の改善のためのかかる遺伝子改変を含むFRETバイオセンサーが開示される。

Description

本発明は、細胞および完全生物における組換え遺伝子構築物の発現の改良方法に関し、特に、導入遺伝子発現のリピートまたは相同性誘発サイレンシングに対する感受性が減少した組換え遺伝子構築物の設計および発現に関する。
真核生物は、外来核酸の侵入および発現に対して各種の有効な防御システムを有する。これらの防御システムは近年、遺伝子治療や植物および動物において外来導入遺伝子を発現させる他の試みにとって重要な障害と認識されている。例えば、Bestor, 2000, Gene silencing as a threat to the success of gene therapy, J. Clin. Invest. 105(4): 409-11を参照。真核生物防御メカニズムは様々な作用様式にて媒介されうるが、共通するトリガーの１つは導入遺伝子核酸におけるリピートDNAの存在である。
例えば、遺伝子サイレンシングは転写レベルまたは転写後レベルのいずれにおいても起こりうるものであり、またDNAのメチレーションおよびクロマチン構造の変化を伴う場合もある。転写サイレンシングのある型は「リピート誘発遺伝子サイレンシング」 (RIGS)と呼ばれており、少なくとも13年前にシロイヌナズナにおいて報告された（Assaad et al., 1992, Somatic and germinal recombination of a direct repeat in Arabidopsis, Genetics 132(2): 553-66）。RIGSは、反復するDNA配列の存在に厳密に依存し、また安定状態のmRNAの非存在、DNAメチレーションの増加、および酵素消化に対するDNAの耐性の増加と一致する。これらの観察から、YeおよびSignerは反復したヌクレオチド配列がクロマチンにヘテロクロマチン形成と同様の転写困難な局部構造をとらせると仮定した（Ye and Signer, 1996, RIGS (repeat-induced gene silencing) in Arabidopsis is transcriptional and alters chromatin configuration）。
より最近RIGSは他の真核生物においても報告され、現在は普遍的なサイレンシングメカニズムと考えられている（Henikoff, 1998, Conspiracy of silence among repeated transgenes, Bioessays 20(7): 532-5）。例えば、真菌Neurospora crassaにおいてDNAメチレーションおよびクロマチン構造の変化がRIGSに関連することも方向されている（Meyer, 1996, Repeat-induced gene silencing: common mechanisms in plants and fungi, Biol. Chem. Hoppe Seyler 377(2): 87-95）。Garrickらは、トランスジェニックマウス系統において導入遺伝子コピー数が減少すると、クロマチン凝縮の減少および導入遺伝子位置でのメチレーションの減少に伴い導入遺伝子発現の顕著な増加が起こることを報告した（Garrick et al., 1998, Repeat-induced gene silencing in mammals, Nat. Genet. 18(1): 5-6）。さらに、マウス胚性癌肝細胞においてヒストンデアセチラーゼ阻害剤により多コピーの導入遺伝子のサイレンシングが減少することが報告され、このことはRIGSがインビトロで哺乳動物細胞におけるサイレンシングを惹起するために重要な少なくとも1のメカニズムであることを示唆する（McBurney et al., 2002, Evidence for repeat-induced gene silencing in cultured mammalian cells: inactivation of tandem repeats of transfected genes, Exp. Cell Res. 274(1): 1-8）。RIGSはほとんどの場合メチレーションと関連するが、修飾されたDNAが検出されないDrosophila melanogasterにおいてもリピート導入遺伝子がサイレンシングを受ける（Dorer and Henikoff, 1997, Transgene repeat arrays interact with distant heterochromatin and cause silencing in cis and trans, Genetics 147: 1181-1190）。したがって、メチレーション非依存的なRIGSのメカニズムも存在する可能性がある。
RIGSはまた、植物において「転写シス不活性化」呼ばれ、なぜなら近隣の反復する配列と導入遺伝子アレイとの間でサイレンシングが観察されるからである。しかしながら、導入遺伝子の転写遺伝子サイレンシング (TGS) は、パラミューテーション様メカニズムと異所トランス不活性化(ectopic trans-inactivation)の両方によってトランスでも起こりうる（Vaucheret et al., 1998, Transgene-induced gene silencing in plants, Plant J. 16(6): 651）。パラミューテーションは本来天然のエピジェネティックな現象であり、ここではサイレント化された相同コピーが存在すると宿主遺伝子がサイレントとなりメチル化され、次の交配で他のコピーを不活性化する能力を獲得できる（Vaucheret at al., 1998; Meyer et al., 1993, Differences in DNA methylation are associated with a paramutation phenomenon in transgenic petunia, Plant J. 4:89-100）。このメカニズムには、ショウジョウバエにおいてふ入り位置効果（position-effect variegation、PEV)の伝達について見られるように、DNA-DNA対合およびサイレントコピーから不活性コピーへのクロマチン構造の伝達が関与すると考えられている（Vaucheret at al., 1998; Karpen, 1994, Position-effect variegation and the new biology of heterochromatin, Curr. Opin. Genetic Dev. 4: 281-91）。
異所トランス不活性化は、非連鎖のサイレント化された相同導入遺伝子が存在すると活性な導入遺伝子がサイレント化されるが、他の非連鎖導入遺伝子をトランスで不活性化する能力を獲得しない点でパラミューテーションと異なる（Vaucheret at al., 1998; Matzke et al., 1989, Reversible methylation and inactivation of marker genes in sequentially transformed tobacco plants, EMBO J. 8: 643-49）。欠失解析から、導入遺伝子のプロモーター領域に相同な90塩基対が存在すればこのタイプのサイレンシングに十分であり、相同プロモーター領域がこの現象の標的の1つであることが示唆されることが示されている（Thierry and Vaucheret, 1996, Sequence homology requirements for transcriptional silencing of 35S transgenes and post-transcriptional silencing of nitrate reductase (trans) genes by the tobacco 271 locus, Plant Mol. Biol. 32: 1075-83）。異所トランス不活性化の可能性あるメカニズムには、安定に組み込まれた導入遺伝子と、ゲノムの離れた位置に存在する相同プロモーターを有する別の遺伝子との間の直接DNA対合が含まれる（Vaucheret, 1998）。別の可能性あるメカニズムは、RNA-DNA 相互作用を介して相同遺伝子座のメチレーションおよびサイレンシングをもたらす拡散性RNAの産生であろう（Vaucheret at al., 1994, Promoter dependent trans-inactivation in transgenic tobacco plants: kinetic aspects of gene silencing and gene reactivation, C.R. Acad. Sci. Paris 317:310-23; Park et al., 1996, Gene silencing mediated by promoter homology occurs at the level of transcription and results in meiotically heritable alterations in methylation and gene activity, Plant J. 9: 183-94; Wassenegger and Pelissier, 1998, A model for RNA-mediated gene silencing in higher plants, Plant Mol. Biol. 37: 349-62）。
前述のように、反復するDNAの結果としての遺伝子サイレンシングは転写後レベルにおいても起こり、すなわちその場合転写が起こってもRNAが蓄積しない。例えば、MaおよびMitraにより報告されるように、トランスジェニックタバコ植物において内在性のダイレクトリピートを有する導入遺伝子が非常に高頻度に転写後遺伝子サイレンシングを誘導した（Ma and Mitra, 2002, Intrinsic direct repeats generate consistent post-transcriptional gene silencing in tobacco, Plant J. 31(1): 37-49）。他にも、トランスジェニック植物における非ウイルス性導入遺伝子の転写後サイレンシングが、導入遺伝子とウイルス配列との間に相同性がある場合に後のウイルス感染を防ぐことが示されている（English et al., 1996, Suppression of virus accumulation in transgenic plants exhibiting silencing of nuclear genes, Plant Cell 8(2): 179-88）。真菌N. crassaにおいて、リピート誘発点突然変異 (RIP) は、DNAメチレーションの増加とRIP領域から発現したmRNA転写物の分解の両方をもたらす（Galagan and Selker, 2004, RIP: the evolutionary cost of genome defense, Trends Genet. 20(9): 417-23; Chicas et al., 2004, RNAi-dependent and RNAi-independent mechanisms contribute to the silencing of RIPed sequences in N. crassa, Nucleic Acids Res. 32(14): 4237-43）。
