CN105001665B - 一种新型核酸染料的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种结构通式为其中R‑为碘负离子的新型核酸染料，其在保持了作为优良核酸染料的高敏感性、高稳定性、同现有检测仪器兼容的情况下，从分子结构上做了改进，从而可以很容易的渗透到聚丙烯酰胺凝胶这种高密集程度的高聚物中，即原来的核酸染料分子是大分子结构，而本发明所包括的产品都是小分子结构，从而解决了作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳的技术难点。另外，本发明从分子结构上做了改进，增加了产品本身所携带电荷量，从而不能够穿透细胞膜，达到了高安全标准，因此，本产品亦解决了通常核酸染料所具有的高毒性问题。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种新型核酸染料的制备及其应用，以用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中核酸的染色。
背景技术
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。核酸电泳是进行核酸研究的重要手段，是核酸探针、核酸扩增和序列分析等技术所不可或缺的组成部分。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不同的凝胶，可用于分离不同分子量的核酸片段。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应、浓缩效应、电荷效应，对于小片段DNA(5bp-500bp)的分离效果最好。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段但，其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳，而且进行高压电泳时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体、链聚合催化剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)和过硫酸铵以及交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺之间的化学反应而形成。丙烯酰胺单体在催化剂作用下产生聚合反应形成长链，长链经交联剂作用交叉连接形成凝胶，其孔径由链长和交联度决定。链长取决于丙烯酰胺的浓度，调节丙烯酰胺和交联剂的浓度比例，可改变聚合物的交联度。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳，可分离只相差1个核苷酸的DNA片段。
相比于琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶是密集程度更高的三维空间的高聚物，这种高密集聚合物结构，使得在分离不同大小范围、不同浓度范围的的核酸分子时，作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳。原有的部分核酸染料也可以用于染色聚丙烯酰胺凝胶中的DNA，例如美国Biotium.Inc.生产的Gel Red/Gel Green，美国Life Technologies公司的SYBR Safe以及通常用的Ethidium Bromide，但是都存在染色效果不佳，或者核酸染料本身具有高毒性、高危害性，比如：Gel Red/Gel Green独特的油性和大分子量特点使其不能穿透细胞膜进入细胞内，艾姆斯氏试验结果也表明，该染料的诱变性远远小于EB，但Gel Red/Gel Green的大分子量特点使其在难以穿透细胞膜的同时也难以渗透高密集的聚丙烯酰胺凝胶，因而存在染色效果不佳的缺陷；SYBR Safe的诱变性比EB要低的多，但检测灵敏性较低。
综上所述，现有技术存在两大问题：
第一个是因为聚丙烯酰胺凝胶是密集程度更高的三维空间的高聚物，这种高密集聚合物结构，使得在分离不同大小范围、不同浓度范围的核酸分子时，现有的多种作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳，因此，需要从分子结构上做改进，从而使小分子的荧光染料可以更容易的渗透到这种高密集程度的高聚物中；
第二个问题是，现有的多种核酸染料本身具有高毒性、高危害性，因为这些核酸染料可以穿透细胞膜，从而和细胞里面的DNA分子结合，导致产生基因突变，具有强致癌性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种新型核酸染料的制备方法与应用，以获得具有染色性能好、毒性低的核酸染料用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种新型核酸染料，其结构通式如下：