転写後遺伝子サイレンシング (PTGS) は、もともと植物における導入遺伝子と相同宿主遺伝子との協調的サイレンシング（「コサプレッション」と呼ばれる）として発見された（Napoli et al., 1990, Introduction of a chimeric chalcone synthesis gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans, Plant Cell 2(4): 279-89）。その後、植物宿主遺伝子の完全転写配列の一部または全体をコードする数多くの導入遺伝子が相同宿主遺伝子のコサプレッションを惹起することが示されている（Depicker and van Montagu, 1997, Post-transcriptional gene silencing in plants, Curr. Opinion Cell Biol. 9: 373-382）。コサプレッションは一般に発現の強い導入遺伝子に関連し、このことからRNAの異常なレベルまたは複数の遺伝子コピー数に関するメカニズムが示唆される。例えば以下を参照：Lehtenberg et al., 2003, Neither inverted repeat T-DNA configurations nor arrangements of tandemly repeated transgenes are sufficient to trigger transgene silencing, Plant J. 34(4): 507-17。しかしながら、宿主遺伝子発現のPTGSは転写の弱い導入遺伝子またはプロモーターを有さない導入遺伝子の存在下でも観察されており、これはDNA-DNA対合がコサプレッションに関与している可能性を示唆する（Vaucherot et al., 1998; van Blokland et al., 1994, Transgene-mediated suppression of chalcone synthase expression in Petunia hybrida results in an increase in RNA turnover, Plant J. 6: 861-77）。
より最近、RNA干渉 (RNAi)と呼ばれる強力な型のPTGSが発見された。RNAiは当初無脊椎生物の線虫において報告されたが、現在ではショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、および哺乳動物を含む広範な真核生物において起こることが知られている（Fire et al., 1998, Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in C. elegans, Nature 391: 806-11）。RNAiのメカニズムは広く研究されており、宿主遺伝子に相同性を有する二本鎖RNA (dsRNA)の形成が関与し、このdsRNAが切断されて低分子干渉RNA (siRNA) 分子となり、これが細胞質における相同宿主RNAの分解および核における相同DNAの新規メチレーションを惹起する（Jana et al., 2004, Mechanisms and roles of the RNA-based gene silencing, Elec. J. Biotechnol. 7(3); Matzke and Birchler, 2005, RNAi-mediated pathways in the nucleus, Nat. Rev. Genet. 6(1): 24-35）。
多くの研究者や会社が、RNAiの特異性および効力を生かして、疾病遺伝子のサイレンシングおよびウイルスの発現および複製の阻害のためのdsRNAに基づく治療法を開発している。しかしながら、遺伝子サイレンシングメカニズムが遺伝子治療や細胞および完全生物における異種遺伝子の発現についてもたらしうる障害に注目している研究者は少ない。米国特許第6635806号は、トランスジェニックトウモロコシにおける相同性に基づく遺伝子サイレンシングを回避するための代替植物種由来のプロモーター、エンハンサー、コード配列、およびターミネータの使用について記載する。米国特許出願公開第20050191723号は、複数の導入遺伝子の発現のためのStabilizing Anti-Repressor (STARTM)配列の使用について記載する。STARTM 配列は、導入遺伝子を遺伝子サイレンシング、特にRIGSから保護する、遺伝子転写制御活性を有するDNAエレメントとして記載される。最後に、米国特許出願公開第20031057715号は、Drosophilaにおいてクロマチン応答エレメント (CRE)に結合し、クロマチンリモデリングおよび遺伝子サイレンシングの減少をもたらす低分子量DNA特異的化合物の使用について記載する。あらゆる生物におけるあらゆるリピート駆動遺伝子サイレンシングメカニズムを減少または回避するため導入遺伝子構造を改良するための、広く適用可能かつ単純な方法が必要とされる。
本発明は、細胞または完全生物での同種または異種遺伝子または導入遺伝子の発現における宿主遺伝子サイレンシングメカニズムによる干渉に対する解決法を提供する。特に、本発明は、細胞における1以上の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを減少させる方法を提供し、この方法は前記1以上の導入遺伝子の少なくとも1のリピートまたは相同領域における同一性レベルが減少するように、前記1以上の導入遺伝子に少なくとも1の遺伝子改変を導入すること、および前記1以上の導入遺伝子を前記細胞にトランスフェクトすることを含み、それにより該1以上の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングが減少する。本方法は、リピートDNAの存在によって引き起こされるいずれのタイプの遺伝子サイレンシングの減少にも適用可能であり、限定はされないが、例えばリピート誘発遺伝子サイレンシング (RIGS)、リピート誘発点突然変異 (RIP)、パラミューテーション、異所トランス不活性化（ectopic trans-inactivation）、コサプレッション（co-suppression) およびRNA干渉である。本方法はまた、リピートまたは相同領域が1の導入遺伝子または2以上の異なる導入遺伝子に存在する場合に適用可能であり、また、リピートまたは相同領域が導入遺伝子と宿主細胞のDNAの両方に存在する場合にも適用可能である。
本発明の方法は、様々な導入遺伝子に適用可能である。例えば、本方法は、発現すべき導入遺伝子が宿主遺伝子と高レベルの同一性を示す場合、または導入遺伝子が宿主遺伝子の一部と高レベルの同一性示すドメインまたはひと続きの塩基を含む場合に使用することができる。本発明は、高レベルの同一性を有する2つのモノマー配列の融合により産生された人工一本鎖ダイマーをコードする一本鎖導入遺伝子をより効率よく発現させるために使用することができる。本方法はまた、重複するドメインを有するタンパク質、例えばABCトランスポーター、をコードする単一の導入遺伝子を発現するため、および、実質的に類似するドメインを有する2以上の異なる導入遺伝子を発現するために使用することができる。
特に本発明者らは、本発明の方法が、リガンド結合タンパク質部分、リガンド結合タンパク質部分に融合したドナーフルオロフォア部分、およびリガンド結合タンパク質部分に融合したアクセプターフルオロフォア部分を含む、リガンド結合蛍光インジケーターまたはバイオセンサーの発現および効力を増加させるのに有用であることを発見した。多くのバイオセンサーの2つのフルオロフォアは同じフルオロフォア遺伝子に由来し高レベルの同一性を示すので、本発明者らは遺伝子サイレンシングが完全生物、特に植物におけるかかるバイオセンサーの発現に非常に影響しうることを発見した。本発明者らは、バイオセンサーのフルオロフォア配列間の同一性を減少させることにより、かかるフルオロフォアの発現が有意に増強されうることを発見した。
したがって、とりわけある態様において、本発明は、リガンド結合蛍光インジケーターをコードする単離核酸およびその使用方法を提供し、このインジケーターはリガンド結合タンパク質部分、リガンド結合タンパク質部分に融合したドナーフルオロフォア部分、およびリガンド結合タンパク質部分に融合したアクセプターフルオロフォア部分を含み、ここでドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)はドナー部分が励起され、かつ前記リガンドがリガンド結合タンパク質部分に結合したときに変化し、またここで前記ドナーフルオロフォア部分または前記アクセプターフルオロフォア部分のいずれかの少なくとも1方をコードする核酸配列はドナーフルオロフォア部分をコードする核酸とアクセプターフルオロフォア部分をコードする核酸の間の核酸配列同一性のレベルが減少するように遺伝子改変されている。本発明の方法では、フルオロフォア配列の両方または一方が核酸配列同一性を減少させるために遺伝子改変されうる。
様々な遺伝子改変を本発明の方法に用いることができ、限定はされないが例えば、ドナーまたはアクセプターフルオロフォアコード配列のゆらぎ位置における保守的アミノ酸置換および縮重置換をコードする塩基変化である。しかしながら、ドナーおよびアクセプターフルオロフォア部分の発光または吸収スペクトルを変化させる変異は、バイオセンサーの活性を損なう改変であるため除かれる。
遺伝子サイレンシングによる干渉が減少することにより、本発明のバイオセンサーは、遺伝子改変されたコード核酸から発現させると、遺伝子改変を含まない核酸から発現される同じまたは類似のバイオセンサーと比較してインビボで増強された機能を示す。
導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを減少させる方法
前述のように、本発明は細胞における1以上の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを減少させる方法であって、該1以上の導入遺伝子に該1以上の導入遺伝子の少なくとも1のリピートまたは相同領域における同一性または相同性のレベルが減少するように少なくとも1の遺伝子改変を導入すること、および該1以上の導入遺伝子を該細胞にトランスフェクトすることを含み、これにより該1以上の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングが減少する方法を提供する。
本明細書で用いる「遺伝子サイレンシング」なる語句は、転写レベルまたは転写後レベルで起こるいずれの形式の遺伝子サイレンシングをも包含する意味であり、限定はされないが、例えば、リピート誘発遺伝子サイレンシング (RIGS)、リピート誘発点突然変異 (RIP) 、パラミューテーション、異所トランス不活性化、コサプレッション、およびRNA干渉である。異なる形式の遺伝子サイレンシング間に共通するメカニズムがDNAのリピートまたは相同領域の存在であることを考慮すると、「遺伝子サイレンシング」はまた「遺伝子発現または導入遺伝子発現のリピートまたは相同性誘発サイレンシング」を意味し、あるいは、「リピートまたは相同性駆動または関連導入遺伝子サイレンシング」を意味する。これらの択一的語句は具体的語句である「リピート誘発遺伝子サイレンシング」または「RIGS」と混同されるべきではなく、後者はクロマチン構造の変化および場合によってメチル化が関与する特定のタイプの転写遺伝子サイレンシングを意味するものである。これらの択一的語句はまた「相同性誘発遺伝子サイレンシング」と混同されるべきではなく、後者は「コサプレッション」なる用語と互換的に使用される当業界にて知られる語句であり、すなわち、内在宿主遺伝子との相同性を示す外来遺伝子の導入により内在および外来遺伝子両方の転写後遺伝子サイレンシングがおこるものである。
本発明に関して、用語「リピート」は別のDNA配列と同一であるDNA配列を意味するのに用いられる。用語「相同性」または「相同」は、別のDNA配列と転写または転写後遺伝子サイレンシングにより遺伝子発現の減少が起こるのに十分な同一性を有するDNA配列を意味するのに用いられる。かかる領域は、単一の導入遺伝子内に、1以上の導入遺伝子において、または宿主ゲノムと比較する場合の1以上の導入遺伝子においてに存在しうる。導入遺伝子におけるかかる領域の存在は、本明細書に記載の1以上の形式の遺伝子サイレンシングを欠く宿主細胞において導入遺伝子を発現させた場合の導入遺伝子発現の増加により検出可能である。
本発明の「リピート」および「相同」領域は、遺伝子サイレンシングをもたらすのに十分であればいかなる長さであってもよいが、典型的には少なくとも 10、少なくとも 15、少なくとも 20、少なくとも 25、少なくとも 30、少なくとも 40、少なくとも 50、少なくとも 75、少なくとも 100、または少なくとも 200塩基の長さである。「相同」領域は、少なくとも 50%、少なくとも 60%、少なくとも 70%、少なくとも 75%、少なくとも 80%、少なくとも 85%、少なくとも 90%、少なくとも 95%、少なくとも 98%、または少なくとも 99% 同一である。遺伝子サイレンシングには個々の遺伝子に由来する21〜28塩基対のサイズの短い二本鎖RNAが関与する場合があり、よってかかる態様におけるリピートは好ましくは最大3つ、次に好ましくは最大2つ、また次に好ましくは1つのミスマッチを有する少なくとも21塩基の配列を含む。
「遺伝子サイレンシング」は、DNAのリピートまたは相同領域の存在の結果としての、遺伝子発現のレベルまたは発現遺伝子から産生されるRNAまたはタンパク質のレベルのいかなる減少をも意味する。よって、遺伝子サイレンシングを「減少」または「低減」する方法は、遺伝子サイレンシングを減少または低減するが必ずしも除去または阻害しないあらゆる方法を意味する。本明細書に記載の方法を用いて遺伝子サイレンシングを除去または阻害する方法もまた含まれる。遺伝子サイレンシングの減少は、本発明の方法非存在下での同じ宿主細胞または生物におけるmRNAレベルまたはタンパク質レベルと比較して、開示の本発明の方法によりもたらされるmRNA レベルまたはタンパク質レベルを測定することにより検出可能である。
本明細書で用いる用語「導入遺伝子」は、宿主細胞ゲノムから発現する「内在」遺伝子に対して、宿主細胞または完全生物において組換えにより発現するあらゆる単離「外来」遺伝子を意味する。導入遺伝子は「異種」遺伝子を含み、これは異なる生物内または異なる生物の細胞内に配置されるある生物のゲノムに由来する遺伝子である。導入遺伝子はまた、宿主細胞または宿主生物と同じ生物に由来する外来遺伝子を含み、これは例えば、異なる機能または発現特性を持つように変異導入されているか内在遺伝子と異なる調節配列下に配置されている。また、欠損する内在遺伝子を補完する目的、または類似の内在遺伝子のコピー数または発現レベルを増加させる目的で、宿主細胞または生物に由来する外来遺伝子を宿主に導入することも可能である。用語「遺伝子」は、核酸のタンパク質コード部分のみならず、プロモーター領域および転写および翻訳を含む遺伝子の発現に関与するあらゆる上流および下流調節領域をも含む意味である。
本発明の方法は、遺伝子サイレンシングの減少または遺伝子発現の増加を目的とした、遺伝子サイレンシングに関与する遺伝子のリピートまたは相同領域に対するあらゆる遺伝子改変の使用を含み、限定はされないが、例えば置換、挿入、および欠失であり、遺伝子改変は遺伝子サイレンシングを減少させ、遺伝子発現を増加させ、また導入遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なわなければよい。かかる改変は、導入遺伝子の上流および下流調節領域の遺伝子修飾を含む。かかる改変には、導入遺伝子コード配列における保守的アミノ酸置換をコードするものも含まれる。
保守的アミノ酸置換は、通常、タンパク質の構造および機能的性質を保存するアミノ酸置換として定義される。別のアミノ酸との保守的置換を許容するアミノ酸の化学的性質は、当業者に周知である。例えば、疎水性アミノ酸には、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびノルロイシンが含まれる。中性および親水性アミノ酸には、システイン、セリンおよびスレオニンが含まれる。酸性アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。塩基性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシンおよびアルギニンが含まれる。芳香族性アミノ酸には、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンが含まれる。グリシンおよびプロリンは、鎖の配向および屈曲に影響しうる2つのアミノ酸である。
本発明のある態様において、縮重置換が導入遺伝子の1以上のゆらぎ位置になされうる。かかる置換は、コードされるアミノ酸配列を変化させることなく導入遺伝子の核酸コード配列を変化させるため好ましい。用語「ゆらぎ（wobble）」は、tRNAといくつかの可能性あるコドンとのアライメントを許容する、tRNAのアンチコドンのある位置における制約の減少を意味する用語として当業界にて知られる。このリダンダンシーは典型的には3番目のコドン位置において見られ、例えばGAAとGAGの両方がアミノ酸グルタミンをコードする。この遺伝コードの性質は、変異に対する耐性を強める。例えば四重縮重コドンは、3番目の位置のいかなる変異にも耐えうる。二重縮重コドンは、3番目の位置の3種の塩基置換のうち1種に耐えうる。以下の表は、最も一般的な20のアミノ酸および各アミノ酸をコードするコドンを示す。
Figure 2009511044
本発明の方法においては、リピートまたは相同配列の間の同一性のレベルを改変するため、幾つの遺伝子改変を導入遺伝子に行ってもよい。リピートまたは相同配列が2つの導入遺伝子の間に存在するとき、異なる改変を各導入遺伝子配列に行い、その2つの配列間の同一性のレベルをさらに減少させることができる。例えば、本発明の方法において、少なくとも2、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも50、または少なくとも100の縮重置換を、遺伝子サイレンシングに関与する各導入遺伝子のゆらぎ位置に行うことができる。
本発明の方法のための遺伝子置換の設計にあたり、当業者は、宿主細胞または生物に存在するあらゆるコドンバイアスを考慮してさらに発現を最適化することができる。例えば、単子葉植物種およびショウジョウバエではGおよびCで終わるコドンが非常に多いことが知られている（Kawabe and Miyashita, 2003, Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species, Genes Genet. Syst. 78(5): 343-52）。シロイヌナズナでは、コドン使用は遺伝子機能と関係があり、G/Cに偏ったコドン使用が光合成遺伝子およびハウスキーピング遺伝子に見られ、A/Tに偏ったコドン使用が組織特異的ストレス誘発性遺伝子に見られる（Chiapello et al., 1998, codon usage and gene function are related in sequences of Arabidopsis thaliana, Gene 209(1-2): GC1-GC38）。ヒトでは、コドン使用の優先性はRNA スプライス部位からの距離によって異なることが示されている（Willie and Majewski, 2004, Evidence for codon bias selection at the pre-mRNA level in eukaryotes, Trends Genet. 20(11): 534-38)。また、代謝率の高い生物は、代謝率の低い生物よりもAで終わるコドンが多いタンパク質コード遺伝子を含み、またイントロン中のA含量が高い（ Xia, 1996, Maximizing transcription efficiency causes codon usage bias, Genetics 144(3): 1309-20)。
前述のように、好ましい遺伝子改変の結果、コード配列は修飾されるがアミノ酸配列は変化しない。遺伝子改変によりタンパク質の機能を損なわない1以上の保守的置換または挿入または欠失を有するトランスジェニックタンパク質が提供される場合、かかる単離タンパク質もまた本発明に含まれる。本発明の改良核酸を含むベクター、原核および真核生物宿主細胞、ならびにトランスジェニック生物もまた含まれる。