其中R-为碘负离子；
其中，R1、R2、R3为小于六个碳的烷基；
n的取值范围为2-6；
R4为磺酸基，为在菲啶6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
其中，所述R1、R2、R3为C1-C4的烷基；优选的，所述R1为C1-C3的烷基、R2与R3为C2-C4的烷基；优选的，所述R1为甲基，所述R2与R3为乙基。
其中，所述n的取值范围为2-4；优选的，所述n＝3。
本发明又提供了一种上述新型核酸染料的制备方法，包括如下步骤：
1)：由原料3,8-二氨基-6-苯基菲啶在体系中反应获得中间体I，即：
其中：
为3,8-二氨基-6-苯基菲啶，
为中间体I；
2)：由中间体I在体系中反应获得中间体II，即：
其中：
为中间体II；
3)：由中间体II与胺基反应获得中间体III，即：
其中：
为中间体III；
4)：由中间体III与溴化氢反应获得中间体IV，即：
其中：
HBr为溴化氢，
为中间体IV；
5)：由中间体IV经过磺化反应继而经过碘化钠处理获得终产物，即：
其中：
NaI为碘化钠；
为终产物，即产品核酸染料。
优选的，所述步骤1)中3,8-二氨基-6-苯基菲啶与氯甲酸乙酯在溶剂体系中反应生成中间体I，即：
其中：
为氯甲酸乙酯；
Pyridine为吡啶；
DMF为二甲基甲酰胺。
优选的，所述步骤2)中反应温度为80-130℃，即：
优选的，所述步骤3)中合成中间体III是在溶剂体系中进行的，所述溶剂为甲醇溶剂，即：
优选的，所述步骤4)中采用的为浓度为10-60％溴化氢溶液，即：
优选的，所述步骤5)中采用的为发烟硫酸，优选的为30％发烟硫酸，即：
其中，R4为磺酸基，为在菲啶6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
本发明又提供了一种上述核酸染料在聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳中的应用。
通过上述技术方案，本发明提供的一种新型核酸染料，其在保持了作为优良核酸染料的高敏感性、高稳定性、同现有检测仪器兼容的情况下，本发明从分子结构上做了改进，从而可以很容易的渗透到聚丙烯酰胺凝胶这种高密集程度的高聚物中，即原来的核酸染料分子是大分子结构，而本发明所包括的产品都是小分子结构，从而解决了作为核酸凝胶染料的荧光染料很难渗透进去以致核酸染色效果不佳的技术难点。另外，本发明从分子结构上做了改进，增加了产品本身所携带电荷量，从而不能够穿透细胞膜，达到了高安全标准，因此，本产品亦解决了通常核酸染料所具有的高毒性问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例所公开的中间体IV的质谱图；
图2为本发明实施例所公开的终产物的核磁共振谱图；
图3显示为本发明实施例所公开的终产物与核酸染料Gelred用于核酸染色后的凝胶电泳效果对比图；
图4显示为本发明实施例所公开的终产物与EtBr(溴化乙锭)用于核酸染色后的凝胶电泳效果对比图；
图5显示为本发明实施例所公开的终产物与SYBR Safe核算染料的安全性能测试对比结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
本发明提供了一种新型核酸染料，其结构通式如下：
其中R-为碘负离子；
其中，R1、R2、R3为小于六个碳的烷基；
n的取值范围为2-6；
R4为磺酸基，为在菲啶6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
其中，所述R1、R2、R3为C1-C4的烷基；优选的，所述R1为C1-C3的烷基、R2与R3为C2-C4的烷基；优选的，所述R1为甲基，所述R2与R3为乙基。
其中，所述n的取值范围为2-4；优选的，所述n＝3。
本发明又提供了一种上述新型核酸染料的制备方法，包括如下步骤：
1)：由原料3,8-二氨基-6-苯基菲啶在体系中反应获得中间体I，即：
其中：
为3,8-二氨基-6-苯基菲啶，
为中间体I；
2)：由中间体I在体系中反应获得中间体II，即：
其中：
为中间体II；
3)：由中间体II与胺基反应获得中间体III，即：
其中：
为中间体III；
4)：由中间体III与溴化氢反应获得中间体IV，即：
其中：
HBr为溴化氢，
为中间体IV；
5)：由中间体IV经过磺化反应继而经过碘化钠处理获得终产物，即：
其中：
NaI为碘化钠；
为终产物，即产品核酸染料。