本発明の方法は、遺伝子サイレンシングにより導入遺伝子発現が減少する様々な真核細胞および生物、例えば植物、動物および真菌において有用である。例えば、本発明の方法は、単一の導入遺伝子配列と比較したときにリピートまたは相同領域を有する1以上の宿主遺伝子を含む細胞および生物においてその導入遺伝子を発現させるために使用可能であり、あるいは、同じまたは異なるコンストラクトに由来する配列類似性のある領域を有する2以上の導入遺伝子、例えば同じ遺伝子ファミリーの2つのメンバーの発現方法において使用可能である。本発明の方法は、人工一本鎖ダイマー、例えば天然ではホモダイマーとして存在するがモノマーの一方に機能的変異を導入する目的などから組換え的に融合されている一本鎖ホルモンその他の糖タンパク質をコードする単一の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを減少させるために使用可能である。本発明の方法はまた、重複するドメインを有するタンパク質をコードする導入遺伝子の発現に使用可能であり、2、3例を挙げると、ABCトランスポーター (van der Heide and Poolman, 2002, ABC transporters: one, two or four extracytoplasmic substrate binding sites, EMBO Rep. 3(10): 938-43)、βプロペラドメイン/kelchリピート含有タンパク質 (Prag and Adams, 2003, Molecular phylogeny of the kelch-repeat superfamily reveals an expansion of BTB/kelch proteins in animals, BMC Bioinformatics 4: 42)、およびトロンボスポンジンリピート含有タンパク質 (Meiniel et al., 2003, The theombospondin type 1 repeat (TSR) and neuronal differenciation: roles of SCO-spondin oligopeptides on neuronal cell types and cell lines, Int. Rev. Cytol. 230: 1-39)である。
ある態様において本発明の方法は、宿主細胞または生物におけるバイオセンサー導入遺伝子の発現の増強、および1の細胞における2以上の蛍光バイオセンサーの同時発現の増強に使用可能である。より広範には、本発明の方法はまた、GFP変異体を利用するあらゆるFRETを使用して、例えばタンパク質相互作用の検出において、用いることができる。
バイオセンサー
前述のように、本発明者らは驚いたことに、本発明の方法がリガンド結合蛍光インジケーターまたはFRET基盤（FRET-based）バイオセンサーの発現および効力を増加させるのに有用であることを発見した。バイオセンサーの例は、米国仮出願第60/643576号、米国仮出願第60/658141号、米国仮出願第60/658142号、米国仮出願第60/657702号、およびPCT出願 [代理人整理番号第056110-5053号 ”Phophate Biosensors and Methods of Using the Same”]、およびPCT出願[代理人整理番号第056100-5055号, ”Sucrose Biosensors and Methods of Using the Same”]（これらは引用により全体として本明細書に含まれる）に記載される。かかるバイオセンサーは、リガンド結合タンパク質部分、リガンド結合タンパク質部分に融合したドナーフルオロフォア部分、およびリガンド結合タンパク質部分に融合したアクセプターフルオロフォア部分を含む。多くのバイオセンサーの2つのフルオロフォアは同じフルオロフォア遺伝子に由来し高レベルの同一性を示すため、遺伝子サイレンシングがかかるバイオセンサーの完全生物、特に植物における発現に顕著に影響しうることを本発明者らは発見した。バイオセンサーのフルオロフォア配列間の同一性を減少させることにより、細胞または生物におけるバイオセンサーの発現が顕著に増強されうることを本発明者らは発見した。
したがって、とりわけある態様において、本発明はリガンド結合蛍光インジケーターをコードする単離核酸およびその使用方法を提供し、ここで前記インジケーターはリガンド結合タンパク質部分、リガンド結合タンパク質部分に融合したドナーフルオロフォア部分、およびリガンド結合タンパク質部分に融合したアクセプターフルオロフォア部分を含み、ドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)はドナー部分が励起され、かつリガンドがリガンド結合タンパク質部分に結合したときに変化し、また、前記ドナーフルオロフォア部分または前記アクセプターフルオロフォア部分のいずれかの少なくとも1方をコードする核酸配列が、インジケーター導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを減少させるためドナーフルオロフォア部分をコードする核酸とアクセプターフルオロフォア部分をコードする核酸との間の核酸配列同一性のレベルが減少するよう遺伝子改変されている。
本発明の方法では、核酸配列同一性のレベルを減少させるため、一方または両方のフルオロフォア配列が遺伝子改変されうる。フルオロフォアコード配列は、リガンド結合ドメインの末端に融合してもよい。あるいは、ドナーフルオロフォア部分および／またはアクセプターフルオロフォア部分の一方または両方がリガンド結合タンパク質部分の内部部位においてリガンド結合タンパク質部分に融合していてもよい。かかる融合は、米国仮出願第60/658141号（引用により本明細書に含まれる）に記載される。ドナー部分およびアクセプター部分は同じタンパク質ドメインまたはローブ（lobe）に含まれうるが、好ましくは、ドナー部分とアクセプター部分は直列に融合されない。ドメインとは特定の機能を発揮するタンパク質の一部分であり、典型的には少なくとも約40〜約50 アミノ酸の長さである。単一のタンパク質にいくつかのタンパク質ドメインが含まれうる。
本発明の「リガンド結合タンパク質部分」は、完全な天然タンパク質の配列であっても、少なくともその1または複数のリガンド結合部分であってもよい。好ましい態様において、とりわけ、本発明のリガンド結合部分は少なくとも約40〜約50アミノ酸、または少なくとも約50〜約100アミノ酸、または約100アミノ酸以上の長さである。
本発明の好ましいリガンド結合タンパク質部分は、とりわけ、トランスポータータンパク質およびそのリガンド結合配列であり、例えばチャンネル、ユニポーター、コポーター、およびアンチポーターからなる群から選択されるトランスポーターである。ペリプラズム結合タンパク質 (PBP)、例えば以下の表２に含まれる細菌PBPのいずれかもまた好ましい。細菌PBPは2つの球状ドメインまたはローブを含み、FRETセンサーの設計に好都合なスカフォールドである（Fehr et al., 2003, J. Biol. Chem. 278: 19127-33）。結合部位は両ドメインの間隙に位置し、結合時にこれらドメインが基質を取り込み、ヒンジのねじれ動作が起こる（Quiocho and Ledvina, 1996, Mol. Microbiol. 20: 17-25）。タイプ I PBP、例えばGGBP (D-ガラクトースD-グルコース結合タンパク質)では、その末端はリガンド結合時に離れていく2つのローブの近位端に存在する（Fehr et al., 2004, Current Opinion in Plant Biology 7: 345-51。タイプ II PBP、例えばマルトース結合タンパク質 (MBP)では、その末端はヒンジ領域に対してローブの遠位端に位置し、リガンド結合時に互いに接近する。このように、PBPのタイプおよび／または融合されたドナーまたはアクセプター部分の位置に依存して、FRETはリガンド結合時に増加または減少しうるものであり、いずれの例も本発明に含まれる。
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細菌PBPは、様々な各種分子および栄養物に対して、例えば表２に示すように糖、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、イオン、金属およびペプチドなどに対して結合能を有する。つまり、本発明の方法にしたがい、PBP基盤リガンド結合センサーをこれら分子のいずれかを検出および定量できるように設計することもできる。表２に挙げるPBPの天然種変異体もまた、測定可能なリガンド結合機能を維持する部位特異的変異、欠失または挿入を含む人工操作変異体に加えて、使用可能である。本発明の核酸コンストラクトにおける使用に好適な変異体核酸配列は、所定のPBPの天然遺伝子配列に対して、好ましくは少なくとも70、75、80、85、90、95、または99%の類似性または同一性を有する。
好適な変異体核酸配列はまた、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下においてPBPの遺伝子とハイブリダイズしてもよい。高度なストリンジェンシー条件は当業界に知られる; 例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989、およびShort Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.（いずれも引用により本明細書に含まれる）を参照。ストリンジェント条件は配列依存的であり、環境によって異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳しい説明は、Tijssen, Techniquess in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, ”Overview of principles of Hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993) に見られる。通常、ストリンジェント条件は、既定のイオン強度およびpHにおける特定の配列の融点温度 (Tm) より約5-10℃低くなるように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする(既定のイオン強度、pH、および核酸濃度における)温度である (標的配列が過剰に存在するとき、Tmにおいて50%のプローブが平衡状態で占有される)。ストリンジェント条件は、pH 7.0〜8.3で塩濃度が約1.0M ナトリウムイオン未満、 典型的には約0.01〜1.0M ナトリウムイオン濃度 (または他の塩) であり、温度が短いプローブ(例えば10〜50 ヌクレオチド)については少なくとも約 30 ℃、長いプローブ(例えば50 ヌクレオチド以上)については少なくとも約 60 ℃である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化試薬（destabilizing agent） の添加により実施されうる。
本発明のセンサーの好ましい人工変異体は、測定可能なリガンド濃度の範囲を拡張するため、リガンドに対する親和性が増加または減少していてもよい。グルタミン酸に対して減少または増加した結合親和性を示す人工変異体は、ランダムまたは部位特異的変異誘発や他の既知の変異誘発技術によって構築し、本明細書に記載のベクターにクローン化し、そして開示のアッセイにしたがい活性についてスクリーニングすればよい。
本発明のバイオセンサー核酸において、蛍光ドメインは、1以上のフレキシブルリンカー配列によってリガンド結合ドメインから分離されていてもよい。かかるリンカー部分は、好ましくは約1〜50 アミノ酸残基、より好ましくは約1〜30 アミノ酸残基の長さである。リンカー部分およびその適用は当業界において周知であり、例えば米国特許第5998204号および5981200号、ならびにNewton et al., Biochemistry 35:545-553 (1996)に記載される。あるいは、本明細書に記載のフルオロフォアまたは結合タンパク質の短縮型を使用してもよい。
例えば、本発明者らは、結合ドメインのコアタンパク質構造とフルオロフォアとをつなぐ配列を除去することにより、例えばリンカー配列を除去することにより、および／または分析物結合部分および／またはフルオロフォアの末端からアミノ酸を欠失させることにより、フルオロフォアのより近いカップリングが達成され、より高率の変化が起こることを発見した。好ましくは欠失は、FRETバイオセンサーをコードする核酸コンストラクトにおいて、リンカー、またはフルオロフォア、またはリガンド結合ドメインをコードする領域に位置する少なくとも1、または少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも8、または少なくとも10、または少なくとも15のヌクレオチドを欠失させることによりなされる。異なる領域における欠失を単一のコンストラクトにおいて組合せ、2以上の領域のリジディティー（rigidity）が増加するようにしてもよい。また、アミノ酸を付加または変異させて、バイオセンサーのリジディティーを増加させ、感度を向上させてもよい。それは例えば、プロリン残基または他の好適なアミノ酸の付加によってねじれを導入することによる。感度の向上はリガンド結合時のFRET蛍光の比変化によって測定することができ、好ましくは前記欠失の結果少なくとも2倍に増加する。米国仮出願第60/658141号（引用により全体として本明細書に含まれる）を参照。
本発明の単離核酸は、FRETにおけるドナーおよびアクセプター部分として組み合わされて機能しうるいずれの好適なドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質部分を組み込んでもいても良い。好ましいドナーおよびアクセプター部分は、GFP (緑色蛍光タンパク質)、CFP (シアン蛍光タンパク質) 、BFP (青色蛍光タンパク質) 、YFP (黄色蛍光タンパク質)、およびそれらの増強型変異体からなる群から選択され、特に好ましい態様は、ドナー/アクセプターペア CFP/YFP-Venus（pH耐性およびマチュレーション時間が改善されたYFP変異体）である (Nagai, T., Ibata, K., Park, E.S., Kubota, M., Mikoshiba, K., and Miyawaki, A. (2002) A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90)。あるいは、より高度のpH安定性とより大きなスペクトル分離を有するMiCy/mKO ペアが好ましい (Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H, Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a doner/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 2004 381:307-12)。Discosoma種由来の天然DsRed、別の属由来のDsRedのオルソログ、または最適化された性質を有する天然DsRedの変異体 (例えば、K83M 変異体またはDsRed2 (Clontechより入手可能))もまた、ドナーまたはアクセプターとして好適である。ドナーおよびアクセプター蛍光部分を選択するときに考慮すべき基準は当業界にて知られており、例えば米国特許第6197928号（引用により全体として本明細書に含まれる）に開示される。
本明細書で用いる用語「フルオロフォア変異体」は、天然の蛍光分子に対して少なくとも約70%、より好ましくは少なくとも75%、例えば少なくとも80%、90%、95%またはそれ以上の同一性を有するポリペプチドを意味する。かかる変異体は当業界にて多く知られており、あるいは天然の蛍光分子のランダムまたは定方向変異誘発により容易に調製可能である (例えば、 Fradkov et al., FEBS Lett. 479:127-130 (2000)を参照)。
本発明はさらに、改良バイオセンサー遺伝子をコードする単離核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターの例は、ウイルス由来、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、またはレトロウイルス由来のベクター、および細菌由来のベクター、または細菌配列と他の生物由来の配列との組合せ、例えばコスミドまたはプラスミドである。ベクターは、原核細胞、例えば大腸菌その他の細菌、または真核細胞、例えば酵母、植物および動物細胞における機能に適応しうる。例えば、本発明のベクターは通常、目的の宿主細胞に適合した複製起源、目的の宿主細胞に適合した1以上の選択マーカー、および1以上のマルチクローニングサイトなどの要素を含む。ベクターに含める特定の要素の選択は、目的の宿主細胞、インサートサイズ、インサート配列の発現調節、すなわち例えば誘導性または調節性プロモーターを使用する発現調節が必要か否か、所望のベクターコピー数、所望のセレクションシステム、などの因子に依存する。様々な適用のための宿主細胞とベクターの適合性の保証に関与する因子は当業界にて周知である。
本発明における使用に好ましいベクターは、ドナーおよびアクセプター蛍光分子をコードする核酸に遺伝子上で融合されたリガンド結合ドメインまたは受容体のクローニングを可能とし、ドナーおよびアクセプター蛍光分子に遺伝子上で融合されたリガンド結合ドメインを含むキメラまたは融合タンパク質の発現をもたらす。ベクターの例は、以下に開示される細菌pRSET-FLIP 誘導体である： Fehr et al. (2002) (Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99, 9846-9851)（引用により全体として本明細書に含まれる）。融合タンパク質を発現するよう核酸をベクターに正しいフレームにてクローニングする方法は、当業界にて周知である。
本発明はまた、本発明のベクターまたは発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞を含み、それには原核細胞、例えば大腸菌その他の細菌、または真核細胞、例えば酵母細胞、植物細胞または動物細胞が含まれる。別の局面において、本発明は、バイオセンサーの発現をコードする核酸配列の発現を特徴とする表現型を有するトランスジェニック非ヒト動物に関する。表現型は動物の体細胞および生殖細胞に含まれる導入遺伝子にしたがい、以下により産生することができる：(a) バイオセンサーをコードするDNAコンストラクトを含む導入遺伝子を動物の接合子に導入する; (b) 偽妊娠動物に前記接合子を移植する; (c) 前記接合子を成長させ妊娠を成立させる; および(d) 導入遺伝子を含む少なくとも1のトランスジェニック子孫を同定する。導入遺伝子を胚に導入する工程は、導入遺伝子を含む胚性幹細胞を胚に導入することによってもよく、あるいは胚に導入遺伝子を含むレトロウイルスを感染させることによってもよい。本発明のトランスジェニック動物は、トランスジェニック線虫およびトランスジェニックマウスおよび他の動物である。
本明細書に記載の核酸を発現するトランスジェニック植物もまた、本発明に含まれる。トランスジェニック作物には、例えばタバコ、サトウダイコン、大豆、豆、エンドウ豆、ジャガイモ、コメまたはトウモロコシが含まれる。双子葉および単子葉植物における遺伝子の発現は、様々な既知のルーチン的に適用できる方法によりなすことができる。例えば、Potrykus, 1990, Gene transfer methods for plants and cell cultures, Ciba Found. Symp. 154: 198-208を参照。一例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を形質転換の手段として使用する、目的の遺伝子を含むT-DNAによる植物細胞の形質転換である。植物細胞への遺伝子の導入にアグロバクテリウムを使用するため、個々の遺伝子をバイナリーベクターにクローン化すべきである。様々な各種クローニングベクターが、高等な植物におけるアグロバクテリウムを用いる遺伝子の発現に利用可能であり、例えばミニバイナリーベクター (Xiang et al., 1999: a mini binary vector series for plant transformation, Plant. Mol. Biol. 40(4): 711-7) およびpPZPシリーズのベクター (Hajdukiewicz et al., 1994, The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation, Plant. Mol. Biol. 25(6): 989-94) である。バイナリー植物形質転換ベクターは、大腸菌とアグロバクテリウムにおいて複製でき、形質転換された植物の選択のための選択マーカーを含むことができる。T-DNAの移行のため、アグロバクテリウムの植物への感染が必要である; これは、完全植物の葉小片、根、プロトプラスト、懸濁培養物、または花の感染によるものであってよい。シロイヌナズナ植物の形質転換には、浸漬法（dipping method）が最も一般的に使用される(Clough and Bent, 1998, : Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16(6): 735-43)。その後、形質転換された植物は、選択マーカー、例えばカナマイシン、ハイグロマイシン、グルフォシネートに対する耐性について選択される。