实施例1：
由原料3,8-二氨基-6-苯基菲啶与氯甲酸乙酯反应获得中间体I，其反应方程式为：
其反应过程为：
①在装有机械搅拌装置的三口烧瓶中，加入DMF，将1摩尔的3,8-二氨基-6-苯基菲啶加入其中，同时搅拌；随后加入2摩尔量的吡啶，降温到0℃-5℃；
②2摩尔量的氯甲酸乙酯被缓慢加入①的反应体系中，滴加过程中温度不能超过15℃，TLC跟踪到反应结束；
③此时得到粘稠状固体，抽滤除去吡啶及DMF，剩余固体倒入水中充分洗涤；洗涤完毕，得到的固体真空干燥，得到产品中间体I，产率为90％。
实施例2：
由实施例1所获得的中间体I在体系中反应获得中间体II，其反应方程式为：
其反应过程为：
①在装有机械搅拌装置的三口烧瓶中，加入等摩尔量的中间体I和1,3-2碘丙烷，在105℃-115℃下反应3-4天；
②向反应体系①中加入过量乙酸乙酯，加热回流1小时然后冷却到室温，过滤；剩余固体真空干燥，得到中间体II，产率为73％。
实施例3：
由中间体II与N,N-二乙基甲胺在溶剂体系中反应获得中间体III，其反应方程式为：
其反应过程为：
①在装有机械搅装置和回流冷凝器的三口烧瓶中，加入1摩尔量的中间体II和20摩尔量的N,N-二乙基甲胺及过量甲醇，回流20小时，用TLC监视反应进程至反应结束；
②将反应体系①降温至室温，抽滤收集产品，用过量乙酸乙酯洗涤滤饼固体；固体在45℃-50℃真空干燥至恒重即为中间体III，产率为75％。
实施例4：
由中间体III与溴化氢反应获得中间体IV，其反应方程式为：
其反应过程为：
①在带有搅拌器的1L三口烧瓶中，加500毫升浓度为48％的溴化氢水溶液，缓慢将1摩尔量的中间体III加入溴化氢水溶液中；加入后，室温搅拌1小时；然后加热到100℃-110℃，直到TLC检测反应结束；
②反应结束，将反应物放到4L烧杯用冰搅拌降温；用475mL氨水调低温反应液的PH值到7-8；控制氨水的滴加速度，控制0℃-10℃，必要时使用冰块降温；然后静止24小时，析晶抽滤搜集产品即为中间体IV，产率为78％。
参考图1，中间体IV的质谱分析方法如下：所得中间体IV经过碘化钠处理结晶析出，所得晶体溶解于甲醇然后经过质谱测试，所得分子量为541，而此晶体的分子结构式为：C27H34N4I2；在质谱制备的过程中，此晶体发生离子化，分子结构式变为C27H34N4I+(带一个正电荷)，分子量正是541，即质谱分析结果证明制备的中间体IV结构正确。
实施例5：
由中间体IV与磺酸基反应合成终产物，其反应方程式为：
其反应过程为：
①125ml发烟硫酸降温到-10℃，12.5g原料中间体IV在搅拌条件下加到发烟硫酸中，1g一次，共12次，大约2小时加完；中间体IV投加完毕，搅拌至室温，TLC检测反应至结束；
②用250ml水溶解250g碘化钠，降温至-10℃；将上述反应液①降到-20℃并缓慢加到碘化钠溶液中；加完后低温搅拌1小时，出现大量悬浊物；抽滤，收集固体，固体被加入到300ml乙氰中搅拌溶解，再搅拌24小时，直到没有沉淀；再加入600ml乙醚，搅拌，抽滤，得到红色固体，抽滤得产品；固体产品真空干燥得到最终产品，产率为83％。
参考图2，终产物在DMSOd6溶剂中的核磁共振(NMR)分析显示其结构式如下：
其中：位于1.1左右的氢的数目为6个，对应两个乙基CH2CH3中的CH3中的6个氢；位于2.2左右的是甲基中的3个氢；位于2.5左右的超大峰来自于溶剂峰；位于2.9左右的是连接两个N的CH2CH2CH2中的中间的CH2上的2个氢；3.3左右的是左右的是连接两个N的CH2CH2CH2中的两个端头上的CH2上的4个氢加两个乙基(Et，即CH2CH3)中的CH2上的4个氢；在4-5之间的氢为NH2中的氢(部分可能与水进行了交换)；位于芳香区域上的氢为10个氢；所得氢数目同终产物氢数目相同。
实施例6：
参考图3，本发明终产物与核酸染料Gelred的染色效果对比结果显示，使用本发明提供的核酸染料page gelred可以获得比常规核酸染料Gelred更优异的染色效果，用于大分子核酸分离实验时可以更有效的对不同碱基对的DNA片段进行观察区分，其具体实验条件如下：
①核酸染料浓度:3X Gelred与5uM page gelred(本发明终产物)；
②所用凝胶为:15％acrylamide TBE gels(Criterion gels,BioRad)；
③后染30分钟，然后用水脱色15分钟；
④从左到右:NEB low MW ladder 50ng，25ng，12.5ng；
⑤2s exposure under EtBr Filter。
实施例7：