アグロバクテリアを用いる形質転換に加えて、他の多くの技術が植物宿主細胞における遺伝子の発現に利用可能である。これら技術には、プロトプラストの融合または形質転換、DNAマイクロインジェクション、およびエレクトロポレーション、ならびに弾道（ballistic）法およびウイルス感染が含まれる。形質転換された植物材料から、選択用の抗生物質または殺生物剤を含む好適な培地において完全植物を再生することができる。プラスミド注入およびエレクトロポレーションについて特別に必要とされるものはない。pUC-誘導体のような単純なプラスミドが使用可能である。しかしながら、完全植物を前記のような形質転換された細胞から再生するには、選択マーカー遺伝子の存在が必要である。
本発明はまた、本明細書に記載の性質を有する単離バイオセンサー分子、特にPBP基盤蛍光インジケーター、を含む。かかるポリペプチドは、好ましくは本明細書に記載の核酸コンストラクトを使用して組換えにより発現される。発現ポリペプチドは、任意で転写-翻訳システムまたは組換え細胞において産生し、そこから当業界にて既知の生化学的および／または免疫学的精製法により精製してもよい。本発明のポリペプチドは、脂質二重膜、例えば細胞膜抽出物または人工脂質二重膜 (例えばリポソーム小胞) またはナノ粒子に導入することができる。
本発明は、サンプル中のリガンドのレベルの変化を検出する方法であって、 (a) 本発明の改良センサーをコードする核酸を発現する細胞および該リガンドを含むサンプルを提供すること; および (b) 前記ドナー蛍光タンパク質部分と前記アクセプター蛍光タンパク質部分の間のFRETにおける変化を検出することを含み、ここで該ドナー部分と該アクセプター部分の間のFRETにおける変化がサンプルにおける該リガンドのレベルの変化を示す方法を含む。リガンドは、それについて融合FRETバイオセンサーが構築できるいずれの好適なリガンドであってもよく、例えば本明細書に記載のリガンドである。好ましくは、リガンドはPBPにより認識されるものであり、より好ましくは表２に含まれるような細菌PBPおよびそのホモログ、天然ならびに人工変異体により認識されるものである。
FRETは、当業界にて知られる様々な技術を用いて測定することができる。例えば、FRETを評価する工程は、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定することを含んでもよい。あるいは、FRETを評価する工程は、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光を測定すること、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定すること、およびドナー蛍光タンパク質部分から放射される光とアクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光の比率を計算することを含んでもよい。FRETを評価する工程はまた、ドナー部分の励起状態寿命または異方性変化を測定することを含んでもよい (Squire A, Verveer PJ, Rocks O, Bastiaens PI. J Struct Biol. 2004 Jul;147(1):62-9. Red-edge anisotropy microscopy enables dynamic imaging of homo-FRET between green fluorescent proteins in cells.)。かかる方法は当業界にて知られており、一般的に米国特許第6197928号（引用により全体として本明細書に含まれる）に記載される。
サンプル中のリガンドの量は、FRETの程度を評価することにより評価できる。はじめにセンサーをサンプルに導入しなければならない。リガンド濃度の変化は、ある時間間隔でFRET変化をモニターすることによって評価できる。サンプル中のリガンドの量は、例えばインビボでの滴定により確立された検量線を用いて定量可能である。本発明の方法により分析されるサンプルは、例えば細胞表面におけるリガンド輸送の測定の場合、インビボに含まれていてもよく、あるいはインビトロでもよく、その場合は細胞培養においてリガンド流出を測定できる。あるいは、細胞または組織の液体抽出物をサンプルとして使用し、その中のリガンドを検出または測定してもよい。
本明細書に開示するリガンド検出方法は、リガンド受容体結合の制御に使用されうる化合物の選別および同定に使用可能である。ある態様において、とりわけ、本発明はリガンドの受容体への結合を制御する化合物を同定する方法であって、(a) 本発明のバイオセンサー核酸を発現する細胞と前記リガンドとを含む混合物を1以上の試験化合物と接触させること; および(b) 前記接触後、前記ドナー蛍光ドメインと前記アクセプター蛍光ドメインの間のFRETを評価することを含み、ここで前記接触後のFRETの増加または減少が前記試験化合物がリガンド結合を制御する化合物であることを示す方法を含む。用語「制御する」は通常、かかる化合物がリガンドとリガンド結合ドメインとの相互作用を増加させる、減少させる、または阻害することを意味する。
本発明の方法はまた、ハイスループットおよびハイコンテントドラッグスクリーニングのためのツールとして使用可能である。例えば、本発明のバイオセンサーを含む固体支持体またはマルチウェルディッシュは、複数の可能性ある薬物候補を同時に選別するのに使用可能である。つまり、本発明は、リガンドの受容体への結合を制御する化合物を同定するハイスループット方法であって、(a) 少なくとも1の本発明のバイオセンサーまたは少なくとも1の本発明のバイオセンサー核酸を発現する細胞を含む固体支持体と、前記リガンドおよび複数の試験化合物とを接触させること; および (b) 前記接触後、前記ドナー蛍光ドメインと該アクセプター蛍光ドメインの間のFRETを評価することを含み、ここで前記接触後のFRETの増加または減少が特定の試験化合物がリガンド結合を制御する化合物であることを示す方法を含む。
センサーの標的を原形質膜の外葉とすることは、可能性ある適用のうちの一態様にすぎない。ナノセンサーの標的を特定のコンパートメントにできることが示されている。あるいは、他の標的化配列を使用して、他のコンパートメント、例えば小胞、ER、液胞などにおいてセンサーを発現させることができる。
センサーをツールとして使用してリガンド結合を修飾することができ、それは例えば、膜または人工脂質複合体上に提示される人工リガンドスカベンジャーとしてセンサーを導入することによる。人工リガンドスカベンジャーは、様々なリガンドに対するシグナル伝達および細胞の応答を操作するのに使用可能である。
以下の実施例は、本発明の説明のため提供される。このように、それらは本発明の範囲を限定するものと解されてはならない。当業者は、これまでの明細書または請求項に記載されるように、他の多くの態様もまた本発明の範囲内であることを当然に理解している。
実施例１ 遺伝子サイレンシングの抑制された植物の使用はダイレクト・リピート導入遺伝子のサイレンシングを妨げる
植物におけるバイオセンサー導入遺伝子の発現を何度も試みたが、発現が低いか、あるいは安定な発現が得られなかった。グルコース、マルトース、およびグルタミン酸のためのバイオセンサーを安定に発現する植物の作成を独立に何度か試みたが、成功せず、全く発現しないか、あるいは若い植物のみで発現するか、孔辺細胞のみで発現するという結果になった。しかしながら、植物の成長期間全体を通して全ての組織で高発現することが望ましい。
植物におけるペリプラズム結合タンパク質基盤バイオセンサーの発現における問題に直面し、本発明者らは、植物における遺伝子サイレンシングがリピート誘発サイレンシングにより導入遺伝子コンストラクトの発現に影響しているとの仮説を立てた。使用したバイオセンサーは、eCFPおよびeYFPが基質結合タンパク質の両端に連結している(図1)。eCFPおよびeYFPは相同性が高く、タンパク質レベルで239 アミノ酸のうち9アミノ酸、核酸レベルで720塩基対のうち16塩基対しか異ならない(図2A)。eYFP Venus (Nagai et al., 2002, A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell biological applications, Nat. Biotech. 20: 87-90) を使用するとより相同性が高く、タンパク質レベルで8 アミノ酸、DNA レベルで13塩基対しか異ならない (図2B)。
2つのシロイヌナズナ遺伝子、SGS3およびRDR6が、転写後遺伝子サイレンシングに必要であることが報告されている（Peragine et al., 2004, SGS3 and SGS2/SDE1/RDR6 are required for juvenile development and the production of transacting siRNAs in Arabidopsis, Genes and Dev. 18: 2368-79）。本発明者らの仮説を試験するため、これら遺伝子の機能消失型変異体およびCol0野生型植物を平行してグルコースセンサー FLIPgludelta 13により形質転換した (図3; Deuschle et al., 2005, Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering, Protein Sci. 14:2304-14)。sgs3-11植物をFLIPglu2μdelta13、により、rdr6-11植物をFLIPglu600μdelta13により、そしてCol0植物をFLIPglu2μdelta13またはFLIPglu600μdelta13により形質転換した。全ての形質転換について、形質転換植物にBasta 耐性を付与するバイナリーベクター pPZP312を使用した。
FLIPgludelta13の2つの親和性の異なる変異体 (2μおよび600μ)についての形質転換体を、T1の苗木にBASTAをスプレーすることで選択し、蛍光について選別した。sgs3-11およびrdr6-11変異体バックグラウンドの形質転換体は、Col0バックグラウンドのものよりも高い割合で蛍光を示した。Col0 形質転換体の蛍光は植物齢があがるにつれて弱くなったが、sgs3-11/rdr6-11 形質転換体における蛍光は少なくとも結実開始時（発芽から約30日）の植物において検出可能であった。この蛍光強度の相違はT-DNAの挿入数が異なることによるとは考えられず、なぜなら次世代の分離が約3:1であり、これが調べた植物のほとんどについて挿入が1つであったことを示唆するからである。
FLIPglu600μdelta13を発現するrdr6-11植物において、グルコースの外部からの適用により起こる植物細胞の細胞質グルコースレベルにおける変化が検出できた (図4参照)。予想されたように、FLIPglu2μdelta13を発現するsgs3-11植物では細胞質グルコース変化は観察できず、FLIPglu2μdelta13は植物細胞の細胞質で飽和していると思われる。
実施例２ バイオセンサーにおけるリピート配列の相同性の減少
遺伝子コードにおいて、ほとんどのアミノ酸配列が2以上のコドンによってコードされる。このリダンダンシーを利用して、元の配列とは異なるコドンを使用してなお同じアミノ酸配列をコードする遺伝子を合成できる。タンデムリピートのパートナーの少なくとも1方についてコドン使用を変化させることにより、相同性の割合を顕著に減少することができる。
バイオセンサーコンストラクトの遺伝子サイレンシングを回避するため、eCFP遺伝子とVenus 遺伝子の相同性を減少させた。このため、短縮型eCFP (アミノ酸 7-230) をコードする遺伝子および短縮型Venus (アミノ酸 7-230)をコードする遺伝子であって、それぞれ互いに異なるコドンを含むがeCFPおよびVenusと同じアミノ酸配列を保持するものを化学的に合成した。短縮型は、合成コストを抑えるために合成した。発現ベクターコンストラクトにクローニングするため、この短縮型を伸長プライマーで増幅して末端配列に尾部を付加してもよく、また要すればこれを縮重置換を考慮して設計してもよい。あるいは、より短い短縮型を使用してもよく、なぜなら本発明者らは一部のケースでより近接したフルオロフォアのカップリングがリガンド結合時により高い比率変化をもたらしうることを発見したからである。
遺伝子改変されたCFP配列およびVenus配列は、それぞれAresおよびAphroditeと命名した。2つの遺伝子間で交互となるパターンにて、各配列においてほぼ2コドンごとに置き換えを行った。新しい配列は672塩基対のうち228が異なり、5塩基対より長い同一のひと続きの配列を含まない (図 5A)。VenusのみをAphroditeと置き換える場合、最も長いeCFPと同一のひと続きの配列は11塩基対である (図 5B)。
AresおよびAphroditeをFRETペアとしてFLIPglu600μdelta11 (Deuschle et al., 2005) において使用し、大腸菌での発現に成功した。Aphroditeの発現が植物において示され、ここでフルオロフォア発現はeYFP 誘導体と比較して明らかに増強された (図 6)。このように、植物におけるAresおよびAphroditeの発現は、相同性依存遺伝子サイレンシングを回避するか、少なくとも減少するようである。ほぼすべてのコドンが修飾されたVenusの短縮型もまた合成し、Marsと命名した (配列番号： 6)。MarsはインビトロにおいてeCFPのFRETパートナーとして機能し、また大腸菌で発現可能である。しかしながら、MarsはAphrodite よりもGC含量が顕著に低く、そのため植物における発現に最適でない可能性がある。
本明細書で論じる文献、特許、および特許出願はすべて、引用により本明細書に含まれる。本発明はその具体的態様との関連で記載されているが、理解されることに、さらなる改変が可能であり、本出願は本発明の原理に通常したがう本発明の変形、使用または適合化を包含することを意図し、また本発明が関連する既知または慣例の方法の範囲内であり、本明細書において前述した必須の特徴に適用でき、かつ付属の特許請求の範囲の範囲内である本開示からの逸脱を包含する。
図１はFLIPバイオセンサー遺伝子コンストラクトの略図である。 図２Ａは、eCFP (配列番号： 1)とeYFP (配列番号： 2)の間の相同性の程度を示すアライメントを提供する。 図２Ｂは、eCFP (配列番号： 1)とeYFP Venus (配列番号： 3)の間の相同性の程度を示すアライメントを提供する。 図３は、シロイヌナズナの形質転換に使用したFLIPgludelta13 コンストラクトを示す略図である。 図４は、FLIPglu600μdelta13を発現する5週齢rdr6-11 植物のシロイヌナズナ表皮細胞における、グルコースに応答した蛍光強度の経時変化を示すグラフである。+glc は50mM グルコースの外部からの適用を意味する。−glcは外部グルコースの除去を意味する。還流はNaPO4バッファー、pH 7において行った。 図５Ａは、Ares (配列番号： 4) (遺伝子改変eCFP)とAphrodite (配列番号： 5) (遺伝子改変Venus)の間の相同性の程度を示すアライメントを提供する。 図５Ｂは、eCFP (配列番号： 1)とAphrodite (配列番号： 5)の間の相同性の程度を示すアライメントを提供する。 図５Ｃは、eCFP (配列番号： 1)とMars (配列番号： 6) (遺伝子改変Venus) の間の相同性の程度を示すアライメントを提供する。 図６は、FLIPglu600μdelta11またはdelta13のNicotiana benthamianaの表皮細胞における一過性発現、およびYFP励起後のYFP蛍光を示す写真である。A: FRETペアとしてeCFPおよびeYFPを使用。B: delta11、FRETペアとしてeCFPおよびAphrodite（Venusをコード）を使用。C: delta13、FRETペアとしてeCFPおよびAphrodite（Venusをコード）を使用。

Claims (87)

  1. 以下を含む、リガンド結合蛍光インジケーターをコードする単離核酸：
    リガンド結合タンパク質部分;
    リガンド結合タンパク質部分に融合したドナーフルオロフォア部分; および
    リガンド結合タンパク質部分に融合したアクセプターフルオロフォア部分、
    ここで、ドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)は、ドナー部分が励起され、かつ該リガンドがリガンド結合タンパク質部分に結合したときに変化する、および
    該ドナーフルオロフォア部分または該アクセプターフルオロフォア部分のいずれかの少なくとも1方をコードする核酸配列は、ドナーフルオロフォア部分をコードする核酸とアクセプターフルオロフォア部分をコードする核酸との間の核酸配列同一性のレベルが減少するよう遺伝子改変されている。
  2. 該ドナーフルオロフォア部分をコードする核酸配列と該アクセプターフルオロフォア部分をコードする核酸配列の両方が、ドナーフルオロフォア部分をコードする核酸とアクセプターフルオロフォア部分をコードする核酸との間の核酸配列同一性のレベルが減少するよう遺伝子改変されている、請求項１の単離核酸。
  3. 該遺伝子改変が、該ドナーフルオロフォア部分および該アクセプターフルオロフォア部分それぞれの発光または吸収スペクトルを変化させない、請求項１の単離核酸。
  4. 該遺伝子改変が、該ドナーまたはアクセプターフルオロフォアにおける少なくとも1の保守的置換をコードする、請求項３の単離核酸。
  5. 該遺伝子改変が、ドナーまたはアクセプターフルオロフォアコード配列のゆらぎ位置における少なくとも1の縮重置換を含む、請求項３の単離核酸。
  6. 該コードされるリガンド結合蛍光インジケーターが、該遺伝子改変を含む該核酸から発現させると、該遺伝子改変の存在しない該核酸から発現される該リガンド結合蛍光インジケーターと比較してインビボで増強された機能を示す、請求項１の単離核酸。
  7. 該インビボ機能の増強が植物、動物または真菌において起こる、請求項６の単離核酸。
  8. 該インビボ機能の増強が遺伝子サイレンシングの減少によるものである、請求項６の単離核酸。
  9. 該ドナーおよびアクセプターフルオロフォア部分が該リガンド結合部分のNおよびC末端に融合されている、請求項１の単離核酸。
  10. 該ドナーフルオロフォア部分または該アクセプターフルオロフォア部分のいずれかの少なくとも1方が該リガンド結合タンパク質部分に該リガンド結合タンパク質部分の内部部位において融合している、請求項１の単離核酸。
  11. 該ドナーフルオロフォア部分と該アクセプターフルオロフォア部分との両方が該リガンド結合タンパク質部分の内部部位に融合している、請求項１の単離核酸。
  12. 該リガンド結合タンパク質部分がトランスポーターである、請求項１の単離核酸。
  13. 該トランスポーターが、チャンネル、ユニポーター、コポーター、およびアンチポーターからなる群から選択される、請求項１２の単離核酸分子。
  14. 該リガンド結合タンパク質部分がペリプラズム結合タンパク質 (PBP)である、請求項１の単離核酸。
  15. 該リガンド結合タンパク質部分が細菌ペリプラズム結合タンパク質である、請求項１４の単離核酸。
  16. 該ドナーフルオロフォア部分および該アクセプターフルオロフォア部分が該PBPの同じローブに融合している、請求項１４の単離核酸。
  17. 該リガンドがアミノ酸である、請求項１の単離核酸。
  18. 該アミノ酸が、グルタミン酸、アスパラギン酸、γ-アミノ酪酸 (GABA)、アミノ酢酸 (グリシン) およびタウリンからなる群から選択される、請求項１７の単離核酸。
  19. 該リガンドが糖である、請求項１の単離核酸。
  20. 該糖が、グルコース、ガラクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、アラビノース、フクルトース、キシロース、セロビオースおよびリボースからなる群から選択される、請求項１９の単離核酸。
  21. 該ドナーフルオロフォアが、GFP、CFP、BFP、YFP、dsRED、CoralHue ミドリイシ-シアン(MiCy) 、および単量体 CoralHue クサビラ-オレンジ (mKO)からなる群から選択される、請求項１の単離核酸。
  22. 該アクセプターフルオロフォア部分が、GFP、CFP、BFP、YFP、dsRED、CoralHue ミドリイシ-シアン(MiCy) 、および単量体 CoralHue クサビラ-オレンジ (mKO)からなる群から選択される、請求項１の単離核酸。