参考图4，本发明终产物与EtBr(溴化乙锭)相比，本发明终产物不仅毒性极低，且又能获得高于EtBr(溴化乙锭)的染色效果；由图4可知，采用EtBr进行染色后的核酸在凝胶电泳测试时存在严重拖尾现象，从而导致不同碱基对DNA片段区分效果较差；而采用本发明提供的page gelred核酸染料在同样条件下获得的凝胶电泳测试结果可知，不同碱基对DNA片段的区分较为明显，不存在拖尾现象，其具体实验条件如下：
①核酸染料浓度:5ug/mL EtBr与5uM page gelred(本发明终产物)；
②所用凝胶为:10％acrylamide TBE gels(Criterion gels，BioRad)；
③后染30分钟；
④从左到右:NEB low MW ladder 100ng，50ng；
⑤2s exposure under EtBr Filter。
实施例8：
基于实施例6及实施例7的通用电泳方法如下：
①按照常规方法进行电泳；
②用H2O将GelRed10000×储液稀释约3300倍到0.1M NaCl中，制成3×染色液(其他荧光染料依据稀释比例制备相应浓度)；
③将凝胶小心地放入合适的容器中，如聚丙烯容器中，缓慢加入足量的3×染色液(或相应浓度其他染色液)浸没凝胶；
④在室温下轻轻摇动凝胶板即振荡染色1个小时左右；
⑤紫外下观察结果。
实施例9：
图5显示的为针对实施例5获得的终产物与SYBR Safe核酸染料的安全性能测试对比结果，其测试条件如下：
①Hela细胞在37摄氏度下分别在1X page gelred和1X SYBR Safe内培育30分钟；
②所得样品在荧光显微镜下拍照，SYBR Safe曝光时间为200毫秒，Page gelred曝光时间为400毫秒；
③Page gelred选用Cy3滤光片，SYBR Safe用的是FITC滤光片；
④参考图5，可以清楚看到SYBR Safe能够很快穿透细胞壁并将核酸部分染色；而Page gelred因为不能穿过所以几乎看不到任何被染色的物质，故本发明获得的核酸染料对细胞具有优异的安全性能。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种新型核酸染料，其特征在于，其结构通式如下：
其中R-为碘负离子；
其中，R1、R2、R3为小于六个碳的烷基；
n的取值范围为2-6；
R4为磺酸基，为在菲啶6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
2.根据权利要求1所述的一种新型核酸染料，其特征在于，所述R1、R2、R3为C1-C4的烷基。
3.根据权利要求2所述的一种新型核酸染料，其特征在于，所述n的取值范围为2-4。
4.一种如权利要求1所述的新型核酸染料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)：由原料3,8-二氨基-6-苯基菲啶在体系中反应获得中间体I，即：
其中：
为3,8-二氨基-6-苯基菲啶，
为中间体I；
2)：由中间体I在体系中反应获得中间体II，即：
其中：
为中间体II；
3)：由中间体II与胺基反应获得中间体III，即：
其中：
为中间体III；
4)：由中间体III与溴化氢反应获得中间体IV，即：
其中：
HBr为溴化氢，
为中间体IV；
5)：由中间体IV经过磺化反应继而经过碘化钠处理获得终产物，即：
其中：
NaI为碘化钠；
为终产物，即产品核酸染料。
5.根据权利要求4所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中3,8-二氨基-6-苯基菲啶与氯甲酸乙酯在溶剂体系中反应生成中间体I，即：
其中：
为氯甲酸乙酯；
Pyridine为吡啶；
DMF为二甲基甲酰胺。
6.根据权利要求5所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中反应温度为80-130℃，即：
7.根据权利要求6所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中合成中间体III是在甲醇中进行，即：
8.根据权利要求7所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中采用的为浓度为10-60％溴化氢溶液，即：
9.根据权利要求8所述的一种新型核酸染料的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中采用的为30％发烟硫酸，即：
其中，R4为磺酸基，为在菲啶6号位苯取代基上的任一位置上的取代基团。
10.权利要求1至3任一项所述的核酸染料在聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳中的应用。
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