  23. 該ドナーフルオロフォア部分がeCFPの遺伝子改変体である、請求項２１の単離核酸。
  24. 該ドナーフルオロフォア部分の核酸配列が配列番号： 1 (Ares)の配列を含む、請求項２３の単離核酸。
  25. 該アクセプターフルオロフォア部分がYFP VENUSの遺伝子改変体である、請求項１の単離核酸。
  26. 該ドナーフルオロフォア部分の核酸配列が配列番号： 2 (Aphrodite)の配列を含む、請求項２５の単離核酸。
  27. 請求項１の核酸を発現する細胞。
  28. 請求項１の核酸を含む発現ベクター。
  29. 請求項２８のベクターを含む細胞。
  30. 原核細胞における機能に適応した、請求項２８の発現ベクター。
  31. 真核細胞における機能に適応した、請求項２８の発現ベクター。
  32. 原核細胞である、請求項２９の細胞。
  33. 大腸菌である、請求項３２の細胞。
  34. 真核細胞である、請求項２５の細胞。
  35. 酵母細胞である、請求項３４の細胞。
  36. 動物細胞である、請求項３４の細胞。
  37. 植物細胞である、請求項３４の細胞。
  38. 請求項１の核酸を発現するトランスジェニック動物。
  39. 請求項１の核酸を発現するトランスジェニック植物。
  40. リガンド結合タンパク質部分の該リガンドに対する親和性を変化させる1以上の核酸改変をさらに含む、請求項１の単離核酸。
  41. 請求項１の核酸によりコードされるリガンド結合蛍光インジケーター。
  42. 以下を含む、サンプル中のリガンドのレベルの変化を検出する方法：
    (a) 請求項１の核酸を発現する細胞および該リガンドを含むサンプルを提供する；および
    (b) 該ドナーフルオロフォア部分と該アクセプターフルオロフォア部分の間のFRETにおける変化を検出する、
    ここで、該ドナー部分と該アクセプター部分の間のFRETにおける変化はサンプル中の該リガンドのレベルの変化を示す。
  43. FRETを評価する工程がアクセプターフルオロフォア部分から放射される光を測定することを含む、請求項４２の方法。
  44. FRETを評価する工程が、ドナーフルオロフォア部分から放射される光を測定すること、アクセプターフルオロフォア部分から放射される光を測定すること、およびドナーフルオロフォア部分から放射される光とアクセプターフルオロフォア部分から放射される光の比を計算することを含む、請求項４２の方法。
  45. FRETを評価する工程が、ドナー部分の励起状態寿命を測定することを含む、請求項４２の方法。
  46. 該細胞がインビボに含まれる、請求項４２の方法。
  47. 該細胞がインビトロに含まれる、請求項４２の方法。
  48. ドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)が、ドナー部分が励起され、かつ該リガンドがリガンド結合タンパク質部分に結合したときに増加する、請求項４２の方法。
  49. ドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)が、ドナー部分が励起され、かつ該リガンドがリガンド結合タンパク質部分に結合したときに減少する、請求項４２の方法。
  50. 遺伝子改変フルオロフォアコード配列を含む単離核酸であって、該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも1のゆらぎ位置塩基置換を含む、単離核酸。
  51. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも2のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  52. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも5のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  53. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも10のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  54. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも15のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  55. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも20のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  56. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも30のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  57. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも50のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  58. 該遺伝子改変フルオロフォアコード配列が遺伝子改変されていないフルオロフォアコード配列と比較して少なくとも100のゆらぎ位置塩基置換を含む、請求項５０の単離核酸。
  59. 該フルオロフォアがeCFPの遺伝子改変体である、請求項５０の単離核酸。
  60. 該フルオロフォア核酸配列が配列番号： 1 (Ares)の配列を含む、請求項５９の単離核酸。
  61. 該フルオロフォアがYFP VENUSの遺伝子改変体である、請求項５０の単離核酸。
  62. 該フルオロフォア核酸配列が配列番号： 2 (Aphrodite)の配列を含む、請求項６１の単離核酸。
  63. 以下を含む、細胞における1以上の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングを減少させる方法：
    該1以上の導入遺伝子に、該1以上の導入遺伝子の少なくとも1のリピート領域における同一性のレベルが減少するように、少なくとも1の遺伝子改変を導入する、および
    該1以上の導入遺伝子を該細胞にトランスフェクトする、ここでこれにより該1以上の導入遺伝子の遺伝子サイレンシングが減少する。
  64. 少なくとも2のリピート領域が単一の導入遺伝子に存在する、請求項６３の方法。
  65. 該少なくとも1のリピート領域が2以上の異なる導入遺伝子に存在する、請求項６３の方法。
  66. 該少なくとも1のリピート領域が該1以上の導入遺伝子に存在し、別のリピート領域が該細胞のDNAに存在する、請求項６３の方法。
  67. 該単一の導入遺伝子が、リガンド結合タンパク質部分、リガンド結合タンパク質部分に融合したドナーフルオロフォア部分、およびリガンド結合タンパク質部分に融合したアクセプターフルオロフォア部分を含むリガンド結合蛍光インジケーターである、請求項６４の方法。
  68. 該単一の導入遺伝子が人工一本鎖ダイマーをコードする、請求項６４の方法。
  69. 該単一の導入遺伝子が重複するドメインを有するタンパク質(例えば、ABCトランスポーター)をコードする、請求項６４の方法。
  70. 該2以上の異なる導入遺伝子が実質的に類似するドメインを有するタンパク質をコードする、請求項６５の方法。
  71. 該細胞が植物細胞である、請求項６３の方法。
  72. 該細胞が動物細胞である、請求項６３の方法。
  73. 該細胞が植物中に存在する、請求項６３の方法。
  74. 該細胞が動物中に存在する、請求項６３の方法。
  75. 該少なくとも1の遺伝子改変が該導入遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なわない、請求項６３の方法。
  76. 該少なくとも1の遺伝子改変が該導入遺伝子における保守的アミノ酸置換をコードする、請求項７５の方法。
  77. 該少なくとも1の遺伝子改変が該導入遺伝子のゆらぎ位置における縮重置換である、請求項７５の方法。
  78. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも2の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  79. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも5の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  80. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも10の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  81. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも15の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  82. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも20の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  83. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも30の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  84. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも50の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  85. 該導入遺伝子のゆらぎ位置に少なくとも100の縮重置換を導入することを含む、請求項７７の方法。
  86. 該少なくとも1の遺伝子改変が該導入遺伝子のGC含量を低下させない、請求項６３の方法。
  87. 該遺伝子サイレンシングが、リピート誘発遺伝子サイレンシング (RIGS) 、リピート誘発点突然変異 (RIP) 、パラミューテーション、異所トランス不活性化、コサプレッション、およびRNA干渉からなる群から選択される、請求項６３の方法。
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